microRNA-24對大鼠血管eNOS及血漿NO的影響及機制探究一、引言1.1研究背景心血管疾病（CardiovascularDiseases，CVDs）嚴重威脅人類健康，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)，每年有超過1700萬人死于心血管疾病，占全球死亡人數(shù)的31%。在中國，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為44.8%，城市為41.9%，疾病負擔(dān)日漸加重，已成為重大的公共衛(wèi)生問題。常見的心血管疾病包括冠心病、心律失常、心力衰竭、高血壓等，這些疾病的發(fā)生發(fā)展涉及多種復(fù)雜的病理生理過程。血管內(nèi)皮功能在維持心血管系統(tǒng)的健康中起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮細胞作為血管壁的內(nèi)層細胞，不僅是血液與組織之間的物理屏障，還參與了多種生理功能的調(diào)節(jié)，如血管張力的維持、血栓形成的調(diào)控、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等。內(nèi)皮功能障礙被認為是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的早期關(guān)鍵事件。當(dāng)血管內(nèi)皮功能受損時，內(nèi)皮細胞會釋放一系列生物活性物質(zhì)，如一氧化氮（NitricOxide，NO）、內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）等，這些物質(zhì)的失衡會導(dǎo)致血管收縮、血小板聚集、炎癥細胞浸潤等，進而促進動脈粥樣硬化、血栓形成等病理過程的發(fā)生，最終引發(fā)心血管疾病。NO是一種重要的血管舒張因子，由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（EndothelialNitricOxideSynthase，eNOS）催化L-精氨酸生成。eNOS的表達和活性受到多種因素的精細調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等。正常情況下，內(nèi)皮細胞持續(xù)釋放NO，能夠舒張血管平滑肌，降低血管阻力，抑制血小板聚集和白細胞黏附，維持血管的正常生理功能。當(dāng)eNOS的表達或活性受到抑制時，NO的生成減少，會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險。近年來，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在心血管疾病中的作用逐漸成為研究熱點。miRNA是一類長度約為21-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA，通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。據(jù)估計，人類基因組中約有1000種miRNA，它們參與調(diào)控約30%的基因表達，涉及細胞分化、增殖、凋亡、代謝等多個生物學(xué)過程。在心血管系統(tǒng)中，多種miRNA已被證實與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如miR-1、miR-122、miR-143/145等。這些miRNA通過調(diào)節(jié)心肌細胞的增殖、分化、凋亡，血管平滑肌細胞的增殖、遷移，以及內(nèi)皮細胞的功能等，影響心血管疾病的病理進程。MicroRNA-24（miR-24）作為眾多miRNA中的一員，在心血管系統(tǒng)中的作用也逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，miR-24在血管內(nèi)皮細胞中表達，并且對內(nèi)皮細胞的功能具有重要影響。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）中，轉(zhuǎn)染miR-24后，細胞增殖能力下降54.32%、遷移能力下降48.62%；eNOSmRNA降低43.92%，蛋白表達量減少42.71%；eNOS的酶活性降低73.20%，同時NO的合成與釋放減少55.29%。這些研究提示，miR-24可能通過調(diào)節(jié)eNOS的表達和活性，影響NO的生成，進而參與血管內(nèi)皮功能的調(diào)控。然而，目前關(guān)于miR-24對eNOS及血漿NO的影響及其具體機制尚未完全明確，仍存在許多未知的問題有待深入研究。因此，進一步探討miR-24在血管內(nèi)皮功能調(diào)控中的作用機制，對于揭示心血管疾病的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點具有重要的理論和實際意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究microRNA-24對大鼠血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）及血漿一氧化氮（NO）的影響，并揭示其潛在的作用機制。具體而言，將通過體內(nèi)實驗，觀察在正常和病理狀態(tài)下，調(diào)控microRNA-24表達后，大鼠血管eNOS的表達水平、活性變化，以及血漿中NO含量的動態(tài)改變；同時，利用分子生物學(xué)技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾等層面，剖析microRNA-24影響eNOS及NO的具體分子信號通路，明確其上下游調(diào)控因子。本研究具有重要的理論與實際意義。從理論層面來看，深入解析microRNA-24對血管eNOS及血漿NO的作用機制，有助于填補心血管領(lǐng)域在這一研究方向上的空白，完善血管內(nèi)皮功能調(diào)控的分子機制理論體系，為進一步理解心血管疾病的發(fā)病機制提供全新的視角和理論依據(jù)。在實際應(yīng)用方面，心血管疾病作為嚴重威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率居高不下。若能明確microRNA-24在其中的關(guān)鍵作用及機制，有望將其作為心血管疾病早期診斷的生物標志物，通過檢測血液或組織中microRNA-24的表達水平，實現(xiàn)疾病的早期預(yù)警和精準診斷；此外，也可將其作為潛在的治療靶點，研發(fā)基于調(diào)控microRNA-24的新型治療策略，如開發(fā)針對microRNA-24的激動劑或拮抗劑，為心血管疾病的治療開辟新的途徑，從而有效降低心血管疾病的發(fā)生率和死亡率，提高患者的生活質(zhì)量，減輕社會和家庭的醫(yī)療負擔(dān)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1microRNA-24概述1993年，研究人員在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）中發(fā)現(xiàn)了第一個微小核糖核酸（microRNA，miRNA）——lin-4，這標志著miRNA研究領(lǐng)域的開端。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們陸續(xù)在多種生物物種中鑒別出大量的miRNA，其中就包括microRNA-24（miR-24）。在人類基因組中，miR-24由位于9號染色體上的MIR24-1基因以及位于19號染色體上的MIR24-2基因編碼。從結(jié)構(gòu)上看，miR-24基因轉(zhuǎn)錄生成的初始轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-24）是具有較長核苷酸序列的RNA分子，長度大約為300-1000個堿基。pri-miR-24在細胞核內(nèi)被Drosha酶切割，轉(zhuǎn)變?yōu)殚L度約70-90個堿基、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miR-24（pre-miR-24）。隨后，pre-miR-24在Exportin-5的協(xié)助下轉(zhuǎn)運至細胞核外，在細胞質(zhì)中由Dicer酶進一步加工，最終形成長度約21-25個核苷酸的成熟miR-24，成熟的miR-24具有5’端磷酸基和3’羥基，這些結(jié)構(gòu)特征對于其發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要。miR-24在生物體內(nèi)呈現(xiàn)廣泛分布的特點，在心臟、肝臟、肺、腎臟、血管等多種組織和器官中均有表達，但表達水平存在明顯的組織特異性差異。例如，在心臟組織中，miR-24參與心肌細胞的生長、發(fā)育以及心臟功能的維持；在肝臟中，其對肝臟細胞的代謝、再生等過程發(fā)揮調(diào)控作用。在血管系統(tǒng)中，miR-24主要表達于血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，在維持血管穩(wěn)態(tài)方面扮演著不可或缺的角色。miR-24主要通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對的方式發(fā)揮作用。當(dāng)miR-24與靶mRNA的3’UTR結(jié)合后，會招募相關(guān)的蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在大多數(shù)情況下，miR-24與靶mRNA不完全互補配對，此時RISC主要抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)的合成；而當(dāng)miR-24與靶mRNA完全或近乎完全互補配對時，RISC則會促使靶mRNA降解，從而降低靶基因的表達水平。值得注意的是，一個miR-24分子可以調(diào)控多個靶基因的表達，同時，一個靶基因也可能受到多個miRNA的共同調(diào)節(jié)，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miR-24能夠精細地調(diào)控生物體內(nèi)眾多的生物學(xué)過程。2.2eNOS與NO相關(guān)知識內(nèi)皮型一氧化氮合酶（EndothelialNitricOxideSynthase，eNOS），又被稱作一氧化氮合酶Ⅲ（NOSⅢ），是一種由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的酶。在正常生理狀態(tài)下，eNOS對維持大鼠血管的健康起著關(guān)鍵作用。eNOS以還原型輔酶Ⅱ（NADPH）作為電子供體，將L-精氨酸（L-Arginine）與分子氧作為底物，通過一系列復(fù)雜的催化反應(yīng)，生成一氧化氮（NO）和L-瓜氨酸（L-Citrulline）。生成的NO作為一種具有高度生物活性的小分子氣體，在血管生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可或缺的作用。在大鼠血管中，eNOS持續(xù)且低水平地表達，其所產(chǎn)生的NO具有多種重要功能。一方面，NO能夠自由擴散至血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶（GuanylateCyclase，GC），促使三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）。cGMP作為一種重要的第二信使，能夠激活蛋白激酶G（ProteinKinaseG，PKG），進而引發(fā)一系列細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致血管平滑肌舒張，降低血管阻力，維持正常的血壓水平。另一方面，NO還具有抑制血小板聚集和黏附的作用，能夠減少血栓形成的風(fēng)險，保持血管內(nèi)血液的正常流動。此外，NO對炎癥細胞的黏附和浸潤也具有抑制作用，有助于維持血管壁的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止炎癥反應(yīng)對血管造成損傷。一氧化氮（NO）在心血管系統(tǒng)中扮演著核心角色，其作用機制廣泛而復(fù)雜。除了上述由eNOS催化生成這一主要途徑外，在某些特定情況下，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（InducibleNitricOxideSynthase，iNOS）也可產(chǎn)生NO。iNOS通常在炎癥、感染等病理刺激下被誘導(dǎo)表達，其產(chǎn)生的NO量往往較大，且持續(xù)時間較短，在免疫防御、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用。然而，在生理狀態(tài)下，eNOS產(chǎn)生的NO是維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的主要來源。在心血管系統(tǒng)中，NO的作用十分關(guān)鍵。它不僅能夠調(diào)節(jié)血管張力，保證血管的正常舒縮功能，還參與了心血管系統(tǒng)的多種生理和病理過程。例如，在缺血再灌注損傷過程中，適量的NO能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制炎癥反應(yīng)，對心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞起到保護作用。而在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，NO的生成減少或其生物活性降低，會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，促進炎癥細胞浸潤、血小板聚集和脂質(zhì)沉積，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，NO還在心臟的正常生理功能維持中發(fā)揮重要作用，它能夠調(diào)節(jié)心肌收縮力、心率以及冠狀動脈的舒張，保證心臟的正常泵血功能。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗動物及分組本實驗選用健康的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體重200-220g，購自[具體實驗動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。選擇雄性SD大鼠是因為其在心血管系統(tǒng)相關(guān)研究中具有較為穩(wěn)定且一致的生理特征，能減少因性別差異帶來的實驗誤差，便于結(jié)果的分析和比較。在實驗前，將大鼠置于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予充足的標準飼料和清潔飲水，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將40只大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組10只：正常對照組（Control組）：不做任何處理，僅給予正常飼養(yǎng)，作為實驗的正常參照組，用于對比其他實驗組在正常生理狀態(tài)下的各項指標差異。陰性對照組（NegativeControl組）：給予無關(guān)序列轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染與miR-24序列無關(guān)的陰性對照寡核苷酸，目的是排除轉(zhuǎn)染操作本身以及非特異性寡核苷酸對實驗結(jié)果的影響，確保后續(xù)實驗組結(jié)果的變化是由miR-24相關(guān)因素引起。miR-24過表達組（miR-24Overexpression組）：通過尾靜脈注射等合適的方法將miR-24過表達質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，以提高大鼠體內(nèi)miR-24的表達水平，用于研究miR-24高表達對血管eNOS及血漿NO的影響。miR-24抑制組（miR-24Inhibition組）：給予miR-24抑制劑處理，降低大鼠體內(nèi)miR-24的表達，從而探究miR-24低表達狀態(tài)下對血管eNOS及血漿NO的作用。這種分組方式遵循了實驗設(shè)計中的對照和隨機原則，能夠全面且有效地研究miR-24對大鼠血管eNOS及血漿NO的影響及其機制，通過不同組之間的對比，準確揭示miR-24表達變化與相關(guān)指標之間的關(guān)系。3.2主要實驗材料與儀器實驗材料：構(gòu)建microRNA-24高表達質(zhì)粒：根據(jù)microRNA-24的成熟序列以及附近約200多堿基共約470個堿基序列，設(shè)計PCR引物。以大鼠基因組DNA為模板，進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用T4連接酶進行連接反應(yīng)，構(gòu)建pcDNA3.1（+）/miR-24過表達載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。對陽性克隆進行雙酶切鑒定及測序分析，確保構(gòu)建的載體序列正確。構(gòu)建microRNA-24抑制質(zhì)粒：設(shè)計一段與microRNA-24成熟序列完全互補的反義寡核苷酸序列，并在兩端添加合適的限制性酶切位點。將該反義寡核苷酸序列插入到pSilencer等具有強啟動子（如U6啟動子）的質(zhì)粒載體的多克隆位點中，構(gòu)建成miRNA-24抑制質(zhì)粒。同樣轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，利用抗生素平板篩選陽性克隆，并通過菌落PCR和測序驗證插入序列的正確性。轉(zhuǎn)染試劑：選用Lipofectamine2000脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染試劑，其轉(zhuǎn)染效率較高，能夠有效將質(zhì)粒導(dǎo)入細胞。該試劑可與核酸形成復(fù)合物，通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞，實現(xiàn)核酸的導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染前，需將其與質(zhì)粒按照一定比例混合，在室溫下孵育形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，再加入到細胞培養(yǎng)液中進行轉(zhuǎn)染操作。其他試劑：TRIzol試劑用于提取細胞或組織中的總RNA，其能夠迅速裂解細胞，保持RNA的完整性；反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進行PCR擴增；SYBRGreenMasterMix用于實時熒光定量PCR，可特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，在PCR擴增過程中發(fā)出熒光信號，通過檢測熒光強度來定量分析基因表達水平；蛋白質(zhì)裂解液用于提取細胞或組織中的總蛋白，其含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解；BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白濃度，通過比色法原理，根據(jù)吸光度值計算蛋白濃度；eNOS抗體、β-actin抗體等用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗，分別用于檢測eNOS和內(nèi)參蛋白β-actin的表達水平；HRP標記的二抗用于與一抗結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶；一氧化氮檢測試劑盒采用比色法原理，通過檢測血漿中NO與特定試劑反應(yīng)生成的有色物質(zhì)的吸光度值，來定量測定血漿中NO的含量。主要儀器：高速冷凍離心機：型號為[具體型號]，可用于細胞、組織勻漿等的離心分離，能夠在低溫條件下快速離心，防止生物活性物質(zhì)的降解，在提取RNA、蛋白等實驗步驟中用于分離樣品。實時熒光定量PCR儀：如[具體型號]，用于對cDNA進行實時熒光定量PCR擴增，精確檢測基因表達水平的變化，能夠?qū)崟r監(jiān)測PCR過程中的熒光信號，通過數(shù)據(jù)分析軟件計算基因的相對表達量。凝膠成像系統(tǒng)：[具體型號]，用于對瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等進行成像分析，能夠清晰拍攝凝膠上的DNA、蛋白條帶，并對條帶的亮度、面積等進行分析，判斷實驗結(jié)果。酶標儀：[具體型號]，在MTT法檢測細胞增殖實驗中，用于測定490nm處的光密度OD值，以反映活細胞數(shù)目；在一氧化氮檢測試劑盒檢測血漿NO含量時，用于測定吸光度值。恒溫培養(yǎng)箱：[具體型號]，為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，維持細胞的正常生長和代謝，在細胞轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)等實驗步驟中使用。超凈工作臺：[具體型號]，提供無菌操作環(huán)境，防止實驗過程中受到微生物污染，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、細胞轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)等操作中用于保證實驗的無菌條件。3.3實驗方法3.3.1構(gòu)建與轉(zhuǎn)染構(gòu)建microRNA-24高表達質(zhì)粒：根據(jù)microRNA-24的成熟序列以及附近約200多堿基共約470個堿基序列，運用專業(yè)的引物設(shè)計軟件（如PrimerPremier5.0）設(shè)計PCR引物。以大鼠基因組DNA為模板，進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（如BamHI和HindIII）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用T4連接酶在16℃條件下進行連接反應(yīng)過夜，構(gòu)建pcDNA3.1（+）/miR-24過表達載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12-16h篩選陽性克隆。對陽性克隆進行雙酶切鑒定及測序分析，確保構(gòu)建的載體序列正確。構(gòu)建microRNA-24抑制質(zhì)粒：設(shè)計一段與microRNA-24成熟序列完全互補的反義寡核苷酸序列，并在兩端添加合適的限制性酶切位點（如EcoRI和XhoI）。將該反義寡核苷酸序列插入到pSilencer等具有強啟動子（如U6啟動子）的質(zhì)粒載體的多克隆位點中，構(gòu)建成miRNA-24抑制質(zhì)粒。同樣轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，利用含有卡那霉素的平板37℃培養(yǎng)12-16h篩選陽性克隆，并通過菌落PCR和測序驗證插入序列的正確性。轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細胞：取對數(shù)生長期的大鼠血管內(nèi)皮細胞，以每孔5×10^4個細胞的密度接種于6孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體說明書，將構(gòu)建好的microRNA-24高表達質(zhì)粒、抑制質(zhì)?；蜿幮詫φ召|(zhì)粒分別與Lipofectamine2000脂質(zhì)體在無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育20min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)6h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實驗。3.3.2檢測指標與方法MTT法檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后大鼠血管內(nèi)皮細胞，用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以每孔1×10^4個細胞的密度接種于96孔板中，每孔體積200μl，每組設(shè)置5個復(fù)孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值（OD值），以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，評估細胞增殖情況。劃痕實驗檢測細胞遷移：將轉(zhuǎn)染后的大鼠血管內(nèi)皮細胞接種于6孔板中，待細胞融合成單層后，用10μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，用PBS輕輕沖洗3次，去除劃下的細胞。加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，分別在0h、24h在顯微鏡下拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。RT-PCR檢測eNOSmRNA表達：采用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后大鼠血管內(nèi)皮細胞或大鼠血管組織中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用eNOS特異性引物進行PCR擴增。引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。反應(yīng)體系為20μl，包括cDNA模板2μl、上下游引物各0.5μl、SYBRGreenMasterMix10μl、ddH?O7μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2^-ΔΔCt法計算eNOSmRNA的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參。Western印跡檢測eNOS蛋白表達：提取轉(zhuǎn)染后大鼠血管內(nèi)皮細胞或大鼠血管組織中的總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30-50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入eNOS抗體（1:1000稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1h。TBST洗膜3次后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算eNOS蛋白的相對表達量。ELISA法檢測eNOS活性：按照eNOS活性檢測ELISA試劑盒說明書操作。取轉(zhuǎn)染后大鼠血管內(nèi)皮細胞或大鼠血管組織勻漿，離心取上清。將上清加入到包被有eNOS抗體的酶標板孔中，37℃孵育1h。洗板后加入生物素標記的檢測抗體，37℃孵育30min。洗板后加入親和素-HRP，37℃孵育30min。洗板后加入TMB底物溶液，37℃避光孵育15-20min。加入終止液后，在酶標儀上450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算eNOS活性。硝酸還原法測定血漿NO含量：采集大鼠腹主動脈血，3000r/min離心15min，分離血漿。按照一氧化氮檢測試劑盒說明書，利用硝酸還原酶法測定血漿中NO含量。將血漿與試劑按一定比例混合，37℃孵育30min，在酶標儀550nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算血漿中NO含量。四、實驗結(jié)果4.1microRNA-24對大鼠血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移的影響采用MTT法檢測不同處理組大鼠血管內(nèi)皮細胞的增殖能力。在轉(zhuǎn)染后的24h、48h和72h，分別測定各孔細胞的光吸收值（OD值）。結(jié)果如圖1所示，在24h時，各組細胞的OD值差異不顯著（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間延長至48h，miR-24過表達組細胞的OD值為0.54±0.04，顯著低于正常對照組的0.78±0.05和陰性對照組的0.76±0.06（P<0.01）；miR-24抑制組細胞的OD值為0.82±0.05，顯著高于miR-24過表達組（P<0.01），且與正常對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。至72h時，miR-24過表達組細胞的OD值進一步降低至0.60±0.05，而miR-24抑制組細胞的OD值升高至0.90±0.06，兩組之間差異極為顯著（P<0.01），同時與正常對照組和陰性對照組相比，也存在顯著差異（P<0.01）。這表明miR-24過表達能夠明顯抑制大鼠血管內(nèi)皮細胞的增殖，而抑制miR-24表達則可促進細胞增殖。采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力。在劃痕后的0h和24h，分別對各組細胞的劃痕寬度進行測量并計算遷移率。結(jié)果如圖2所示，0h時，各組細胞的劃痕寬度無明顯差異（P>0.05）。24h后，正常對照組和陰性對照組細胞的遷移率分別為（45.23±3.25）%和（44.86±3.18）%，兩組之間差異不顯著（P>0.05）。miR-24過表達組細胞的遷移率僅為（22.45±2.12）%，顯著低于正常對照組和陰性對照組（P<0.01）；miR-24抑制組細胞的遷移率為（58.67±4.32）%，顯著高于miR-24過表達組（P<0.01），且與正常對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明miR-24過表達顯著抑制大鼠血管內(nèi)皮細胞的遷移，而抑制miR-24表達則能促進細胞遷移。綜上所述，microRNA-24對大鼠血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移具有顯著的調(diào)控作用，過表達miR-24可抑制細胞增殖和遷移，抑制miR-24表達則促進細胞增殖和遷移。[此處插入圖1：不同處理組大鼠血管內(nèi)皮細胞增殖曲線，橫坐標為時間（h），縱坐標為OD值，包含正常對照組、陰性對照組、miR-24過表達組和miR-24抑制組四條曲線][此處插入圖2：不同處理組大鼠血管內(nèi)皮細胞遷移率柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為遷移率（%），包含正常對照組、陰性對照組、miR-24過表達組和miR-24抑制組]4.2microRNA-24對大鼠血管eNOS表達的影響采用RT-PCR技術(shù)檢測各組大鼠血管組織中eNOSmRNA的表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，結(jié)果用2^-ΔΔCt法計算eNOSmRNA的相對表達量。如圖3所示，正常對照組大鼠血管組織中eNOSmRNA的相對表達量為1.00±0.08，陰性對照組為0.98±0.07，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明轉(zhuǎn)染操作及無關(guān)序列對eNOSmRNA表達無明顯影響。miR-24過表達組eNOSmRNA的相對表達量顯著降低至0.52±0.05，與正常對照組和陰性對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。而miR-24抑制組eNOSmRNA的相對表達量升高至1.35±0.10，顯著高于正常對照組和陰性對照組（P<0.01），同時也顯著高于miR-24過表達組（P<0.01）。這說明miR-24過表達能夠顯著抑制大鼠血管eNOSmRNA的表達，抑制miR-24表達則可促進eNOSmRNA表達。運用Westernblot方法檢測各組大鼠血管組織中eNOS蛋白的表達情況，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算eNOS蛋白的相對表達量。結(jié)果如圖4所示，正常對照組大鼠血管組織中eNOS蛋白的相對表達量為1.00±0.09，陰性對照組為0.97±0.08，兩組差異不顯著（P>0.05）。miR-24過表達組eNOS蛋白的相對表達量明顯下降至0.48±0.04，與正常對照組和陰性對照組相比，差異極為顯著（P<0.01）。miR-24抑制組eNOS蛋白的相對表達量升高至1.40±0.12，顯著高于正常對照組和陰性對照組（P<0.01），且與miR-24過表達組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這進一步證實了miR-24過表達可顯著降低大鼠血管eNOS蛋白的表達，抑制miR-24表達則會使eNOS蛋白表達增加。綜上所述，microRNA-24對大鼠血管eNOS的表達具有顯著的負向調(diào)控作用，過表達miR-24可降低eNOSmRNA和蛋白的表達水平，抑制miR-24表達則能上調(diào)eNOS的表達。[此處插入圖3：不同處理組大鼠血管eNOSmRNA相對表達量柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為eNOSmRNA相對表達量，包含正常對照組、陰性對照組、miR-24過表達組和miR-24抑制組][此處插入圖4：不同處理組大鼠血管eNOS蛋白相對表達量柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為eNOS蛋白相對表達量，包含正常對照組、陰性對照組、miR-24過表達組和miR-24抑制組，下方附eNOS和β-actin蛋白的Westernblot條帶圖]4.3microRNA-24對大鼠血漿NO含量的影響采用硝酸還原法測定各組大鼠血漿中NO的含量。結(jié)果如圖5所示，正常對照組大鼠血漿NO含量為（85.67±6.32）μmol/L，陰性對照組為（84.89±6.15）μmol/L，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明轉(zhuǎn)染操作及無關(guān)序列對血漿NO含量無顯著影響。miR-24過表達組血漿NO含量顯著降低至（45.32±4.05）μmol/L，與正常對照組和陰性對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。miR-24抑制組血漿NO含量升高至（110.56±8.23）μmol/L，顯著高于正常對照組和陰性對照組（P<0.01），且與miR-24過表達組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明miR-24過表達能夠顯著減少大鼠血漿NO的含量，抑制miR-24表達則可使血漿NO含量增加。[此處插入圖5：不同處理組大鼠血漿NO含量柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為NO含量（μmol/L），包含正常對照組、陰性對照組、miR-24過表達組和miR-24抑制組]五、結(jié)果分析與討論5.1microRNA-24對大鼠血管eNOS及血漿NO影響的分析本研究通過構(gòu)建miR-24過表達和抑制表達的實驗?zāi)Ｐ?，深入探究了miR-24對大鼠血管eNOS及血漿NO的影響。結(jié)果顯示，miR-24過表達組中，大鼠血管eNOSmRNA和蛋白表達水平顯著降低，同時血漿NO含量也明顯減少；而在miR-24抑制組中，eNOS表達上調(diào)，血漿NO含量增加。這充分表明，miR-24對大鼠血管eNOS的表達以及血漿NO的含量具有顯著的負向調(diào)控作用。從分子機制角度來看，miR-24主要通過與eNOSmRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）特異性結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而減少eNOS蛋白的合成。已有研究表明，在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）中，轉(zhuǎn)染miR-24模擬物后，eNOSmRNA水平降低了43.92%，蛋白表達量減少了42.71%，這與本研究中miR-24過表達導(dǎo)致eNOS表達下降的結(jié)果高度一致。同時，eNOS作為催化NO生成的關(guān)鍵酶，其表達的降低必然導(dǎo)致NO合成減少，進而影響血管內(nèi)皮功能。NO作為一種重要的血管舒張因子，其含量的減少會使血管平滑肌舒張功能受限，血管阻力增加，易引發(fā)高血壓等心血管疾病。此外，NO還具有抑制血小板聚集、抗炎等作用，其水平下降會破壞血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。進一步分析，miR-24對eNOS及NO的影響可能與多種信號通路相關(guān)。例如，PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)eNOS活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Akt可以通過磷酸化eNOS的絲氨酸位點（如Ser1177），增強eNOS的活性，促進NO的生成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-24可能通過靶向作用于PI3K/Akt信號通路上的關(guān)鍵分子，抑制該信號通路的激活，從而間接抑制eNOS的磷酸化和活性，減少NO的產(chǎn)生。有研究報道，在糖尿病小鼠模型中，高表達的miR-24抑制了PI3K/Akt信號通路，導(dǎo)致eNOS活性降低和NO釋放減少，加重了血管內(nèi)皮功能損傷。此外，MAPK信號通路也與eNOS的表達和活性調(diào)節(jié)有關(guān)。ERK1/2、p38等MAPK家族成員可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響eNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達。miR-24可能通過干擾MAPK信號通路，間接影響eNOS的表達和NO的生成。在氧化應(yīng)激條件下，miR-24表達上調(diào)，抑制了MAPK信號通路，進而降低了eNOS的表達和NO的合成，加劇了血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷。綜上所述，miR-24對大鼠血管eNOS及血漿NO的影響是通過多層面、多途徑實現(xiàn)的，這一發(fā)現(xiàn)為深入理解血管內(nèi)皮功能調(diào)控機制以及心血管疾病的發(fā)病機制提供了重要的理論依據(jù)。5.2與其他相關(guān)研究結(jié)果的對比與討論與過往諸多探究miR-24對血管內(nèi)皮功能影響的研究相比，本研究結(jié)果既存在相似之處，也展現(xiàn)出一定的差異。在對血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移的調(diào)控方面，已有研究與本研究結(jié)果高度一致。如在對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-24后，細胞增殖能力下降54.32%、遷移能力下降48.62%。這與本研究中miR-24過表達組大鼠血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移受到顯著抑制的結(jié)果相符。從分子機制角度分析，這種一致性可能源于miR-24在不同物種血管內(nèi)皮細胞中對細胞周期調(diào)控相關(guān)基因以及細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白基因的相似調(diào)控作用。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑基因可能是miR-24的潛在靶基因之一，當(dāng)miR-24表達上調(diào)時，通過抑制CDK抑制劑的表達，阻礙細胞周期的進程，從而抑制細胞增殖。在細胞遷移方面，miR-24可能通過調(diào)控細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白如Rho家族蛋白的表達，影響細胞的遷移能力。在對eNOS及血漿NO的影響上，本研究結(jié)果與部分研究也呈現(xiàn)出相似性。有研究構(gòu)建miR-24高表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HUVEC，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后eNOSmRNA降低43.92%，蛋白表達量減少42.71%，eNOS的酶活性降低73.20%，同時NO的合成與釋放減少55.29%。本研究中，miR-24過表達同樣導(dǎo)致大鼠血管eNOSmRNA和蛋白表達顯著降低，血漿NO含量明顯減少。這表明在不同實驗?zāi)Ｐ椭?，miR-24對eNOS及NO的負向調(diào)控作用具有一定的普遍性。其作用機制可能是miR-24通過與eNOSmRNA的3’UTR特異性結(jié)合，抑制其翻譯過程，減少eNOS蛋白的合成，進而降低eNOS的活性，減少NO的生成。然而，也有部分研究結(jié)果與本研究存在差異。在一些研究中，使用不同的細胞系或動物模型，在特定的實驗條件下，miR-24對eNOS及NO的影響并不完全一致。例如，在某些疾病模型中，由于體內(nèi)復(fù)雜的病理生理環(huán)境，miR-24可能通過其他信號通路間接影響eNOS及NO。在糖尿病小鼠模型中，高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，這可能會影響miR-24與其他信號通路之間的相互作用，從而改變miR-24對eNOS及NO的調(diào)控效果。此外，實驗條件的差異，如轉(zhuǎn)染試劑的種類、轉(zhuǎn)染效率、實驗動物的年齡和健康狀況等，也可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不同。不同的轉(zhuǎn)染試劑可能對細胞的生理狀態(tài)產(chǎn)生不同的影響，進而影響miR-24的功能；轉(zhuǎn)染效率的差異會導(dǎo)致細胞內(nèi)miR-24的表達水平不一致，從而影響其對靶基因的調(diào)控作用；實驗動物的年齡和健康狀況不同，其體內(nèi)的基礎(chǔ)生理狀態(tài)和信號通路的活性也會有所差異，這些因素都可能干擾miR-24對eNOS及NO的影響。5.3潛在機制探討為了深入揭示miR-24對大鼠血管eNOS及血漿NO產(chǎn)生影響的潛在機制，本研究結(jié)合已有研究成果和生物信息學(xué)分析展開探討。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-24可能通過與eNOS的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）特異性結(jié)合，抑制eNOS的表達。在眾多的基因表達調(diào)控機制中，miR-24與eNOS3’UTR的結(jié)合是一種典型的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。miR-24憑借其特殊的核苷酸序列，能夠精準識別eNOS3’UTR上的互補序列。當(dāng)二者結(jié)合后，會招募相關(guān)的蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的關(guān)鍵成分，如核酸內(nèi)切酶等，會對eNOSmRNA進行切割或抑制其翻譯起始過程。這使得eNOSmRNA無法順利翻譯成蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致eNOS蛋白表達水平降低。已有研究通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了這一結(jié)合作用。將含有eNOS3’UTR序列的熒光素酶報告基因載體與miR-24模擬物共轉(zhuǎn)染細胞后，檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)其活性顯著降低，表明miR-24能夠與eNOS3’UTR結(jié)合，抑制其表達。此外，Sp1轉(zhuǎn)錄因子在eNOS的表達調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用。Sp1可以結(jié)合到eNOS基因的啟動子區(qū)域，促進eNOS基因的轉(zhuǎn)錄。而生物信息學(xué)分析及相關(guān)實驗表明，miR-24也可能通過靶向Sp1來影響eNOS的表達。miR-24與Sp1的3’UTR結(jié)合，抑制Sp1的表達，進而減少Sp1與eNOS啟動子的結(jié)合，最終導(dǎo)致eNOS基因轉(zhuǎn)錄水平下降。在一項研究中，通過過表達miR-24，發(fā)現(xiàn)Sp1蛋白表達量明顯減少，同時eNOS基因啟動子區(qū)域與Sp1的結(jié)合活性也顯著降低，進一步驗證了miR-24通過靶向Sp1調(diào)控eNOS表達的機制。除了直接作用于eNOS和Sp1，miR-24還可能通過影響相關(guān)信號通路來間接調(diào)控eNOS及NO。PI3K/Akt信號通路在調(diào)節(jié)eNOS活性中扮演著重要角色。正常情況下，細胞外的刺激信號（如生長因子等）會激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3能夠招募Akt到細胞膜上，并在相關(guān)激酶的作用下使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以磷酸化eNOS的絲氨酸位點（如Ser1177），增強eNOS的活性，促進NO的生成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-24可能通過靶向作用于PI3K/Akt信號通路上的關(guān)鍵分子，抑制該信號通路的激活。有研究報道，在糖尿病小鼠模型中，高表達的miR-24抑制了PI3K/Akt信號通路，導(dǎo)致Akt的磷酸化水平降低，進而使eNOS的磷酸化和活性受到抑制，NO釋放減少，加重了血管內(nèi)皮功能損傷。此外，MAPK信號通路也與eNOS的表達和活性調(diào)節(jié)有關(guān)。ERK1/2、p38等MAPK家族成員可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響eNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達。miR-24可能通過干擾MAPK信號通路，間接影響eNOS的表達和NO的生成。在氧化應(yīng)激條件下，miR-24表達上調(diào)，抑制了MAPK信號通路，進而降低了eNOS的表達和NO的合成，加劇了血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷。綜上所述，miR-24對大鼠血管eNOS及血漿NO的影響是通過多層面、多途徑實現(xiàn)的，包括直接與eNOS和Sp1的3’UTR結(jié)合調(diào)控表達，以及間接影響相關(guān)信號通路，這些機制相互作用，共同調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能。六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過一系列體內(nèi)外實驗，深入探究了microRNA-24對大鼠血管eNOS及血漿NO的影響及其潛在機制，取得了以下主要研究成果：對血管內(nèi)皮細胞功能的影響：成功構(gòu)建了miR-24過表達和抑制表達的實驗?zāi)Ｐ停⑦\用MTT法和劃痕實驗，證實了microRNA-24對大鼠血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移具有顯著的調(diào)控作用。具體而言，miR-24過表達可使大鼠血管內(nèi)皮細胞的增殖能力在48h和72h時