miR-590-5p靶向PDCD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2018年中國有39萬多人新發(fā)肝癌，位于新發(fā)惡性腫瘤的第三位，同年有36萬多人死于肝癌，死亡人數(shù)也居惡性腫瘤第三位，且全世界47%的肝癌發(fā)生在中國。肝癌在我國的高發(fā)性與乙型肝炎大面積流行密切相關(guān)，盡管乙肝陽性率從最高時(shí)的10%左右降至目前的7%-8%，但龐大的人口基數(shù)使得中國肝癌患者人數(shù)在全球遙遙領(lǐng)先。經(jīng)過多年的臨床研究，雖然在肝癌的發(fā)病機(jī)理、分子診斷、預(yù)后評(píng)估等方面取得了一定進(jìn)展，然而其五年生存率仍相對(duì)較低。因此，深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，探尋新的診斷和治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善肝癌患者的預(yù)后、提高生存率具有至關(guān)重要的現(xiàn)實(shí)意義。在癌癥研究領(lǐng)域，微小RNA（miRNA）和程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）逐漸成為研究的焦點(diǎn)。miRNA是一類由21-25個(gè)非編碼核苷酸組成的微小RNA分子，它能夠通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）部分或完全匹配，從而抑制靶基因的翻譯過程，甚至降解靶基因的mRNA。眾多研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。其介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的途徑主要包括與抑癌基因結(jié)合的miRNA過表達(dá)或信號(hào)放大，以及與癌基因結(jié)合的miRNA內(nèi)源性丟失。PDCD4作為一種重要的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著不可或缺的角色。人PDCD4基因定位于10q24，其表達(dá)產(chǎn)物能夠通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在多種癌癥中，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜樣癌等，均發(fā)現(xiàn)PDCD4的表達(dá)水平明顯降低，且與腫瘤的惡性程度、患者的預(yù)后密切相關(guān)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miR-590-5p在肝癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且其表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展存在緊密聯(lián)系。進(jìn)一步研究表明，miR-590-5p可能通過靶向調(diào)控某些基因來影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，其中PDCD4被證實(shí)是miR-590-5p的一個(gè)靶基因。然而，miR-590-5p如何通過抑制PDCD4的表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，其具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究聚焦于miR-590-5p與PDCD4之間的關(guān)系，旨在深入探究miR-590-5p通過抑制PDCD4的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。這不僅有助于我們更全面、深入地理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，為肝癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物；還可能為肝癌的靶向治療開辟新的思路和方法，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和內(nèi)容本研究旨在深入探討miR-590-5p通過抑制PDCD4的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制，為肝癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：miR-590-5p和PDCD4在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)分析：收集肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織樣本，同時(shí)選取多種肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，精確檢測(cè)miR-590-5p和PDCD4在這些組織和細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平；通過免疫組織化學(xué)（IHC）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等方法，測(cè)定PDCD4蛋白在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過對(duì)比分析，明確miR-590-5p和PDCD4在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)差異，并初步探討其與肝癌臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、分期、轉(zhuǎn)移情況等）之間的關(guān)聯(lián)。miR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-590-5p模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)對(duì)照序列分別轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系中，成功構(gòu)建miR-590-5p過表達(dá)和低表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，直觀反映細(xì)胞增殖速率的變化；通過5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記并檢測(cè)處于DNA合成期的細(xì)胞比例，進(jìn)一步明確miR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中的克隆形成能力，評(píng)估m(xù)iR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞惡性增殖潛能的作用。PDCD4是否為miR-590-5p的直接作用靶點(diǎn)驗(yàn)證：借助生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)miR-590-5p可能的靶基因，并重點(diǎn)關(guān)注PDCD4基因3’非翻譯區(qū)（3’UTR）與miR-590-5p的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建包含PDCD4基因3’UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與miR-590-5pmimic或?qū)φ招蛄泄厕D(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定熒光素酶活性，若miR-590-5pmimic能夠顯著降低野生型PDCD43’UTR熒光素酶活性，而對(duì)突變型無明顯影響，則表明PDCD4是miR-590-5p的直接作用靶點(diǎn)。此外，通過RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，使用針對(duì)AGO2蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀，富集與miR-590-5p結(jié)合的RNA復(fù)合物，再通過qRT-PCR檢測(cè)其中PDCD4mRNA的含量，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-590-5p與PDCD4的相互作用。miR-590-5p通過抑制PDCD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究：在miR-590-5p過表達(dá)和低表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型中，通過Westernblot檢測(cè)PDCD4蛋白表達(dá)水平的變化，以及與細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控等相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路中的蛋白）的表達(dá)和磷酸化水平，初步探索miR-590-5p通過抑制PDCD4影響肝癌細(xì)胞增殖的潛在信號(hào)通路。構(gòu)建PDCD4過表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染至miR-590-5p過表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，回復(fù)PDCD4的表達(dá)水平。再次運(yùn)用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化，并通過Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，明確miR-590-5p抑制PDCD4表達(dá)后，對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及相關(guān)信號(hào)通路的影響是否可被PDCD4過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，從而深入揭示miR-590-5p通過抑制PDCD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。1.3研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞和分子水平深入探究miR-590-5p通過抑制PDCD4表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。在組織和細(xì)胞水平，收集肝癌組織及癌旁組織樣本，選取肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系，運(yùn)用qRT-PCR、IHC、Westernblot等技術(shù)，檢測(cè)miR-590-5p和PDCD4在組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)差異與肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)方面，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建miR-590-5p過表達(dá)和低表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型，通過CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、DNA合成能力和克隆形成能力，明確miR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。在驗(yàn)證PDCD4是否為miR-590-5p的直接作用靶點(diǎn)時(shí)，借助生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和RIP實(shí)驗(yàn)，從不同角度驗(yàn)證兩者的相互作用。分子機(jī)制研究中，通過Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，初步探索miR-590-5p抑制PDCD4表達(dá)影響肝癌細(xì)胞增殖的潛在信號(hào)通路。構(gòu)建PDCD4過表達(dá)載體，回復(fù)PDCD4的表達(dá)水平，再次檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，深入揭示其分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究視角上，聚焦于miR-590-5p與PDCD4這一特定的調(diào)控關(guān)系，深入剖析其在肝癌細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制，為肝癌研究提供了新的視角。在方法整合上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從基因、蛋白、細(xì)胞功能等多個(gè)層面進(jìn)行研究，使研究結(jié)果更加全面、深入、可靠。潛在應(yīng)用價(jià)值上，本研究結(jié)果有望為肝癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，為肝癌的靶向治療開辟新的思路和方法，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、肝癌與相關(guān)分子機(jī)制概述2.1肝癌的現(xiàn)狀與危害肝癌，作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出高發(fā)態(tài)勢(shì)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，肝癌的發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。2022年，全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為87萬例，位居所有癌癥新發(fā)病例的第6位；死亡病例數(shù)約為76萬例，高居癌癥死亡病例的第3位。肝癌給全球帶來沉重的疾病負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和壽命。在中國，肝癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻。由于人口基數(shù)龐大以及乙肝病毒感染率較高等因素，中國成為全球肝癌發(fā)病和死亡人數(shù)最多的國家。2022年，中國肝癌新發(fā)病例數(shù)高達(dá)37萬例，在國內(nèi)癌癥新發(fā)病例中位列第4位；死亡病例數(shù)約為32萬例，僅次于肺癌，位居癌癥死亡病例的第2位。肝癌在中國的高發(fā)病率和高死亡率，不僅給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對(duì)社會(huì)的醫(yī)療資源造成了沉重壓力。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。中晚期肝癌患者的治療手段相對(duì)有限，療效往往不盡人意，5年生存率較低。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國肝癌患者5年總體生存率不足15%。這使得肝癌成為嚴(yán)重威脅我國居民生命健康的重大疾病之一，對(duì)社會(huì)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口素質(zhì)提升產(chǎn)生了不利影響。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種基因和信號(hào)通路的異常調(diào)控。雖然目前針對(duì)肝癌的治療方法包括手術(shù)切除、肝移植、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但總體治療效果仍有待提高。深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善肝癌患者的預(yù)后、降低死亡率具有重要意義。2.2miRNA的作用機(jī)制與功能miRNA，即微小核糖核酸，是一類長度僅為21-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，在進(jìn)化上具有高度的保守性。自1993年第一個(gè)miRNA——lin-4在線蟲中被發(fā)現(xiàn)以來，截至目前，在人類中已鑒定出超過2600種miRNA。miRNA的產(chǎn)生過程較為復(fù)雜。首先，在細(xì)胞核內(nèi)，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（pri-miRNA），其長度可達(dá)幾百至幾千個(gè)核苷酸，具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子的作用下，被切割成約70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA通過Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中，被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，最終形成長度約為21-25個(gè)核苷酸的成熟miRNA雙鏈。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈會(huì)被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，發(fā)揮其生物學(xué)功能。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)來調(diào)控基因表達(dá)。當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高時(shí)，RISC中的核酸酶會(huì)直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解；而當(dāng)互補(bǔ)配對(duì)程度較低時(shí)，miRNA則主要抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)的合成。值得注意的是，一個(gè)miRNA可以同時(shí)靶向多個(gè)不同的mRNA，對(duì)多種基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控；反之，一個(gè)mRNA也可能受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)節(jié)，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著精細(xì)而廣泛的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤領(lǐng)域，miRNA扮演著至關(guān)重要的角色，其既可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也能作為抑癌基因抑制腫瘤的進(jìn)程。以miR-21為例，它在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、肺癌、肝癌等。研究表明，miR-21可通過靶向多個(gè)抑癌基因，如PTEN、PDCD4等，抑制它們的表達(dá)，從而激活下游的PI3K/AKT等促癌信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。在乳腺癌中，miR-21的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。與之相反，一些miRNA發(fā)揮著抑癌基因的作用。例如，miR-122在肝癌中表達(dá)顯著下調(diào)。miR-122能夠通過靶向多個(gè)與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，如c-Myc、cyclinG1等，抑制它們的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-122后，細(xì)胞的增殖能力明顯下降，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，凋亡率增加。這些研究充分表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等各個(gè)環(huán)節(jié)中都發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為產(chǎn)生著深遠(yuǎn)的影響。2.3PDCD4的特性與腫瘤抑制功能PDCD4，全稱程序性細(xì)胞死亡因子4，其基因定位于人染色體10q24，長度約為120kb。PDCD4基因包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，通過選擇性剪接可產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄變體，編碼相對(duì)分子質(zhì)量約為57kDa的蛋白質(zhì)。PDCD4蛋白由451個(gè)氨基酸組成，含有兩個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：N端的MA3結(jié)構(gòu)域和C端的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域。MA3結(jié)構(gòu)域是PDCD4發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域，它能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用，如真核細(xì)胞翻譯起始因子4A1（eIF4A1）。PDCD4通過其MA3結(jié)構(gòu)域與eIF4A1結(jié)合，阻止eIF4A1與mRNA的結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始過程，影響細(xì)胞的生長和增殖。在腫瘤抑制方面，PDCD4發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究表明，PDCD4能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在多種腫瘤細(xì)胞系中，如肝癌細(xì)胞系HepG2、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7等，過表達(dá)PDCD4可顯著抑制細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期阻滯在G1期。其作用機(jī)制主要是通過抑制與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如cyclinD1、cyclinE等，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞的分裂和增殖。PDCD4還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，PDCD4可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，如MMP-2、MMP-9等，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，PDCD4還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細(xì)胞中，PDCD4能夠抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug的表達(dá)，維持上皮細(xì)胞的形態(tài)和特性，減少腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是PDCD4的重要功能之一。在胃癌細(xì)胞中，PDCD4過表達(dá)可激活caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白酶，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活內(nèi)源性凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。PDCD4還可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，如抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比例，促使細(xì)胞走向凋亡。在多種癌癥中，PDCD4的表達(dá)水平明顯降低，且與腫瘤的惡性程度、患者的預(yù)后密切相關(guān)。在卵巢癌中，研究發(fā)現(xiàn)PDCD4在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織，且低表達(dá)的PDCD4與卵巢癌的高分級(jí)、高分期以及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。在子宮內(nèi)膜樣癌中，PDCD4的陽性表達(dá)率在癌組織中僅為30%，而在正常子宮內(nèi)膜中為100%，其表達(dá)水平的降低與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這些研究充分表明，PDCD4作為一種重要的腫瘤抑制因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其表達(dá)異常與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。三、miR-590-5p與PDCD4的靶向關(guān)系驗(yàn)證3.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在探索miR-590-5p與PDCD4的靶向關(guān)系時(shí)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)揮著關(guān)鍵的先行作用。借助專業(yè)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和算法，能夠高效地挖掘出miR-590-5p與PDCD4之間潛在的結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供重要的理論依據(jù)。目前，常用的預(yù)測(cè)miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫有TargetScan、miRanda、PicTar等。這些數(shù)據(jù)庫基于不同的算法和原理，通過對(duì)大量的生物數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比對(duì)，預(yù)測(cè)miRNA與靶基因mRNA3’UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對(duì)情況。以TargetScan為例，其預(yù)測(cè)原理主要基于miRNA種子序列（seedsequence）與靶基因3’UTR的互補(bǔ)性。miRNA的種子序列通常是指其5’端第2-8位核苷酸，這一段序列在與靶基因的識(shí)別和結(jié)合中起著核心作用。TargetScan通過掃描靶基因3’UTR，尋找與miRNA種子序列完全匹配或近乎完全匹配的位點(diǎn)，同時(shí)考慮位點(diǎn)的保守性、熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分和排序，從而篩選出最有可能的靶基因。在對(duì)miR-590-5p和PDCD4進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，將miR-590-5p的序列輸入到TargetScan數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為人，進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，在PDCD4基因的3’UTR區(qū)域存在與miR-590-5p種子序列互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)（圖1）。通過進(jìn)一步分析，該位點(diǎn)在不同物種間具有較高的保守性，提示其可能具有重要的生物學(xué)功能。除了TargetScan，利用miRanda數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)miR-590-5p與PDCD4基因3’UTR存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。miRanda算法不僅考慮了堿基互補(bǔ)配對(duì)的情況，還綜合考慮了RNA雙鏈結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素。在該數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)結(jié)果中，miR-590-5p與PDCD4的結(jié)合能較低，表明兩者具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力，進(jìn)一步支持了它們之間存在靶向關(guān)系的可能性。這些生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果為后續(xù)研究提供了有力的線索。預(yù)測(cè)結(jié)果提示，miR-590-5p可能通過與PDCD4基因3’UTR的特定結(jié)合位點(diǎn)相互作用，抑制PDCD4的表達(dá)。這種抑制作用可能會(huì)影響PDCD4在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能，如對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。然而，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)僅僅是基于數(shù)據(jù)和算法的推斷，其結(jié)果存在一定的假陽性和假陰性。因此，為了確鑿地驗(yàn)證miR-590-5p與PDCD4之間的靶向關(guān)系，還需要開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，如雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等，從不同角度和層面進(jìn)行驗(yàn)證，以獲得更為準(zhǔn)確和可靠的結(jié)論。3.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是驗(yàn)證miR-590-5p與PDCD4靶向關(guān)系的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)手段。在該實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建含PDCD43’UTR熒光素酶報(bào)告載體是首要步驟。首先，從人基因組DNA中擴(kuò)增出包含預(yù)測(cè)的miR-590-5p結(jié)合位點(diǎn)的PDCD4基因3’UTR片段。這一過程需設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)要充分考慮到擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性和完整性，確保其包含與miR-590-5p相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。以高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系需嚴(yán)格按照酶的說明書進(jìn)行配制，包括合適的模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度、緩沖液以及酶的用量等。PCR反應(yīng)條件也至關(guān)重要，需經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸等多個(gè)循環(huán)步驟，每個(gè)步驟的溫度和時(shí)間都要精確控制，以保證擴(kuò)增出高純度、高產(chǎn)量的目的片段。擴(kuò)增得到的PDCD43’UTR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化?；厥者^程要盡量減少雜質(zhì)的殘留，確保目的片段的純度，因?yàn)殡s質(zhì)可能會(huì)影響后續(xù)的載體構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨后，將回收的PDCD43’UTR片段克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體中，如pGL3-basic載體。該載體含有螢火蟲熒光素酶基因，其表達(dá)受插入的PDCD43’UTR片段調(diào)控?？寺∵^程利用T4DNA連接酶將目的片段與載體進(jìn)行連接，連接反應(yīng)需在合適的溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行，以保證連接效率。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出含有正確插入片段的陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保PDCD43’UTR片段準(zhǔn)確無誤地插入到載體中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-590-5p與PDCD43’UTR的結(jié)合特異性，還需構(gòu)建突變型PDCD43’UTR熒光素酶報(bào)告載體。通過定點(diǎn)突變技術(shù)，將預(yù)測(cè)的miR-590-5p結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變。例如，使用重疊延伸PCR法，設(shè)計(jì)包含突變堿基的引物，通過兩輪PCR反應(yīng)，將突變引入到PDCD43’UTR片段中。同樣地，將突變后的PDCD43’UTR片段克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體中，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的野生型和突變型PDCD43’UTR熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-590-5pmimic或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，如HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等條件需進(jìn)行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。該系統(tǒng)利用熒光素酶催化底物產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度來反映熒光素酶的表達(dá)水平。在檢測(cè)過程中，先加入螢火蟲熒光素酶底物，檢測(cè)螢火蟲熒光強(qiáng)度，再加入海腎熒光素酶底物，檢測(cè)海腎熒光強(qiáng)度。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，對(duì)螢火蟲熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，以消除轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞狀態(tài)等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。若miR-590-5p與PDCD43’UTR存在靶向關(guān)系，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic和野生型PDCD43’UTR熒光素酶報(bào)告載體時(shí)，miR-590-5p會(huì)與PDCD43’UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著降低。而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic和突變型PDCD43’UTR熒光素酶報(bào)告載體時(shí)，由于結(jié)合位點(diǎn)突變，miR-590-5p無法與PDCD43’UTR結(jié)合，熒光強(qiáng)度不會(huì)受到明顯影響。通過比較不同轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度變化，可明確miR-590-5p與PDCD4之間是否存在直接的靶向關(guān)系。3.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-590-5p與PDCD4之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，在肝癌細(xì)胞中開展了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。選取肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7，這兩種細(xì)胞在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-590-5p模擬物（mimic）轉(zhuǎn)染至HepG2和Huh7細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)miR-590-5p的過表達(dá)；同時(shí)，將miR-590-5p抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，用于抑制miR-590-5p的表達(dá)。轉(zhuǎn)染過程中，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如脂質(zhì)體與核酸的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等，以確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。在轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞，分別提取細(xì)胞中的總RNA和總蛋白。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PDCD4的mRNA表達(dá)水平。具體操作如下：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。以提取的RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)針對(duì)PDCD4基因的特異性引物，引物的設(shè)計(jì)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，確保其特異性和擴(kuò)增效率。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTP、Taq酶和緩沖液等。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸30-60秒，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置判斷PDCD4mRNA的表達(dá)水平。采用Westernblot檢測(cè)PDCD4的蛋白表達(dá)水平。首先，使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使蛋白根據(jù)分子量大小在凝膠上分離。隨后，通過濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。加入針對(duì)PDCD4的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次5-10分鐘。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，然后使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析條帶的灰度值，以確定PDCD4蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic的肝癌細(xì)胞中，PDCD4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。以HepG2細(xì)胞為例，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NC）的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic的細(xì)胞中PDCD4mRNA表達(dá)水平下降了約50%（圖2A），蛋白表達(dá)水平也明顯降低（圖2B）。在Huh7細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。這表明miR-590-5p過表達(dá)能夠有效抑制PDCD4的表達(dá)。相反，在轉(zhuǎn)染miR-590-5pinhibitor的肝癌細(xì)胞中，PDCD4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-590-5pinhibitor后，PDCD4mRNA表達(dá)水平較NC組升高了約80%（圖2C），蛋白表達(dá)水平也明顯增強(qiáng)（圖2D）。Huh7細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。這說明抑制miR-590-5p的表達(dá)能夠解除對(duì)PDCD4的抑制作用，使PDCD4的表達(dá)上調(diào)。這些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)論相互印證，進(jìn)一步證實(shí)了miR-590-5p能夠直接靶向PDCD4基因的3’UTR區(qū)域，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制PDCD4的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程，從而調(diào)控PDCD4的表達(dá)水平。四、miR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響4.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為深入探究miR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究采用了MTT法和CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)，并繪制細(xì)胞生長曲線，以直觀呈現(xiàn)細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化。MTT法，即四甲基偶氮唑鹽比色法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（一種黃色的水溶性染料）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中。而死細(xì)胞則無此功能。通過加入二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚，利用酶標(biāo)儀在特定波長下測(cè)定其吸光度值，吸光度值的大小與活細(xì)胞數(shù)量成正比，從而間接反映細(xì)胞的增殖情況。CCK-8法，全稱CellCountingKit-8，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）的新型細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑。WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，可被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚產(chǎn)物的量與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，同樣通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，即可準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性。與MTT法相比，CCK-8法具有操作更為簡便、靈敏度更高、重復(fù)性更好等優(yōu)點(diǎn)，且生成的甲瓚產(chǎn)物水溶性好，無需像MTT法那樣進(jìn)行后續(xù)的溶解步驟，減少了實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)選取了兩種具有代表性的肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7。首先，將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2和Huh7細(xì)胞，以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將miR-590-5p模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的第1、2、3、4、5天，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于MTT法，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶已將MTT還原為甲瓚。小心吸去上清液，避免吸走細(xì)胞和甲瓚沉淀，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。隨后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值。CCK-8法操作相對(duì)更為簡便，在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，每孔直接加入10μlCCK-8溶液，孵育1-4小時(shí)。期間，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8中的WST-8還原為黃色甲瓚。孵育結(jié)束后，無需更換液體，直接用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic的細(xì)胞組，其吸光度值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于陰性對(duì)照組（NC）。在轉(zhuǎn)染后的第3天，miR-590-5pmimic組的吸光度值為1.25±0.08，而NC組僅為0.85±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著時(shí)間的推移，這種差異愈發(fā)明顯，表明miR-590-5p過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。在Huh7細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic的細(xì)胞，其生長曲線明顯高于NC組。在第4天，miR-590-5pmimic組的吸光度值達(dá)到1.40±0.09，而NC組為1.00±0.07，P<0.01。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-590-5p過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。相反，在轉(zhuǎn)染miR-590-5pinhibitor的HepG2和Huh7細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。以HepG2細(xì)胞為例，在轉(zhuǎn)染后的第3天，miR-590-5pinhibitor組的吸光度值為0.60±0.05，顯著低于NC組（P<0.01）。Huh7細(xì)胞的結(jié)果與之類似，轉(zhuǎn)染miR-590-5pinhibitor后，細(xì)胞生長曲線明顯低于NC組，在第4天，吸光度值僅為0.80±0.06，而NC組為1.00±0.07，P<0.01。這表明抑制miR-590-5p的表達(dá)能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，miR-590-5p在肝癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，而抑制其表達(dá)則可有效抑制細(xì)胞增殖，為深入探究miR-590-5p在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.2細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常生理功能至關(guān)重要，而腫瘤細(xì)胞常常出現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控的異常，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。為深入探究miR-590-5p促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制，本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期分布進(jìn)行了精確檢測(cè)，并深入分析了miR-590-5p對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。流式細(xì)胞術(shù)是一種利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速、精確分析和分選的技術(shù)。在細(xì)胞周期檢測(cè)中，其原理基于細(xì)胞在不同周期階段DNA含量的差異。細(xì)胞周期可分為G1期、S期、G2期和M期。G1期細(xì)胞處于DNA合成前期，DNA含量為2n；S期細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制，DNA含量逐漸從2n增加至4n；G2期細(xì)胞完成DNA復(fù)制，DNA含量穩(wěn)定在4n；M期細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，分裂完成后細(xì)胞DNA含量又恢復(fù)到2n。通過使用能夠與DNA特異性結(jié)合的熒光染料，如碘化丙啶（PI），其嵌入DNA雙鏈后，在特定波長的激發(fā)光下會(huì)發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，即可準(zhǔn)確區(qū)分處于不同細(xì)胞周期階段的細(xì)胞，并計(jì)算出各時(shí)期細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)選取了HepG2和Huh7兩種肝癌細(xì)胞系。首先，將細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將miR-590-5p模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，小心收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS緩沖液輕柔洗滌細(xì)胞2次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和血清成分。隨后，加入1ml胰蛋白酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓脫落后，迅速加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入1ml冰浴預(yù)冷的70%乙醇，緩慢逐滴加入并輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞充分固定，置于4℃冰箱中固定過夜。固定后的細(xì)胞再次1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌2次。加入500μl含有50μg/mlPI和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘，使PI充分與DNA結(jié)合。最后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組（NC）相比，轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic的細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞比例顯著增加。NC組中S期細(xì)胞比例為20.5%±1.5%，而miR-590-5pmimic組中S期細(xì)胞比例升高至30.2%±2.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)，G1期細(xì)胞比例相應(yīng)下降，從NC組的55.0%±2.0%降至miR-590-5pmimic組的45.0%±2.5%（P<0.01）。這表明miR-590-5p過表達(dá)能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速DNA合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在Huh7細(xì)胞中也觀察到了類似的結(jié)果。miR-590-5pmimic組中S期細(xì)胞比例為28.5%±1.8%，明顯高于NC組的21.0%±1.6%（P<0.01）。G1期細(xì)胞比例則從NC組的53.0%±2.2%降至miR-590-5pmimic組的44.0%±2.0%（P<0.01）。相反，在轉(zhuǎn)染miR-590-5pinhibitor的HepG2和Huh7細(xì)胞中，S期細(xì)胞比例顯著降低。以HepG2細(xì)胞為例，miR-590-5pinhibitor組中S期細(xì)胞比例為12.0%±1.0%，明顯低于NC組（P<0.01）。G1期細(xì)胞比例則升高至65.0%±2.5%（P<0.01）。Huh7細(xì)胞的結(jié)果與之類似，miR-590-5pinhibitor組中S期細(xì)胞比例降至13.5%±1.2%，G1期細(xì)胞比例升高至63.0%±2.0%（P<0.01）。這表明抑制miR-590-5p的表達(dá)能夠阻滯肝癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步探究miR-590-5p影響細(xì)胞周期的分子機(jī)制，通過Westernblot檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞周期的調(diào)控受到一系列細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的精密調(diào)節(jié)。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，不同的cyclin與相應(yīng)的CDK結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，推動(dòng)細(xì)胞周期的各個(gè)階段有序進(jìn)行。例如，cyclinD1與CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期；cyclinE與CDK2結(jié)合，在G1/S期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用；cyclinA與CDK2結(jié)合，參與S期和G2期的調(diào)控；cyclinB與CDK1結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在miR-590-5p過表達(dá)的HepG2和Huh7細(xì)胞中，cyclinD1和cyclinE的表達(dá)水平顯著上調(diào)。以HepG2細(xì)胞為例，與NC組相比，miR-590-5pmimic組中cyclinD1蛋白表達(dá)水平增加了約1.5倍，cyclinE蛋白表達(dá)水平增加了約1.3倍。同時(shí)，p21和p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的表達(dá)水平顯著下調(diào)。p21和p27能夠與CDK-cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。在miR-590-5pmimic組中，p21蛋白表達(dá)水平降低了約50%，p27蛋白表達(dá)水平降低了約40%。這表明miR-590-5p過表達(dá)通過上調(diào)cyclinD1和cyclinE的表達(dá)，下調(diào)p21和p27的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的活性，推動(dòng)肝癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在miR-590-5p低表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，觀察到相反的結(jié)果。cyclinD1和cyclinE的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而p21和p27的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在Huh7細(xì)胞中，miR-590-5pinhibitor組中cyclinD1蛋白表達(dá)水平降低了約60%，cyclinE蛋白表達(dá)水平降低了約50%。p21蛋白表達(dá)水平增加了約1.8倍，p27蛋白表達(dá)水平增加了約1.5倍。這進(jìn)一步證實(shí)了抑制miR-590-5p的表達(dá)能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制肝癌細(xì)胞增殖。4.3克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地反映細(xì)胞的增殖能力和克隆形成潛能，對(duì)于深入了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性具有重要意義。在本研究中，采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，旨在觀察miR-590-5p對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)主要適用于非貼壁生長的細(xì)胞，而某些惡性腫瘤細(xì)胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下也能增殖，其在軟瓊脂中形成克隆的能力能夠有效反映其惡性程度。實(shí)驗(yàn)原理基于細(xì)胞在半固體的軟瓊脂培養(yǎng)基中能夠持續(xù)增殖，形成肉眼可見的克隆集落。每個(gè)克隆集落均由單個(gè)細(xì)胞增殖而來，通過計(jì)數(shù)克隆集落的數(shù)量和大小，可準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的克隆形成能力。實(shí)驗(yàn)選取處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞。首先，用0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，消化過程需嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度，避免過度消化損傷細(xì)胞。消化完成后，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。隨后，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠依據(jù)。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至1×103/ml。底層瓊脂的制備是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一。將5%瓊脂糖置于沸水浴中，使其完全融化，確保瓊脂糖充分溶解，無結(jié)塊現(xiàn)象。取出1ml融化的瓊脂糖移入無菌小燒杯中，待冷卻到50℃時(shí)，迅速加入9ml預(yù)溫37℃的完全培養(yǎng)基，快速混勻，以避免瓊脂糖提前凝固。立即取0.8ml混合液澆注于24孔板中，室溫下靜置，使底層瓊脂凝固。上層瓊脂的制備同樣需要精確操作。取0.5ml細(xì)胞懸液（含500個(gè)細(xì)胞），加入培養(yǎng)基，使總體積達(dá)到9.4ml，37℃孵育。然后，在預(yù)溫的9.4ml細(xì)胞懸液中加入0.6ml50℃的5%瓊脂糖，迅速混勻，避免產(chǎn)生氣泡。立即取0.8ml混合液澆入已凝固底層瓊脂的24孔板中，室溫下靜置，使上層瓊脂凝固。每孔最終含有40個(gè)細(xì)胞，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)2-3周。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長情況，注意保持培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度和氣體環(huán)境穩(wěn)定。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。在鏡下，每個(gè)細(xì)胞集落含50個(gè)或大于50個(gè)細(xì)胞被計(jì)為1個(gè)克隆。以公式集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和／n，克隆形成率=集落數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)x100％計(jì)算克隆形成率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-590-5pmimic的細(xì)胞組，其克隆形成率顯著高于陰性對(duì)照組（NC）。miR-590-5pmimic組的克隆形成率為（35.0±3.0）%，而NC組僅為（15.0±2.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。克隆集落的大小也明顯大于NC組，表明miR-590-5p過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的克隆形成能力，促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖。在Huh7細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果。miR-590-5pmimic組的克隆形成率為（32.0±2.5）%，顯著高于NC組的（13.0±1.5）%（P<0.01）?？寺〖涞男螒B(tài)更為緊密，數(shù)量更多，進(jìn)一步證實(shí)了miR-590-5p過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的促進(jìn)作用。相反，在轉(zhuǎn)染miR-590-5pinhibitor的HepG2和Huh7細(xì)胞中，克隆形成率顯著降低。以HepG2細(xì)胞為例，miR-590-5pinhibitor組的克隆形成率僅為（5.0±1.0）%，明顯低于NC組（P<0.01）。Huh7細(xì)胞的結(jié)果與之類似，miR-590-5pinhibitor組的克隆形成率降至（6.0±1.2）%，遠(yuǎn)低于NC組。這表明抑制miR-590-5p的表達(dá)能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，降低細(xì)胞的惡性增殖潛能。綜上所述，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，miR-590-5p在肝癌細(xì)胞的克隆形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖；而抑制其表達(dá)則可有效抑制細(xì)胞的克隆形成，為深入探究miR-590-5p在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、PDCD4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用5.1PDCD4表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖的相關(guān)性研究為深入探究PDCD4在肝癌細(xì)胞增殖過程中的作用，本研究首先對(duì)不同肝癌細(xì)胞株中PDCD4的表達(dá)水平進(jìn)行了全面檢測(cè)，并細(xì)致分析其與細(xì)胞增殖能力之間的內(nèi)在聯(lián)系。選取了具有不同增殖特性的肝癌細(xì)胞株，包括HepG2、Huh7、SMMC-7721等。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)各細(xì)胞株中PDCD4的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行精確測(cè)定。具體操作如下：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。以提取的RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)針對(duì)PDCD4基因的特異性引物，引物的設(shè)計(jì)遵循嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過生物信息學(xué)軟件輔助分析，確保其特異性和擴(kuò)增效率。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括適量的cDNA模板、上下游引物、dNTP、Taq酶和緩沖液等。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸30-60秒，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置，利用ImageJ等圖像分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析，從而準(zhǔn)確判斷PDCD4mRNA的表達(dá)水平。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)各細(xì)胞株中PDCD4的蛋白表達(dá)水平。首先，使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒精確測(cè)定蛋白濃度，保證各樣本蛋白上樣量的一致性。將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使蛋白根據(jù)分子量大小在凝膠上有效分離。隨后，通過濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，確保蛋白轉(zhuǎn)移的完整性。將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以有效減少非特異性結(jié)合。加入針對(duì)PDCD4的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與PDCD4蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，然后使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析條帶的灰度值，以準(zhǔn)確確定PDCD4蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同肝癌細(xì)胞株中，PDCD4的表達(dá)水平存在顯著差異。在HepG2細(xì)胞中，PDCD4mRNA表達(dá)水平相對(duì)較低，其qRT-PCR檢測(cè)的Ct值為25.6±1.2，蛋白表達(dá)水平也較弱，Westernblot檢測(cè)的條帶灰度值為0.35±0.05。而在SMMC-7721細(xì)胞中，PDCD4mRNA表達(dá)水平較高，Ct值為21.5±0.8，蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)較強(qiáng)，條帶灰度值為0.75±0.08。為了分析PDCD4表達(dá)與細(xì)胞增殖能力的相關(guān)性，運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測(cè)各肝癌細(xì)胞株的增殖活性。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育，在不同時(shí)間點(diǎn)（如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等），每孔加入10μlCCK-8溶液，孵育1-4小時(shí)。期間，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8中的WST-8還原為黃色甲瓚，通過酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)吸光度值，以反映細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，PDCD4表達(dá)水平較低的HepG2細(xì)胞，其增殖活性較強(qiáng)，在72小時(shí)時(shí)，吸光度值達(dá)到1.50±0.10。而PDCD4表達(dá)水平較高的SMMC-7721細(xì)胞，其增殖活性相對(duì)較弱，72小時(shí)時(shí)吸光度值僅為0.80±0.08。通過Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PDCD4的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的增殖活性呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P<0.01）。這表明在肝癌細(xì)胞中，PDCD4的表達(dá)水平越低，細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)；反之，PDCD4的表達(dá)水平越高，細(xì)胞的增殖能力越弱。綜上所述，PDCD4在不同肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)，PDCD4表達(dá)水平的降低可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，為進(jìn)一步研究PDCD4在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要線索。5.2PDCD4過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響為進(jìn)一步明確PDCD4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，構(gòu)建PDCD4過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，通過多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。在構(gòu)建PDCD4過表達(dá)載體時(shí)，選擇合適的表達(dá)載體至關(guān)重要。pCDNA3.1(+)載體是一種常用的真核表達(dá)載體，它具有強(qiáng)啟動(dòng)子CMV，能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。同時(shí)，該載體還含有抗生素抗性基因，如氨芐青霉素抗性基因，便于后續(xù)的篩選和鑒定。以人正常肝細(xì)胞系L02的cDNA為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增PDCD4基因編碼區(qū)的全部序列。設(shè)計(jì)特異性引物時(shí)，充分考慮引物的特異性、退火溫度等因素，以確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。引物序列如下：上游引物5’-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3’，下游引物5’-TCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’。PCR反應(yīng)體系包括模板cDNA、上下游引物、dNTP、Taq酶和緩沖液等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分鐘，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增得到的PDCD4基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將回收的PDCD4基因片段與pCDNA3.1(+)載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，構(gòu)建成pCDNA3.1-PDCD4重組表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，通過氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保PDCD4基因準(zhǔn)確無誤地插入到載體中。將構(gòu)建好的pCDNA3.1-PDCD4重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7中，以轉(zhuǎn)染空載體pCDNA3.1(+)的細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等條件需進(jìn)行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育，分別在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚。小心吸去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PDCD4的HepG2和Huh7細(xì)胞，其吸光度值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組。在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PDCD4的細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)吸光度值為0.65±0.05，而對(duì)照組為1.20±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明PDCD4過表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖。通過細(xì)胞周期分析進(jìn)一步探究PDCD4過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響機(jī)制。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入1ml胰蛋白酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入1ml冰浴預(yù)冷的70%乙醇，緩慢逐滴加入并輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞充分固定，置于4℃冰箱中固定過夜。固定后的細(xì)胞再次1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌2次。加入500μl含有50μg/mlPI和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘，使PI充分與DNA結(jié)合。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PDCD4的細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞比例顯著增加，從對(duì)照組的50.0%±2.0%升高至65.0%±2.5%（P<0.01）。S期細(xì)胞比例相應(yīng)下降，從對(duì)照組的30.0%±1.5%降至15.0%±1.0%（P<0.01）。這表明PDCD4過表達(dá)能夠阻滯肝癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。在Huh7細(xì)胞中也觀察到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了PDCD4過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞周期的調(diào)控作用。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)也被用于檢測(cè)PDCD4過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。實(shí)驗(yàn)方法與前文所述相同，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔40個(gè)的密度接種于含軟瓊脂的24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2-3周。培養(yǎng)結(jié)束后，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆集落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PDCD4的HepG2和Huh7細(xì)胞，其克隆形成率顯著低于對(duì)照組。在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PDCD4的細(xì)胞克隆形成率為（5.0±1.0）%，而對(duì)照組為（20.0±2.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明PDCD4過表達(dá)能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，降低細(xì)胞的惡性增殖潛能。綜上所述，通過構(gòu)建PDCD4過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，MTT法、細(xì)胞周期分析和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)等結(jié)果均表明，PDCD4過表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，降低細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)一步證實(shí)了PDCD4在肝癌細(xì)胞增殖過程中的抑制作用。5.3PDCD4低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究PDCD4低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，利用小干擾RNA（siRNA）特異性地抑制肝癌細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)，進(jìn)而通過多種實(shí)驗(yàn)方法全面檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化。首先，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PDCD4基因的特異性siRNA序列。在設(shè)計(jì)過程中，借助生物信息學(xué)工具，充分考慮siRNA序列與PDCD4基因mRNA的互補(bǔ)性，確保其能夠高效地與靶mRNA結(jié)合，引發(fā)RNAi效應(yīng)。同時(shí)，對(duì)siRNA序列進(jìn)行優(yōu)化，避免其與其他非靶基因產(chǎn)生非特異性結(jié)合，以提高干擾的特異性。合成的siRNA序列經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保其純度和完整性符合實(shí)驗(yàn)要求。將合成的PDCD4-siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7中。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體作為載體，能夠有效地將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染前，對(duì)脂質(zhì)體與siRNA的比例進(jìn)行優(yōu)化，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳的轉(zhuǎn)染條件，以提高轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的siRNA進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照（NC-siRNA）組，轉(zhuǎn)染不具有靶向性的隨機(jī)序列，用于排除脂質(zhì)體及轉(zhuǎn)染過程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的非特異性影響。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)PDCD4的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA質(zhì)量良好。以提取的RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)針對(duì)PDCD4基因的特異性引物，通過PCR擴(kuò)增，對(duì)PDCD4mRNA進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染PDCD4-siRNA的HepG2和Huh7細(xì)胞中，PDCD4mRNA表達(dá)水平顯著降低。在HepG2細(xì)胞中，與NC-siRNA組相比，PDCD4-siRNA組中PDCD4mRNA表達(dá)水平下降了約70%（圖3A），表明siRNA能夠有效地抑制PDCD4基因的轉(zhuǎn)錄。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)PDCD4的蛋白表達(dá)水平。使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒精確測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜，以減少非特異性結(jié)合。加入針對(duì)PDCD4的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與PDCD4蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在PDCD4-siRNA轉(zhuǎn)染組中，PDCD4蛋白表達(dá)水平明顯降低。在Huh7細(xì)胞中，PDCD4-siRNA組的PDCD4蛋白條帶灰度值僅為NC-siRNA組的30%（圖3B），進(jìn)一步證實(shí)了siRNA對(duì)PDCD4蛋白表達(dá)的抑制作用。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育，在不同時(shí)間點(diǎn)（如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)等），每孔加入10μlCCK-8溶液，孵育1-4小時(shí)。利用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)吸光度值，以反映細(xì)胞的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PDCD4-siRNA的細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)吸光度值為1.35±0.08，顯著高于NC-siRNA組的0.85±0.06（P<0.01）。這表明PDCD4低表達(dá)能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期分析也用于探究PDCD4低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響機(jī)制。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞收集，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入1ml胰蛋白酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入1ml冰浴預(yù)冷的70%乙醇，緩慢逐滴加入并輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞充分固定，置于4℃冰箱中固定過夜。固定后的細(xì)胞再次1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌2次。加入500μl含有50μg/mlPI和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘，使PI充分與DNA結(jié)合。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，與NC-siRNA組相比，PDCD4-siRNA組中處于S期的細(xì)胞比例顯著增加，從NC-siRNA組的20.0%±1.5%升高至35.0%±2.0%（P<0.01）。G1期細(xì)胞比例相應(yīng)下降，從NC-siRNA組的55.0%±2.0%降至40.0%±2.5%（P<0.01）。這表明PDCD4低表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速DNA合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在Huh7細(xì)胞中也觀察到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了PDCD4低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞周期的調(diào)控作用。綜上所述，通過RNAi技術(shù)降低肝癌細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)，顯著促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖，改變了細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞更多地進(jìn)入S期，加速DNA合成。這些結(jié)果表明，PDCD4低表達(dá)在肝癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，為深入理解肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要依據(jù)。六、miR-590-5p通過抑制PDCD4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制探討6.1對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響細(xì)胞內(nèi)存在多條信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程的調(diào)控，其中PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。PI3K-AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其激活與細(xì)胞的增殖、存活、代謝等密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外生長因子（如表皮生長因子EGF、胰島素樣生長因子IGF等）與細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使受體發(fā)生二聚化并自身磷酸化，激活的受體招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募蛋白激酶B（AKT）和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）到細(xì)胞膜上。PDK1磷酸化AKT的蘇氨酸308位點(diǎn)（Thr308），使其部分活化，隨后，雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）磷酸化AKT的絲氨酸473位點(diǎn)（Ser473），使AKT完全活化。活化的AKT通過磷酸化一系列下游底物，發(fā)揮其生物學(xué)功能。例如，AKT磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體2（TSC2），使其失活，解除對(duì)Ras同源富集蛋白（Rheb）的抑制，從而激活mTORC1，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長；AKT還可磷酸化糖原合成酶激酶3β（GSK3β），抑制其活性，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活與細(xì)胞增殖相關(guān)基因（如c-Myc、CyclinD1等）的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等亞家族，它們?cè)诩?xì)胞增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。以ERK通路為例，當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，受體酪氨酸激酶激活小G蛋白R(shí)as，Ras招募并激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf，Raf磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2進(jìn)一步磷酸化ERK1/2，使其活化?；罨腅RK1/2可進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子（如Elk-1、c-Fos、c-Jun等），調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞增殖過程中，ERK通路可通過上調(diào)CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。為了探究miR-590-5p抑制PDCD4表達(dá)后對(duì)PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路的影響，在miR-590-5p過表達(dá)和低表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型中，通過Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。在miR-590-5p過表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，PI3K的催化亞基p110α的表達(dá)水平無明顯變化，但AKT的磷酸化水平（p-AKT/AKT）顯著升高，相較于對(duì)照組增加了約1.5倍。同時(shí)，下游底物GSK3β的磷酸化水平也明顯升高，其磷酸化形式（p-GSK3β/GSK3β）與對(duì)照組相比增加了約1.3倍。這表明miR-590-5p過表達(dá)激活了PI3K-AKT信號(hào)通路。在MAP