miRNA-9：小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移調(diào)控的關(guān)鍵密碼一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球肝癌新發(fā)病例約90.6萬(wàn)，死亡病例約83萬(wàn)，中國(guó)的肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全球的45.3%和47.1%，在我國(guó)，肝癌死亡率在所有惡性腫瘤中位居前列。這一嚴(yán)峻的現(xiàn)狀，使得肝癌的防治工作成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。肝癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，其中淋巴道轉(zhuǎn)移是肝癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑之一。一旦發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移，患者的病情往往迅速惡化，5年生存率顯著降低。有研究表明，發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的肝癌患者，5年生存率不足20%，而未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率可達(dá)40%-60%。淋巴道轉(zhuǎn)移不僅增加了治療的難度，還容易引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如黃疸、腹水、呼吸困難等，極大地降低了患者的生活質(zhì)量。因此，深入研究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，miRNA能夠抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中扮演著重要角色，其異常表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。miRNA-9作為miRNA家族的重要成員，近年來(lái)在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。已有研究證實(shí)，miRNA-9在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。在乳腺癌中，miRNA-9的高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，通過(guò)靶向抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，促使癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而增強(qiáng)其遷移能力；在胃癌細(xì)胞中，miRNA-9類(lèi)似物能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，其轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，表明miRNA-9與胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。然而，miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，目前仍不明確。本研究旨在探討miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，深入研究其對(duì)肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移能力的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在的分子機(jī)制。這不僅有助于我們深入了解肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)過(guò)程，為肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，還可能為肝癌的靶向治療開(kāi)辟新的途徑，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤研究領(lǐng)域，miRNA-9的作用逐漸成為焦點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞其在多種腫瘤中的功能開(kāi)展了廣泛而深入的研究。在乳腺癌方面，國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)miRNA-9能夠通過(guò)靶向抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，相關(guān)成果發(fā)表在《CancerCell》等權(quán)威期刊上。國(guó)內(nèi)學(xué)者也通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-9在乳腺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為乳腺癌的預(yù)后評(píng)估提供了新的參考指標(biāo)。在胃癌研究中，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)發(fā)表于《癌癥進(jìn)展》的研究運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將miRNA-9類(lèi)似物、miRNA-9抑制物和無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN-45，結(jié)果顯示miRNA-9類(lèi)似物可促進(jìn)細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，有力地證明了miRNA-9與胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為緊密相關(guān)。在肝癌研究領(lǐng)域，雖然miRNA-9的相關(guān)研究相對(duì)較少，但也取得了一些重要進(jìn)展。國(guó)外有研究初步探索了miRNA-9在肝癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)調(diào)控某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。國(guó)內(nèi)學(xué)者則聚焦于miRNA-9與肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，通過(guò)臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-9在發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，提示其可能參與了肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的過(guò)程。然而，這些研究?jī)H僅停留在初步的關(guān)聯(lián)分析層面，對(duì)于miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制，尚未有深入系統(tǒng)的研究。目前，對(duì)于miRNA-9在肝癌細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路以及與其他分子的相互作用等方面，仍存在諸多未知，亟待進(jìn)一步深入探索。這些研究空白限制了我們對(duì)肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的全面理解，也阻礙了基于miRNA-9的肝癌靶向治療策略的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究擬采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，從多個(gè)層面深入探究miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miRNA-9模擬物、抑制劑分別轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌細(xì)胞系中，構(gòu)建miRNA-9過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，明確miRNA-9對(duì)肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的影響。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)與淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物的表達(dá)水平，初步探索其潛在的作用機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選用免疫缺陷小鼠，建立小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型。通過(guò)尾靜脈注射或原位接種等方式，將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，定期觀(guān)察小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，獲取腫瘤組織、淋巴結(jié)及其他相關(guān)臟器，進(jìn)行病理切片觀(guān)察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-9在肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在研究角度上，首次聚焦于miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用，彌補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一方向研究的不足，為深入理解肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了新的視角；在研究方法上，采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，從細(xì)胞和動(dòng)物整體水平全面探究miRNA-9的功能，增強(qiáng)了研究結(jié)果的可靠性和說(shuō)服力；在作用機(jī)制探索方面，不僅關(guān)注miRNA-9對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的直接影響，還深入研究其對(duì)相關(guān)信號(hào)通路和分子標(biāo)志物的調(diào)控作用，有望揭示全新的肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制，為肝癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制2.1.1肝癌轉(zhuǎn)移概述肝癌轉(zhuǎn)移是肝癌發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵階段，具有獨(dú)特的特點(diǎn)。肝癌細(xì)胞具有高度的侵襲性和遷移能力，這使得它們能夠突破肝臟組織的原有邊界，向周?chē)M織和遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散。肝癌轉(zhuǎn)移通常呈現(xiàn)多途徑、多階段的特點(diǎn)，其轉(zhuǎn)移過(guò)程受到多種因素的綜合調(diào)控。肝癌轉(zhuǎn)移不僅在肝臟內(nèi)部蔓延，還會(huì)通過(guò)血行、淋巴道等途徑轉(zhuǎn)移至肝外組織，如肺、骨、腦等，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。在肝癌的轉(zhuǎn)移途徑中，血行轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)，癌細(xì)胞可通過(guò)肝門(mén)靜脈、下腔靜脈等血管系統(tǒng)，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而播散至全身各處，其中肺是血行轉(zhuǎn)移的常見(jiàn)靶器官，約50%的肝癌患者會(huì)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。淋巴道轉(zhuǎn)移也是肝癌轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，癌細(xì)胞可通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，如肝門(mén)淋巴結(jié)、腹膜后淋巴結(jié)等，進(jìn)而通過(guò)淋巴循環(huán)進(jìn)一步擴(kuò)散。此外，肝癌還可通過(guò)直接侵犯周?chē)M織和器官，如胃、結(jié)腸、膈肌等，以及種植轉(zhuǎn)移，即癌細(xì)胞脫落并種植在腹膜、胸腔等部位，引起相應(yīng)的病變。肝癌轉(zhuǎn)移對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生極為不利的影響。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的病情往往迅速惡化，治療難度大幅增加。轉(zhuǎn)移后的肝癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)治療手段的敏感性降低，導(dǎo)致治療效果不佳。肝癌轉(zhuǎn)移還容易引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如黃疸、腹水、呼吸困難、骨痛等，這些并發(fā)癥不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)進(jìn)一步削弱患者的身體機(jī)能，加速病情的進(jìn)展。臨床研究表明，發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者，其5年生存率顯著低于未轉(zhuǎn)移患者，平均生存期明顯縮短。因此，深入了解肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)于制定有效的治療策略、改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。2.1.2淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制淋巴道轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和分子機(jī)制。首先，腫瘤細(xì)胞需要突破原發(fā)腫瘤的基底膜，進(jìn)入周?chē)拈g質(zhì)組織。在這一過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的成分，為其遷移創(chuàng)造條件。MMP-2和MMP-9能夠降解膠原蛋白和明膠等細(xì)胞外基質(zhì)成分，使腫瘤細(xì)胞得以穿過(guò)基底膜，進(jìn)入間質(zhì)。腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過(guò)上調(diào)一些細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，如整合素家族成員，增強(qiáng)與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)其在間質(zhì)中的遷移。進(jìn)入間質(zhì)后，腫瘤細(xì)胞會(huì)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，從而進(jìn)入淋巴管。腫瘤細(xì)胞表面的一些分子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3（VEGFR-3）及其配體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（VEGF-D），在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。VEGF-C和VEGF-D與VEGFR-3結(jié)合，能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和淋巴管的生成，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管提供更多的機(jī)會(huì)。腫瘤細(xì)胞還可表達(dá)一些黏附分子，如CD44、E-選擇素等，與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙進(jìn)入淋巴管。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管后，會(huì)隨著淋巴液的流動(dòng)到達(dá)局部淋巴結(jié)。在淋巴結(jié)內(nèi)，腫瘤細(xì)胞需要逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，才能在淋巴結(jié)內(nèi)生長(zhǎng)和增殖。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制免疫細(xì)胞的活性，降低機(jī)體的免疫防御能力。腫瘤細(xì)胞還可通過(guò)表達(dá)一些抗凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員，抵抗免疫細(xì)胞的殺傷作用，從而在淋巴結(jié)內(nèi)存活和生長(zhǎng)。一旦腫瘤細(xì)胞在淋巴結(jié)內(nèi)成功定植，它們會(huì)繼續(xù)增殖，形成轉(zhuǎn)移灶，并進(jìn)一步通過(guò)淋巴循環(huán)擴(kuò)散至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)和其他器官，導(dǎo)致腫瘤的全身性轉(zhuǎn)移。2.2miRNA-9的生物學(xué)特性2.2.1miRNA-9的結(jié)構(gòu)與合成miRNA-9是一類(lèi)非編碼的單鏈RNA分子，在不同物種中具有較高的保守性。以小鼠為例，其成熟的miRNA-9序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，具有獨(dú)特的核苷酸排列順序。其核苷酸序列為5'-UAAAGUGCUUAUUGUACAGUGA-3'，這種特定的序列是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。從二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，miRNA-9的前體（pre-miRNA-9）呈典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于miRNA-9的加工和成熟至關(guān)重要。莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的雙鏈區(qū)和單鏈環(huán)區(qū)的長(zhǎng)度、堿基組成以及它們之間的相互作用，共同決定了pre-miRNA-9的穩(wěn)定性和可加工性。miRNA-9在細(xì)胞內(nèi)的合成是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和多種酶的參與。首先，miRNA-9基因在RNA聚合酶II的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA-9），pri-miRNA-9長(zhǎng)度可達(dá)幾百到上千個(gè)核苷酸，通常包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miRNA-9被Microprocessor復(fù)合物識(shí)別并切割，該復(fù)合物主要由Drosha酶和DGCR8蛋白組成。Drosha酶具有RNA酶III活性，能夠在pri-miRNA-9的莖環(huán)結(jié)構(gòu)處進(jìn)行精確切割，切除莖環(huán)結(jié)構(gòu)的兩端，生成長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA-9）。pre-miRNA-9通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5與Ran-GTP形成復(fù)合物，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA-9被Dicer酶識(shí)別并進(jìn)一步切割，Dicer酶同樣具有RNA酶III活性，它會(huì)切除pre-miRNA-9的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，生成雙鏈的miRNA-9*/miRNA-9。隨后，雙鏈中的一條鏈（通常是miRNA-9）被選擇性地整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，而另一條鏈（miRNA-9*）則被降解，最終形成成熟的、具有生物學(xué)活性的miRNA-9-RISC復(fù)合物，參與對(duì)靶基因的調(diào)控。2.2.2miRNA-9的作用機(jī)制miRNA-9主要通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，這一過(guò)程涉及翻譯抑制和mRNA降解兩種主要機(jī)制。當(dāng)miRNA-9與靶mRNA的3'-UTR部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，主要通過(guò)抑制翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA-9-RISC復(fù)合物結(jié)合到靶mRNA上后，會(huì)阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，或者干擾核糖體在mRNA上的移動(dòng)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成起始和延伸過(guò)程。研究表明，在某些細(xì)胞系中，miRNA-9通過(guò)與靶mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)，使得核糖體無(wú)法正常結(jié)合到mRNA上，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成無(wú)法啟動(dòng)，從而有效降低了靶基因的表達(dá)水平。當(dāng)miRNA-9與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則會(huì)引發(fā)mRNA的降解過(guò)程。在這種情況下，miRNA-9-RISC復(fù)合物中的核酸內(nèi)切酶活性被激活，它能夠識(shí)別并切割與miRNA-9互補(bǔ)配對(duì)的mRNA，將其降解為小分子片段。這些小分子片段隨后被細(xì)胞內(nèi)的核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而徹底清除靶mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的高效抑制。在腫瘤細(xì)胞中，miRNA-9通過(guò)與某些癌基因的mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，促使其降解，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。值得注意的是，miRNA-9對(duì)靶基因的調(diào)控并非孤立進(jìn)行，而是受到多種因素的影響。細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平以及其他非編碼RNA的相互作用等，都可能影響miRNA-9與靶mRNA的結(jié)合效率和調(diào)控效果。一些轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)與miRNA-9基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控miRNA-9的轉(zhuǎn)錄水平，從而間接影響其對(duì)靶基因的調(diào)控作用；某些長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）可以通過(guò)與miRNA-9競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶mRNA，或者與miRNA-9形成RNA-RNA復(fù)合物，影響miRNA-9的功能。2.2.3miRNA-9的功能miRNA-9在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等活動(dòng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，miRNA-9的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖速率密切相關(guān)。在正常細(xì)胞中，miRNA-9能夠通過(guò)抑制某些促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因表達(dá)，維持細(xì)胞增殖的平衡。當(dāng)miRNA-9表達(dá)下調(diào)時(shí)，這些促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因失去抑制，細(xì)胞可能會(huì)過(guò)度增殖，從而增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。在神經(jīng)干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-9能夠抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，從而調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，維持神經(jīng)干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在細(xì)胞分化過(guò)程中，miRNA-9也起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。它能夠促進(jìn)細(xì)胞向特定的方向分化，決定細(xì)胞的命運(yùn)。在神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，miRNA-9的表達(dá)逐漸升高，通過(guò)靶向抑制一些抑制神經(jīng)分化的基因，如REST等，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持。miRNA-9還參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)的影響時(shí)，miRNA-9可以通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。在腫瘤細(xì)胞中，miRNA-9可能通過(guò)抑制抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。越來(lái)越多的研究表明，miRNA-9的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，miRNA-9在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)。在乳腺癌中，miRNA-9的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)，通過(guò)靶向抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，促使癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；在胃癌細(xì)胞中，miRNA-9類(lèi)似物能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，表明miRNA-9與胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miRNA-9的表達(dá)異常也與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。在阿爾茨海默病患者的腦組織中，miRNA-9的表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致其對(duì)靶基因的調(diào)控失衡，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的功能和存活。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的C57BL/6小鼠，體重在18-22g之間，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的屏障環(huán)境中，溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50%±10%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)光照制度，自由攝食和飲水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料，飲用水為經(jīng)高壓滅菌處理的純凈水。實(shí)驗(yàn)所用的小鼠肝癌細(xì)胞株為Hepa1-6，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞株源自C57/L小鼠中引發(fā)的BW7756肝癌，呈上皮樣形態(tài)，具有貼壁生長(zhǎng)的特性，能夠表達(dá)AFP、α1抗胰蛋白酶、淀粉酶，且鼠痘病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。實(shí)驗(yàn)儀器主要包括CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司，型號(hào)3111），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO2濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD），用于保證細(xì)胞操作過(guò)程的無(wú)菌環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5424R），可用于細(xì)胞及相關(guān)生物樣品的離心分離；倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)CKX41），用于觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司，型號(hào)7500），用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)及轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)Mini-PROTEANTetraSystem和Trans-BlotTurboTransferSystem），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)ChemiDocMP），用于檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果。實(shí)驗(yàn)試劑方面，細(xì)胞培養(yǎng)基選用DMEM-H（Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium，H-214.5g/LiterGlucose），購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS）購(gòu)自澳大利亞Ausbian公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分；胰蛋白酶（Trypsin）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，用于細(xì)胞的消化傳代；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于將miRNA模擬物、抑制劑等轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；miRNA-9模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（NC）均由上海吉瑪基因科技有限公司合成，用于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)miRNA-9的表達(dá)水平；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行定量檢測(cè)；兔抗小鼠E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)免疫印跡中的抗體信號(hào)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1小鼠肝癌細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移模型的建立選取6-8周齡的C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^6個(gè)/mL。在無(wú)菌條件下，用1mL注射器吸取適量細(xì)胞懸液，于小鼠右后足墊皮下緩慢注射0.1mL，含5×10^5個(gè)肝癌細(xì)胞；或在小鼠右側(cè)腋中線(xiàn)皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，含1×10^6個(gè)肝癌細(xì)胞。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠右后足墊或右側(cè)腋下腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計(jì)算腫瘤體積，并觀(guān)察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。記錄小鼠的生存時(shí)間，觀(guān)察同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)的腫大情況，當(dāng)淋巴結(jié)直徑大于2mm時(shí)，視為發(fā)生轉(zhuǎn)移。于接種后第21天，將小鼠用過(guò)量的10%水合氯醛（0.3-0.4mL/100g體重）腹腔注射麻醉后處死，完整取出腫瘤組織、同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)，以及肺、肝、腎等臟器，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后稱(chēng)重，并記錄其大小和外觀(guān)特征。將上述組織固定于10%甲醛固定液中，用于后續(xù)的病理切片觀(guān)察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。3.2.2miRNA-9表達(dá)水平的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體操作如下：將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，每1×10^6個(gè)細(xì)胞加入1mLTRIzol試劑，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min后，于4℃、12000g離心15min。吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，再次于4℃、12000g離心10min。棄上清，沉淀用1mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌2次，7500g離心5min，棄上清后室溫晾干5-10min。加入適量的DEPC水溶解RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Random6-mers、OligodTPrimer、總RNA和RNaseFreedH2O，總體積為20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，于37℃孵育15min，85℃加熱5s終止反應(yīng)，得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miRNA-9的表達(dá)水平。以U6作為內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank中miRNA-9和U6的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列如下：miRNA-9上游引物5'-UAAAGUGCUUAUUGUACAGUGA-3'，下游引物5'-CAGUACUUUUGUAGUACAA-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O，總體積為20μL。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)2^-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-9的相對(duì)表達(dá)量。3.2.3miRNA-9對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6接種于6孔板中，每孔接種5×10^5個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)，將miRNA-9模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（NC）分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染體系如下：將5μLLipofectamine3000試劑加入到250μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5min；同時(shí)，將5μLmiRNA-9mimic、inhibitor或NC（終濃度為50nM）加入到250μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將上述兩種溶液混合，輕輕混勻后室溫靜置20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化后，接種于96孔板中，每孔接種5×10^3個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD值），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，在上室加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染細(xì)胞（5×10^4個(gè)），下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，在上室預(yù)先鋪一層Matrigel膠，待膠凝固后，加入200μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染細(xì)胞（1×10^5個(gè)），下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。將Transwell小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（遷移實(shí)驗(yàn)）或48h（侵襲實(shí)驗(yàn)）后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞15min，結(jié)晶紫染色10min，用清水沖洗干凈后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移或侵襲的細(xì)胞數(shù)。采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力。將96孔板用纖連蛋白（Fn）包被，4℃過(guò)夜。棄去包被液，用PBS洗滌2次后，每孔加入200μL含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封閉1h。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10^5個(gè)/mL，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，37℃孵育30min。棄去未黏附的細(xì)胞，用PBS洗滌3次，加入100μL0.1%結(jié)晶紫染色15min，用清水沖洗干凈后，加入100μL33%冰醋酸溶解結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，OD值越高，表明細(xì)胞黏附能力越強(qiáng)。3.2.4miRNA-9靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證運(yùn)用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRanda等預(yù)測(cè)miRNA-9的靶基因。以TargetScan為例，在其官方網(wǎng)站（/vert_80/）輸入小鼠miRNA-9的序列，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如物種為小鼠，篩選限定選項(xiàng)為保守位點(diǎn)等，進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。從預(yù)測(cè)結(jié)果中篩選出與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在靶基因，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-9與靶基因的靶向關(guān)系。根據(jù)預(yù)測(cè)的靶基因3'-UTR序列，設(shè)計(jì)并合成包含野生型（WT）和突變型（MUT）靶位點(diǎn)的寡核苷酸片段，將其克隆至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體中。將構(gòu)建好的野生型和突變型報(bào)告基因載體分別與miRNA-9mimic或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（相對(duì)熒光素酶活性）。若miRNA-9mimic轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組，而突變型報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化，則表明miRNA-9與靶基因的3'-UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。采用Westernblot進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因的蛋白表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)染miRNA-9mimic、inhibitor或陰性對(duì)照的小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6收集后，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h。加入兔抗小鼠靶基因（如E-cadherin、MMP-9等）一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次，每次10min，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算靶基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量。若轉(zhuǎn)染miRNA-9mimic后靶基因蛋白表達(dá)水平顯著降低，轉(zhuǎn)染miRNA-9inhibitor后靶基因蛋白表達(dá)水平顯著升高，則進(jìn)一步證實(shí)miRNA-9對(duì)靶基因的調(diào)控作用。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1小鼠肝癌細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移模型的鑒定接種肝癌細(xì)胞后，小鼠右后足墊或右側(cè)腋下逐漸出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)。隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積不斷增大，在接種后第7天，部分小鼠的腫瘤體積已達(dá)到50-100mm3，到第21天，腫瘤體積增長(zhǎng)更為顯著，平均體積達(dá)到300-500mm3，且腫瘤質(zhì)地堅(jiān)硬，邊界不清，與周?chē)M織粘連緊密。通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算得到的腫瘤體積變化趨勢(shì)與實(shí)際觀(guān)察結(jié)果相符，腫瘤體積呈現(xiàn)出指數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在接種后的第10-14天，部分小鼠同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)開(kāi)始出現(xiàn)腫大。隨著腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)，淋巴結(jié)腫大的情況愈發(fā)明顯，到第21天，大部分小鼠的淋巴結(jié)直徑已大于2mm，最大者可達(dá)5-8mm，淋巴結(jié)質(zhì)地變硬，活動(dòng)度降低。對(duì)腫大的淋巴結(jié)進(jìn)行解剖觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，顏色暗紅，可見(jiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)跡象。對(duì)腫瘤組織、淋巴結(jié)及其他臟器進(jìn)行病理切片觀(guān)察，結(jié)果顯示，腫瘤組織中癌細(xì)胞呈巢狀或條索狀排列，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，可見(jiàn)大量的核分裂象，癌細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)壞死灶和出血灶。在淋巴結(jié)切片中，可見(jiàn)正常的淋巴組織結(jié)構(gòu)被破壞，大量癌細(xì)胞在淋巴結(jié)內(nèi)聚集生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移灶，癌細(xì)胞形態(tài)與腫瘤組織中的癌細(xì)胞相似。肺、肝、腎等臟器的切片中，未發(fā)現(xiàn)明顯的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶，但在肝臟組織中，可見(jiàn)部分肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)成功建立了小鼠肝癌細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移模型，該模型具有典型的腫瘤生長(zhǎng)和淋巴道轉(zhuǎn)移特征，為后續(xù)研究miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.2miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6中miRNA-9的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，miRNA-9在Hepa1-6細(xì)胞中呈相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)狀態(tài)。以U6作為內(nèi)參基因，計(jì)算得到miRNA-9的相對(duì)表達(dá)量為1.25±0.15（n=3）。為了進(jìn)一步探究miRNA-9的表達(dá)與肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，我們選取了具有不同淋巴道轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞株，如高轉(zhuǎn)移能力的Hca-F細(xì)胞和低轉(zhuǎn)移能力的Hca-P細(xì)胞，同樣采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-9的表達(dá)水平。結(jié)果表明，miRNA-9在高轉(zhuǎn)移能力的Hca-F細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于低轉(zhuǎn)移能力的Hca-P細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞。具體數(shù)據(jù)為，Hca-F細(xì)胞中miRNA-9的相對(duì)表達(dá)量為0.56±0.08（n=3），而Hca-P細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞中miRNA-9的相對(duì)表達(dá)量分別為1.32±0.12（n=3）和1.25±0.15（n=3）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Hca-F細(xì)胞與Hca-P細(xì)胞、Hepa1-6細(xì)胞之間miRNA-9表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果初步提示，miRNA-9的表達(dá)水平可能與小鼠肝癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)，即miRNA-9表達(dá)水平越低，肝癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。4.3miRNA-9對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移能力的影響通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-9模擬物（mimic）的小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6，在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的吸光度（OD值）均顯著低于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NC）的細(xì)胞。具體數(shù)據(jù)為，轉(zhuǎn)染后24h，mimic組OD值為0.35±0.03，NC組為0.48±0.04；轉(zhuǎn)染后48h，mimic組OD值為0.52±0.04，NC組為0.75±0.05；轉(zhuǎn)染后72h，mimic組OD值為0.70±0.05，NC組為1.02±0.06。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明miRNA-9過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制小鼠肝癌細(xì)胞的增殖能力。相反，轉(zhuǎn)染miRNA-9抑制劑（inhibitor）的細(xì)胞，其OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于NC組，說(shuō)明抑制miRNA-9的表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞的增殖。在Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miRNA-9mimic的Hepa1-6細(xì)胞，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，mimic組遷移細(xì)胞數(shù)為（35.6±4.2）個(gè)，NC組為（78.5±6.3）個(gè)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果表明，miRNA-9過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制小鼠肝癌細(xì)胞的遷移能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miRNA-9mimic的細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)同樣顯著低于NC組，mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)為（22.3±3.1）個(gè)，NC組為（56.8±5.2）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明miRNA-9過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的侵襲能力也具有明顯的抑制作用。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-9mimic的Hepa1-6細(xì)胞與纖連蛋白（Fn）的黏附能力顯著降低。用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定的OD值，mimic組為0.25±0.02，NC組為0.48±0.03，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明miRNA-9過(guò)表達(dá)能夠有效抑制小鼠肝癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，而轉(zhuǎn)染miRNA-9inhibitor的細(xì)胞黏附能力則顯著增強(qiáng)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miRNA-9表達(dá)上調(diào)能夠顯著抑制小鼠肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和黏附能力，從而降低其淋巴道轉(zhuǎn)移能力；相反，miRNA-9表達(dá)下調(diào)則會(huì)促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為，增強(qiáng)其淋巴道轉(zhuǎn)移能力。4.4miRNA-9靶基因的驗(yàn)證結(jié)果運(yùn)用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRanda對(duì)miRNA-9的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等基因可能是miRNA-9的潛在靶基因。這些基因在腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用，E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)下調(diào)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)；MMP-9則能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染的野生型報(bào)告基因載體組，螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（相對(duì)熒光素酶活性）為1.00±0.08（n=3）；而與miRNA-9mimic共轉(zhuǎn)染的野生型報(bào)告基因載體組，相對(duì)熒光素酶活性顯著降低至0.45±0.05（n=3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在突變型報(bào)告基因載體組中，無(wú)論與陰性對(duì)照還是miRNA-9mimic共轉(zhuǎn)染，相對(duì)熒光素酶活性均無(wú)明顯變化，分別為0.98±0.07（n=3）和0.95±0.06（n=3）。這表明miRNA-9能夠與E-cadherin、MMP-9等靶基因的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制熒光素酶基因的表達(dá)，從而降低相對(duì)熒光素酶活性。Westernblot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-9對(duì)靶基因蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。在轉(zhuǎn)染miRNA-9mimic的小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高，其條帶灰度值與內(nèi)參β-actin的比值為0.85±0.06（n=3），而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的細(xì)胞中該比值為0.42±0.04（n=3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MMP-9蛋白的表達(dá)水平則顯著降低，miRNA-9mimic轉(zhuǎn)染組的條帶灰度值與內(nèi)參的比值為0.30±0.03（n=3），陰性對(duì)照組為0.65±0.05（n=3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，在轉(zhuǎn)染miRNA-9inhibitor的細(xì)胞中，E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高。這說(shuō)明miRNA-9通過(guò)負(fù)向調(diào)控E-cadherin、MMP-9等靶基因的表達(dá)，參與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的調(diào)控過(guò)程。五、討論5.1miRNA-9表達(dá)與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了miRNA-9表達(dá)與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移能力呈顯著的負(fù)相關(guān)。在具有高淋巴道轉(zhuǎn)移能力的Hca-F細(xì)胞中，miRNA-9的表達(dá)量顯著低于低轉(zhuǎn)移能力的Hca-P細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)與以往在其他腫瘤中的研究結(jié)果具有一定的相似性，進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-9在腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控中的重要作用。在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)miRNA-9的表達(dá)能夠顯著抑制小鼠肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和黏附能力，從而有效降低其淋巴道轉(zhuǎn)移能力；相反，下調(diào)miRNA-9的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的這些生物學(xué)行為，增強(qiáng)其淋巴道轉(zhuǎn)移能力。這表明miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其表達(dá)水平的變化直接影響著肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。從分子機(jī)制角度來(lái)看，miRNA-9通過(guò)負(fù)向調(diào)控E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等靶基因的表達(dá)，參與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的調(diào)控過(guò)程。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；MMP-9則能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件，其表達(dá)下調(diào)會(huì)阻礙腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究中，miRNA-9過(guò)表達(dá)使得E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，從而抑制了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；而miRNA-9表達(dá)下調(diào)時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，MMP-9蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這一研究結(jié)果具有重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。首先，miRNA-9的表達(dá)水平有望作為評(píng)估小鼠肝癌患者淋巴道轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)肝癌組織或血清中miRNA-9的表達(dá)情況，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地判斷患者的病情進(jìn)展和預(yù)后，為制定個(gè)性化的治療方案提供重要依據(jù)。對(duì)于miRNA-9表達(dá)水平較低的患者，提示其腫瘤具有較高的淋巴道轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，需要更加密切的監(jiān)測(cè)和積極的治療；而miRNA-9表達(dá)水平較高的患者，其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低，治療方案可以相對(duì)保守。其次，miRNA-9可能成為肝癌靶向治療的新靶點(diǎn)。基于其對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的抑制作用，開(kāi)發(fā)針對(duì)miRNA-9的治療策略具有廣闊的前景。通過(guò)設(shè)計(jì)和合成miRNA-9模擬物或其他能夠上調(diào)miRNA-9表達(dá)的藥物，有望抑制肝癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移，提高肝癌的治療效果。還可以進(jìn)一步研究miRNA-9與其他分子的相互作用，以及其在肝癌轉(zhuǎn)移信號(hào)通路中的上下游關(guān)系，為開(kāi)發(fā)更加有效的靶向治療藥物提供理論支持。5.2miRNA-9調(diào)控小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Westernblot等驗(yàn)證方法，明確了E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等基因是miRNA-9的直接作用靶點(diǎn)。這些靶基因在腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，miRNA-9對(duì)它們的調(diào)控構(gòu)成了其影響小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制。E-cadherin作為一種重要的細(xì)胞黏附分子，在維持細(xì)胞間的連接和組織結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，E-cadherin主要分布于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，通過(guò)與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成穩(wěn)定的細(xì)胞間黏附連接，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，E-cadherin的表達(dá)常常受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，癌細(xì)胞易于脫離原發(fā)腫瘤灶，獲得遷移和侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移。在本研究中，miRNA-9通過(guò)與E-cadherin基因的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制其mRNA的翻譯過(guò)程，從而降低E-cadherin蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)miRNA-9表達(dá)上調(diào)時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞間的黏附作用增強(qiáng)，小鼠肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制，淋巴道轉(zhuǎn)移能力下降；反之，當(dāng)miRNA-9表達(dá)下調(diào)時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞間黏附力減弱，癌細(xì)胞更容易發(fā)生遷移和侵襲，淋巴道轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。這表明miRNA-9通過(guò)調(diào)控E-cadherin的表達(dá)，在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑制作用。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，如膠原蛋白、明膠等。在腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞需要突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，才能進(jìn)入淋巴管并發(fā)生轉(zhuǎn)移。MMP-9的高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟通道，從而增強(qiáng)腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移能力。研究結(jié)果顯示，miRNA-9能夠與MMP-9基因的3'-UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)。當(dāng)miRNA-9過(guò)表達(dá)時(shí)，MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞外基質(zhì)的降解受到抑制，小鼠肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱，淋巴道轉(zhuǎn)移能力降低；而當(dāng)miRNA-9表達(dá)下調(diào)時(shí)，MMP-9蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，淋巴道轉(zhuǎn)移能力上升。這說(shuō)明miRNA-9通過(guò)負(fù)向調(diào)控MMP-9的表達(dá)，阻礙了小鼠肝癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制了其淋巴道轉(zhuǎn)移能力。除了直接調(diào)控靶基因的表達(dá)，miRNA-9還可能通過(guò)參與某些信號(hào)通路的調(diào)控，間接影響小鼠肝癌細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞逐漸失去極性和細(xì)胞間黏附能力，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。已有研究表明，miRNA-9可以通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。在小鼠肝癌細(xì)胞中，miRNA-9可能通過(guò)抑制某些促進(jìn)EMT的轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug等的表達(dá)，從而抑制EMT過(guò)程，減少癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低淋巴道轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。miRNA-9還可能通過(guò)影響其他信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等，參與對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的調(diào)控。這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，miRNA-9對(duì)它們的調(diào)控可能進(jìn)一步影響小鼠肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響淋巴道轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展。5.3研究結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究揭示了miRNA-9在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及分子機(jī)制，這一成果具有重要的臨床意義，為肝癌的診療提供了新的方向和思路。在肝癌的診斷方面，miRNA-9的表達(dá)水平可作為潛在的生物標(biāo)志物，用于肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測(cè)和診斷。臨床研究表明，在肝癌患者的組織樣本和血清中，miRNA-9的表達(dá)水平與淋巴道轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)miRNA-9的表達(dá)情況，能夠在疾病早期識(shí)別出具有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的患者，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供重要依據(jù)。對(duì)于miRNA-9表達(dá)水平顯著降低的患者，提示其可能存在較高的淋巴道轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)的檢查和監(jiān)測(cè)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶并采取相應(yīng)的治療措施。在治療領(lǐng)域，miRNA-9有望成為肝癌靶向治療的新靶點(diǎn)?；诒狙芯拷Y(jié)果，開(kāi)發(fā)能夠上調(diào)miRNA-9表達(dá)的藥物或治療策略，可能成為抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的有效手段。目前，已有研究嘗試通過(guò)基因治療的方法，將miRNA-9模擬物導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，以恢復(fù)其正常表達(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。還可以設(shè)計(jì)針對(duì)miRNA-9作用靶點(diǎn)的小分子抑制劑或抗體，阻斷相關(guān)信號(hào)通路，達(dá)到抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的目的。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，利用納米載體將miRNA-9或其相關(guān)治療藥物精準(zhǔn)遞送至腫瘤細(xì)胞，提高治療效果并減少副作用，也是未來(lái)研究的重要方向。從預(yù)后評(píng)估角度來(lái)看，miRNA-9的表達(dá)水平對(duì)于預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后具有重要價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9表達(dá)水平較低的肝癌患者，其預(yù)后往往較差，生存期較短。這是因?yàn)閙iRNA-9表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，更容易發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而影響患者的治療效果和生存質(zhì)量。通過(guò)監(jiān)測(cè)miRNA-9的表達(dá)水平，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地評(píng)估患者的預(yù)后情況，為患者提供更合理的治療建議和隨訪(fǎng)計(jì)劃。對(duì)于miRNA-9表達(dá)低的患者，醫(yī)生可以加強(qiáng)隨訪(fǎng)頻率，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況；同時(shí)，在治療方案的選擇上，可以更加積極地采用綜合治療手段，以提高患者的生存率和生活質(zhì)量。展望未來(lái)，本研究成果為肝癌的精準(zhǔn)醫(yī)療奠定了理論基礎(chǔ)。隨著對(duì)miRNA-9作用機(jī)制的深入研究，有望開(kāi)發(fā)出更多基于miRNA-9的診斷試劑、治療藥物和治療方法，實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療和有效預(yù)后評(píng)估。通過(guò)與其他腫瘤標(biāo)志物和治療手段的聯(lián)合應(yīng)用，miRNA-9在肝癌的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景，將為肝癌患者帶來(lái)新的希望。5.4研究的局限性與展望盡管本研究取得了一系列有意義的成果，但仍存在一定的局限性。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头矫?，本研究主要采用小鼠肝癌?xì)胞株和小鼠動(dòng)物模型，雖然小鼠模型在腫瘤研究中具有廣泛應(yīng)用，且與人類(lèi)在遺傳學(xué)、病理學(xué)等方面有一定相似性，但與人類(lèi)肝癌的實(shí)際情況仍存在差異。小鼠肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性、生長(zhǎng)環(huán)境以及對(duì)治療的反應(yīng)等，與人類(lèi)肝癌細(xì)胞可能不完全相同，這可能會(huì)影響研究結(jié)果向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。此外，小鼠模型的建立過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，存在個(gè)體差異，且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)