MicroRNA-141：解鎖IBD治療新密碼——靶點調(diào)控與治療策略深度剖析一、引言1.1IBD研究現(xiàn)狀炎癥性腸?。↖nflammatoryBowelDisease，IBD）是一類病因尚未完全明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（UlcerativeColitis，UC）和克羅恩?。–rohn'sDisease，CD）。UC主要累及直腸和結(jié)腸黏膜及黏膜下層，呈現(xiàn)連續(xù)性、淺表性炎癥，癥狀以腹瀉、黏液膿血便、腹痛為主；CD可累及從口腔到肛門的整個消化道，呈節(jié)段性、透壁性炎癥，臨床表現(xiàn)除了腸道癥狀外，還常伴有發(fā)熱、營養(yǎng)不良、貧血、關(guān)節(jié)炎等全身癥狀以及瘺管形成、腸梗阻等并發(fā)癥。在全球范圍內(nèi)，IBD的發(fā)病率和患病率呈持續(xù)上升趨勢。在歐美等西方國家，IBD早已是消化系統(tǒng)的常見病，發(fā)病率一直處于較高水平。而隨著發(fā)展中國家經(jīng)濟水平提升、生活方式西方化以及醫(yī)療衛(wèi)生條件改善，IBD在這些地區(qū)的發(fā)病率也急劇攀升，逐漸成為全球性的公共衛(wèi)生問題。中國曾被認為是IBD低發(fā)國家，但近年來的流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國IBD發(fā)病率顯著增加，患者數(shù)量不斷增多。據(jù)中國疾病預防控制中心預測，到2025年，我國IBD患者或?qū)⑼黄?50萬人。IBD不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，還會給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔?；颊唛L期受到腹痛、腹瀉、便血等癥狀的折磨，日?；顒邮芟?，工作和學習受到影響，心理上也承受著巨大壓力，易出現(xiàn)焦慮、抑郁等精神問題。由于IBD是一種慢性疾病，需要長期治療和管理，患者需頻繁就醫(yī)、長期服用藥物，部分患者還可能需要接受手術(shù)治療，這使得醫(yī)療費用居高不下。相關(guān)研究表明，IBD患者的年人均醫(yī)療費用是普通人群的數(shù)倍，給家庭和社會的醫(yī)療資源造成了極大的壓力。此外，IBD還存在較高的癌變風險，尤其是病程較長、病情嚴重的患者，發(fā)生結(jié)直腸癌的幾率顯著增加，嚴重威脅患者的生命健康。盡管目前臨床上有多種治療手段，如氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑以及生物制劑等，但仍有相當一部分患者治療效果不佳，病情反復發(fā)作，難以徹底治愈。而且，現(xiàn)有治療藥物存在不同程度的不良反應，如長期使用糖皮質(zhì)激素可能導致骨質(zhì)疏松、感染風險增加、血糖血壓異常等；免疫抑制劑可能影響肝腎功能、抑制骨髓造血等，這些不良反應限制了藥物的使用，也影響了患者的治療依從性。因此，深入研究IBD的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和更有效的治療方法迫在眉睫。1.2MicroRNA概述MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度通常在21-25個核苷酸左右。1993年，科學家在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了MicroRNA——lin-4，開啟了對這一微小分子的研究大門。此后，越來越多的MicroRNA被發(fā)現(xiàn)，目前已知人類基因組中編碼超過1000個MicroRNA，它們廣泛存在于各種真核生物中，從低等的線蟲、果蠅到高等的哺乳動物，包括人類。MicroRNA的作用機制獨特且精妙。它主要通過與靶信使核糖核酸（mRNA）的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）進行不完全互補配對結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。當MicroRNA與靶mRNA結(jié)合后，主要會產(chǎn)生兩種效應：一是抑制靶mRNA的翻譯過程，就如同給蛋白質(zhì)合成的“生產(chǎn)線”踩下剎車，使得核糖體無法正常讀取mRNA上的遺傳信息來合成蛋白質(zhì)；二是促進靶mRNA的降解，直接將mRNA“拆解”，減少其在細胞內(nèi)的含量，從源頭上降低蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。值得注意的是，單個MicroRNA可以調(diào)控多個不同的靶基因，同時，一個靶基因也可能受到多個MicroRNA的共同調(diào)控，這種復雜的調(diào)控網(wǎng)絡使得MicroRNA能夠精細地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的各種生物學過程，如細胞增殖、分化、凋亡、代謝以及免疫反應等。例如，在細胞增殖過程中，特定的MicroRNA可以通過抑制相關(guān)基因的表達，控制細胞分裂的速度和進程；在細胞分化時，MicroRNA又能引導細胞朝著特定的方向分化，形成不同類型的組織和器官。MicroRNA與人類疾病的關(guān)聯(lián)研究是當今生命科學領(lǐng)域的熱點之一。大量研究表明，MicroRNA的表達異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，無論是在腫瘤領(lǐng)域，還是心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病以及炎癥相關(guān)疾病等方面，都發(fā)揮著重要作用。在腫瘤研究中，一些MicroRNA表現(xiàn)出類似癌基因或抑癌基因的功能。比如，miR-21在多種腫瘤組織中表達上調(diào)，它可以通過抑制一些腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演“幫兇”的角色；而miR-34家族則常常在腫瘤組織中表達下調(diào)，它們原本可以抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，一旦表達不足，腫瘤細胞就可能逃脫控制，肆意生長。在心血管疾病方面，miR-1和miR-133與心肌細胞的增殖、分化以及心臟的發(fā)育密切相關(guān)，其表達異?？赡軐е滦募》屎?、心律失常等疾病；在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如阿爾茨海默病、帕金森病等，特定MicroRNA的表達改變參與了神經(jīng)細胞的凋亡、炎癥反應以及神經(jīng)遞質(zhì)的代謝異常等病理過程。在炎癥性腸?。↖BD）的研究中，MicroRNA同樣展現(xiàn)出關(guān)鍵地位。腸道內(nèi)環(huán)境復雜，涉及多種細胞類型和生物學過程，而MicroRNA作為基因表達的重要調(diào)控因子，參與了IBD發(fā)病過程中的多個環(huán)節(jié)，包括腸道免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應、腸上皮屏障功能維護以及細胞凋亡等。研究IBD中MicroRNA的表達譜變化以及它們的作用機制，有助于深入理解IBD的發(fā)病機制，為開發(fā)新的診斷標志物和治療靶點提供理論依據(jù)。其中，MicroRNA-141作為眾多MicroRNA中的一員，在IBD研究中逐漸嶄露頭角，越來越多的研究關(guān)注到它在IBD發(fā)病機制中的潛在作用，以及作為治療靶點的可能性，這也使得對MicroRNA-141的研究成為IBD領(lǐng)域的一個重要方向。1.3MicroRNA-141與IBD關(guān)聯(lián)研究背景MicroRNA-141（miR-141）作為miR-200家族的重要成員之一，近年來在多種疾病的研究中備受關(guān)注，尤其是在炎癥性腸病（IBD）領(lǐng)域，其獨特的調(diào)控作用逐漸凸顯。在IBD患者的腸道組織及相關(guān)細胞中，研究人員通過高通量測序、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）等技術(shù)手段，檢測發(fā)現(xiàn)miR-141的表達水平呈現(xiàn)出顯著的異常變化。在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的結(jié)腸黏膜組織中，miR-141的表達相較于健康對照組明顯上調(diào)，且其表達量與疾病的活動程度緊密相關(guān)，疾病活動期患者的miR-141表達水平顯著高于緩解期患者。在克羅恩?。–D）患者的病變腸段組織以及外周血單個核細胞中，同樣觀察到miR-141表達的異常改變，不過其表達趨勢在不同研究中存在一定差異，部分研究顯示表達上調(diào)，而另一些研究則提示表達下調(diào)，這種差異可能與樣本來源、疾病分型、病程階段以及檢測方法的不同等多種因素有關(guān)?，F(xiàn)有研究已初步揭示了miR-141在IBD發(fā)病機制中扮演的重要角色，使其成為極具潛力的IBD治療靶點。在腸道免疫調(diào)節(jié)方面，miR-141能夠靶向作用于多個關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)因子，如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。研究表明，miR-141可通過與Foxp3mRNA的3’-UTR區(qū)域互補結(jié)合，抑制Foxp3的表達，進而影響Treg細胞的分化與功能。Treg細胞作為維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細胞群體，其功能異常會導致腸道免疫系統(tǒng)失衡，引發(fā)過度的炎癥反應，而miR-141對Foxp3的調(diào)控作用可能在IBD的免疫失調(diào)過程中起到重要的推動作用。此外，miR-141還參與調(diào)控輔助性T細胞17（Th17）相關(guān)的信號通路，通過影響Th17細胞的分化和細胞因子的分泌，對腸道炎癥微環(huán)境產(chǎn)生影響。在腸上皮屏障功能維護方面，miR-141的作用也不容忽視。腸上皮屏障是抵御腸道病原體和有害物質(zhì)入侵的第一道防線，其完整性對于維持腸道健康至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-141可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達，如ZO-1、Occludin等。當miR-141表達異常時，會導致這些緊密連接蛋白的表達減少，破壞腸上皮細胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，使腸上皮屏障的通透性增加，腸道內(nèi)的細菌及其毒素等物質(zhì)更容易穿透腸上皮進入組織，引發(fā)炎癥反應，這一過程在IBD的發(fā)病過程中可能起到關(guān)鍵的促進作用。對miR-141的深入研究對IBD的治療具有重要意義。目前臨床上IBD的治療手段存在諸多局限性，如傳統(tǒng)藥物的不良反應、部分患者對生物制劑治療無應答或產(chǎn)生耐藥性等，尋找新的治療靶點和更有效的治療策略迫在眉睫。miR-141作為一個與IBD發(fā)病機制密切相關(guān)的關(guān)鍵分子，為IBD的治療提供了新的方向。通過對miR-141的調(diào)控，可以從多個層面干預IBD的發(fā)病過程，改善腸道免疫失調(diào)和腸上皮屏障功能障礙，有望開發(fā)出更具針對性、療效更顯著且不良反應更小的治療方法。例如，基于miR-141的反義寡核苷酸（antagomir）技術(shù)，能夠特異性地抑制miR-141的功能，為IBD的治療提供了潛在的藥物研發(fā)思路；同時，深入研究miR-141的調(diào)控網(wǎng)絡，有助于發(fā)現(xiàn)更多與之相關(guān)的潛在治療靶點，進一步拓展IBD的治療策略，為廣大IBD患者帶來新的希望。二、MicroRNA-141的功能與調(diào)控機制2.1在細胞增殖與凋亡中的作用2.1.1實驗設(shè)計與細胞模型選擇為深入探究MicroRNA-141在細胞增殖與凋亡過程中的具體作用，本研究選用了人正常結(jié)腸上皮細胞系NCM460和人結(jié)腸癌細胞系HT-29。NCM460細胞系來源于正常人結(jié)腸黏膜，能夠較好地模擬正常腸道上皮細胞的生理特性；HT-29細胞系則具有癌細胞的典型特征，在研究細胞增殖與凋亡相關(guān)機制時是常用的細胞模型，兩種細胞系的選用有助于全面分析MicroRNA-141對不同狀態(tài)細胞的影響。在構(gòu)建過表達MicroRNA-141的細胞模型時，首先通過化學合成法獲得包含MicroRNA-141成熟序列及側(cè)翼序列的前體寡核苷酸片段。將該片段克隆至真核表達載體pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-miR-141。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒導入NCM460和HT-29細胞中，具體操作如下：在轉(zhuǎn)染前24小時，將細胞以合適密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作，將稀釋后的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，室溫孵育15-20分鐘后，加入到細胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測MicroRNA-141的表達水平，篩選出過表達效果良好的細胞克隆。對于敲低MicroRNA-141的細胞模型構(gòu)建，設(shè)計并合成針對MicroRNA-141的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其連接到慢病毒載體GV248上，構(gòu)建重組慢病毒載體GV248-sh-miR-141。利用包裝細胞293T進行慢病毒的包裝和擴增，收集病毒上清液。將NCM460和HT-29細胞接種于6孔板，待細胞生長至合適密度后，加入含有病毒上清液和聚凝胺的培養(yǎng)基進行感染，感染48小時后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。通過嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定敲低MicroRNA-141的細胞株，同樣采用qRT-PCR檢測MicroRNA-141的表達水平，以驗證敲低效果。在細胞增殖檢測方面，采用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）法。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中代替胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中。具體實驗步驟為：將過表達或敲低MicroRNA-141的細胞以及對照組細胞接種于96孔板，培養(yǎng)至合適時間點后，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時。然后按照EdU檢測試劑盒說明書進行操作，去除培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞，0.5%TritonX-100破膜處理，加入Click反應液進行熒光標記，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，通過計數(shù)EdU陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例來評估細胞增殖能力。細胞凋亡檢測則采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸具有高度親和力的蛋白，在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV可以與之特異性結(jié)合；PI是一種核酸染料，能夠穿透死亡細胞的細胞膜，對細胞核進行染色。將處理后的細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌兩次后，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15分鐘，再加入PBS后立即用流式細胞儀進行檢測，根據(jù)不同象限內(nèi)細胞的分布情況，分析細胞凋亡率。2.1.2實驗結(jié)果分析通過EdU法檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，在NCM460細胞中，過表達MicroRNA-141組的EdU陽性細胞比例相較于對照組顯著降低，表明MicroRNA-141過表達抑制了正常結(jié)腸上皮細胞的增殖；而敲低MicroRNA-141組的EdU陽性細胞比例明顯升高，說明敲低MicroRNA-141能夠促進NCM460細胞的增殖。在HT-29細胞中，同樣觀察到過表達MicroRNA-141使細胞增殖受到顯著抑制，敲低MicroRNA-141則促進了癌細胞的增殖。對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用SPSS軟件進行單因素方差分析，結(jié)果顯示各組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步通過LSD法進行組間兩兩比較，明確了過表達組與對照組、敲低組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義。AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的結(jié)果表明，在NCM460細胞中，過表達MicroRNA-141組的早期凋亡細胞（AnnexinV陽性/PI陰性）和晚期凋亡細胞（AnnexinV陽性/PI陽性）比例之和相較于對照組顯著增加，表明MicroRNA-141過表達誘導了正常結(jié)腸上皮細胞的凋亡；敲低MicroRNA-141組的凋亡細胞比例則明顯降低，說明敲低MicroRNA-141抑制了NCM460細胞的凋亡。在HT-29細胞中，過表達MicroRNA-141同樣誘導了細胞凋亡的增加，敲低MicroRNA-141抑制了細胞凋亡。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，各組間細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），組間兩兩比較表明過表達組與對照組、敲低組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義。綜合細胞增殖和凋亡的檢測結(jié)果，MicroRNA-141在腸道上皮細胞中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其表達上調(diào)可抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，表達下調(diào)則促進細胞增殖并抑制細胞凋亡。進一步探討其作用的分子機制，通過生物信息學分析軟件TargetScan和miRanda預測MicroRNA-141的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)多個與細胞增殖和凋亡相關(guān)的基因，如Bcl-2、CyclinD1等可能是其作用靶點。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過抑制細胞色素C從線粒體釋放，阻止caspase級聯(lián)反應的激活，從而抑制細胞凋亡；CyclinD1則是細胞周期蛋白，在細胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進細胞增殖。為驗證這些預測，進行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。將含有Bcl-2、CyclinD1等基因3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）的野生型和突變型熒光素酶報告載體分別與MicroRNA-141模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至細胞中，結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染野生型報告載體和MicroRNA-141模擬物的細胞中，熒光素酶活性顯著降低，而在共轉(zhuǎn)染突變型報告載體和MicroRNA-141模擬物的細胞中，熒光素酶活性無明顯變化，表明MicroRNA-141能夠直接靶向結(jié)合Bcl-2、CyclinD1等基因的3’-UTR，抑制其表達。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗進一步檢測Bcl-2、CyclinD1等蛋白的表達水平，結(jié)果與雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓恢?，過表達MicroRNA-141的細胞中Bcl-2、CyclinD1蛋白表達量顯著降低，敲低MicroRNA-141的細胞中這些蛋白表達量則明顯升高。由此推測，MicroRNA-141可能通過靶向抑制Bcl-2的表達，促進細胞色素C釋放，激活caspase級聯(lián)反應，從而誘導細胞凋亡；同時，通過靶向抑制CyclinD1的表達，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞增殖。2.2在炎癥反應中的調(diào)控2.2.1炎癥相關(guān)信號通路研究在炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病過程中，炎癥相關(guān)信號通路的異常激活發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中核因子κB（NF-κB）信號通路是最為經(jīng)典且研究深入的通路之一。NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在靜息狀態(tài)下，它與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到炎癥刺激，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）等炎癥因子的作用時，IκB激酶（IKK）被激活，進而磷酸化IκB，使其發(fā)生泛素化降解。失去IκB的抑制后，NF-κB得以釋放，并迅速從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，如誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶2（COX-2）以及多種促炎細胞因子等，從而引發(fā)和加劇炎癥反應。為深入探究MicroRNA-141對NF-κB信號通路的調(diào)控作用，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測信號通路關(guān)鍵分子的表達。以正常結(jié)腸上皮細胞系NCM460和炎癥刺激后的細胞為研究對象，將細胞分為對照組、炎癥刺激組、炎癥刺激+MicroRNA-141過表達組以及炎癥刺激+MicroRNA-141敲低組。在實驗處理完成后，收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，充分裂解細胞后，通過離心獲取細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行測定，確保各組上樣蛋白量一致。將蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，隨后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以阻斷非特異性結(jié)合位點。分別加入針對NF-κBp65亞基、IκB、磷酸化IκB（p-IκB）以及內(nèi)參蛋白β-actin的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，洗去未結(jié)合的一抗。再加入相應的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1-2小時。最后，利用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，分析各蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參進行歸一化處理，從而確定各關(guān)鍵分子的相對表達量。研究MicroRNA-141對NF-κB信號通路調(diào)控的實驗設(shè)計如下：首先，構(gòu)建MicroRNA-141過表達和敲低的細胞模型，方法同前文所述。對細胞進行炎癥刺激，采用TNF-α處理細胞，模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境，TNF-α的作用濃度和時間通過預實驗確定，以確保能夠有效激活NF-κB信號通路且細胞狀態(tài)良好。在TNF-α刺激不同時間點（0、15、30、60分鐘）收集細胞，進行Westernblot檢測，觀察NF-κBp65亞基的磷酸化水平、IκB的降解情況以及p-IκB的表達變化，分析MicroRNA-141對NF-κB信號通路激活動力學的影響。為進一步驗證MicroRNA-141對NF-κB信號通路的調(diào)控作用，采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?。?gòu)建含有NF-κB響應元件的熒光素酶報告質(zhì)粒，將其與MicroRNA-141模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至細胞中，同時設(shè)置陰性對照。轉(zhuǎn)染一定時間后，加入熒光素酶底物，利用熒光檢測儀檢測熒光素酶活性。若MicroRNA-141能夠調(diào)控NF-κB信號通路，那么共轉(zhuǎn)染MicroRNA-141模擬物的細胞中熒光素酶活性將相較于對照組降低，而共轉(zhuǎn)染抑制劑的細胞中熒光素酶活性則會升高，以此明確MicroRNA-141與NF-κB信號通路之間的調(diào)控關(guān)系。2.2.2炎癥因子表達變化通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測炎癥因子的表達水平，以評估MicroRNA-141對炎癥因子表達的影響。實驗選用正常結(jié)腸上皮細胞系NCM460和經(jīng)TNF-α刺激構(gòu)建的炎癥細胞模型，將細胞分為正常對照組、TNF-α刺激組、TNF-α刺激+MicroRNA-141過表達組以及TNF-α刺激+MicroRNA-141敲低組。在細胞培養(yǎng)至合適時間點后，收集細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。首先，將特異性抗體包被在酶標板上，4℃過夜孵育，使抗體牢固結(jié)合在板孔表面。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌酶標板3-5次，以去除未結(jié)合的抗體。加入封閉液，室溫孵育1-2小時，封閉非特異性結(jié)合位點。再次洗滌后，加入細胞培養(yǎng)上清液，37℃孵育1-2小時，使炎癥因子與包被抗體特異性結(jié)合。接著，加入生物素標記的檢測抗體，37℃孵育1小時，形成抗體-抗原-檢測抗體復合物。洗滌后，加入親和素-辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物，37℃孵育30分鐘，進一步放大檢測信號。最后，加入酶底物溶液，在37℃避光條件下反應15-20分鐘，待顯色充分后，加入終止液終止反應，使用酶標儀在特定波長下測定吸光度值，通過標準曲線計算樣品中炎癥因子的濃度。檢測結(jié)果顯示，在TNF-α刺激組中，促炎因子如IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平相較于正常對照組顯著升高，表明成功構(gòu)建了炎癥細胞模型。而在TNF-α刺激+MicroRNA-141過表達組中，IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子的表達水平明顯低于TNF-α刺激組；在TNF-α刺激+MicroRNA-141敲低組中，促炎因子的表達水平則進一步升高。對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPadPrism軟件進行單因素方差分析，結(jié)果顯示各組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步通過Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較，明確了各處理組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義。這表明MicroRNA-141能夠負向調(diào)控炎癥因子的表達，其過表達可抑制炎癥因子的產(chǎn)生，敲低則會促進炎癥因子的釋放。綜合上述結(jié)果，MicroRNA-141在炎癥反應中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在IBD的炎癥發(fā)展過程中，腸道內(nèi)環(huán)境中的炎癥刺激會導致MicroRNA-141表達異常，進而影響NF-κB等炎癥相關(guān)信號通路的激活以及炎癥因子的表達。當MicroRNA-141表達上調(diào)時，能夠抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和釋放，從而減輕炎癥反應；反之，當MicroRNA-141表達下調(diào)，NF-κB信號通路過度激活，炎癥因子大量產(chǎn)生，加劇腸道炎癥，促進IBD的病情進展。因此，MicroRNA-141有望成為調(diào)控IBD炎癥反應的關(guān)鍵靶點，通過調(diào)節(jié)其表達水平，可能為IBD的治療提供新的策略。2.3調(diào)控機制的驗證與分析2.3.1生物信息學預測在探索MicroRNA-141的調(diào)控機制過程中，生物信息學預測發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。本研究選用了目前應用最為廣泛的生物信息學工具之一——TargetScan（版本8.0，/vert_80/）。TargetScan是一款專門用于預測哺乳動物中MicroRNA結(jié)合位點及靶基因的軟件，其預測原理基于對MicroRNA種子序列（通常為成熟MicroRNA的第2-8位核苷酸）與靶mRNA3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）的堿基互補配對情況分析，同時綜合考慮位點的保守性、上下文特征以及熱力學穩(wěn)定性等多方面因素，從而準確地預測潛在的調(diào)控關(guān)系。以預測MicroRNA-141的潛在調(diào)控靶點為例，具體操作步驟如下：首先，進入TargetScan網(wǎng)站后，在“Selectaspecies”選項中選擇研究物種為“Human”，確保預測結(jié)果與人類相關(guān)研究背景一致。接著，在“EnteramicroRNAname”位置輸入“miR-141”，點擊“submit”按鈕，提交篩選信息。網(wǎng)站隨即進行運算分析，生成預測結(jié)果。結(jié)果以表格形式呈現(xiàn)，詳細列出了預測到的靶基因信息，包括基因名、序列編號（ENSG編號，Ensembl數(shù)據(jù)庫）、MicroRNA-141與靶基因3’-UTR的作用位點、結(jié)合區(qū)域的具體序列、位點類型以及位點評分信息等。其中，位點類型如“7mer-m8”表示與成熟MicroRNA-141的第2-8位（種子+8位）完全匹配；位點評分方面，“Context++score”評分越低，表明該位點是真正靶點的概率越大，而“Context++scorepercentile”數(shù)值越接近100，也意味著位點是真實靶點的可能性越高。除了TargetScan，本研究還選用了miRanda（/microrna/home.do）作為輔助預測工具。miRanda同樣基于MicroRNA與靶mRNA3’-UTR的序列互補性進行預測，同時考慮了RNA二級結(jié)構(gòu)以及結(jié)合自由能等因素。使用miRanda時，將MicroRNA-141的成熟序列和人類mRNA的3’-UTR序列上傳至網(wǎng)站，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后進行預測分析。miRanda的預測結(jié)果同樣包含了潛在靶基因列表以及MicroRNA與靶基因的結(jié)合位點、結(jié)合自由能等詳細信息。綜合TargetScan和miRanda的預測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多個基因被兩種工具共同預測為MicroRNA-141的潛在靶基因，如ZEB1、ZEB2、SOX9等。這些基因在細胞生物學過程中具有重要功能，ZEB1和ZEB2是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細胞的遷移、侵襲和分化等過程；SOX9則在胚胎發(fā)育、細胞命運決定以及組織穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。共同預測結(jié)果的出現(xiàn)，增加了這些基因作為MicroRNA-141真實靶基因的可信度。此外，對預測結(jié)果進行功能富集分析，利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這些潛在靶基因主要富集在細胞增殖、凋亡、炎癥反應以及細胞信號轉(zhuǎn)導等生物學過程和相關(guān)信號通路中，進一步提示MicroRNA-141可能通過調(diào)控這些靶基因參與上述重要的生物學過程，與前文關(guān)于MicroRNA-141在細胞增殖、凋亡和炎癥反應中的作用研究相呼應。然而，生物信息學預測結(jié)果僅僅是基于算法和數(shù)據(jù)分析得出的理論推測，還需要通過實驗進行進一步的驗證，以明確MicroRNA-141與這些潛在靶基因之間真實的調(diào)控關(guān)系。2.3.2實驗驗證調(diào)控機制為了驗證生物信息學預測的MicroRNA-141與潛在靶基因之間的調(diào)控關(guān)系，本研究采用了熒光素酶報告基因?qū)嶒?。該實驗的原理是基于熒光素酶的催化反應，當熒光素酶基因與靶基因的3’-UTR區(qū)域融合構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒后，若MicroRNA能夠與靶基因3’-UTR的特定區(qū)域結(jié)合，就會影響報告基因的表達，進而改變熒光素酶的活性，通過檢測熒光素酶活性的變化，即可判斷MicroRNA與靶基因之間是否存在調(diào)控關(guān)系。以驗證MicroRNA-141對ZEB1基因的調(diào)控為例，具體實驗步驟如下：首先，通過基因克隆技術(shù)，從人基因組DNA中擴增出ZEB1基因的3’-UTR序列。將擴增得到的3’-UTR序列插入到含有熒光素酶基因的報告載體pGL3-Basic中，構(gòu)建野生型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-ZEB1-WT。同時，針對MicroRNA-141與ZEB1基因3’-UTR的預測結(jié)合位點，采用定點突變技術(shù)，將結(jié)合位點處的關(guān)鍵堿基進行突變，構(gòu)建突變型熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-ZEB1-MUT。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將野生型報告質(zhì)粒pGL3-ZEB1-WT和突變型報告質(zhì)粒pGL3-ZEB1-MUT分別與MicroRNA-141模擬物（mimic）或陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。設(shè)置4組實驗：A組轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-WT和NC；B組轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-WT和MicroRNA-141mimic；C組轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-MUT和NC；D組轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-MUT和MicroRNA-141mimic。轉(zhuǎn)染24-48小時后，收集細胞，按照熒光素酶檢測試劑盒（如Promega公司的Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem）說明書進行操作。首先，向細胞裂解液中加入含有螢火蟲熒光素酶底物的反應緩沖液，利用熒光檢測儀檢測螢火蟲熒光素酶的活性，其活性反映了報告基因的表達水平；然后，加入海腎熒光素酶底物，檢測海腎熒光素酶的活性，作為內(nèi)參用于校正轉(zhuǎn)染效率和細胞裂解差異。計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，得到相對熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，B組（轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-WT和MicroRNA-141mimic）的相對熒光素酶活性相較于A組（轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-WT和NC）顯著降低，表明MicroRNA-141能夠與ZEB1基因的野生型3’-UTR結(jié)合，抑制報告基因的表達，進而降低熒光素酶活性；而C組（轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-MUT和NC）和D組（轉(zhuǎn)染pGL3-ZEB1-MUT和MicroRNA-141mimic）的相對熒光素酶活性無明顯差異，說明當ZEB1基因3’-UTR的MicroRNA-141結(jié)合位點突變后，MicroRNA-141無法與之結(jié)合，也就不能對報告基因的表達產(chǎn)生影響。對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用SPSS軟件進行單因素方差分析，結(jié)果顯示各組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步通過LSD法進行組間兩兩比較，明確了B組與A組、C組與D組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果有力地驗證了生物信息學預測的MicroRNA-141與ZEB1基因之間的調(diào)控關(guān)系，表明MicroRNA-141可以通過直接靶向結(jié)合ZEB1基因的3’-UTR，抑制其表達。為了進一步驗證MicroRNA-141對ZEB1基因表達的影響，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗檢測ZEB1蛋白的表達水平。將MicroRNA-141mimic或NC轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌細胞系HT-29中，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，提取總蛋白。按照常規(guī)的Westernblot實驗步驟，進行蛋白定量、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育（使用抗ZEB1抗體和內(nèi)參抗體β-actin）、二抗孵育以及化學發(fā)光顯色等操作。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MicroRNA-141mimic的細胞中ZEB1蛋白表達量相較于轉(zhuǎn)染NC的細胞顯著降低，與熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果一致，再次證實了MicroRNA-141能夠抑制ZEB1基因的表達。綜合熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖esternblot實驗結(jié)果，明確了MicroRNA-141與ZEB1基因之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，為深入理解MicroRNA-141在炎癥性腸?。↖BD）發(fā)病機制中的作用提供了重要的實驗依據(jù)。三、MicroRNA-141靶點的篩選與驗證3.1生物信息學分析篩選靶點3.1.1數(shù)據(jù)庫與分析工具在探索MicroRNA-141與炎癥性腸?。↖BD）潛在關(guān)聯(lián)靶點的過程中，本研究運用了多種權(quán)威且廣泛應用的數(shù)據(jù)庫與先進分析工具，以確保篩選結(jié)果的準確性與可靠性。miRBase數(shù)據(jù)庫作為存儲MicroRNA信息的核心資源，本研究利用其來獲取MicroRNA-141的詳細序列信息，這是后續(xù)分析的基礎(chǔ)。在靶點預測環(huán)節(jié)，選用了TargetScan（版本8.0，/vert_80/）、miRanda（/microrna/home.do）和PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）這三款經(jīng)典且各具優(yōu)勢的生物信息學軟件。TargetScan基于對MicroRNA種子序列（通常為成熟MicroRNA的第2-8位核苷酸）與靶mRNA3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）的堿基互補配對情況分析，同時綜合考慮位點的保守性、上下文特征以及熱力學穩(wěn)定性等多方面因素，從而準確地預測潛在的調(diào)控關(guān)系。miRanda同樣基于MicroRNA與靶mRNA3’-UTR的序列互補性進行預測，同時考慮了RNA二級結(jié)構(gòu)以及結(jié)合自由能等因素，為預測結(jié)果提供了不同維度的考量。PicTar則側(cè)重于整合多個物種間的保守性信息，通過比較不同物種中MicroRNA與mRNA的相互作用，提高預測的準確性和可信度。具體篩選流程如下：首先，將MicroRNA-141的成熟序列分別輸入到上述三款軟件中。在TargetScan中，選擇人類物種后提交序列，軟件根據(jù)其算法生成包含潛在靶基因的列表，該列表詳細呈現(xiàn)了基因名、序列編號（ENSG編號，Ensembl數(shù)據(jù)庫）、MicroRNA-141與靶基因3’-UTR的作用位點、結(jié)合區(qū)域的具體序列、位點類型以及位點評分信息等。例如，“7mer-m8”表示與成熟MicroRNA-141的第2-8位（種子+8位）完全匹配；位點評分方面，“Context++score”評分越低，表明該位點是真正靶點的概率越大，而“Context++scorepercentile”數(shù)值越接近100，也意味著位點是真實靶點的可能性越高。在miRanda中，上傳MicroRNA-141序列和人類mRNA的3’-UTR序列，設(shè)置相關(guān)參數(shù)后進行預測分析，結(jié)果同樣包含了潛在靶基因列表以及MicroRNA與靶基因的結(jié)合位點、結(jié)合自由能等詳細信息。在PicTar中，按照其特定的輸入格式和參數(shù)設(shè)置，提交序列后獲得基于多物種保守性分析的潛在靶基因預測結(jié)果。為了進一步篩選出與IBD發(fā)病機制密切相關(guān)的潛在靶點，本研究還利用了DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫進行基因功能富集分析。將上述軟件預測得到的潛在靶基因列表上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇人類基因作為參考背景，對基因進行功能注釋和富集分析。DAVID數(shù)據(jù)庫整合了多個生物信息學資源，能夠從基因本體論（GO）的生物過程、分子功能和細胞組成三個層面，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路等方面，對基因進行全面的功能解讀。通過設(shè)置合適的富集分析參數(shù)，如P值閾值為0.05，篩選出在IBD相關(guān)生物學過程和信號通路中顯著富集的基因，從而確定重點研究的潛在靶點。3.1.2潛在靶點預測結(jié)果經(jīng)過生物信息學軟件的預測和DAVID數(shù)據(jù)庫的功能富集分析，得到了一系列MicroRNA-141的潛在靶點。其中，ZEB1、ZEB2、SOX9、FOXO1等基因被多種軟件共同預測為潛在靶點，這些基因在細胞生物學過程中具有重要功能，與IBD的發(fā)病機制存在緊密關(guān)聯(lián)。ZEB1和ZEB2是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在腸道生理狀態(tài)下，上皮細胞通過緊密連接等結(jié)構(gòu)維持腸上皮屏障的完整性，而在IBD發(fā)生發(fā)展過程中，腸道炎癥微環(huán)境的改變可能誘導EMT過程。ZEB1和ZEB2的異常表達會導致上皮細胞間緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin等的表達減少，使腸上皮細胞的極性喪失，細胞間連接松散，進而破壞腸上皮屏障功能，增加腸道通透性，使得腸道內(nèi)的病原體和有害物質(zhì)更容易侵入組織，引發(fā)和加劇炎癥反應。MicroRNA-141可能通過靶向ZEB1和ZEB2，調(diào)節(jié)其表達水平，從而影響EMT過程，在維持腸上皮屏障功能和抑制IBD炎癥發(fā)展中發(fā)揮作用。SOX9是一種在胚胎發(fā)育、細胞命運決定以及組織穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮著不可或缺作用的轉(zhuǎn)錄因子。在腸道中，SOX9參與腸道干細胞的維持和分化調(diào)控，對于腸上皮細胞的更新和修復至關(guān)重要。研究表明，在IBD患者的腸道組織中，SOX9的表達異常，影響腸道干細胞的功能和腸上皮細胞的再生能力，導致腸道黏膜損傷難以修復，炎癥持續(xù)存在。MicroRNA-141對SOX9的調(diào)控可能是維持腸道組織穩(wěn)態(tài)、促進腸上皮修復的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有望成為IBD治療的潛在靶點。FOXO1是叉頭框蛋白O家族的成員之一，參與細胞代謝、增殖、凋亡以及應激反應等多種生物學過程。在腸道免疫調(diào)節(jié)方面，F(xiàn)OXO1通過調(diào)節(jié)免疫細胞的分化、活化和細胞因子的分泌，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。在IBD發(fā)病過程中，腸道免疫失調(diào)，F(xiàn)OXO1的表達和功能異常，導致免疫細胞過度活化，促炎細胞因子大量釋放，引發(fā)和加重腸道炎癥。MicroRNA-141與FOXO1之間的靶向關(guān)系，可能為調(diào)節(jié)腸道免疫反應、治療IBD提供新的思路。綜合上述分析，本研究確定ZEB1、ZEB2、SOX9和FOXO1等基因作為重點研究的潛在靶點。這些基因在IBD發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用以及與MicroRNA-141的潛在靶向關(guān)系，為后續(xù)深入研究MicroRNA-141在IBD中的作用機制和開發(fā)新的治療策略奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)將通過一系列實驗，如熒光素酶報告基因?qū)嶒?、蛋白質(zhì)免疫印跡實驗以及細胞功能實驗等，進一步驗證MicroRNA-141與這些潛在靶點之間的相互作用關(guān)系及其在IBD發(fā)病過程中的具體調(diào)控機制。三、MicroRNA-141靶點的篩選與驗證3.2實驗驗證靶點功能3.2.1細胞實驗驗證為了驗證生物信息學預測的MicroRNA-141潛在靶點基因的功能，本研究在細胞水平進行了深入實驗。以ZEB1基因為例，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)敲低其表達，具體操作如下：設(shè)計并合成針對ZEB1基因的小干擾RNA（siRNA），其序列經(jīng)過嚴格篩選，確保能夠特異性地靶向ZEB1mRNA，干擾其轉(zhuǎn)錄過程。將siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按照一定比例混合，形成轉(zhuǎn)染復合物。在轉(zhuǎn)染前24小時，將人結(jié)腸癌細胞系HT-29以合適密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，將轉(zhuǎn)染復合物加入到細胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，使siRNA能夠有效進入細胞并發(fā)揮作用。利用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測ZEB1基因mRNA水平的表達變化。提取轉(zhuǎn)染后的細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增，引物序列根據(jù)ZEB1基因的保守區(qū)域設(shè)計，同時設(shè)置內(nèi)參基因GAPDH作為對照，以校正不同樣本間的RNA上樣量差異。反應體系和條件按照qRT-PCR試劑盒說明書進行優(yōu)化，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應，記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計算ZEB1基因mRNA的相對表達量。結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染ZEB1-siRNA的細胞中ZEB1mRNA表達水平顯著降低，表明RNA干擾成功敲低了ZEB1基因的表達。在過表達實驗方面，構(gòu)建ZEB1基因的過表達質(zhì)粒。從人基因組DNA中擴增出ZEB1基因的編碼序列，將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-ZEB1。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒導入HT-29細胞中，轉(zhuǎn)染方法同RNAi實驗。轉(zhuǎn)染48-72小時后，同樣利用qRT-PCR檢測ZEB1基因mRNA的表達水平，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZEB1的細胞中ZEB1mRNA表達量相較于對照組顯著升高，成功實現(xiàn)了ZEB1基因的過表達。為了進一步分析靶點基因表達變化對細胞表型的影響，進行了細胞遷移和侵襲實驗。采用Transwell小室進行細胞遷移實驗，在Transwell小室的上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后的細胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時間后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，將下室遷移到膜表面的細胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取多個視野進行細胞計數(shù)，統(tǒng)計遷移細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗則在Transwell小室的上室預先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細胞外基質(zhì)，其他操作同遷移實驗。結(jié)果顯示，敲低ZEB1基因表達后，HT-29細胞的遷移和侵襲能力顯著降低；而過表達ZEB1基因則促進了細胞的遷移和侵襲。這表明ZEB1基因在細胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，MicroRNA-141可能通過調(diào)控ZEB1基因的表達，影響細胞的遷移和侵襲能力，進而參與炎癥性腸?。↖BD）的發(fā)病過程，如腸道黏膜損傷后的修復以及炎癥細胞向腸道組織的浸潤等。3.2.2動物實驗驗證為了在體內(nèi)驗證MicroRNA-141靶點的功能及與IBD發(fā)病的關(guān)系，本研究構(gòu)建了葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型。選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后開始造模。將小鼠隨機分為4組，每組10只：正常對照組、DSS模型組、DSS+antagomir-miR-141組（通過腹腔注射anti-miR-141抑制小鼠體內(nèi)MicroRNA-141的表達）以及DSS+agomir-miR-141組（通過腹腔注射miR-141模擬物過表達MicroRNA-141）。在造模過程中，DSS模型組、DSS+antagomir-miR-141組和DSS+agomir-miR-141組小鼠自由飲用3%-5%（質(zhì)量分數(shù)）的DSS溶液，連續(xù)7天，以誘導小鼠發(fā)生UC；正常對照組小鼠則自由飲用正常飲用水。同時，從造模第1天開始，DSS+antagomir-miR-141組小鼠每天腹腔注射anti-miR-141（劑量為5nmol/g體重），DSS+agomir-miR-141組小鼠每天腹腔注射miR-141模擬物（劑量為5nmol/g體重），正常對照組和DSS模型組小鼠則腹腔注射等量的生理鹽水。在實驗期間，每天觀察并記錄小鼠的體重變化、糞便性狀、便血情況等，根據(jù)這些指標計算疾病活動指數(shù)（DAI），以評估小鼠的疾病嚴重程度。DAI評分標準如下：體重下降0%-1%為0分，1%-5%為1分，5%-10%為2分，10%-15%為3分，＞15%為4分；糞便性狀正常為0分，松軟但未腹瀉為1分，腹瀉為2分；無便血為0分，潛血陽性為1分，肉眼可見便血為2分。實驗結(jié)束后，處死小鼠，迅速取出結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，測量結(jié)腸長度，觀察結(jié)腸大體形態(tài)學變化，如結(jié)腸是否出現(xiàn)充血、水腫、潰瘍等。隨后，將結(jié)腸組織一部分用于組織病理學分析，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理變化，包括炎癥細胞浸潤程度、隱窩破壞情況、上皮損傷程度等，并按照標準的組織學評分系統(tǒng)進行評分；另一部分結(jié)腸組織用于提取RNA和蛋白質(zhì)，通過qRT-PCR檢測靶點基因ZEB1、SOX9等以及炎癥因子IL-6、IL-8等的mRNA表達水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測靶點蛋白的表達變化。動物實驗結(jié)果顯示，DSS模型組小鼠體重明顯下降，DAI評分顯著升高，結(jié)腸長度縮短，結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的充血、水腫、潰瘍等病理改變，炎癥細胞大量浸潤，隱窩結(jié)構(gòu)破壞嚴重；與DSS模型組相比，DSS+antagomir-miR-141組小鼠體重下降幅度減小，DAI評分降低，結(jié)腸長度有所增加，結(jié)腸組織病理損傷減輕，炎癥細胞浸潤減少，隱窩破壞程度減輕，同時ZEB1、SOX9等靶點基因的表達上調(diào)，炎癥因子IL-6、IL-8等的表達水平降低；而DSS+agomir-miR-141組小鼠體重下降更為明顯，DAI評分更高，結(jié)腸長度更短，結(jié)腸組織病理損傷更為嚴重，炎癥細胞浸潤更為廣泛，隱窩結(jié)構(gòu)幾乎完全消失，靶點基因ZEB1、SOX9等的表達下調(diào)，炎癥因子IL-6、IL-8等的表達水平顯著升高。對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用SPSS軟件進行單因素方差分析，結(jié)果顯示各組間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步通過LSD法進行組間兩兩比較，明確了各處理組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義。綜合上述動物實驗結(jié)果，驗證了MicroRNA-141靶點在體內(nèi)的功能，表明MicroRNA-141通過調(diào)控ZEB1、SOX9等靶點基因的表達，參與了IBD的發(fā)病過程，影響腸道炎癥反應和組織損傷程度。抑制MicroRNA-141的表達可以減輕DSS誘導的小鼠UC癥狀，改善腸道病理損傷，其機制可能與上調(diào)靶點基因表達，抑制炎癥因子釋放有關(guān)；而過表達MicroRNA-141則加重了疾病癥狀和腸道病理損傷，這為IBD的治療提供了重要的體內(nèi)實驗依據(jù)，提示靶向MicroRNA-141及其靶點基因可能成為治療IBD的有效策略。3.3靶點在IBD發(fā)生中的作用機制3.3.1靶點與IBD相關(guān)信號通路的關(guān)系在炎癥性腸?。↖BD）的復雜發(fā)病機制中，多種信號通路相互交織、協(xié)同作用，共同影響著疾病的發(fā)生與發(fā)展。其中，核因子κB（NF-κB）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在IBD炎癥反應中扮演著核心角色，而MicroRNA-141的靶點基因ZEB1、ZEB2、SOX9和FOXO1等與這些關(guān)鍵信號通路存在著緊密且復雜的聯(lián)系。以ZEB1基因為例，它與NF-κB信號通路之間存在著雙向調(diào)控關(guān)系。在正常生理狀態(tài)下，腸道上皮細胞中ZEB1的表達維持在相對穩(wěn)定的水平，對腸上皮屏障功能的維持起到重要作用。當腸道受到炎癥刺激時，NF-κB信號通路被激活，激活后的NF-κB可以結(jié)合到ZEB1基因的啟動子區(qū)域，促進ZEB1的轉(zhuǎn)錄表達。高表達的ZEB1會誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，導致腸上皮細胞間緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin等的表達減少，腸上皮屏障功能受損，腸道通透性增加，使得腸道內(nèi)的病原體和有害物質(zhì)更容易侵入組織，進一步激活NF-κB信號通路，形成一個正反饋循環(huán)，加劇腸道炎癥反應。另一方面，ZEB1也可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路中相關(guān)分子的表達來影響該通路的活性。研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1能夠與IκBα相互作用，促進IκBα的降解，從而使NF-κB更容易被激活，增強炎癥反應。在MAPK信號通路方面，SOX9基因與之存在密切關(guān)聯(lián)。MAPK信號通路主要包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導途徑，在細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥反應等過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。在IBD發(fā)病過程中，腸道炎癥刺激會導致MAPK信號通路的異常激活。研究表明，SOX9可以通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性來影響炎癥反應。具體來說，SOX9能夠與ERK的上游激活因子Raf-1相互作用，抑制Raf-1的活性，從而阻斷ERK的磷酸化激活，抑制下游炎癥相關(guān)基因的表達。當SOX9表達異常時，無法有效抑制Raf-1，導致ERK過度激活，促使炎癥因子如IL-6、IL-8等大量分泌，加重腸道炎癥。此外，JNK和p38MAPK信號途徑也受到SOX9的間接調(diào)控，通過影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達，參與IBD的發(fā)病過程。FOXO1基因同樣在IBD相關(guān)信號通路中發(fā)揮重要作用。在正常腸道免疫調(diào)節(jié)過程中，F(xiàn)OXO1通過調(diào)控免疫細胞的分化、活化和細胞因子的分泌，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。當腸道發(fā)生炎癥時，NF-κB和MAPK等信號通路被激活，這些信號通路的激活會影響FOXO1的磷酸化狀態(tài)和核質(zhì)穿梭。例如，ERK的激活可以使FOXO1發(fā)生磷酸化，磷酸化后的FOXO1從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，失去對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。而FOXO1的靶基因中包含多個與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應相關(guān)的基因，如IL-10等抗炎細胞因子。當FOXO1功能受到抑制時，IL-10等抗炎因子的表達減少，無法有效抑制炎癥反應，導致腸道炎癥進一步加劇。綜上所述，MicroRNA-141的靶點基因ZEB1、ZEB2、SOX9和FOXO1等在IBD相關(guān)信號通路中扮演著關(guān)鍵角色，它們通過與NF-κB、MAPK等信號通路的相互作用，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達和細胞生物學行為，在IBD的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。深入研究這些靶點基因與信號通路之間的關(guān)系，有助于進一步揭示IBD的發(fā)病機制，為開發(fā)基于MicroRNA-141靶點調(diào)控的IBD治療策略提供理論依據(jù)。3.3.2靶點與其他基因或蛋白的相互作用為了深入探究MicroRNA-141靶點在炎癥性腸?。↖BD）發(fā)病機制中的作用，本研究采用了多種實驗方法來研究靶點與其他基因或蛋白的相互作用。在蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實驗方面，以研究ZEB1蛋白與緊密連接蛋白ZO-1的相互作用為例，具體實驗步驟如下：首先，將人結(jié)腸癌細胞系HT-29培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細胞并裂解，獲取細胞總蛋白。將抗ZEB1抗體與ProteinA/G磁珠進行孵育，使抗體與磁珠結(jié)合。然后，將細胞總蛋白與結(jié)合了抗ZEB1抗體的磁珠共同孵育，4℃緩慢搖晃過夜，使ZEB1蛋白與抗體-磁珠復合物充分結(jié)合。次日，利用磁力架分離磁珠，用洗滌緩沖液多次洗滌磁珠，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后，加入洗脫緩沖液，將與ZEB1蛋白相互結(jié)合的蛋白從磁珠上洗脫下來。將洗脫得到的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，隨后通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測ZO-1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，在與ZEB1蛋白共沉淀的樣品中檢測到了ZO-1蛋白，表明ZEB1與ZO-1之間存在相互作用。在RNA免疫沉淀（RIP）實驗中，以研究MicroRNA-141與靶基因ZEB1mRNA的相互作用為例，選用人正常結(jié)腸上皮細胞系NCM460。首先，將細胞用甲醛進行交聯(lián)處理，使RNA與結(jié)合的蛋白固定在一起。然后，裂解細胞，獲取細胞裂解液。將抗AGO2抗體與ProteinA/G磁珠孵育結(jié)合，AGO2蛋白是RNA誘導沉默復合體（RISC）的核心組成部分，MicroRNA-141通過與AGO2結(jié)合形成RISC來發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用。將細胞裂解液與結(jié)合了抗AGO2抗體的磁珠共同孵育，4℃緩慢搖晃過夜，使與MicroRNA-141結(jié)合的ZEB1mRNA與抗體-磁珠復合物結(jié)合。利用磁力架分離磁珠，用洗滌緩沖液充分洗滌，去除未結(jié)合的RNA和雜質(zhì)。最后，用蛋白酶K消化磁珠上結(jié)合的蛋白，釋放出RNA。通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測釋放的RNA中ZEB1mRNA的含量。結(jié)果顯示，在抗AGO2抗體免疫沉淀的樣品中，ZEB1mRNA的含量明顯高于對照組，表明MicroRNA-141與ZEB1mRNA存在相互作用，且這種相互作用是通過AGO2蛋白介導的。研究結(jié)果表明，MicroRNA-141的靶點基因與其他基因或蛋白之間存在廣泛的相互作用。ZEB1除了與緊密連接蛋白ZO-1相互作用外，還與轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug等存在相互作用，它們共同調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。在IBD發(fā)病過程中，ZEB1與這些蛋白的相互作用導致腸上皮細胞間緊密連接破壞，細胞極性喪失，促進炎癥細胞的浸潤和炎癥反應的加劇。SOX9與Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白β-catenin存在相互作用，SOX9可以與β-catenin結(jié)合，共同調(diào)節(jié)腸道干細胞的增殖和分化。在IBD患者的腸道組織中，SOX9與β-catenin的相互作用異常，影響腸道干細胞的功能，導致腸上皮修復受損，炎癥持續(xù)存在。綜上所述，MicroRNA-141靶點與其他基因或蛋白之間的相互作用在IBD發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。這些相互作用通過調(diào)節(jié)細胞生物學行為、信號通路的激活以及基因表達等多個層面，影響腸道免疫調(diào)節(jié)、腸上皮屏障功能和炎癥反應等過程，共同推動IBD的發(fā)生和發(fā)展。深入研究這些相互作用機制，有助于全面揭示IBD的發(fā)病機制，為尋找新的治療靶點和開發(fā)有效的治療策略提供理論基礎(chǔ)。四、基于MicroRNA-141靶向治療的研究4.1體外治療模型的建立與驗證4.1.1治療策略設(shè)計基于MicroRNA-141在炎癥性腸?。↖BD）發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用，本研究設(shè)計了一系列針對性的靶向治療策略。其中，反義寡核苷酸（Antisenseoligonucleotides，ASO）技術(shù)是重要手段之一。反義寡核苷酸是一類人工合成的短鏈核酸分子，其序列與MicroRNA-141的成熟序列互補。當將反義寡核苷酸導入細胞后，它能夠與MicroRNA-141特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，從而阻斷MicroRNA-141與靶mRNA的相互作用，抑制其功能。這種策略的設(shè)計原理基于核酸分子的堿基互補配對原則，具有高度的特異性，能夠精準地調(diào)控MicroRNA-141的表達和活性。為了提高反義寡核苷酸在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率，對其進行了化學修飾，如在磷酸骨架上引入硫代磷酸酯修飾，增強其對核酸酶的抗性，延長作用時間；在末端添加膽固醇等親脂性基團，改善其細胞膜穿透能力，促進細胞攝取。miRNA模擬物（miRNAmimics）也是本研究采用的重要治療策略。miRNA模擬物是人工合成的雙鏈RNA分子，其序列與內(nèi)源性MicroRNA-141的成熟序列相同。將miRNA模擬物轉(zhuǎn)染至細胞后，它可以進入RNA誘導沉默復合體（RISC），替代內(nèi)源性MicroRNA-141發(fā)揮作用。當細胞內(nèi)MicroRNA-141表達不足時，miRNA模擬物能夠補充其功能，通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）結(jié)合，抑制靶基因的表達，從而調(diào)節(jié)相關(guān)生物學過程。在制備miRNA模擬物時，對其進行了優(yōu)化設(shè)計，確保其雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和與靶mRNA結(jié)合的特異性，同時通過調(diào)整轉(zhuǎn)染條件，如轉(zhuǎn)染試劑的選擇、轉(zhuǎn)染時間和劑量的優(yōu)化，提高miRNA模擬物在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率和生物學活性。為了驗證治療策略的有效性，還設(shè)計了陰性對照和陽性對照。陰性對照采用與MicroRNA-141序列無關(guān)的亂序寡核苷酸，在轉(zhuǎn)染實驗中，它不會與細胞內(nèi)的任何分子發(fā)生特異性結(jié)合，用于排除非特異性干擾。陽性對照則選擇已知對IBD治療有效的藥物或干預措施，如5-氨基水楊酸（5-ASA），在相同的實驗條件下進行處理，用于對比評估基于MicroRNA-141的治療策略的效果。通過設(shè)置合理的對照，能夠準確地判斷反義寡核苷酸和miRNA模擬物對MicroRNA-141的調(diào)控作用以及對IBD相關(guān)生物學過程的影響。4.1.2體外細胞實驗驗證為了驗證基于MicroRNA-141的靶向治療策略在體外細胞模型中的有效性，本研究選用人結(jié)腸癌細胞系HT-29和人正常結(jié)腸上皮細胞系NCM460作為實驗對象。首先，將反義寡核苷酸和miRNA模擬物轉(zhuǎn)染至細胞中。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，具體操作如下：在轉(zhuǎn)染前24小時，將細胞以合適密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。將反義寡核苷酸或miRNA模擬物與脂質(zhì)體按照一定比例混合，室溫孵育15-20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物加入到細胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，使反義寡核苷酸或miRNA模擬物能夠有效進入細胞并發(fā)揮作用。同時設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染亂序寡核苷酸；陽性對照組，用5-氨基水楊酸（5-ASA）處理細胞。利用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測MicroRNA-141的表達水平。提取轉(zhuǎn)染后的細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增，引物序列根據(jù)MicroRNA-141的成熟序列設(shè)計，同時設(shè)置內(nèi)參基因U6作為對照，以校正不同樣本間的RNA上樣量差異。反應體系和條件按照qRT-PCR試劑盒說明書進行優(yōu)化，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應，記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計算MicroRNA-141的相對表達量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸的細胞中MicroRNA-141的表達水平相較于陰性對照組顯著降低，表明反義寡核苷酸能夠有效抑制MicroRNA-141的表達；轉(zhuǎn)染miRNA模擬物的細胞中MicroRNA-141的表達水平則明顯升高，說明miRNA模擬物成功過表達了MicroRNA-141。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測靶基因ZEB1、SOX9等蛋白的表達變化。收集轉(zhuǎn)染后的細胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，充分裂解細胞后，通過離心獲取細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行測定，確保各組上樣蛋白量一致。將蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，隨后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以阻斷非特異性結(jié)合位點。分別加入針對ZEB1、SOX9以及內(nèi)參蛋白β-actin的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，洗去未結(jié)合的一抗。再加入相應的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1-2小時。最后，利用化學發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，分析各蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參進行歸一化處理，從而確定各靶蛋白的相對表達量。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸的細胞中，由于MicroRNA-141表達被抑制，ZEB1、SOX9等靶蛋白的表達水平上調(diào)；而在轉(zhuǎn)染miRNA模擬物的細胞中，隨著MicroRNA-141表達升高，靶蛋白的表達水平顯著降低，與理論預期一致。在細胞功能檢測方面，進行了細胞增殖、遷移和炎癥因子分泌的檢測。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于96孔板，培養(yǎng)不同時間點后，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制細胞生長曲線。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸的細胞增殖能力相較于陰性對照組增強，而轉(zhuǎn)染miRNA模擬物的細胞增殖受到抑制，與5-ASA處理組的細胞增殖變化趨勢相似。在細胞遷移實驗中，采用Transwell小室進行檢測，具體方法同前文所述。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸促進了細胞的遷移，而轉(zhuǎn)染miRNA模擬物則抑制了細胞的遷移。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-6、IL-8等的分泌水平，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸的細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的分泌量增加，轉(zhuǎn)染miRNA模擬物的細胞炎癥因子分泌顯著減少，5-ASA處理組同樣表現(xiàn)出炎癥因子分泌降低的趨勢。綜合上述體外細胞實驗結(jié)果，基于MicroRNA-141的靶向治療策略在體外細胞模型中表現(xiàn)出良好的有效性。反義寡核苷酸能夠有效抑制MicroRNA-141的表達，上調(diào)靶基因蛋白表達，促進細胞增殖和遷移，增加炎癥因子分泌；miRNA模擬物則成功過表達MicroRNA-141，下調(diào)靶基因蛋白表達，抑制細胞增殖和遷移，減少炎癥因子分泌，且與陽性對照5-ASA的作用效果具有相似性。這些結(jié)果為進一步開展基于MicroRNA-141的靶向治療研究提供了重要的體外實驗依據(jù)。4.2體內(nèi)治療模型的構(gòu)建與評估4.2.1動物模型選擇與構(gòu)建在炎癥性腸?。↖BD）的體內(nèi)研究中，小鼠模型因其與人類在生理、遺傳和免疫等方面具有一定的相似性，且易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、實驗操作方便等優(yōu)點，成為了最常用的動物模型之一。本研究選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠，該品系小鼠對炎癥刺激較為敏感，能夠較好地模擬IBD的病理過程。構(gòu)建小鼠IBD模型采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導法，其原理是DSS能夠破壞腸上皮屏障，引發(fā)腸道炎癥和免疫反應。具體操作如下：將小鼠適應性飼養(yǎng)1周后開始造模，在造模期間，小鼠自由飲用含3%-5%（質(zhì)量分數(shù)）DSS的無菌水溶液，連續(xù)7天。在此過程中，需要密切關(guān)注小鼠的健康狀況，確保小鼠有充足的水分和食物攝入。同時，保持飼養(yǎng)