miR-365/BAX軸調(diào)控機(jī)制：皮膚鱗狀細(xì)胞癌凋亡與發(fā)展的關(guān)鍵紐帶一、引言1.1研究背景與意義皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CutaneousSquamousCellCarcinoma，CSCC）是一種起源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的常見惡性腫瘤，在非黑色素瘤皮膚癌中占據(jù)重要地位。近年來，隨著環(huán)境變化、人口老齡化以及紫外線暴露增加等因素影響，CSCC的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著上升趨勢，對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了日益嚴(yán)重的威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在歐美等發(fā)達(dá)國家，CSCC的發(fā)病率以每年3%-8%的速度遞增，而在我國，雖然總體發(fā)病率低于西方國家，但隨著生活方式的改變和皮膚癌篩查意識的提高，CSCC的確診病例數(shù)也在逐漸增多。CSCC好發(fā)于頭頸部、四肢等暴露部位，早期癥狀可能僅表現(xiàn)為皮膚表面的紅斑、鱗屑或小結(jié)節(jié)，容易被忽視。然而，若病情未得到及時(shí)控制，腫瘤細(xì)胞可迅速增殖并侵犯周圍組織，導(dǎo)致局部組織破壞、潰瘍形成，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。更為嚴(yán)峻的是，CSCC具有較高的轉(zhuǎn)移潛能，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如轉(zhuǎn)移至肺、肝、骨等重要臟器，患者的5年生存率將大幅下降，預(yù)后極差。盡管目前臨床上針對CSCC已經(jīng)開展了手術(shù)切除、放療、化療以及免疫治療等多種治療手段，但對于中晚期患者，治療效果仍不盡人意，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題依然是制約患者生存和康復(fù)的關(guān)鍵因素。深入探究CSCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，已成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的迫切需求。在眾多參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）逐漸成為研究熱點(diǎn)。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-365作為miRNA家族的重要成員之一，在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、預(yù)后等密切相關(guān)。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，已有研究證實(shí)miR-365呈高表達(dá)狀態(tài)，且其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)密切相關(guān)，提示miR-365可能作為一種促癌基因參與CSCC的發(fā)生發(fā)展過程。然而，目前關(guān)于miR-365在CSCC中發(fā)揮促癌作用的具體分子機(jī)制尚未完全明確。BAX基因是BCL-2家族中的重要促凋亡成員，其編碼的BAX蛋白能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究表明，多種miRNA可通過靶向調(diào)控BAX基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。在CSCC中，BAX基因的表達(dá)水平明顯下調(diào)，且其低表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。然而，miR-365是否通過靶向調(diào)控BAX基因的表達(dá)，進(jìn)而影響CSCC細(xì)胞的凋亡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究聚焦于miR-365對BAX基因的靶向調(diào)控作用及其在CSCC發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來看，深入揭示miR-365與BAX之間的調(diào)控關(guān)系，將有助于進(jìn)一步完善CSCC的發(fā)病機(jī)制理論體系，為腫瘤分子生物學(xué)研究提供新的思路和方向。從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，明確miR-365和BAX作為CSCC潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的可行性，將為CSCC的早期診斷、精準(zhǔn)治療以及預(yù)后評估提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持，有望推動CSCC臨床診療水平的顯著提升，改善患者的生存預(yù)后。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入揭示miR-365通過靶向下調(diào)BAX抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。具體而言，將通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，明確miR-365與BAX在CSCC細(xì)胞系和組織樣本中的表達(dá)差異及其相關(guān)性；運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)手段，驗(yàn)證miR-365對BAX基因的直接靶向調(diào)控作用；借助細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等功能實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)闡述miR-365靶向下調(diào)BAX對CSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，從動物水平驗(yàn)證miR-365/BAX軸在CSCC發(fā)生發(fā)展中的作用，為CSCC的早期診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是首次聚焦于miR-365與BAX之間的靶向調(diào)控關(guān)系在CSCC中的研究，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一方向的空白，為深入理解CSCC的發(fā)病機(jī)制提供了全新的視角；二是從分子、細(xì)胞和動物整體等多個層面系統(tǒng)研究miR-365/BAX軸對CSCC細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)展的影響，使研究結(jié)果更具說服力和完整性；三是有望為CSCC的臨床診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，為開發(fā)針對CSCC的精準(zhǔn)治療策略奠定理論基礎(chǔ)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，miRNA在腫瘤中的作用成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌領(lǐng)域，關(guān)于miR-365和BAX的研究也取得了一定的進(jìn)展，但仍存在諸多有待進(jìn)一步探索的空間。國外在miR-365與腫瘤關(guān)系的研究起步較早，一些研究團(tuán)隊(duì)通過高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中檢測到miR-365的異常表達(dá)。例如，在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-365表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，通過調(diào)控相關(guān)信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在前列腺癌研究中，證實(shí)miR-365可通過靶向特定基因影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和耐藥性。然而，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，miR-365的研究相對較少，僅有部分研究報(bào)道了其在CSCC細(xì)胞系和組織中的高表達(dá)現(xiàn)象，以及對細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，但對于miR-365在CSCC發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子調(diào)控機(jī)制，尤其是其與下游靶基因的相互作用關(guān)系，尚未進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。國內(nèi)在皮膚鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)研究方面也投入了大量精力，在miR-365的研究上取得了一些成果。有研究團(tuán)隊(duì)通過紫外線照射正常人皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCaT，分析miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-365是對紫外線B輻射最敏感的miRNA之一，且在皮膚鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞，進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)表明抑制miR-365表達(dá)可顯著抑制CSCC細(xì)胞的克隆形成和體外遷移能力，過表達(dá)miR-365則促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，初步揭示了miR-365在CSCC發(fā)生發(fā)展中的促癌作用。但整體而言，國內(nèi)對于miR-365在CSCC中作用機(jī)制的研究仍不夠全面和深入，特別是在其與關(guān)鍵凋亡調(diào)控基因BAX之間的關(guān)系研究方面，尚處于探索階段。關(guān)于BAX基因在腫瘤中的研究，國內(nèi)外均有大量報(bào)道。BAX作為BCL-2家族中的促凋亡成員，其在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵作用已得到廣泛認(rèn)可。在多種腫瘤，如肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等研究中發(fā)現(xiàn)，BAX基因的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡受阻，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，已有研究證實(shí)BAX在CSCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低，且其低表達(dá)與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，提示BAX可能作為一種抑癌基因參與CSCC的發(fā)生發(fā)展過程。然而，目前關(guān)于BAX在CSCC中表達(dá)下調(diào)的具體分子機(jī)制尚未完全明確，是否受到miR-365等miRNA的靶向調(diào)控，仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。綜上所述，盡管國內(nèi)外在miR-365、BAX及二者與皮膚鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多不足之處。目前對于miR-365在CSCC中的作用機(jī)制研究不夠深入，尤其是其與BAX之間的靶向調(diào)控關(guān)系及對CSCC細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，尚未見系統(tǒng)報(bào)道。深入開展這方面的研究，對于揭示CSCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。二、皮膚鱗狀細(xì)胞癌及相關(guān)分子概述2.1皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡介皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CutaneousSquamousCellCarcinoma，CSCC）是一種起源于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤，在非黑色素瘤皮膚癌中占據(jù)重要地位。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素。長期紫外線（UV）暴露是CSCC發(fā)生的主要環(huán)境危險(xiǎn)因素，尤其是UVB（280-320nm）可誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞DNA損傷，導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞異常增殖。慢性皮膚炎癥也是重要誘因，炎癥微環(huán)境中產(chǎn)生的細(xì)胞因子和活性氧等物質(zhì)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲。免疫抑制狀態(tài)，如器官移植后長期使用免疫抑制劑、HIV感染導(dǎo)致的免疫功能低下等，會使機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視能力下降，增加CSCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，某些化學(xué)物質(zhì)（如砷、多環(huán)芳烴等）的接觸、遺傳因素（如遺傳性皮膚病患者）等也與CSCC的發(fā)生相關(guān)。CSCC在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢，尤其在白種人群中更為常見，且男性發(fā)病率高于女性。在我國，隨著人口老齡化和環(huán)境變化，CSCC的發(fā)病率也逐漸增加。其好發(fā)于頭頸部、四肢等暴露部位，這些部位長期受到紫外線照射，使得腫瘤細(xì)胞更易在此處發(fā)生異常增殖。早期CSCC的癥狀缺乏特異性，常表現(xiàn)為皮膚表面的紅斑、鱗屑、丘疹或小結(jié)節(jié)，容易被誤診為其他良性皮膚病。隨著病情進(jìn)展，腫瘤逐漸增大，可形成潰瘍、菜花狀腫物，伴有疼痛、出血、感染等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。若腫瘤侵犯周圍神經(jīng)，還可導(dǎo)致局部感覺異常或疼痛加?。磺址噶馨凸芑蜓埽瑒t可能引發(fā)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肺、肝、骨等部位的轉(zhuǎn)移，極大地增加了治療難度和患者的死亡率。目前，臨床上對于CSCC的診斷主要依靠組織病理學(xué)檢查。通過手術(shù)切除或穿刺活檢獲取病變組織，制作病理切片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分化程度等特征，以明確診斷。免疫組化技術(shù)也常用于輔助診斷，通過檢測腫瘤組織中特定標(biāo)志物的表達(dá)，如細(xì)胞角蛋白、p53蛋白等，有助于進(jìn)一步確定腫瘤的性質(zhì)和分化程度。此外，影像學(xué)檢查如超聲、CT、MRI等可用于評估腫瘤的大小、位置、侵犯范圍以及是否存在轉(zhuǎn)移等情況，為臨床治療方案的制定提供重要依據(jù)。針對CSCC的治療，需根據(jù)腫瘤的分期、患者的身體狀況等因素綜合選擇合適的治療方法。手術(shù)切除是早期CSCC的主要治療手段，包括Mohs顯微外科手術(shù)、廣泛切除手術(shù)等，通過徹底切除腫瘤組織，可達(dá)到根治的目的。對于不能手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，放療是一種重要的治療選擇，利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，控制腫瘤生長?；焺t主要用于晚期或轉(zhuǎn)移性CSCC患者，通過使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，常用的化療藥物有順鉑、5-氟尿嘧啶等。近年來，免疫治療和靶向治療作為新興的治療方法，在CSCC的治療中取得了一定的進(jìn)展。免疫治療通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，如PD-1抑制劑等；靶向治療則針對腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，如EGFR抑制劑等，這些治療方法為CSCC患者帶來了新的希望，但目前仍存在治療效果個體差異大、耐藥性等問題，有待進(jìn)一步研究和解決。2.2miR-365概述miR-365是微小核糖核酸（microRNA，miRNA）家族中的重要成員，其成熟體是通過兩種前體has-mir-365-1和has-mir-365-2剪切而成，其中has-mir-365-1位于16p13.12，has-mir-365-2位于17q11.2。miR-365的長度約為22個核苷酸，具有高度保守的序列結(jié)構(gòu)，這種保守性在不同物種間維持了其生物學(xué)功能的穩(wěn)定性，暗示其在生命活動中具有重要作用。在多種腫瘤中，miR-365呈現(xiàn)出異常表達(dá)，但其表達(dá)模式在不同腫瘤類型中存在顯著差異。在乳腺癌研究中，通過Microarray分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)性乳腺癌中miR-365的表達(dá)差異量上調(diào)2.56倍，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其潛在的靶基因包括RAS癌基因家族，如RAB1B和RAN22A，以及泛素特異性肽酶33（USP33）等，提示miR-365在原發(fā)性乳腺癌中可能作為癌基因，通過調(diào)控這些靶基因來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在胰腺癌研究中，通過收集胰腺癌組織及正常胰腺組織樣本，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)miR-365在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)密切相關(guān)，進(jìn)一步機(jī)制研究表明miR-365可能通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響細(xì)胞周期、凋亡和遷移等信號通路，從而促進(jìn)胰腺癌的惡性進(jìn)展。然而，在部分腫瘤中，miR-365卻發(fā)揮著抑癌基因的作用。在結(jié)腸癌研究中，發(fā)現(xiàn)miR-365在人類結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)與癌癥發(fā)展和治療后癌癥病人較差的預(yù)后存活率密切相關(guān)。功能研究實(shí)驗(yàn)表明，修復(fù)miR-365的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，提高5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制結(jié)腸腫瘤發(fā)生。通過生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-365靶基因，發(fā)現(xiàn)其抗瘤功能可能是通過靶向抑制CyclinD1和Bcl-2表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，表明miR-365在結(jié)腸癌細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因作用。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）中，miR-365的研究相對較少，但已有研究證實(shí)其呈高表達(dá)狀態(tài)。南方醫(yī)科大學(xué)的研究人員通過對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和臨床標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-365在其中呈過表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-365的HaCaTpre-miR-365-2細(xì)胞系可以誘導(dǎo)形成皮下腫瘤，而利用抗miR-365寡核苷酸Antagomir-365，則可抑制體內(nèi)皮膚腫瘤形成，誘導(dǎo)癌細(xì)胞G期阻滯和凋亡，這表明miR-365在CSCC中可能充當(dāng)了一種促癌基因，通過調(diào)控相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，從而推動CSCC的發(fā)生發(fā)展。但目前關(guān)于miR-365在CSCC中發(fā)揮促癌作用的具體分子機(jī)制，尤其是其與下游靶基因的相互作用關(guān)系，尚未完全明確，仍有待深入研究。2.3BAX蛋白概述BAX蛋白是BCL-2家族中的重要成員，屬于促凋亡蛋白。BCL-2家族包含眾多成員，根據(jù)其功能可分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如BAX、BAK等），它們在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，維持著細(xì)胞內(nèi)凋亡平衡。BAX蛋白由192個氨基酸殘基組成，分子量約為21kDa，其結(jié)構(gòu)主要包含BH1、BH2、BH3、BH4四個保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域由九個α-螺旋組成，其中一個疏水的α-螺旋核心被兩性螺旋包圍，一個跨膜的C端α-螺旋固定在線粒體外膜上，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了BAX蛋白在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。在正常生理狀態(tài)下，BAX主要以潛在單體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子剝奪等，細(xì)胞內(nèi)的信號通路被激活，BH3-only蛋白被活化并與BAX結(jié)合，從而誘導(dǎo)BAX發(fā)生構(gòu)象變化，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上。在線粒體膜上，BAX與線粒體膜上的一些孔蛋白相互作用，形成多聚體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)線粒體的通透性。線粒體通透性的改變導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，活化的caspase-9又進(jìn)一步激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，如caspase-3、caspase-6、caspase-7等，這些效應(yīng)caspase切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，BAX還可通過與抗凋亡蛋白Bcl-2形成異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比率是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”，當(dāng)Bax同源二聚體占主導(dǎo)時(shí)，在適當(dāng)信號誘導(dǎo)下細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，BAX蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。大量研究表明，BAX基因的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中，BAX的表達(dá)水平明顯下調(diào)。例如，在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中BAX的表達(dá)水平顯著低于正常肺組織，且其低表達(dá)與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后相關(guān)，低表達(dá)的BAX使得腫瘤細(xì)胞凋亡受阻，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌研究中，同樣觀察到BAX在腫瘤組織中的低表達(dá)現(xiàn)象，且BAX表達(dá)越低，腫瘤的分期越高，患者的生存率越低。在肝癌研究中，也證實(shí)了BAX的表達(dá)下調(diào)與肝癌細(xì)胞的耐藥性和不良預(yù)后密切相關(guān)。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，已有研究顯示BAX在CSCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低，其低表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對凋亡的抵抗能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖和惡性進(jìn)展，使得腫瘤細(xì)胞更容易逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，從而推動皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。因此，BAX被認(rèn)為是一種重要的抑癌基因，其表達(dá)水平的變化可作為評估腫瘤惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。三、miR-365與BAX靶向調(diào)控關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法細(xì)胞系：人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431、SCC13，人永生化表皮細(xì)胞HaCaT，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這些細(xì)胞系在本研究中用于模擬皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程，以及正常皮膚細(xì)胞的生理狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源。A431和SCC13細(xì)胞系具有皮膚鱗狀細(xì)胞癌的典型特征，如高增殖能力、侵襲性等，而HaCaT細(xì)胞系作為正常對照，有助于對比分析miR-365和BAX在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中的表達(dá)差異及功能變化。動物模型：BALB/c裸鼠，雌性，4-6周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。在本研究中，將構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，用于在體內(nèi)驗(yàn)證miR-365/BAX軸對皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響。裸鼠由于缺乏胸腺，免疫功能缺陷，對異種移植的人腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，能夠較好地模擬腫瘤在人體內(nèi)的生長環(huán)境，為研究腫瘤的體內(nèi)生物學(xué)行為提供了理想的動物模型。試劑：miR-365mimic、miR-365inhibitor、negativecontrol（NC）mimic、NCinhibitor均購自廣州銳博生物科技有限公司，這些試劑用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以改變細(xì)胞內(nèi)miR-365的表達(dá)水平，從而研究其對BAX及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，該試劑能夠高效地將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞，是細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵試劑之一。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA，為后續(xù)的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)提供模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix均購自日本TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以檢測miR-365和BAXmRNA的表達(dá)水平。蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行定量，為免疫印跡實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。兔抗人BAX多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國CellSignalingTechnology公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，這些抗體用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測BAX和內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)水平，以分析BAX蛋白的表達(dá)變化。雙熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-BAX-3'UTR（野生型和突變型）由上海吉瑪基因科技有限公司構(gòu)建，用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-365與BAX的靶向調(diào)控關(guān)系。Dual-LuciferaseReporterAssaySystem購自美國Promega公司，是雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的核心試劑，通過檢測熒光素酶活性來判斷miR-365是否與BAX的3'UTR結(jié)合。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到了細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗等常規(guī)試劑，用于細(xì)胞培養(yǎng)和維持細(xì)胞生長環(huán)境。儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境，確保細(xì)胞正常生長和代謝。高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞離心、蛋白和RNA提取過程中的樣品分離等操作，能夠在低溫條件下快速離心，保證生物分子的活性。PCR儀（美國Bio-Rad公司），用于逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)，精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增和檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測qRT-PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，準(zhǔn)確測定miR-365和BAXmRNA的表達(dá)水平。凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于檢測核酸和蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果，通過拍攝凝膠圖像并進(jìn)行分析，獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。酶標(biāo)儀（美國ThermoFisherScientific公司），用于檢測雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中的熒光素酶活性，以及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）中的吸光度值，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的量化分析提供數(shù)據(jù)支持。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），分別用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜操作，將蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)的免疫印跡檢測。細(xì)胞培養(yǎng)：將A431、SCC13和HaCaT細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。傳代時(shí)，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后將細(xì)胞按適當(dāng)比例接種到新的培養(yǎng)瓶中。通過嚴(yán)格控制細(xì)胞培養(yǎng)條件，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性提供保障。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。分別將miR-365mimic、miR-365inhibitor、NCmimic、NCinhibitor轉(zhuǎn)染至A431和SCC13細(xì)胞中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染前，將適量的核酸和Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后混合均勻，室溫孵育15-20min，使其形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功改變細(xì)胞內(nèi)miR-365的表達(dá)水平，為研究其功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。qRT-PCR檢測：轉(zhuǎn)染后24-48h，收集各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、2μLcDNA模板和7μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火延伸30s。以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-365和BAXmRNA的相對表達(dá)量。通過qRT-PCR技術(shù)，能夠準(zhǔn)確檢測miR-365和BAXmRNA在不同處理組細(xì)胞中的表達(dá)變化，為研究二者的調(diào)控關(guān)系提供分子水平的證據(jù)。免疫印跡檢測：轉(zhuǎn)染后48h，收集各組細(xì)胞，加入適量的蛋白提取試劑盒裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入兔抗人BAX多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，分析BAX蛋白的表達(dá)水平。免疫印跡檢測能夠直觀地反映BAX蛋白在不同處理組細(xì)胞中的表達(dá)變化，與qRT-PCR結(jié)果相互印證，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證miR-365對BAX的調(diào)控作用。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將A431細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，將pGL3-BAX-3'UTR（野生型或突變型）與miR-365mimic或NCmimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48h后，按照Dual-LuciferaseReporterAssaySystem說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以評估m(xù)iR-365與BAX3'UTR的結(jié)合情況。若miR-365能夠與BAX的3'UTR結(jié)合，則會導(dǎo)致熒光素酶活性降低，通過對比不同組的熒光素酶活性比值，可明確miR-365與BAX之間是否存在靶向調(diào)控關(guān)系。3.2miR-365和BAX在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)差異運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)對人永生化表皮細(xì)胞HaCaT以及人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431、SCC13中的miR-365和BAXmRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與HaCaT細(xì)胞相比，miR-365在A431和SCC13細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），這表明miR-365在皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能在CSCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。而BAXmRNA在A431和SCC13細(xì)胞系中的表達(dá)水平則明顯低于HaCaT細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示BAX在皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)受到抑制，其低表達(dá)可能與CSCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-365和BAX在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，收集了30例人正常表皮組織和30例人皮膚鱗癌組織樣本，采用qRT-PCR和免疫印跡（WesternBlot）方法分別檢測miR-365和BAX的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果表明，miR-365在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常表皮組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)了miR-365在CSCC組織中的高表達(dá)現(xiàn)象。免疫印跡結(jié)果顯示，BAX蛋白在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常表皮組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這與細(xì)胞系中的檢測結(jié)果一致，說明BAX在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中同樣呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。為更直觀地觀察BAX在組織中的表達(dá)差異，對人正常表皮組織和人皮膚鱗癌組織進(jìn)行免疫組化檢測。結(jié)果顯示，在正常表皮組織中，BAX呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；而在皮膚鱗癌組織中，BAX的陽性表達(dá)明顯減弱，陽性率顯著低于正常表皮組織（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果從蛋白質(zhì)定位和表達(dá)強(qiáng)度方面，進(jìn)一步驗(yàn)證了BAX在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的低表達(dá)情況，表明BAX表達(dá)的下調(diào)可能在CSCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜合以上細(xì)胞系和組織樣本的檢測結(jié)果，miR-365在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，而BAX則表現(xiàn)為低表達(dá)，這種表達(dá)差異暗示了miR-365和BAX可能在CSCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且二者的表達(dá)變化可能存在某種關(guān)聯(lián)，為后續(xù)深入研究miR-365與BAX之間的靶向調(diào)控關(guān)系及對CSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。3.3雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-365與BAX之間是否存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-365的種子序列與BAXmRNA的3'-UTR區(qū)域存在互補(bǔ)配對位點(diǎn)，這為二者可能的靶向關(guān)系提供了初步線索。實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了包含BAXmRNA3'-UTR野生型（BAX-3'UTR-WT）和突變型（BAX-3'UTR-Mut）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將A431細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，將pGL3-BAX-3'UTR（野生型或突變型）與miR-365mimic或NCmimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48h后，按照Dual-LuciferaseReporterAssaySystem說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以評估m(xù)iR-365與BAX3'UTR的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，與NCmimic組相比，miR-365mimic與BAX-3'UTR-WT共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明miR-365能夠與BAXmRNA的野生型3'-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，從而抑制熒光素酶的表達(dá)。而miR-365mimic與BAX-3'UTR-Mut共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性與NCmimic組相比無明顯差異（P＞0.05），這是因?yàn)橥蛔冃偷?'-UTR區(qū)域破壞了與miR-365的互補(bǔ)配對位點(diǎn)，使得miR-365無法與之結(jié)合，進(jìn)而熒光素酶的表達(dá)不受影響。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果明確證實(shí)了miR-365與BAX之間存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系，miR-365可通過與BAXmRNA的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對，直接抑制BAX基因的表達(dá)，這為深入理解miR-365在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮促癌作用的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵證據(jù)，也為后續(xù)研究miR-365/BAX軸對CSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.4過表達(dá)和抑制miR-365對BAX表達(dá)的影響為深入探究miR-365表達(dá)水平的改變對BAX表達(dá)的影響，將miR-365mimic、miR-365inhibitor及其相應(yīng)的陰性對照（NCmimic、NCinhibitor）分別轉(zhuǎn)染至A431和SCC13細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中miR-365和BAXmRNA的表達(dá)水平，同時(shí)采用免疫印跡法（WesternBlot）檢測BAX蛋白的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果清晰顯示，在A431和SCC13細(xì)胞中，與NCmimic組相比，miR-365mimic轉(zhuǎn)染組的miR-365表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），這表明miR-365mimic成功轉(zhuǎn)染并有效提高了細(xì)胞內(nèi)miR-365的表達(dá)。與此同時(shí)，該組BAXmRNA的表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），說明miR-365的過表達(dá)能夠顯著抑制BAXmRNA的表達(dá)。而在miR-365inhibitor轉(zhuǎn)染組中，miR-365的表達(dá)水平相較于NCinhibitor組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明miR-365inhibitor有效抑制了細(xì)胞內(nèi)miR-365的表達(dá)。與之相對應(yīng)的是，BAXmRNA的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示抑制miR-365的表達(dá)能夠促進(jìn)BAXmRNA的表達(dá)。免疫印跡檢測結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果高度一致。在A431和SCC13細(xì)胞中，miR-365mimic轉(zhuǎn)染組的BAX蛋白表達(dá)水平明顯低于NCmimic組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），進(jìn)一步證實(shí)了miR-365過表達(dá)對BAX蛋白表達(dá)的抑制作用。在miR-365inhibitor轉(zhuǎn)染組中，BAX蛋白表達(dá)水平顯著高于NCinhibitor組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），再次驗(yàn)證了抑制miR-365表達(dá)可促進(jìn)BAX蛋白表達(dá)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，過表達(dá)miR-365能夠顯著抑制BAX在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而抑制miR-365的表達(dá)則可促進(jìn)BAX的表達(dá)。這充分表明miR-365對BAX的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用，二者之間存在緊密的靶向調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究miR-365/BAX軸在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。四、miR-365靶向下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌凋亡的影響4.1細(xì)胞凋亡檢測方法與原理在研究miR-365靶向下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌凋亡的影響過程中，需要借助多種細(xì)胞凋亡檢測方法，其中流式細(xì)胞術(shù)和Tunnel實(shí)驗(yàn)是常用且重要的檢測手段。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡具有快速、準(zhǔn)確、可多參數(shù)分析等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其基于的原理是細(xì)胞凋亡時(shí)會伴隨一系列特征性的形態(tài)、生化和分子改變，這些變化均可利用流式細(xì)胞儀（flowcytometer，F(xiàn)CM）的單參數(shù)和多參數(shù)分析進(jìn)行檢測。細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核會發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致DNA可染性發(fā)生改變，經(jīng)過固定處理的凋亡細(xì)胞DNA可染性會降低，這被視為凋亡細(xì)胞的一個重要標(biāo)志。凋亡細(xì)胞的形態(tài)變化也會影響其光散射特性，在流式細(xì)胞儀上，前散射光與細(xì)胞大小相關(guān)，側(cè)散射光則反映了細(xì)胞內(nèi)部顆粒的數(shù)量，凋亡細(xì)胞通常表現(xiàn)出前散射光降低、側(cè)散射光升高的特點(diǎn)。此外，正常活細(xì)胞及凋亡早期細(xì)胞的一個重要特點(diǎn)是細(xì)胞膜完整，而死亡細(xì)胞（壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞）的膜完整性喪失、膜通透性降低或喪失。利用一些熒光染料對細(xì)胞膜通透性選擇性不同，對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記可研究細(xì)胞膜的完整性和膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。例如碘化丙啶（PI）可以染死亡細(xì)胞，Hoechst33258及乙酰乙酸（FDA）可以染活細(xì)胞。目前，基于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的方法主要有4種：亞二倍體分析法、AnnexinV／PI雙染法、線粒體膜電位檢測法和TUNEL法。其中，AnnexinV／PI雙染法是最為經(jīng)典的方法，它基于凋亡早期細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine,PS）從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面這一原理。AnnexinⅤ（膜聯(lián)蛋白V）是一種分子量為35-36kDa的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，將AnnexinV進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium,PI）是一種可與DNA結(jié)合的染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，將AnnexinV與PI聯(lián)合使用時(shí)，便可用來鑒別活細(xì)胞，凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞。通過軟件分析，繪制雙色散點(diǎn)圖，F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)，細(xì)胞可以分為4個象限：左下象限（LL）為正常（活）細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）；右下象限（LR）為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）；右上象限（UR）為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）；左上象限（UL）為可能是已經(jīng)沒有細(xì)胞膜的細(xì)胞碎片，或者其他原因?qū)е碌乃劳黾?xì)胞（AnnexinV?/PI?）。Tunnel實(shí)驗(yàn)，即原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay），也是檢測細(xì)胞凋亡的常用方法之一，尤其適用于組織樣本在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測。其原理是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT）的催化下加上熒光素（FITC）標(biāo)記的dUTP（fluorescein-dUTP），從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在實(shí)驗(yàn)操作中，對于石蠟包埋的組織切片，需先進(jìn)行預(yù)處理，如用二甲苯洗兩次以脫蠟，再用無水酒精、不同濃度酒精下行處理，然后用枸櫞酸鈉緩沖溶液在微波爐里加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。之后依次進(jìn)行PBS洗滌、加TdT酶緩沖液、滴加TdT酶反應(yīng)液（陰性染色對照加不含TdT酶的反應(yīng)液）、洗滌與終止反應(yīng)、加過氧化物酶標(biāo)記的抗體、再次洗滌、DAB溶液顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、封片等步驟，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若樣本為細(xì)胞爬片或冰凍切片，也有相應(yīng)的操作步驟，如先固定樣本，用PBS洗滌后進(jìn)行通透處理，再配制TdT酶反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，后續(xù)同樣經(jīng)過洗滌、標(biāo)記、染色等步驟，最后在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長543nm，發(fā)射波長571nm。由于正常的或正在增值的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色，所以該方法能夠特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞。4.2下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響為深入探究下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響，將siRNA靶向轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞中，以有效敲低BAX的表達(dá)。設(shè)置正常對照組（NC）和siBAX轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinV/PI雙染法）檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，正常對照組細(xì)胞凋亡率為（5.68±0.45）%，而siBAX轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著降低至（2.35±0.21）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在AnnexinV/PI雙染的流式細(xì)胞圖中，正常對照組位于右下象限（早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?）和右上象限（晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?）的細(xì)胞比例相對較高；而siBAX轉(zhuǎn)染組中，這兩個象限的細(xì)胞比例明顯減少，表明下調(diào)BAX能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡?！敬颂幉迦雸D1：流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)BAX對A431細(xì)胞凋亡的影響】為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，進(jìn)行Tunnel實(shí)驗(yàn)，對細(xì)胞凋亡過程中DNA斷裂情況進(jìn)行檢測。將A431細(xì)胞分為正常對照組和siBAX轉(zhuǎn)染組，培養(yǎng)48h后，制作細(xì)胞爬片并進(jìn)行Tunnel染色。在熒光顯微鏡下觀察，正常對照組中可見較多細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光（FITC標(biāo)記），表明存在較多凋亡細(xì)胞；而siBAX轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明細(xì)胞凋亡受到抑制。通過圖像分析軟件對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，正常對照組細(xì)胞凋亡陽性率為（18.56±1.23）%，siBAX轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡陽性率降低至（7.45±0.89）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?！敬颂幉迦雸D2：Tunnel實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)BAX對A431細(xì)胞凋亡的影響】綜合流式細(xì)胞術(shù)和Tunnel實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下調(diào)BAX能夠顯著抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。這一結(jié)果表明，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，BAX作為促凋亡蛋白，其表達(dá)水平的降低會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡調(diào)控機(jī)制，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展提供了有利條件。這也進(jìn)一步證實(shí)了miR-365靶向下調(diào)BAX在抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用。4.3miR-365通過下調(diào)BAX抑制凋亡的分子機(jī)制為深入剖析miR-365通過下調(diào)BAX抑制凋亡的分子機(jī)制，對相關(guān)蛋白和信號通路的變化展開了系統(tǒng)研究。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體途徑是關(guān)鍵的調(diào)控通路之一，而BAX作為該途徑中的核心促凋亡蛋白，其表達(dá)水平的改變會引發(fā)一系列下游事件。當(dāng)miR-365過表達(dá)導(dǎo)致BAX表達(dá)下調(diào)時(shí)，線粒體的正常功能受到顯著影響。正常情況下，BAX蛋白在細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，會從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與線粒體膜上的一些孔蛋白相互作用，形成多聚體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的通透性。線粒體通透性的增加使得細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9，隨后激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，如caspase-3、caspase-6、caspase-7等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。然而，在miR-365高表達(dá)的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，由于BAX表達(dá)被抑制，BAX無法正常定位于線粒體膜，使得線粒體的通透性改變受阻，細(xì)胞色素C釋放減少。這一變化導(dǎo)致凋亡小體的形成受到抑制，caspase-9及其下游的caspase-3、caspase-6、caspase-7等的激活也相應(yīng)減少。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測caspase-3、caspase-9的活性片段表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，miR-365過表達(dá)組中caspase-3、caspase-9的活性片段表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明miR-365通過下調(diào)BAX，抑制了線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白的激活，從而阻礙了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。除了線粒體途徑，miR-365下調(diào)BAX還可能通過影響其他凋亡相關(guān)信號通路來抑制細(xì)胞凋亡。BCL-2家族蛋白之間的相互作用在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著重要作用，BAX與抗凋亡蛋白Bcl-2的比例是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)BAX表達(dá)下調(diào)時(shí)，Bcl-2相對表達(dá)量增加，Bcl-2/BAX比率升高。研究表明，Bcl-2可以通過與BAX競爭結(jié)合其他促凋亡蛋白，從而抑制細(xì)胞凋亡。在miR-365過表達(dá)的細(xì)胞中，由于BAX表達(dá)降低，Bcl-2與BAX形成異源二聚體的機(jī)會減少，Bcl-2得以發(fā)揮更強(qiáng)的抗凋亡作用，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Bcl-2與BAX的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，miR-365過表達(dá)組中Bcl-2與BAX的結(jié)合量明顯低于正常對照組，表明miR-365下調(diào)BAX改變了BCL-2家族蛋白之間的相互作用，從而抑制了細(xì)胞凋亡。此外，miR-365下調(diào)BAX還可能通過影響一些凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號分子來抑制細(xì)胞凋亡。例如，p53是一種重要的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。p53可以通過上調(diào)BAX的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在miR-365過表達(dá)的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，p53的表達(dá)水平雖然沒有明顯改變，但由于BAX表達(dá)被miR-365抑制，p53無法有效地發(fā)揮其促進(jìn)凋亡的作用。同時(shí)，一些其他凋亡相關(guān)的信號分子，如Fas/FasL信號通路、PI3K/Akt信號通路等，也可能受到miR-365下調(diào)BAX的影響，進(jìn)而參與到miR-365抑制細(xì)胞凋亡的過程中。雖然目前對于這些信號通路在miR-365/BAX軸調(diào)控細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，但已有研究表明它們在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有重要意義，未來還需要進(jìn)一步深入研究來揭示它們之間的相互關(guān)系。綜上所述，miR-365通過靶向下調(diào)BAX，主要通過抑制線粒體凋亡途徑，同時(shí)影響B(tài)CL-2家族蛋白相互作用以及其他凋亡相關(guān)信號通路和分子，從而抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這一分子機(jī)制的揭示，為深入理解皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索，也為開發(fā)針對CSCC的靶向治療策略提供了理論依據(jù)。五、miR-365靶向下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲的影響5.1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK8法，該方法基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑存在的情況下，可被細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶還原為橙黃色的甲臜產(chǎn)物，且其顏色深淺與細(xì)胞增殖程度成正比，與細(xì)胞毒性程度成反比的原理。具體操作如下：將處于對數(shù)生長期的A431細(xì)胞用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。分別將NCsiRNA和siBAX轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的0h、24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μLCCK8試劑，輕輕晃動培養(yǎng)板，使其充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡影響檢測結(jié)果。然后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5h，孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，通過比較不同組在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值，評估細(xì)胞的增殖能力。在實(shí)驗(yàn)過程中，為避免邊緣效應(yīng)，培養(yǎng)板最外一圈的孔只加PBS，不作為測定孔用；若待檢測物質(zhì)有氧化性或還原性，在加入CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，以去掉待測物質(zhì)的影響。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)兩種方法。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡單經(jīng)濟(jì)的研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)方法，其原理是當(dāng)細(xì)胞長到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白無細(xì)胞區(qū)域（即“劃痕”），然后觀察劃痕邊緣的細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合的過程，以此判斷細(xì)胞的遷移能力。具體操作步驟如下：首先，用marker筆在6孔板背面均勻劃平行線，線間距為0.5-1cm，每孔至少劃5條線。然后，將A431細(xì)胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿孔底（融合度達(dá)到100%）。接著，用20μL槍頭垂直于孔板和標(biāo)記線制造細(xì)胞劃痕，使劃痕與標(biāo)記線相交，形成若干交叉點(diǎn)作為固定檢測點(diǎn)。劃痕完成后，用顯微鏡拍照記錄初始劃痕狀態(tài)（0h）。隨后，吸去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的6h、12h和24h，在顯微鏡下于相同位置拍照記錄劃痕愈合情況。最后，使用圖像分析軟件（如ImageJ）測量不同時(shí)間點(diǎn)劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，通過比較不同組的細(xì)胞遷移率，評估細(xì)胞的遷移能力。在實(shí)驗(yàn)過程中，注意槍頭要垂直，力度一致，盡量一次性劃完，保證各個劃痕寬度一致；不同孔之間最好使用同一只槍頭，避免因槍頭差異導(dǎo)致劃痕不一致；同時(shí)，要確保拍照位置固定，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)則是利用Transwell小室，模擬細(xì)胞在體內(nèi)的遷移環(huán)境，評估細(xì)胞對化學(xué)誘導(dǎo)劑等的響應(yīng)和遷移能力。具體操作如下：將Transwell小室（孔徑8μm，未包被膠）放入24孔板中，在上室加入100μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，注意避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀輹p弱下層培養(yǎng)液的趨化作用。將A431細(xì)胞用胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，然后用甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。用0.1%結(jié)晶紫染色20分鐘，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞，取平均值作為該組的遷移細(xì)胞數(shù)，通過比較不同組的遷移細(xì)胞數(shù)，評估細(xì)胞的遷移能力。在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間，常規(guī)24-wellchamber接種細(xì)胞數(shù)約為2-5×10?/well，遷移時(shí)間12-36小時(shí)；同時(shí)，要注意操作過程中避免污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，其原理是在Transwell小室的聚碳酸酯膜上涂覆一層基質(zhì)膠（如Matrigel），模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），細(xì)胞必須先降解基質(zhì)膠才能穿過膜遷移到下室，從而更精確地模擬并評估細(xì)胞在生物體內(nèi)的侵襲行為特性。具體操作步驟如下：實(shí)驗(yàn)前將Matrigel在4℃過夜融化，用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，取60μL稀釋后的Matrigel垂直加入Transwell小室的上室面，使其均勻平鋪在底部，注意避免產(chǎn)生氣泡，然后置于37℃孵育2-4h使Matrigel聚合成凝膠。使用前，加入100μL無血清培養(yǎng)基進(jìn)行基底膜水化30分鐘。將A431細(xì)胞用胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，用甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。用0.1%結(jié)晶紫染色20分鐘，用棉簽輕輕擦掉上層未侵襲細(xì)胞，用PBS洗3遍。在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并計(jì)數(shù)侵襲到下室膜表面的細(xì)胞，取平均值作為該組的侵襲細(xì)胞數(shù)，通過比較不同組的侵襲細(xì)胞數(shù)，評估細(xì)胞的侵襲能力。在實(shí)驗(yàn)過程中，Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷；鋪膠時(shí)保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡，以免影響細(xì)胞侵襲；同時(shí)，要根據(jù)細(xì)胞的侵襲能力選擇合適的孵育時(shí)間，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.2下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力的影響為深入探究下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖能力的影響，采用CCK8法對轉(zhuǎn)染NCsiRNA和siBAX的A431細(xì)胞進(jìn)行檢測。在轉(zhuǎn)染后的0h、24h、48h、72h和96h，分別測定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，隨著時(shí)間的推移，兩組細(xì)胞的OD值均呈現(xiàn)上升趨勢，但siBAX轉(zhuǎn)染組的OD值顯著高于NCsiRNA轉(zhuǎn)染組。在24h時(shí)，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的OD值為0.35±0.02，siBAX轉(zhuǎn)染組的OD值為0.42±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；48h時(shí)，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的OD值為0.56±0.04，siBAX轉(zhuǎn)染組的OD值為0.75±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；72h時(shí)，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的OD值為0.82±0.06，siBAX轉(zhuǎn)染組的OD值為1.10±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；96h時(shí)，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的OD值為1.15±0.09，siBAX轉(zhuǎn)染組的OD值為1.50±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，可清晰地看出siBAX轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖速度明顯快于NCsiRNA轉(zhuǎn)染組?！敬颂幉迦雸D3：CCK8法檢測下調(diào)BAX對A431細(xì)胞增殖能力的影響】綜合以上CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下調(diào)BAX能夠顯著增強(qiáng)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力。這表明在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，BAX表達(dá)的降低會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，使得腫瘤細(xì)胞能夠更快地生長和分裂，進(jìn)一步推動皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。這一結(jié)果與下調(diào)BAX抑制細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互關(guān)聯(lián)，共同揭示了miR-365靶向下調(diào)BAX在促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展過程中的重要作用。5.3下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響為探究下調(diào)BAX對皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，分別進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，將A431細(xì)胞分為NCsiRNA轉(zhuǎn)染組和siBAX轉(zhuǎn)染組。待細(xì)胞鋪滿孔底后，用20μL槍頭制造細(xì)胞劃痕，然后分別在0h、6h、12h和24h觀察并拍照記錄劃痕愈合情況。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果如圖4所示，在0h時(shí)，兩組細(xì)胞的劃痕寬度無明顯差異。隨著時(shí)間的推移，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率逐漸增加，而siBAX轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率顯著高于NCsiRNA轉(zhuǎn)染組。在24h時(shí)，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率為（35.68±2.35）%，siBAX轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率高達(dá)（68.45±3.21）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明下調(diào)BAX能夠顯著促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移能力，使細(xì)胞能夠更快地遷移到劃痕區(qū)域，促進(jìn)劃痕的愈合?！敬颂幉迦雸D4：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)BAX對A431細(xì)胞遷移能力的影響】Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。將A431細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸后，接種于Transwell小室的上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24h后，取出Transwell小室，固定并染色遷移到下室膜表面的細(xì)胞。在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（125.6±10.2）個，siBAX轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加至（356.8±15.6）個，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明下調(diào)BAX能夠顯著增加皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步證實(shí)了下調(diào)BAX對細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用?！敬颂幉迦雸D5：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)BAX對A431細(xì)胞遷移能力的影響】在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，先將Matrigel鋪在Transwell小室的上室面，使其聚合成凝膠。然后將A431細(xì)胞接種于上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育48h后，固定并染色侵襲到下室膜表面的細(xì)胞。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖6所示，NCsiRNA轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（86.5±8.4）個，siBAX轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多，達(dá)到（265.3±12.8）個，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明下調(diào)BAX能夠顯著增強(qiáng)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲能力，使細(xì)胞能夠更好地穿過Matrigel基質(zhì)膠，侵襲到下室。【此處插入圖6：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)BAX對A431細(xì)胞侵襲能力的影響】綜合以上細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下調(diào)BAX能夠顯著促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這表明在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，BAX表達(dá)的降低會使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，更容易突破組織屏障，發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而進(jìn)一步促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。這一結(jié)果與下調(diào)BAX促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同揭示了miR-365靶向下調(diào)BAX在促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。5.4miR-365通過下調(diào)BAX促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的綜合作用綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-365通過靶向下調(diào)BAX，對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了多方面的促進(jìn)作用。在細(xì)胞凋亡方面，下調(diào)BAX能夠顯著抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)和Tunnel實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，下調(diào)BAX使得細(xì)胞凋亡率明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9的活性片段表達(dá)顯著減少，線粒體凋亡途徑受到抑制，同時(shí)BCL-2家族蛋白之間的相互作用發(fā)生改變，Bcl-2/BAX比率升高，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡調(diào)控機(jī)制，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。在細(xì)胞增殖方面，下調(diào)BAX能夠顯著增強(qiáng)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)BAX后，細(xì)胞的增殖速度明顯加快，在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著高于對照組。這表明BAX表達(dá)的降低會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，使得腫瘤細(xì)胞能夠更快地生長和分裂，進(jìn)一步推動皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，下調(diào)BAX能夠顯著促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致表明，下調(diào)BAX后，細(xì)胞的遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加，細(xì)胞能夠更快地遷移到劃痕區(qū)域，更好地穿過Matrigel基質(zhì)膠，侵襲到下室。這使得腫瘤細(xì)胞更容易突破組織屏障，發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而進(jìn)一步促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展。miR-365通過靶向下調(diào)BAX，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從多個角度共同促進(jìn)了皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。這一研究結(jié)果揭示了miR-365/BAX軸在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的關(guān)鍵作用，為深入理解CSCC的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索，也為開發(fā)針對CSCC的靶向治療策略提供了有力的理論依據(jù)。六、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-365/BAX軸對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的影響6.1裸鼠移植瘤模型構(gòu)建為了從體內(nèi)水平驗(yàn)證miR-365/BAX軸對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的影響，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，在無特定病原體（SPF）級動物房環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水，控制環(huán)境溫度在（23±2）℃，相對濕度在（50±10）%，12h光照/黑暗循環(huán)。將處于對數(shù)生長期的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液（含1×10?個細(xì)胞），與等體積的Matrigel基質(zhì)膠充分混勻，以確保細(xì)胞在基質(zhì)膠中均勻分布，為細(xì)胞提供良好的生長微環(huán)境。使用1mL無菌注射器吸取細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合液，將裸鼠用異氟烷麻醉后，固定于手術(shù)臺上，用75%酒精消毒裸鼠右側(cè)腋窩部位皮膚3次，以防止感染。在消毒后的部位，將注射器針頭以45度角斜刺入皮下，然后近水平位置將針頭幾乎完全插入皮下，緩慢注射混合液，注射完畢后快速退針，用無菌棉球輕壓針孔約1min，防止液體流出。將注射后的裸鼠側(cè)放于飼養(yǎng)籠的墊料上，2-3h后觀察小鼠是否蘇醒，待小鼠完全蘇醒后恢復(fù)正常飼養(yǎng)。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并記錄腫瘤的生長情況。在測量過程中，保持測量手法和測量位置的一致性，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化以及腫瘤部位有無破潰、感染等異常情況。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm3時(shí)，隨機(jī)將裸鼠分為兩組，每組5只，分別為NCsiRNA組和siBAX組。NCsiRNA組裸鼠瘤內(nèi)注射NCsiRNA，siBAX組裸鼠瘤內(nèi)注射siBAX，每次注射量為50μL，濃度為100nM，每周注射3次，連續(xù)注射3周。在注射過程中，注意無菌操作，避免感染，同時(shí)盡量保證每次注射的位置和深度一致。通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型并進(jìn)行干預(yù)，為后續(xù)研究miR-365/BAX軸對皮膚鱗狀細(xì)胞癌在體內(nèi)的影響提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。6.2觀察指標(biāo)與檢測方法在構(gòu)建裸鼠移植瘤模型后，對一系列關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行了嚴(yán)密觀察和精準(zhǔn)檢測，以深入探究miR-365/BAX軸對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的影響。腫瘤生長情況：每隔3天使用游標(biāo)卡尺精確測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并依據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在測量過程中，保持測量手法的一致性，確保每次測量均在腫瘤的最大徑和垂直于最大徑的方向進(jìn)行。同時(shí)，密切關(guān)注裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化以及腫瘤部位有無破潰、感染等異常情況。若發(fā)現(xiàn)裸鼠精神萎靡、飲食減少、體重明顯下降或腫瘤部位出現(xiàn)紅腫、滲液等異常，及時(shí)記錄并分析原因。通過定期測量腫瘤體積和密切觀察裸鼠整體狀況，動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長趨勢，為評估m(xù)iR-365/BAX軸對腫瘤生長的影響提供直觀的數(shù)據(jù)支持?；蚝偷鞍妆磉_(dá)檢測：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出腫瘤組織，一部分置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的RNA和蛋白質(zhì)提取。采用qRT-PCR技術(shù)檢測腫瘤組織中miR-365和BAXmRNA的表達(dá)水平。具體操作步驟如下：使用TRIzol試劑提取腫瘤組織總RNA，通過分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，確保RNA質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書設(shè)置，以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-