Legumain促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究：從分子到臨床的深入剖析一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球約有大量新增胃癌病例，且死亡率居高不下。在我國，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及多種基因和信號通路的異常改變。盡管目前胃癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等取得了一定進(jìn)展，但對于晚期胃癌患者，總體生存率仍不理想，5年生存率較低。這主要是由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，且腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，對于提高胃癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。Legumain又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（AEP），是半胱氨酸蛋白酶C13家族的一個(gè)新成員。近年來，大量研究表明Legumain在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，并通過多種機(jī)制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，Legumain可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的生長優(yōu)勢。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，Legumain能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如纖維連接蛋白等，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造有利條件；同時(shí)，它還可以激活其他蛋白酶，如明膠酶原，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。此外，Legumain在腫瘤血管生成中也扮演重要角色，通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在胃癌中，已有研究發(fā)現(xiàn)Legumain在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于Legumain促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚未完全明確，仍存在許多未知的環(huán)節(jié)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待深入研究。因此，進(jìn)一步深入探討Legumain在胃癌中的作用機(jī)制，有望為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，為改善胃癌患者的預(yù)后帶來新的希望。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Legumain促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，明確其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察干擾或過表達(dá)Legumain對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)成瘤能力的影響；運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫共沉淀等，研究Legumain調(diào)控胃癌生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路及關(guān)鍵分子，解析其上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；分析臨床胃癌組織樣本中Legumain的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，評估其作為胃癌診斷生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)的潛在價(jià)值。胃癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其高發(fā)病率和死亡率給患者及其家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。深入研究Legumain在胃癌中的作用機(jī)制具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，有助于進(jìn)一步揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，豐富對腫瘤生物學(xué)行為的認(rèn)識，完善胃癌發(fā)病機(jī)制的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要參考。在臨床應(yīng)用方面，若能明確Legumain是促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，將為胃癌的靶向治療開辟新的方向。以Legumain為靶點(diǎn)開發(fā)特異性的抑制劑或拮抗劑，有望為胃癌患者提供更精準(zhǔn)、有效的治療手段，提高治療效果，改善患者預(yù)后；同時(shí)，Legumain作為潛在的生物標(biāo)志物，可用于胃癌的早期診斷和病情監(jiān)測，有助于實(shí)現(xiàn)胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，從而顯著降低胃癌的死亡率，具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，早期對Legumain的研究主要集中在其生物學(xué)特性和生理功能方面。隨著腫瘤研究的不斷深入，Legumain與腫瘤的關(guān)系逐漸受到關(guān)注。有研究通過對多種腫瘤細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾Legumain的表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在動(dòng)物模型研究中，將過表達(dá)Legumain的腫瘤細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，腫瘤生長速度明顯加快，且更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；而抑制Legumain表達(dá)后，腫瘤生長受到抑制，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量減少。在對胃癌的研究中，國外學(xué)者利用免疫組化等技術(shù)分析胃癌組織芯片及臨床樣本，發(fā)現(xiàn)Legumain在胃癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，高表達(dá)Legumain的胃癌患者總體生存率較低。同時(shí)，通過基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選出了一些可能與Legumain相互作用的分子和信號通路，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。在國內(nèi)，關(guān)于Legumain與胃癌的研究也取得了一系列成果。重慶醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測大量胃癌組織及癌旁正常組織中Legumain的表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌組織中Legumain的高表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、低分化等不良預(yù)后因素相關(guān)，多因素生存分析表明Legumain高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另有研究針對幽門螺桿菌感染性胃癌組織展開，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Legumain和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）呈過度表達(dá)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，幽門螺桿菌陽性組中Legumain、MMP-9表達(dá)與患者性別、組織分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示幽門螺桿菌感染可能通過影響Legumain等分子的表達(dá)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。在機(jī)制研究方面，國內(nèi)學(xué)者從細(xì)胞周期調(diào)控、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤血管生成等多個(gè)角度進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)Legumain可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1等分子的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖；通過激活EMT相關(guān)信號通路，如TGF-β/Smad信號通路，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力；還可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)胃癌組織新生血管的形成。然而，目前國內(nèi)外對于Legumain促進(jìn)胃癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究仍存在一些不足之處。雖然已發(fā)現(xiàn)一些與Legumain相關(guān)的信號通路和分子，但這些通路和分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明，存在許多未知的調(diào)控節(jié)點(diǎn)和反饋機(jī)制。對于Legumain在胃癌微環(huán)境中的作用，以及它如何與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞成分相互作用來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，研究還不夠深入。此外，針對Legumain開發(fā)的特異性抑制劑或靶向治療策略，目前大多還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。二、胃癌概述2.1胃癌的流行病學(xué)胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中始終占據(jù)較高比例。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，在所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)中位居第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬例，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。這表明胃癌在全球范圍內(nèi)廣泛分布，給眾多患者及其家庭帶來沉重的痛苦和負(fù)擔(dān)，也對全球醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)造成巨大壓力。從地域分布來看，胃癌的發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異。亞洲地區(qū)是胃癌的高發(fā)區(qū)域，尤其是中國、日本和韓國等國家。其中，中國的胃癌發(fā)病情況尤為嚴(yán)峻。據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2019年我國胃癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位列第二位，死亡率居第三位，是我國發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均遠(yuǎn)高于世界平均水平。2020年，我國胃癌新發(fā)病例數(shù)約占全球發(fā)病總數(shù)的43.9%，死亡病例數(shù)約占全球死亡總數(shù)的48.6%，近乎占據(jù)全球胃癌發(fā)病和死亡人數(shù)的半壁江山。這種地域差異的形成與多種因素密切相關(guān)，包括不同地區(qū)的飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌（Hp）感染率、環(huán)境因素以及遺傳易感性等。在亞洲國家，普遍存在高鹽飲食、腌制食品攝入較多的飲食習(xí)慣，這些食物中含有的亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)在胃酸作用下可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類化合物，長期攝入會(huì)增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，亞洲部分地區(qū)幽門螺桿菌感染率較高，幽門螺桿菌持續(xù)感染可引發(fā)胃黏膜慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞損傷、增殖異常，最終促使胃癌的發(fā)生。在我國，胃癌的發(fā)病也呈現(xiàn)出一定的特點(diǎn)。農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于城市地區(qū)，這可能與農(nóng)村地區(qū)居民的生活條件、飲食結(jié)構(gòu)、衛(wèi)生習(xí)慣以及醫(yī)療資源可及性等因素有關(guān)。偏遠(yuǎn)地區(qū)由于經(jīng)濟(jì)相對落后，居民的飲食中新鮮蔬菜水果攝入不足，而高鹽、腌制、熏制食品攝入較多，同時(shí)衛(wèi)生條件相對較差，幽門螺桿菌感染機(jī)會(huì)增加，這些因素共同作用，使得偏遠(yuǎn)地區(qū)的胃癌發(fā)病率高于沿海等經(jīng)濟(jì)相對發(fā)達(dá)地區(qū)。此外，胃癌的發(fā)病還存在性別差異，男性胃癌的發(fā)病率約為女性的3倍，死亡率約為女性的2.7倍，主要高發(fā)年齡段集中在60-69歲的男性群體。男性不良的生活習(xí)慣，如吸煙、過量飲酒比例遠(yuǎn)高于女性，加之社會(huì)壓力較大、飲食習(xí)慣不夠規(guī)律和健康，使得男性患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。盡管近年來隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，全球及我國胃癌的發(fā)病率和死亡率總體上呈現(xiàn)出下降趨勢，但值得注意的是，胃癌發(fā)病人群卻出現(xiàn)了年輕化態(tài)勢，19歲至35歲青年人的胃癌發(fā)病率明顯上升。這可能與現(xiàn)代社會(huì)快節(jié)奏的生活方式、不健康的作息習(xí)慣（如熬夜、失眠等）以及不良的飲食習(xí)慣（如長期食用快餐、外賣，喜食辛辣、油膩、刺激性食物，飲食不規(guī)律等）密切相關(guān)。同時(shí)，工作和生活壓力增大，精神長期處于緊張、焦慮狀態(tài)，也可能通過影響機(jī)體的內(nèi)分泌和免疫功能，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，幽門螺桿菌感染在年輕人群中依然較為普遍，這也是導(dǎo)致年輕人群胃癌發(fā)病率上升的重要因素之一。2.2胃癌的發(fā)病機(jī)制胃癌的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用，是一個(gè)多步驟、多階段的過程。從分子層面來看，基因的異常改變在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因。原癌基因如Ras基因家族，在正常細(xì)胞中，其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，參與細(xì)胞的正常生長、分化和增殖等生理過程。然而，當(dāng)Ras基因發(fā)生點(diǎn)突變時(shí)，其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，持續(xù)激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，使細(xì)胞不受控制地增殖，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在部分胃癌組織中存在Ras基因的點(diǎn)突變，突變頻率約為10%-30%，且突變的Ras基因與胃癌的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。抑癌基因如p53基因，正常情況下，p53蛋白能夠監(jiān)控細(xì)胞基因組的完整性，當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，p53蛋白被激活，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)DNA修復(fù)或觸發(fā)細(xì)胞凋亡等機(jī)制，維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，防止細(xì)胞發(fā)生癌變。在胃癌發(fā)生過程中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致p53蛋白功能喪失，無法有效發(fā)揮其抑癌作用，使得受損DNA的細(xì)胞得以繼續(xù)存活和增殖，增加了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約50%-70%的胃癌組織中存在p53基因的異常改變。此外，一些與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、DNA修復(fù)等相關(guān)的基因表達(dá)異常也與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因的過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞增殖加快，在胃癌組織中，CyclinD1的過表達(dá)率較高，且與胃癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。除了基因?qū)用娴母淖?，環(huán)境因素在胃癌的發(fā)病中也扮演著重要角色。飲食因素是不可忽視的環(huán)境因素之一。長期高鹽飲食是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。高鹽食物可直接損傷胃黏膜上皮細(xì)胞，破壞胃黏膜的保護(hù)屏障，使胃黏膜更容易受到其他致癌物質(zhì)的侵襲。高鹽還可促進(jìn)幽門螺桿菌的生長和定植，增強(qiáng)幽門螺桿菌的致病性，兩者協(xié)同作用，進(jìn)一步增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。腌制食品中含有大量的亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在胃內(nèi)酸性環(huán)境下可與食物中的二級胺結(jié)合，形成亞硝胺類化合物，亞硝胺具有強(qiáng)烈的致癌性，能夠誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生基因突變，引發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。有研究表明，經(jīng)常食用腌制食品的人群，其胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高出數(shù)倍。此外，長期缺乏新鮮蔬菜水果的攝入，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化物質(zhì)（如維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等）和微量元素（如硒等）攝入不足，這些物質(zhì)具有抗氧化、清除自由基的作用，能夠保護(hù)胃黏膜免受氧化損傷，減少致癌物質(zhì)的生成，缺乏時(shí)會(huì)使胃黏膜更容易受到損傷，增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生的另一個(gè)重要環(huán)境因素，也是目前已知的第Ⅰ類生物致癌因子。幽門螺桿菌能夠在胃內(nèi)酸性環(huán)境中生存并定植于胃黏膜表面，通過分泌多種毒力因子，如細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）蛋白、空泡毒素A（VacA）等，引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥反應(yīng)。CagA蛋白可通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細(xì)胞內(nèi)，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，如Src家族激酶、絲裂原活化蛋白激酶等，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排、增殖異常和凋亡受阻，促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。VacA則可使胃上皮細(xì)胞形成空泡樣變性，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)還能抑制免疫細(xì)胞的活性，削弱機(jī)體的免疫防御能力，為胃癌的發(fā)生創(chuàng)造條件。長期的幽門螺桿菌感染可導(dǎo)致胃黏膜從慢性淺表性胃炎逐步發(fā)展為萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生，最終演變?yōu)槲赴?，這一過程被稱為“Correa序列”。研究顯示，幽門螺桿菌感染人群發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)比未感染人群高出3-6倍，全球約80%的胃癌發(fā)生與幽門螺桿菌感染有關(guān)。遺傳因素在胃癌發(fā)病中也具有一定的作用。家族聚集現(xiàn)象在胃癌中較為常見，約10%的胃癌患者有家族遺傳傾向。遺傳性彌漫型胃癌（HDGC）是一種具有明確遺傳背景的胃癌類型，主要由E-鈣黏蛋白（CDH1）基因的胚系突變引起。CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白是一種重要的細(xì)胞黏附分子，能夠維持上皮細(xì)胞之間的緊密連接，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。當(dāng)CDH1基因發(fā)生突變時(shí)，E-鈣黏蛋白的表達(dá)和功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，上皮細(xì)胞的極性和完整性被破壞，使得腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。HDGC患者通常發(fā)病年齡較早，且多為彌漫型胃癌，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后較差。除了HDGC，還有其他一些遺傳綜合征與胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，如林奇綜合征（Lynchsyndrome），該綜合征是由于DNA錯(cuò)配修復(fù)基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）發(fā)生突變所致，患者不僅結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，胃癌等其他惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)升高。此外，一些基因多態(tài)性也可能影響個(gè)體對胃癌的易感性，如細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）基因多態(tài)性與個(gè)體對亞硝胺類致癌物的代謝能力相關(guān)，某些基因型的個(gè)體可能對亞硝胺的解毒能力較弱，從而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，胃癌的發(fā)病是基因、環(huán)境和遺傳等多種因素相互作用的結(jié)果?；虻漠惓８淖?yōu)槲赴┑陌l(fā)生提供了內(nèi)在基礎(chǔ)，環(huán)境因素如飲食、幽門螺桿菌感染等則是誘發(fā)胃癌的重要外部因素，而遺傳因素在部分胃癌患者中起著關(guān)鍵作用，決定了個(gè)體對胃癌的易感性。深入研究這些因素及其相互作用機(jī)制，對于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、制定有效的預(yù)防和治療策略具有重要意義。2.3胃癌的轉(zhuǎn)移途徑及危害胃癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者病情惡化和預(yù)后不良的重要因素，了解其轉(zhuǎn)移途徑及危害對于制定合理的治療策略和評估患者預(yù)后至關(guān)重要。胃癌主要有以下幾種轉(zhuǎn)移途徑。血行轉(zhuǎn)移：當(dāng)胃癌發(fā)展到一定階段，腫瘤細(xì)胞可侵入血管，隨血液循環(huán)播散到全身各處。常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺、骨骼、腦等重要器官。肝臟是胃癌血行轉(zhuǎn)移最常見的靶器官之一，這主要是因?yàn)槲傅撵o脈血流首先回流至門靜脈，使得癌細(xì)胞容易通過門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟并定植生長。一旦癌細(xì)胞在肝臟形成轉(zhuǎn)移灶，會(huì)嚴(yán)重影響肝臟的正常功能，導(dǎo)致肝功能受損，出現(xiàn)黃疸、腹水、肝功能異常等癥狀，如膽紅素升高、轉(zhuǎn)氨酶升高等，進(jìn)而影響機(jī)體的代謝和解毒功能，引發(fā)全身代謝紊亂。肺也是胃癌血行轉(zhuǎn)移的常見部位，癌細(xì)胞可通過體循環(huán)到達(dá)肺部，在肺部形成大小不等的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，影響肺部的通氣和換氣功能，患者會(huì)出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致呼吸衰竭，危及生命。當(dāng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨骼時(shí)，會(huì)破壞骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能，引起骨痛、病理性骨折等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。若轉(zhuǎn)移至腦部，可導(dǎo)致顱內(nèi)占位性病變，引起頭痛、嘔吐、視力障礙、肢體活動(dòng)障礙、癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對患者的生命健康造成極大威脅。淋巴轉(zhuǎn)移：淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌最主要的轉(zhuǎn)移方式之一，約70%的胃癌患者會(huì)發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。胃癌細(xì)胞首先轉(zhuǎn)移至胃周圍的局部淋巴結(jié)，如賁門右、賁門左、胃小彎、胃大彎、幽門上、幽門下等區(qū)域的淋巴結(jié)。隨著病情進(jìn)展，癌細(xì)胞可進(jìn)一步沿淋巴管轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)，如腹腔動(dòng)脈旁、腸系膜上動(dòng)脈旁、腹主動(dòng)脈旁等淋巴結(jié)。淋巴轉(zhuǎn)移不僅會(huì)導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大，還會(huì)影響淋巴系統(tǒng)的正常免疫功能，使機(jī)體的免疫防御能力下降。腫大的淋巴結(jié)可能會(huì)壓迫周圍的組織和器官，如壓迫血管可導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，壓迫神經(jīng)可引起疼痛、麻木等不適癥狀。而且，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往是胃癌分期的重要依據(jù)之一，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的患者，其臨床分期通常較晚，預(yù)后相對較差，手術(shù)切除的難度增加，術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也明顯提高。局部侵襲轉(zhuǎn)移：胃癌細(xì)胞可直接侵犯胃周圍的組織和器官，如食管、肝臟、胰腺、橫結(jié)腸等。當(dāng)胃癌侵犯食管時(shí)，可導(dǎo)致食管狹窄，引起吞咽困難，患者進(jìn)食受阻，營養(yǎng)攝入不足，進(jìn)而影響身體的營養(yǎng)狀況和整體機(jī)能；侵犯肝臟可導(dǎo)致肝臟局部組織受損，影響肝臟的正常代謝和解毒功能；侵犯胰腺可引起胰腺炎樣癥狀，如腹痛、惡心、嘔吐等，還可能影響胰腺的內(nèi)分泌和外分泌功能，導(dǎo)致血糖異常和消化功能障礙；侵犯橫結(jié)腸可導(dǎo)致腸道梗阻，出現(xiàn)腹痛、腹脹、嘔吐、停止排氣排便等癥狀，嚴(yán)重影響患者的消化系統(tǒng)功能和生活質(zhì)量。局部侵襲轉(zhuǎn)移使得腫瘤與周圍組織器官緊密粘連，增加了手術(shù)切除的難度，即使進(jìn)行手術(shù)，也難以完全切除腫瘤組織，容易導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)。胃癌的轉(zhuǎn)移嚴(yán)重危害患者的身體健康和生命安全，顯著降低患者的生活質(zhì)量和生存率。對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌患者，治療難度大幅增加，治療效果往往不理想。因此，深入研究胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的干預(yù)措施，對于改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。三、Legumain的生物學(xué)特性3.1Legumain的結(jié)構(gòu)與功能Legumain又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（AEP），是半胱氨酸蛋白酶C13家族的重要成員。人類Legumain基因定位于染色體14q32.1上，編碼包含433個(gè)氨基酸的酶原。在酸性環(huán)境中，相對分子質(zhì)量為56000的酶原在半胱氨酸蛋白酶的作用下，通過連續(xù)去除C-端和N-端的前肽，進(jìn)一步加工為相對分子質(zhì)量分別為36000和25000的活性蛋白酶。從空間結(jié)構(gòu)來看，Legumain由位于中心的6鏈β-折疊和周圍的5個(gè)α-螺旋構(gòu)成，其內(nèi)部含有高度保守的His148-Gly-Spacer-Ala-Cys189基序，該基序?qū)τ谧R別和結(jié)合底物起著關(guān)鍵作用，可特異性識別底物中的Z-Ala-Ala-Asn-AMC及Z-Ala-Pro-Asn-AMC序列。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了Legumain特異性水解天冬酰胺（Asn）羧基端的能力，使其在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Legumain主要定位于細(xì)胞的溶酶體中，參與降解基質(zhì)蛋白等多種生理過程。它能夠直接降解纖維連接蛋白，抑制成骨細(xì)胞分化并誘導(dǎo)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞趨化。在免疫調(diào)節(jié)方面，Legumain可以影響主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）介導(dǎo)的抗原提呈效率，通過對蛋白質(zhì)的水解加工，使抗原能夠更有效地被呈遞給T細(xì)胞，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，在抗原呈遞細(xì)胞中，Legumain參與了抗原肽的加工和裝載過程，對于維持機(jī)體正常的免疫功能具有重要意義。此外，Legumain還在維生素D的代謝過程中發(fā)揮作用。在腎臟中，Legumain可降解維生素D結(jié)合蛋白（DBP），使25羥化維生素D（25OHD）被內(nèi)吞和易位進(jìn)入線粒體，并被其中的1-α-羥化酶轉(zhuǎn)化為具有生物活性的1,25雙羥維生素D，這對于維持體內(nèi)鈣磷平衡和骨骼健康至關(guān)重要。3.2Legumain在腫瘤中的異常表達(dá)大量研究表明，Legumain在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)的特征，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。在乳腺癌中，研究人員通過免疫組化技術(shù)對乳腺癌組織芯片及大量臨床樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Legumain在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常乳腺組織。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Legumain的高表達(dá)與乳腺癌的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在高侵襲性的三陰乳腺癌細(xì)胞系中，Legumain的表達(dá)水平明顯高于其他乳腺癌細(xì)胞系，干擾Legumain的表達(dá)可顯著抑制三陰乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌中，Legumain同樣呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。有研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測不同分期結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中Legumain的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中Legumain的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織，且隨著腫瘤分期的進(jìn)展，Legumain的表達(dá)逐漸升高。臨床隨訪數(shù)據(jù)表明，Legumain高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，無病生存期和總生存期明顯縮短，提示Legumain可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。在肺癌方面，多項(xiàng)研究證實(shí)Legumain在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織，且與腫瘤的大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Legumain可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制Legumain的表達(dá)則可使肺癌細(xì)胞的增殖能力下降，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)遷移和侵襲能力也明顯減弱。在卵巢癌中，研究發(fā)現(xiàn)Legumain在卵巢癌組織中的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與卵巢癌的組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。利用RNA干擾技術(shù)沉默卵巢癌細(xì)胞中Legumain的表達(dá)，可抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并降低腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。此外，在腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中，也均檢測到Legumain的高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。綜上所述，Legumain在多種腫瘤中異常高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程和不良預(yù)后緊密相連，這使其成為腫瘤研究領(lǐng)域極具潛力的靶點(diǎn)，深入探究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，對于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評估具有重要意義。四、Legumain促進(jìn)胃癌生長的機(jī)制研究4.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理選取人胃癌細(xì)胞系MKN45和BGC823，均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將MKN45細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，BGC823細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），兩種培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Gibco公司）。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。針對Legumain的干預(yù)，采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)抑制Legumain的表達(dá)。設(shè)計(jì)針對Legumain的特異性siRNA序列（si-Legumain），同時(shí)設(shè)置陰性對照siRNA（si-NC），均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Invitrogen公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。具體步驟如下：在轉(zhuǎn)染前1天，將處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%。按照Lipofectamine3000試劑說明書，將適量的si-Legumain或si-NC與Lipofectamine3000分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，輕柔混勻后室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，再次室溫孵育20分鐘，形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了過表達(dá)Legumain，構(gòu)建攜帶Legumain基因的慢病毒表達(dá)載體（LV-Legumain），同時(shí)設(shè)置空載慢病毒載體（LV-NC）作為對照。慢病毒載體由上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建和包裝。在轉(zhuǎn)染前1天，將胃癌細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/孔。次日，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為10的比例，將LV-Legumain或LV-NC與含有8μg/mL聚凝胺（Sigma公司）的完全培養(yǎng)基混合均勻，加入到6孔板中，輕輕搖勻。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育12小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行后續(xù)檢測。4.1.2Legumain對胃癌細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測Legumain對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。在96孔板中，每孔接種5×103個(gè)轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞（MKN45和BGC823），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，Sigma公司），繼續(xù)孵育4小時(shí)。然后小心吸去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀（ThermoScientific公司）在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MKN45細(xì)胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組細(xì)胞在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的OD值均顯著降低（P<0.05），表明抑制Legumain表達(dá)后，MKN45細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制；而在LV-Legumain組中，細(xì)胞的OD值在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于LV-NC組（P<0.05），說明過表達(dá)Legumain能夠促進(jìn)MKN45細(xì)胞的增殖。在BGC823細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，si-Legumain組細(xì)胞增殖受到抑制，LV-Legumain組細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)。EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（RiboBio公司）說明書進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，向培養(yǎng)基中加入EdU工作液（終濃度為50μM），繼續(xù)孵育2小時(shí)。然后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。接著使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌后，加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞15分鐘。再用PBS洗滌3次，加入1×Apollo染色反應(yīng)液避光孵育30分鐘。最后用PBS洗滌3次，加入DAPI染液染色5分鐘，PBS洗滌后在熒光顯微鏡（Olympus公司）下觀察并拍照。通過ImageJ軟件計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，在MKN45和BGC823細(xì)胞中，si-Legumain組的EdU陽性細(xì)胞比例均顯著低于si-NC組（P<0.05），LV-Legumain組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于LV-NC組（P<0.05），表明Legumain能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。4.1.3Legumain對胃癌細(xì)胞周期的調(diào)控利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Legumain對胃癌細(xì)胞周期的影響。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的胃癌細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶（不含EDTA，Gibco公司）消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清。加入70%預(yù)冷乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。次日，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI，Sigma公司）和100μg/mLRNaseA（Sigma公司）的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。最后使用流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII，BD公司）檢測細(xì)胞周期分布，通過FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，在MKN45細(xì)胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），說明抑制Legumain表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，阻礙細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成和后續(xù)的分裂過程；而LV-Legumain組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），表明過表達(dá)Legumain促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程。在BGC823細(xì)胞中，同樣觀察到抑制Legumain導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，過表達(dá)Legumain促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展的現(xiàn)象。這些結(jié)果提示，Legumain可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。4.1.4Legumain對胃癌細(xì)胞凋亡的抑制采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測Legumain對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的胃癌細(xì)胞，用PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)胞并再次離心。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BD公司）說明書，將細(xì)胞重懸于500μLBindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。隨后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，通過FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），兩者之和為總凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MKN45細(xì)胞中，si-Legumain組的總凋亡細(xì)胞比例顯著高于si-NC組（P<0.05），而LV-Legumain組的總凋亡細(xì)胞比例顯著低于LV-NC組（P<0.05）。在BGC823細(xì)胞中也得到了一致的結(jié)果，表明抑制Legumain表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)Legumain則抑制胃癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以探究Legumain抑制胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的胃癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）冰上裂解30分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人Bcl-2抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人Bax抗體（1:1000，CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000，CST公司），室溫孵育1小時(shí)。TBST洗滌3次后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Beyotime公司）顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，在MKN45和BGC823細(xì)胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2/Bax比值明顯下降；而LV-Legumain組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bcl-2/Bax比值明顯升高。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，從而阻止caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡；Bax則是促凋亡蛋白，可與Bcl-2形成異二聚體，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，Legumain可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活和生長。4.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型構(gòu)建選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠（購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），體重18-22g。將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動(dòng)物房內(nèi)，保持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度在40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，給予無菌飼料和飲水。將處于對數(shù)生長期的MKN45胃癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在無菌條件下，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，即接種1×10?個(gè)MKN45細(xì)胞。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。約7-10天后，可觀察到接種部位出現(xiàn)肉眼可見的皮下結(jié)節(jié)，即為移植瘤。當(dāng)移植瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.2.2Legumain對腫瘤生長的影響將成功接種MKN45細(xì)胞的裸鼠隨機(jī)分為三組，每組6只，分別為對照組（Control）、干擾組（si-Legumain）和過表達(dá)組（LV-Legumain）。干擾組裸鼠瘤內(nèi)注射針對Legumain的小干擾RNA（si-Legumain）脂質(zhì)體復(fù)合物，過表達(dá)組裸鼠瘤內(nèi)注射攜帶Legumain基因的慢病毒表達(dá)載體（LV-Legumain），對照組裸鼠瘤內(nèi)注射等量的陰性對照siRNA（si-NC）脂質(zhì)體復(fù)合物或空載慢病毒載體（LV-NC）。注射體積均為50μL，每3天注射一次，共注射5次。從第一次注射開始，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，對照組移植瘤體積逐漸增大。干擾組在注射si-Legumain后，腫瘤體積增長速度明顯減緩，與對照組相比，在第9天、12天、15天和18天，干擾組腫瘤體積均顯著小于對照組（P<0.05）。而過表達(dá)組在注射LV-Legumain后，腫瘤體積增長速度明顯加快，在第9天、12天、15天和18天，過表達(dá)組腫瘤體積均顯著大于對照組（P<0.05）。在實(shí)驗(yàn)第18天，將裸鼠頸椎脫臼處死后，完整取出移植瘤，用電子天平稱取腫瘤重量。結(jié)果表明，干擾組腫瘤平均重量為（0.45±0.08）g，顯著低于對照組的（0.78±0.12）g（P<0.05）；過表達(dá)組腫瘤平均重量為（1.25±0.15）g，顯著高于對照組（P<0.05）。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中Legumain對胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，表明在體內(nèi)環(huán)境下，Legumain同樣能夠顯著影響胃癌移植瘤的生長。五、Legumain促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究5.1體外轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)5.1.1細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)為探究Legumain對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：選用孔徑為8μm的Transwell小室（Corning公司），將其置于24孔板中。在上室中加入100μL無血清培養(yǎng)基，下室中加入600μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，形成化學(xué)梯度。收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞（MKN45和BGC823），用0.25%胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到Transwell上室中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用無菌PBS輕輕沖洗上室，去除未遷移的細(xì)胞。用棉簽小心擦去上室膜表面的細(xì)胞，然后將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，隨后用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，在MKN45細(xì)胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.05），表明抑制Legumain表達(dá)后，MKN45細(xì)胞的遷移能力明顯降低；而LV-Legumain組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于LV-NC組（P<0.05），說明過表達(dá)Legumain能夠增強(qiáng)MKN45細(xì)胞的遷移能力。在BGC823細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，證實(shí)Legumain能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的聚碳酸酯膜上均勻鋪覆一層Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），將其置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使基質(zhì)膠固化。按照上述Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的方法，將處理好的胃癌細(xì)胞接種到上室中，下室加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基。將24孔板置于培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，后續(xù)的固定、染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。結(jié)果表明，在MKN45細(xì)胞中，si-Legumain組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著低于si-NC組（P<0.05），LV-Legumain組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著高于LV-NC組（P<0.05）。BGC823細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之類似，說明Legumain能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至融合成單層狀態(tài)。用200μL無菌移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一道直線，形成劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。然后加入含2%FBS的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在劃痕后0小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)，使用倒置顯微鏡（Olympus公司）在相同視野下拍照。利用ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0小時(shí)劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。結(jié)果顯示，在MKN45細(xì)胞中，隨著時(shí)間的推移，si-NC組劃痕逐漸愈合，而si-Legumain組劃痕愈合速度明顯減慢，在12小時(shí)和24小時(shí)時(shí)，si-Legumain組的劃痕愈合率顯著低于si-NC組（P<0.05）；LV-Legumain組劃痕愈合速度明顯加快，在12小時(shí)和24小時(shí)時(shí)，LV-Legumain組的劃痕愈合率顯著高于LV-NC組（P<0.05）。BGC823細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MKN45細(xì)胞一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了Legumain能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。5.1.2Legumain對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞在特定生理或病理?xiàng)l件下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起著關(guān)鍵作用。為研究Legumain是否通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法和免疫熒光染色法檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的胃癌細(xì)胞（MKN45和BGC823），加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）冰上裂解30分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人E-cadherin抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人N-cadherin抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人Vimentin抗體（1:1000，CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000，CST公司），室溫孵育1小時(shí)。TBST洗滌3次后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Beyotime公司）顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，在MKN45細(xì)胞中，與si-NC組相比，si-Legumain組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；而LV-Legumain組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。在BGC823細(xì)胞中也觀察到了相同的變化趨勢，表明抑制Legumain表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的EMT過程，而過表達(dá)Legumain則誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，取出蓋玻片。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。然后用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，PBS洗滌3次。用5%BSA封閉1小時(shí)，分別加入兔抗人E-cadherin抗體（1:200，CST公司）、兔抗人N-cadherin抗體（1:200，CST公司），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:500，Invitrogen公司），室溫避光孵育1小時(shí)。PBS洗滌3次后，用DAPI染液染色5分鐘，PBS洗滌3次。將蓋玻片置于載玻片上，使用熒光顯微鏡（Olympus公司）觀察并拍照。結(jié)果顯示，在si-NC組中，E-cadherin主要分布在細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接處，呈現(xiàn)連續(xù)的線性分布；而在LV-Legumain組中，E-cadherin表達(dá)明顯減少，分布變得不連續(xù)。相反，N-cadherin在si-NC組中表達(dá)較弱，而在LV-Legumain組中表達(dá)明顯增強(qiáng)，且分布于整個(gè)細(xì)胞。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Legumain能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT。為了深入探究Legumain調(diào)控EMT的信號通路，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)Legumain的胃癌細(xì)胞中，TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵蛋白Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著升高，而抑制Legumain表達(dá)后，p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平明顯降低。同時(shí)，使用TGF-β受體抑制劑SB431542處理過表達(dá)Legumain的胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力也受到抑制。這表明Legumain可能通過激活TGF-β/Smad信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。5.2體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)5.2.1動(dòng)物轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體重控制在18-22g。將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動(dòng)物房內(nèi)，維持環(huán)境溫度在22-25℃，相對濕度40%-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)模式，給予無菌飼料和飲水。構(gòu)建裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型。將處于對數(shù)生長期的MKN45胃癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在無菌條件下，使用1mL注射器（配備29G針頭）吸取0.1mL細(xì)胞懸液。固定裸鼠，將鼠尾浸入37℃溫水中浸泡3-5分鐘，使血管充分?jǐn)U張，再用75%乙醇消毒皮膚。隨后，進(jìn)行尾靜脈穿刺，確保穿刺成功后，在30-60秒內(nèi)緩慢且均勻地注入細(xì)胞懸液。注射完成后，輕輕按壓穿刺部位片刻，防止細(xì)胞懸液回流。隨機(jī)將裸鼠分為三組，每組6只，分別為對照組（Control）、干擾組（si-Legumain）和過表達(dá)組（LV-Legumain）。干擾組裸鼠尾靜脈注射含有針對Legumain的小干擾RNA（si-Legumain）的脂質(zhì)體復(fù)合物，過表達(dá)組裸鼠尾靜脈注射攜帶Legumain基因的慢病毒表達(dá)載體（LV-Legumain），對照組裸鼠尾靜脈注射等量的陰性對照siRNA（si-NC）脂質(zhì)體復(fù)合物或空載慢病毒載體（LV-NC）。5.2.2Legumain對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響在注射細(xì)胞后的第4周，將裸鼠頸椎脫臼處死，取出肺、肝、骨等常見的轉(zhuǎn)移靶器官，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋、切片，再通過蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量。結(jié)果顯示，對照組裸鼠的肺、肝等器官出現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)移灶，干擾組裸鼠各器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于對照組（P<0.05），而過表達(dá)組裸鼠的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量則明顯多于對照組（P<0.05）。在肺組織中，對照組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（12.5±2.3）個(gè)，干擾組為（3.2±1.1）個(gè)，過表達(dá)組為（20.8±3.5）個(gè)；在肝臟中，對照組平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（7.8±1.5）個(gè)，干擾組為（1.5±0.8）個(gè)，過表達(dá)組為（15.6±2.8）個(gè)。這表明抑制Legumain表達(dá)可顯著減少胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)Legumain則明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)變化。收集裸鼠腫瘤組織，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）冰上裂解30分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘，收集上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，TBST洗滌3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體（1:1000，CST公司）、兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體（1:1000，CST公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（1:5000，CST公司），室溫孵育1小時(shí)。TBST洗滌3次后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，與對照組相比，干擾組腫瘤組織中MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而過表達(dá)組中這些蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。MMP-2和MMP-9是重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件；VEGF則是促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子，可促使腫瘤組織新生血管形成，有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果說明，Legumain可能通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9和VEGF等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。六、臨床研究6.1Legumain在胃癌組織中的表達(dá)分析為深入探究Legumain在胃癌臨床中的作用及潛在價(jià)值，本研究收集了2018年1月至2021年12月期間，于我院接受手術(shù)治療的100例胃癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整。采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測Legumain在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平。具體操作步驟如下：將石蠟包埋的組織標(biāo)本切成4μm厚的切片，常規(guī)脫蠟至水。采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，通過高壓加熱5分鐘后自然冷卻。隨后，用3%過氧化氫溶液孵育切片10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15分鐘，減少非特異性染色。傾去封閉液，勿洗，直接滴加兔抗人Legumain多克隆抗體（1:200稀釋，CST公司），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，每次5分鐘，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋，Vector公司），室溫孵育15分鐘。再次用PBS洗滌3次后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（Vector公司），室溫孵育15分鐘。最后，使用DAB顯色試劑盒（Vector公司）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明后，用中性樹膠封片。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行判讀。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%計(jì)0分，10%-25%計(jì)1分，26%-50%計(jì)2分，51%-75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞比例得分相乘，得到最終的綜合評分：0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強(qiáng)陽性（+++）。將弱陽性及以上結(jié)果判定為陽性表達(dá)，陰性結(jié)果判定為陰性表達(dá)。結(jié)果顯示，在100例胃癌組織中，Legumain陽性表達(dá)72例（72%），而在相應(yīng)的癌旁正常組織中，陽性表達(dá)僅25例（25%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明Legumain在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步分析Legumain表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果如表1所示。臨床病理參數(shù)例數(shù)Legumain陽性表達(dá)例數(shù)（%）P值性別男6548（73.8）0.672女3524（68.6）年齡（歲）≤604028（70.0）0.745＞606044（73.3）腫瘤大?。╟m）≤54529（64.4）0.048*＞55543（78.2）腫瘤部位胃底賁門部2016（80.0）0.287胃體部3020（66.7）胃竇部5036（72.0）組織學(xué)類型腺癌8562（72.9）0.368黏液腺癌106（60.0）未分化癌54（80.0）分化程度高、中分化3520（57.1）0.012*低分化6552（80.0）TNM分期Ⅰ-Ⅱ期3016（53.3）0.001*Ⅲ-Ⅳ期7056（80.0）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有6048（80.0）0.010*無4024（60.0）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有2018（90.0）0.003*無8054（67.5）注：*表示P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表1中可以看出，Legumain的陽性表達(dá)與胃癌患者的腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。腫瘤越大、分化程度越低、TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，Legumain陽性表達(dá)率越高。而Legumain表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤部位、組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性（P>0.05）。這表明Legumain的高表達(dá)可能參與了胃癌的進(jìn)展過程，與胃癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，提示其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。6.2Legumain表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，分析Legumain表達(dá)與胃癌患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）的關(guān)系。隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開始計(jì)算，直至患者死亡、失訪或隨訪截止日期（2023年6月30日）。結(jié)果顯示，Legumain陽性表達(dá)組患者的總生存期和無病生存期均顯著短于陰性表達(dá)組（P<0.01），如圖1所示。圖1：Legumain表達(dá)與胃癌患者生存曲線（A：總生存期；B：無病生存期）進(jìn)一步將患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Legumain表達(dá)等因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果表明，TNM分期（HR=2.563，95%CI：1.678-3.921，P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=1.897，95%CI：1.236-2.915，P=0.003）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR=2.874，95%CI：1.562-5.302，P<0.001）和Legumain陽性表達(dá)（HR=1.758，95%CI：1.156-2.683，P=0.009）是影響胃癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在無病生存期方面，TNM分期（HR=2.345，95%CI：1.521-3.628，P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=1.764，95%CI：1.172-2.661，P=0.007）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR=2.681，95%CI：1.456-