P2Y6受體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞功能對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肝纖維化是一種由慢性肝損傷引起的肝臟結(jié)構(gòu)及功能異常改變的病理學(xué)過程，在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康。它是肝臟對(duì)各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，但當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積，超過肝臟的自我修復(fù)能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而引發(fā)一系列嚴(yán)重后果。若肝纖維化持續(xù)進(jìn)展，往往會(huì)發(fā)展為肝硬化，甚至誘發(fā)肝癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝硬化患者發(fā)生肝癌的年發(fā)生率約為3%-6%，而肝纖維化是肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，這使得肝纖維化的研究顯得尤為迫切和重要。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，在肝纖維化進(jìn)程中扮演著核心角色。在正常肝臟中，巨噬細(xì)胞主要以庫普弗細(xì)胞（Kupffercells）的形式存在，它們?cè)诰S持肝臟免疫穩(wěn)態(tài)、清除病原體和衰老細(xì)胞等方面發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞迅速活化并發(fā)生極化，產(chǎn)生多種表型。經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些因子能夠招募炎癥細(xì)胞，放大炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷肝細(xì)胞，同時(shí)刺激肝星狀細(xì)胞（HSC）活化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積，從而推動(dòng)肝纖維化的發(fā)展；而交替活化的M2型巨噬細(xì)胞則主要分泌抗炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，它們具有抑制炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用，在一定程度上有助于緩解肝纖維化。巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的雙向調(diào)節(jié)作用使其成為研究肝纖維化治療靶點(diǎn)的重要方向。P2Y6受體作為G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，在多種細(xì)胞類型中均有表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞。其主要被細(xì)胞外的尿苷二磷酸（UDP）激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。P2Y6受體在巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其活化能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的趨化、吞噬、細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)行為。在炎癥反應(yīng)中，P2Y6受體可通過激活磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-8（IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等趨化因子，招募更多的免疫細(xì)胞到炎癥部位，加劇炎癥反應(yīng)。P2Y6受體還參與巨噬細(xì)胞的極化過程，影響M1/M2型巨噬細(xì)胞的比例，從而對(duì)肝纖維化進(jìn)程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在動(dòng)脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞P2Y6受體缺失可通過限制泡沫細(xì)胞形成，減弱動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，這為P2Y6受體在炎癥相關(guān)疾病中的作用機(jī)制研究提供了重要參考。深入探究P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的功能和機(jī)制，不僅有助于揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，還為開發(fā)新型抗肝纖維化藥物提供潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.2肝纖維化概述肝纖維化是肝臟在遭受各種慢性損傷時(shí)，試圖進(jìn)行自我修復(fù)的一種病理性過程，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟內(nèi)的過度沉積。正常肝臟中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)肝臟受到持續(xù)的損傷刺激時(shí)，這種平衡被打破，肝星狀細(xì)胞（HSC）被大量激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖等，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，導(dǎo)致其在肝臟內(nèi)異常積聚，逐漸形成纖維瘢痕組織，這就是肝纖維化的主要病理特征。肝纖維化對(duì)人體健康危害巨大。它不僅會(huì)導(dǎo)致肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，使肝臟逐漸失去其應(yīng)有的解毒、代謝、分泌等功能，還可能進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭和肝癌，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有數(shù)百萬人因肝纖維化相關(guān)疾病死亡。肝硬化患者常出現(xiàn)腹水、消化道出血、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥，生活質(zhì)量急劇下降，5年生存率較低；而肝癌更是惡性程度極高的腫瘤，治療難度大，預(yù)后極差。肝纖維化的病因較為復(fù)雜，常見的包括病毒性肝炎（如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染）、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、遺傳代謝性肝病以及寄生蟲感染等。在我國(guó)，病毒性肝炎是導(dǎo)致肝纖維化的主要原因之一，乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）持續(xù)感染可引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，造成肝細(xì)胞反復(fù)損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。長(zhǎng)期大量飲酒是酒精性肝病的主要誘因，乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)肝細(xì)胞具有直接毒性作用，可引起肝細(xì)胞脂肪變性、壞死和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝纖維化。非酒精性脂肪性肝病則與肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征等密切相關(guān)，肝臟脂肪堆積引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。炎癥在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，炎癥細(xì)胞迅速聚集到損傷部位，釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質(zhì)一方面可以直接損傷肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和壞死；另一方面，它們能夠激活肝星狀細(xì)胞，促使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌能力。炎癥介質(zhì)還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)一步加劇細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞，在肝纖維化進(jìn)程中具有雙向調(diào)節(jié)作用，其活化狀態(tài)和分泌的細(xì)胞因子類型決定了對(duì)肝纖維化的促進(jìn)或抑制作用，這也使得巨噬細(xì)胞成為研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵切入點(diǎn)。1.3巨噬細(xì)胞與肝纖維化巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，已成為肝纖維化研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。在正常肝臟組織中，巨噬細(xì)胞主要以庫普弗細(xì)胞（Kupffercells）的形式存在，約占肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的20%。它們定居于肝血竇內(nèi)，緊密附著于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面，具有獨(dú)特的形態(tài)和功能特征。庫普弗細(xì)胞通過其表面豐富的模式識(shí)別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，能夠識(shí)別并清除進(jìn)入肝臟的病原體、內(nèi)毒素以及衰老或凋亡的細(xì)胞，維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。它們還參與肝臟的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)，通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)免疫細(xì)胞的募集和活化，確保肝臟免疫應(yīng)答的適度性。當(dāng)肝臟受到慢性損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞的表型和功能會(huì)發(fā)生顯著變化，這一過程被稱為巨噬細(xì)胞的活化與極化。巨噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化的M1型和交替活化的M2型兩種主要表型，它們?cè)诟卫w維化進(jìn)程中發(fā)揮著截然不同的作用。M1型巨噬細(xì)胞主要由脂多糖（LPS）、γ-干擾素（IFN-γ）等刺激物激活，其活化后高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），大量分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等。這些促炎細(xì)胞因子能夠招募大量炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等至肝臟損傷部位，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。TNF-α可直接損傷肝細(xì)胞，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和壞死；IL-6能夠激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，同時(shí)也加劇了肝臟炎癥；IL-12則可促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，加重肝臟炎癥損傷。M1型巨噬細(xì)胞分泌的趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，能夠吸引更多的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集到肝臟，使得炎癥反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，為肝纖維化的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了有利條件。M1型巨噬細(xì)胞還通過激活肝星狀細(xì)胞（HSC），直接推動(dòng)肝纖維化的進(jìn)程。肝星狀細(xì)胞是肝臟內(nèi)合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要細(xì)胞，在正常肝臟中，肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的脂滴，儲(chǔ)存維生素A。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，在M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子的刺激下，肝星狀細(xì)胞被激活，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞。這些活化的肝星狀細(xì)胞失去脂滴，大量表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），獲得增殖和遷移能力，同時(shí)合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白（尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白）、纖連蛋白、蛋白聚糖等。細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積逐漸形成纖維瘢痕組織，破壞肝臟的正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，在小鼠肝纖維化模型中，阻斷M1型巨噬細(xì)胞的活化或減少其分泌的細(xì)胞因子，能夠顯著抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減輕肝纖維化程度。M2型巨噬細(xì)胞則主要由白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）等細(xì)胞因子激活，其活化后高表達(dá)精氨酸酶-1（Arg-1）、甘露糖受體（MR）、幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1（Ym1）等標(biāo)志性分子。M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎、促進(jìn)組織修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用，在一定程度上有助于緩解肝纖維化。它們分泌的白細(xì)胞介素-10（IL-10）是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，能夠抑制炎癥細(xì)胞的活化和促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕肝臟炎癥反應(yīng)。IL-10可通過抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活，減少TNF-α、IL-1、IL-6等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而降低肝臟炎癥水平。M2型巨噬細(xì)胞還分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），雖然TGF-β在一定程度上也能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)合成，但在肝纖維化后期，它可以誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)的精氨酸酶-1能夠?qū)⒕彼岽x為鳥氨酸和多胺，鳥氨酸可進(jìn)一步合成脯氨酸，為膠原蛋白的合成提供原料，但同時(shí)精氨酸酶-1還可以通過競(jìng)爭(zhēng)精氨酸底物，抑制iNOS的活性，減少一氧化氮（NO）的生成，從而減輕炎癥損傷。M2型巨噬細(xì)胞還能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)纖維瘢痕組織的溶解和吸收，有利于肝臟組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化小鼠模型中，過繼轉(zhuǎn)移M2型巨噬細(xì)胞能夠顯著減輕肝纖維化程度，改善肝臟功能。巨噬細(xì)胞的極化并非是絕對(duì)的M1和M2兩種狀態(tài)，而是一個(gè)連續(xù)的動(dòng)態(tài)過程，在不同的微環(huán)境刺激下，巨噬細(xì)胞可以呈現(xiàn)出多種中間表型，其功能也具有多樣性和可塑性。肝臟內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，包括細(xì)胞因子、趨化因子、代謝產(chǎn)物、細(xì)胞外基質(zhì)成分等，都可以影響巨噬細(xì)胞的極化方向和功能。在肝纖維化早期，炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，M1型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生；隨著肝纖維化的發(fā)展，機(jī)體試圖啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，M2型巨噬細(xì)胞的比例逐漸增加，發(fā)揮抗纖維化作用。如果肝臟損傷持續(xù)存在，M1/M2型巨噬細(xì)胞的平衡被打破，M1型巨噬細(xì)胞持續(xù)活化，而M2型巨噬細(xì)胞的功能受到抑制，肝纖維化就會(huì)不斷進(jìn)展，最終導(dǎo)致肝硬化等嚴(yán)重后果。巨噬細(xì)胞在肝纖維化中具有雙向調(diào)節(jié)作用，深入研究其極化機(jī)制和功能調(diào)控，對(duì)于揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。1.4P2Y6受體的相關(guān)研究P2Y6受體，全稱嘌呤能受體P2Y6（purinergicreceptorP2Y6），是P2Y受體家族中的重要成員，屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族。其基因位于人類染色體Xq24，編碼的蛋白質(zhì)由348個(gè)氨基酸殘基組成，具有典型的七次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠穿越細(xì)胞膜，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在細(xì)胞膜外，P2Y6受體具有特定的配體結(jié)合位點(diǎn)，能夠高度選擇性地與細(xì)胞外的尿苷二磷酸（UDP）緊密結(jié)合。UDP作為P2Y6受體的內(nèi)源性激動(dòng)劑，當(dāng)細(xì)胞受到損傷、炎癥刺激或處于病理狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的UDP會(huì)通過自分泌、旁分泌或泄漏等方式釋放到細(xì)胞外，與P2Y6受體結(jié)合，從而激活受體。P2Y6受體在人體多個(gè)器官和組織中廣泛分布，呈現(xiàn)出豐富的表達(dá)譜。在免疫器官，如脾臟、淋巴結(jié)等，P2Y6受體參與免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化過程，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答起著重要的調(diào)節(jié)作用。在心血管系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及心肌細(xì)胞等均有P2Y6受體的表達(dá)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞，P2Y6受體的激活可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8（IL-8）和血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）的表達(dá)，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)的發(fā)生；在平滑肌細(xì)胞，P2Y6受體介導(dǎo)細(xì)胞的收縮與增殖，對(duì)血管張力和結(jié)構(gòu)的維持具有重要意義；在心肌細(xì)胞，P2Y6受體參與心肌纖維化的過程，在壓力負(fù)荷（如高血壓）刺激下，ATP、UDP等核苷酸經(jīng)Pnx離子通道釋放到胞外，刺激心肌細(xì)胞的P2Y6受體，通過偶聯(lián)的G12/13蛋白激活Rho途徑，調(diào)節(jié)纖維化因子（如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βTGF-β）的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)下游Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，推動(dòng)心肌纖維化的發(fā)展。在神經(jīng)系統(tǒng)中，P2Y6受體主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的P2Y6受體能顯著增強(qiáng)其對(duì)損傷神經(jīng)元細(xì)胞的吞噬作用，在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在巨噬細(xì)胞中，P2Y6受體發(fā)揮著多方面的重要作用，深刻影響著巨噬細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能。P2Y6受體的活化能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)UDP激活P2Y6受體后，巨噬細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α/β（MIP-1α/β）、干擾素-α/β（IFN-α/β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子以及免疫共刺激分子CD80/86的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。這些細(xì)胞因子和趨化因子的大量分泌，使得巨噬細(xì)胞能夠招募更多的免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，聚集到炎癥部位，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，但在某些情況下，也可能導(dǎo)致炎癥過度反應(yīng)，對(duì)組織造成損傷。P2Y6受體的激活還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的趨化遷移能力。研究表明，UDP刺激巨噬細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清能明顯誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的趨化遷移，而這種作用可被P2Y6受體選擇性抑制劑MRS2578有效抑制。同時(shí)，UDP激活P2Y6受體后，巨噬細(xì)胞RAW264.7的遷移能力也顯著增強(qiáng)。這一特性使得巨噬細(xì)胞能夠快速響應(yīng)炎癥信號(hào)，及時(shí)遷移到受損組織部位，發(fā)揮免疫防御和組織修復(fù)的功能。P2Y6受體與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在炎癥相關(guān)疾病和纖維化疾病中尤為顯著。在動(dòng)脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞P2Y6受體的高表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。巨噬細(xì)胞通過清道夫受體攝取氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）形成泡沫細(xì)胞，是動(dòng)脈粥樣硬化病變的早期標(biāo)志，而P2Y6受體缺失可通過磷脂酶Cβ/儲(chǔ)存操作的鈣進(jìn)入/鈣網(wǎng)蛋白/清道夫受體A途徑，限制泡沫細(xì)胞的形成，從而有效減弱動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。在肺部疾病中，P2Y6受體參與氣道炎癥的發(fā)生及維持。在氣道上皮細(xì)胞，P2Y6受體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性蛋白20（CCL20）趨化因子的表達(dá)，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/P38通路，促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生。在氣道炎癥反應(yīng)過程中，核苷酸釋放激活P2Y6受體，引起白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）等促炎因子的產(chǎn)生，這些因子在維持氣道炎癥性疾病中起著關(guān)鍵作用。在肝纖維化疾病中，雖然目前關(guān)于P2Y6受體在肝纖維化中作用機(jī)制的研究尚不完全明確，但基于其在巨噬細(xì)胞中的功能以及巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的核心地位，可以推測(cè)P2Y6受體可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化、極化和細(xì)胞因子分泌，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。深入研究P2Y6受體在肝纖維化中的具體作用機(jī)制，對(duì)于揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.5研究目的與意義本研究旨在深入探究P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的功能和機(jī)制，為揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時(shí)為開發(fā)針對(duì)肝纖維化的新型治療策略奠定基礎(chǔ)。具體研究目的如下：明確P2Y6受體在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及活化情況：通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫組化等，檢測(cè)在正常肝臟組織和肝纖維化模型中，巨噬細(xì)胞上P2Y6受體的表達(dá)水平及其在不同刺激條件下的活化狀態(tài)，分析其表達(dá)變化與肝纖維化進(jìn)程的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。揭示P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響：利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，研究P2Y6受體的激活或抑制對(duì)巨噬細(xì)胞向M1型和M2型極化的影響。通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物（如iNOS、Arg-1等）的表達(dá)，以及分泌的細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-10等）的變化，明確P2Y6受體在巨噬細(xì)胞極化調(diào)控中的作用方向和程度。闡明P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞功能影響肝纖維化的信號(hào)通路：運(yùn)用信號(hào)通路抑制劑、基因敲除技術(shù)和蛋白質(zhì)相互作用研究方法，深入探討P2Y6受體激活后介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PLC-PKC、MAPK等信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞活化、極化以及對(duì)肝星狀細(xì)胞作用中的調(diào)控機(jī)制，明確關(guān)鍵信號(hào)分子和節(jié)點(diǎn)，揭示P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞功能影響肝纖維化的分子機(jī)制。評(píng)估P2Y6受體作為肝纖維化治療靶點(diǎn)的潛力：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察P2Y6受體特異性激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)肝纖維化模型的干預(yù)效果，評(píng)估其對(duì)肝纖維化程度、肝臟功能以及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響，為將P2Y6受體開發(fā)為肝纖維化治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，深入研究P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的功能和機(jī)制，有助于填補(bǔ)該領(lǐng)域在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)控機(jī)制方面的知識(shí)空白，豐富對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步理解肝臟疾病的病理生理過程提供新的視角和理論基礎(chǔ)。在巨噬細(xì)胞極化機(jī)制研究中，P2Y6受體可能成為新的研究熱點(diǎn)，為揭示細(xì)胞可塑性和功能多樣性的調(diào)控機(jī)制提供范例。在臨床應(yīng)用方面，若能明確P2Y6受體在肝纖維化中的關(guān)鍵作用及機(jī)制，將為肝纖維化的治療提供全新的靶點(diǎn)和思路。開發(fā)針對(duì)P2Y6受體的特異性藥物，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)肝纖維化進(jìn)程的精準(zhǔn)調(diào)控，打破傳統(tǒng)治療手段的局限性，提高治療效果，改善患者預(yù)后。這不僅能減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還能為肝臟疾病的防治帶來新的突破，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。二、P2Y6受體與巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)研究2.1P2Y6受體的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)2.1.1受體結(jié)構(gòu)P2Y6受體是嘌呤能受體P2Y家族中的重要成員，屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族，具有典型的七次跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征使其能夠穿越細(xì)胞膜，在細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答之間搭建起關(guān)鍵的橋梁。P2Y6受體的氨基酸序列由348個(gè)氨基酸殘基組成，其N端位于細(xì)胞膜外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，七個(gè)跨膜螺旋（TM1-TM7）通過三個(gè)細(xì)胞外環(huán)（ECL1-ECL3）和三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)（ICL1-ICL3）相互連接。P2Y6受體的活性位點(diǎn)是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵區(qū)域，位于跨膜螺旋形成的疏水口袋內(nèi)，具有高度的特異性和親和力，能夠與內(nèi)源性配體尿苷二磷酸（UDP）緊密結(jié)合。UDP與P2Y6受體結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象變化，從而激活下游信號(hào)通路。研究表明，P2Y6受體的活性位點(diǎn)存在多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，如位于TM3上的天冬氨酸（Asp）殘基和TM6上的精氨酸（Arg）殘基，它們與UDP的磷酸基團(tuán)和核糖部分相互作用，對(duì)于維持受體與配體的結(jié)合穩(wěn)定性至關(guān)重要。若這些關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生突變，可能會(huì)導(dǎo)致受體與UDP的結(jié)合能力下降，進(jìn)而影響受體的激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。P2Y6受體主要與Gq/11亞型蛋白偶聯(lián)，這一特性決定了其獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。當(dāng)UDP激活P2Y6受體后，受體的構(gòu)象變化促使其與Gq/11蛋白相互作用，導(dǎo)致Gq/11蛋白的α亞基與βγ亞基解離。解離后的Gq/11α亞基可以激活下游的磷脂酶Cβ（PLCβ），引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件。研究發(fā)現(xiàn)，P2Y6受體與Gq/11蛋白的偶聯(lián)具有高度的選擇性和特異性，這種特異性的偶聯(lián)機(jī)制有助于確保信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的準(zhǔn)確性和高效性。通過基因敲除或RNA干擾技術(shù)降低Gq/11蛋白的表達(dá)水平，會(huì)顯著抑制P2Y6受體激活后引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，表明P2Y6受體與Gq/11蛋白的偶聯(lián)在其信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著不可或缺的作用。2.1.2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑P2Y6受體激活后，主要通過磷脂酶Cβ（PLCβ）-蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)UDP與P2Y6受體結(jié)合并使其激活后，受體與Gq/11蛋白偶聯(lián)，激活的Gq/11α亞基進(jìn)一步激活PLCβ。PLCβ能夠水解細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），生成兩個(gè)重要的第二信使：三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG）。IP3是一種水溶性小分子，它可以迅速擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放儲(chǔ)存的鈣離子（Ca2+），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高。Ca2+作為重要的第二信使，參與多種細(xì)胞生理過程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞的收縮、分泌、增殖和凋亡等。DAG則仍然留在細(xì)胞膜上，它可以激活蛋白激酶C（PKC）。PKC是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它被激活后可以磷酸化多種底物蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。PKC可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，如核因子-κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1），促進(jìn)它們進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和增殖等過程。P2Y6受體激活還可以通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號(hào)通路。PI3K是一種參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶。在P2Y6受體激活后，PI3K可以被招募到細(xì)胞膜上，并被激活。激活的PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以作為第二信使，招募含有plekstrin同源結(jié)構(gòu)域（PH結(jié)構(gòu)域）的蛋白，如蛋白激酶B（Akt）和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1），到細(xì)胞膜上。PDK1可以磷酸化Akt，使其激活。激活的Akt可以通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等。研究發(fā)現(xiàn)，在巨噬細(xì)胞中，P2Y6受體激活后通過PI3K-Akt信號(hào)通路，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的存活和增殖，增強(qiáng)其免疫防御能力。P2Y6受體激活還與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路相關(guān)。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡等多種生理過程。P2Y6受體激活后，通過G蛋白偶聯(lián)的方式激活下游的小G蛋白R(shí)as，Ras可以激活Raf蛋白，Raf蛋白進(jìn)而激活MEK1/2，MEK1/2再激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）。ERK1/2被激活后，可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，在氣道上皮細(xì)胞中，P2Y6受體通過激活MAPK/P38通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性蛋白20（CCL20）趨化因子的表達(dá)，參與氣道炎癥的發(fā)生及維持。在巨噬細(xì)胞中，P2Y6受體激活后通過MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞的免疫功能。2.2P2Y6受體在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)和分布研究表明，P2Y6受體在巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7以及原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中，P2Y6受體的mRNA水平呈現(xiàn)出較高的表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，P2Y6受體蛋白在巨噬細(xì)胞中穩(wěn)定存在。在正常肝臟組織中，庫普弗細(xì)胞作為肝臟內(nèi)的固有巨噬細(xì)胞，同樣表達(dá)P2Y6受體。當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥或纖維化時(shí)，巨噬細(xì)胞被大量募集到肝臟組織，此時(shí)P2Y6受體在這些巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，隨著肝纖維化程度的加重，肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞P2Y6受體的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，這表明P2Y6受體的表達(dá)與肝纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。P2Y6受體在巨噬細(xì)胞中的分布具有一定的特點(diǎn)，主要定位于細(xì)胞膜上，其七次跨膜結(jié)構(gòu)使得受體的N端和C端分別位于細(xì)胞膜外和細(xì)胞膜內(nèi)。這種分布特點(diǎn)使得P2Y6受體能夠有效地感知細(xì)胞外環(huán)境中的尿苷二磷酸（UDP）信號(hào)。當(dāng)UDP與P2Y6受體結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，激活下游的Gq/11蛋白，進(jìn)而啟動(dòng)磷脂酶Cβ（PLCβ）-蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，P2Y6受體在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上并非均勻分布，而是存在于特定的微結(jié)構(gòu)域中。這些微結(jié)構(gòu)域富含膽固醇和鞘磷脂，被稱為脂筏。脂筏能夠聚集多種信號(hào)分子，促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的高效進(jìn)行。P2Y6受體與脂筏中的其他信號(hào)分子，如PLCβ、PKC等相互作用，形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，從而增強(qiáng)P2Y6受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞效率。鈣離子信號(hào)在P2Y6受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)P2Y6受體被UDP激活后，通過Gq/11蛋白激活PLCβ，PLCβ水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG）。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放儲(chǔ)存的鈣離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高。升高的鈣離子作為第二信使，參與多種細(xì)胞生理過程的調(diào)節(jié)。在巨噬細(xì)胞中，鈣離子濃度的升高可以激活鈣調(diào)蛋白（CaM），CaM與鈣調(diào)蛋白激酶（CaM-K）結(jié)合，使其活化?；罨腃aM-K可以磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，如細(xì)胞因子分泌、吞噬作用等。鈣離子還可以通過與PKC相互作用，調(diào)節(jié)PKC的活性，進(jìn)一步影響巨噬細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能。研究表明，在UDP刺激巨噬細(xì)胞后，使用鈣螯合劑（如乙二醇雙四乙酸，EGTA）降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，能夠顯著抑制P2Y6受體激活后誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌和趨化遷移等功能，這表明鈣離子信號(hào)是P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的重要環(huán)節(jié)。2.3P2Y6受體在巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制2.3.1巨噬細(xì)胞活化相關(guān)機(jī)制P2Y6受體的活化對(duì)巨噬細(xì)胞的多種生物學(xué)行為具有重要影響，在巨噬細(xì)胞活化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）、損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）或其他炎癥刺激時(shí)，細(xì)胞外的尿苷二磷酸（UDP）濃度升高，UDP與巨噬細(xì)胞表面的P2Y6受體特異性結(jié)合，激活P2Y6受體。激活后的P2Y6受體通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，使其功能發(fā)生改變。P2Y6受體活化能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子。研究表明，UDP激活P2Y6受體后，巨噬細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α/β（MIP-1α/β）、干擾素-α/β（IFN-α/β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子以及免疫共刺激分子CD80/86的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。這些細(xì)胞因子和趨化因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。MCP-1能夠招募單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到炎癥部位，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；MIP-1α/β則可吸引T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；IFN-α/β具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種功能，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗病毒能力和免疫監(jiān)視功能；TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可直接損傷靶細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，還能激活其他免疫細(xì)胞，放大炎癥信號(hào)。免疫共刺激分子CD80/86的表達(dá)增加，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。P2Y6受體活化還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化遷移。當(dāng)P2Y6受體被UDP激活后，巨噬細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，UDP刺激巨噬細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清能明顯誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的趨化遷移，而這種作用可被P2Y6受體選擇性抑制劑MRS2578有效抑制。巨噬細(xì)胞的趨化遷移能力使其能夠快速響應(yīng)炎癥信號(hào)，及時(shí)遷移到受損組織部位，發(fā)揮免疫防御和組織修復(fù)的功能。在炎癥部位，巨噬細(xì)胞通過趨化遷移聚集到損傷區(qū)域，清除病原體、凋亡細(xì)胞和壞死組織，同時(shí)分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。P2Y6受體活化對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬功能也有重要影響。巨噬細(xì)胞通過吞噬作用清除病原體和異物，是其重要的免疫防御機(jī)制之一。研究表明，P2Y6受體的激活能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)病原體和凋亡細(xì)胞的吞噬能力。在細(xì)菌感染模型中，激活P2Y6受體后，巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬量明顯增加，從而有效清除細(xì)菌，減輕感染癥狀。P2Y6受體活化可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架重排、膜泡運(yùn)輸?shù)冗^程，增強(qiáng)其吞噬功能。激活P2Y6受體后，可通過下游信號(hào)通路調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚，使巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜能夠更好地包裹病原體，形成吞噬體，進(jìn)而提高吞噬效率。2.3.2相關(guān)信號(hào)通路的激活P2Y6受體激活后，主要通過磷脂酶Cβ（PLCβ）-蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)UDP與P2Y6受體結(jié)合并使其激活后，受體與Gq/11蛋白偶聯(lián)，激活的Gq/11α亞基進(jìn)一步激活PLCβ。PLCβ能夠水解細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），生成兩個(gè)重要的第二信使：三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG）。IP3是一種水溶性小分子，它可以迅速擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放儲(chǔ)存的鈣離子（Ca2+），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高。Ca2+作為重要的第二信使，參與多種細(xì)胞生理過程的調(diào)節(jié)。在巨噬細(xì)胞中，升高的Ca2+可以激活鈣調(diào)蛋白（CaM），CaM與鈣調(diào)蛋白激酶（CaM-K）結(jié)合，使其活化?；罨腃aM-K可以磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，如細(xì)胞因子分泌、吞噬作用等。DAG則仍然留在細(xì)胞膜上，它可以激活蛋白激酶C（PKC）。PKC是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它被激活后可以磷酸化多種底物蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。PKC可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，如核因子-κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1），促進(jìn)它們進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和增殖等過程。P2Y6受體激活還可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號(hào)通路發(fā)揮作用。PI3K是一種參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶。在P2Y6受體激活后，PI3K可以被招募到細(xì)胞膜上，并被激活。激活的PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以作為第二信使，招募含有plekstrin同源結(jié)構(gòu)域（PH結(jié)構(gòu)域）的蛋白，如蛋白激酶B（Akt）和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1），到細(xì)胞膜上。PDK1可以磷酸化Akt，使其激活。激活的Akt可以通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等。研究發(fā)現(xiàn)，在巨噬細(xì)胞中，P2Y6受體激活后通過PI3K-Akt信號(hào)通路，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的存活和增殖，增強(qiáng)其免疫防御能力。P2Y6受體激活還與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路相關(guān)。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡等多種生理過程。P2Y6受體激活后，通過G蛋白偶聯(lián)的方式激活下游的小G蛋白R(shí)as，Ras可以激活Raf蛋白，Raf蛋白進(jìn)而激活MEK1/2，MEK1/2再激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）。ERK1/2被激活后，可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，在氣道上皮細(xì)胞中，P2Y6受體通過激活MAPK/P38通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性蛋白20（CCL20）趨化因子的表達(dá)，參與氣道炎癥的發(fā)生及維持。在巨噬細(xì)胞中，P2Y6受體激活后通過MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞的免疫功能。當(dāng)P2Y6受體激活MAPK信號(hào)通路后，ERK1/2可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，使其與血清反應(yīng)元件（SRE）結(jié)合，促進(jìn)c-fos基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。三、巨噬細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路與肝纖維化3.1ADP信號(hào)通路ADP信號(hào)通路在肝纖維化進(jìn)程中扮演著重要角色，其主要由細(xì)胞外的ADP激活，涉及多種細(xì)胞類型及復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程。在肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞、血小板、肝星狀細(xì)胞（HSC）和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞均可釋放ADP，這些ADP作為信號(hào)分子，與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，從而影響肝纖維化的發(fā)展。不同來源細(xì)胞釋放的ADP在肝纖維化中發(fā)揮著不同的作用。肝細(xì)胞受損時(shí)，會(huì)釋放ADP，這些ADP可作為“危險(xiǎn)信號(hào)”，激活肝臟內(nèi)的免疫細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表面表達(dá)有多種ADP受體，如P2Y1、P2Y12、P2X1-7等。當(dāng)ADP與巨噬細(xì)胞表面的P2Y1受體結(jié)合后，通過與Gq蛋白偶聯(lián)，激活磷脂酶Cβ（PLCβ），使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解為三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG）。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白（CaM），進(jìn)而激活鈣調(diào)蛋白激酶（CaM-K），調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，如細(xì)胞因子分泌、吞噬作用等。DAG則激活蛋白激酶C（PKC），PKC可磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，肝細(xì)胞釋放的ADP通過激活巨噬細(xì)胞的P2Y1受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子，加劇肝臟炎癥，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。血小板在止血和血栓形成過程中會(huì)釋放大量ADP，這些ADP在肝纖維化中也發(fā)揮著重要作用。血小板釋放的ADP可以激活血小板自身表面的P2Y12受體，促進(jìn)血小板的聚集和活化?；罨难“蹇膳c肝星狀細(xì)胞相互作用，通過釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，激活肝星狀細(xì)胞，促使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程。研究表明，在肝纖維化小鼠模型中，抑制血小板的活化或阻斷P2Y12受體，可減少血小板釋放的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，從而抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減輕肝纖維化程度。肝星狀細(xì)胞在受到損傷刺激時(shí)，也會(huì)釋放ADP，這些ADP可通過自分泌或旁分泌的方式作用于肝星狀細(xì)胞自身或周圍的其他細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞表面表達(dá)的P2Y2受體可被ADP激活，激活后的P2Y2受體通過與Gq蛋白偶聯(lián)，激活PLCβ，進(jìn)而激活下游的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）信號(hào)通路。ERK1/2被激活后，可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。在體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞中，添加ADP可顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，而使用P2Y2受體拮抗劑則可抑制這些作用。巨噬細(xì)胞在肝纖維化過程中既是ADP的釋放者，也是ADP信號(hào)的響應(yīng)者。巨噬細(xì)胞釋放的ADP可以調(diào)節(jié)自身及周圍細(xì)胞的功能。巨噬細(xì)胞表面的P2X7受體可被高濃度的ADP激活，P2X7受體是一種配體門控離子通道，被激活后可導(dǎo)致細(xì)胞膜對(duì)陽離子的通透性增加，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高可激活半胱天冬酶-1（caspase-1），促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）等炎性細(xì)胞因子的成熟和釋放，加劇肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。在脂多糖（LPS）刺激的巨噬細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞釋放的ADP通過激活P2X7受體，促進(jìn)IL-1β和IL-18的釋放，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。ADP信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用，共同調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)程。ADP信號(hào)通路可與TGF-β/Smad信號(hào)通路相互影響。TGF-β是一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，其信號(hào)通路在肝纖維化中起著核心作用。研究發(fā)現(xiàn)，ADP激活的P2Y1受體可通過激活ERK1/2信號(hào)通路，增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3的磷酸化，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。在肝纖維化小鼠模型中，抑制P2Y1受體可減弱TGF-β信號(hào)通路的激活，減輕肝纖維化程度。ADP信號(hào)通路還與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。ADP激活的P2Y12受體可通過激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上并使其激活。激活的Akt可通過磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等。在肝星狀細(xì)胞中，ADP通過激活P2Y12受體，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的存活和增殖，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可阻斷ADP對(duì)肝星狀細(xì)胞的促增殖作用，減輕肝纖維化。3.2凋亡通路巨噬細(xì)胞凋亡在肝纖維化進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，其凋亡過程受到多種因素的精細(xì)調(diào)控，對(duì)肝纖維化的發(fā)展具有重要影響。在肝纖維化過程中，肝臟內(nèi)的微環(huán)境發(fā)生顯著改變，炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)成分以及細(xì)胞間相互作用等因素都可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)肝臟受到持續(xù)損傷時(shí)，炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等大量釋放。TNF-α可以與巨噬細(xì)胞表面的TNF受體1（TNFR1）結(jié)合，招募死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（TRADD）、Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和半胱天冬酶-8（caspase-8）等，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8被激活，進(jìn)而激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡。在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，肝臟內(nèi)TNF-α水平升高，巨噬細(xì)胞凋亡增加，且凋亡的巨噬細(xì)胞數(shù)量與肝纖維化程度呈正相關(guān)。氧化應(yīng)激也是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的重要因素。在肝纖維化過程中，肝細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等。這些ROS可以損傷巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜、線粒體和DNA等，引發(fā)細(xì)胞凋亡。ROS可以通過氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，使細(xì)胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，進(jìn)而激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路。ROS還可以損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。研究表明，在酒精性肝病導(dǎo)致的肝纖維化模型中，給予抗氧化劑可以減少ROS的產(chǎn)生，降低巨噬細(xì)胞凋亡率，減輕肝纖維化程度。巨噬細(xì)胞凋亡對(duì)肝纖維化進(jìn)程具有多方面的影響。適度的巨噬細(xì)胞凋亡可以減輕肝臟炎癥反應(yīng)，從而對(duì)肝纖維化起到一定的抑制作用。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者，當(dāng)它們發(fā)生凋亡后，其分泌的促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等會(huì)減少，從而減弱炎癥細(xì)胞的募集和活化，降低肝臟炎癥水平。減少的TNF-α可以減輕對(duì)肝細(xì)胞的損傷，降低肝細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生率；減少的IL-6可以抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路的過度激活，避免肝細(xì)胞的異常增殖和炎癥的加劇。巨噬細(xì)胞凋亡還可以減少其對(duì)肝星狀細(xì)胞的激活作用?；罨木奘杉?xì)胞分泌的細(xì)胞因子如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等可以激活肝星狀細(xì)胞，促使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。巨噬細(xì)胞凋亡后，這些促纖維化細(xì)胞因子的分泌減少，肝星狀細(xì)胞的活化受到抑制，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，有利于緩解肝纖維化。然而，過度的巨噬細(xì)胞凋亡也可能對(duì)肝纖維化產(chǎn)生不利影響。巨噬細(xì)胞在肝臟中不僅參與炎癥反應(yīng)，還具有免疫調(diào)節(jié)、清除病原體和凋亡細(xì)胞等重要功能。過度凋亡的巨噬細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致其免疫功能受損，無法有效清除肝臟內(nèi)的病原體和凋亡細(xì)胞，從而使肝臟內(nèi)的炎癥持續(xù)存在，甚至加重。未被及時(shí)清除的病原體和凋亡細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)，釋放更多的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，招募更多的炎癥細(xì)胞到肝臟，加劇肝臟損傷。過度凋亡的巨噬細(xì)胞可能會(huì)影響肝臟的修復(fù)和再生能力。巨噬細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等，對(duì)肝細(xì)胞的增殖和修復(fù)具有促進(jìn)作用。過度凋亡導(dǎo)致這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的分泌減少，肝細(xì)胞的再生和修復(fù)受到抑制，不利于肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，從而間接促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。巨噬細(xì)胞凋亡與其他細(xì)胞過程之間存在復(fù)雜的相互作用。巨噬細(xì)胞凋亡與肝星狀細(xì)胞的活化和凋亡密切相關(guān)。如前所述，巨噬細(xì)胞凋亡可以減少對(duì)肝星狀細(xì)胞的激活，抑制肝纖維化的發(fā)展；而肝星狀細(xì)胞的活化狀態(tài)也會(huì)影響巨噬細(xì)胞的凋亡。活化的肝星狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，可以招募巨噬細(xì)胞到肝臟，并調(diào)節(jié)其凋亡。MCP-1可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的存活，抑制其凋亡；而MIP-1α則可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。巨噬細(xì)胞凋亡還與肝臟內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞是肝臟免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，其凋亡會(huì)影響其他免疫細(xì)胞的功能。巨噬細(xì)胞凋亡后，其表面的抗原提呈能力下降，影響T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而改變肝臟的免疫應(yīng)答狀態(tài)。巨噬細(xì)胞凋亡釋放的凋亡小體可以被其他免疫細(xì)胞吞噬，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和炎癥反應(yīng)。3.3HMGB1信號(hào)通路高遷移率族蛋白B1（HMGB1）信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞活化過程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。HMGB1是一種高度保守的核DNA結(jié)合蛋白，在正常生理狀態(tài)下，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與核小體結(jié)構(gòu)的維持和基因轉(zhuǎn)錄等過程。然而，當(dāng)細(xì)胞受到損傷、炎癥或缺氧等刺激時(shí)，HMGB1會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，作為一種損傷相關(guān)分子模式（DAMP）發(fā)揮作用，成為啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)分子。在肝纖維化過程中，受損的肝細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞等均可釋放HMGB1。這些釋放到細(xì)胞外的HMGB1通過與巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。HMGB1在細(xì)胞外的作用主要通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，其主要受體包括晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs），其中TLR2、TLR4和TLR9與HMGB1的相互作用較為關(guān)鍵。當(dāng)HMGB1與巨噬細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件。RAGE屬于免疫球蛋白超家族，是一種跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等細(xì)胞表面。HMGB1與RAGE具有高親和力，二者結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，如p21ras、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-κB（NF-κB）和Cdc42/Rac等信號(hào)通路。激活的p21ras可進(jìn)一步激活下游的MAPK信號(hào)通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。ERK1/2被激活后，可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-fos等，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和炎癥反應(yīng)；JNK和p38MAPK則主要參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。HMGB1與RAGE結(jié)合后，通過激活I(lǐng)κB激酶（IKK），使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。Cdc42/Rac信號(hào)通路的激活則參與細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞的遷移過程，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的趨化能力。在脂多糖（LPS）和HMGB1協(xié)同刺激巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合作用可顯著增加RAGE的表達(dá)，并進(jìn)一步增強(qiáng)RAGE下游信號(hào)通路的活化，促使巨噬細(xì)胞分泌大量的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子，加劇炎癥反應(yīng)。HMGB1還可與巨噬細(xì)胞表面的TLR2、TLR4和TLR9相互作用，激活TLR信號(hào)通路。TLR是一類主要由先天免疫細(xì)胞表達(dá)的跨膜受體，屬于模式識(shí)別受體（PRRs）家族。在配體的刺激下，TLRs招募下游連接分子，包括含TIR結(jié)構(gòu)域的適配器誘導(dǎo)IFN-β（TRIF）和髓樣分化因子88（MyD88）等。MyD88依賴性途徑中，MyD88與TLR結(jié)合后，招募IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK），激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)而激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)炎癥。TRIF依賴性途徑則主要激活干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）信號(hào)通路，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。在肝纖維化小鼠模型中，阻斷HMGB1與TLR4的相互作用，可顯著抑制巨噬細(xì)胞的活化和炎癥細(xì)胞因子的分泌，減輕肝纖維化程度。HMGB1信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用，共同調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能和肝纖維化的進(jìn)程。HMGB1信號(hào)通路可與TGF-β/Smad信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)。TGF-β是一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，其信號(hào)通路在肝纖維化中起著核心作用。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1激活的RAGE信號(hào)通路可通過激活ERK1/2信號(hào)通路，增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3的磷酸化，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。在肝纖維化過程中，HMGB1信號(hào)通路還可與PI3K/Akt信號(hào)通路相互影響。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。HMGB1與RAGE結(jié)合后，可激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上并使其激活。激活的Akt可通過磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等。在巨噬細(xì)胞中，HMGB1通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的存活和增殖，增強(qiáng)其免疫防御能力，同時(shí)也可能促進(jìn)其向促纖維化表型極化。四、P2Y6受體調(diào)控巨噬細(xì)胞在肝纖維化中的功能研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立本研究選用6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重在20-25g之間。小鼠購(gòu)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，在溫度（22±2）℃、濕度（50±5）%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的方法建立小鼠肝纖維化模型。具體操作如下：將CCl4與橄欖油按1:4的體積比混合，配制成20%的CCl4橄欖油溶液。小鼠按照2ml/kg的劑量，通過腹腔注射的方式給予CCl4橄欖油溶液，每周注射2次，連續(xù)注射8周。對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的橄欖油。在造模過程中，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等一般狀況。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，造模小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、飲食減少、體重增長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象，提示肝纖維化模型正在逐漸形成。為了驗(yàn)證肝纖維化模型的成功建立，在造模結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行肝臟組織病理學(xué)檢查。取部分肝臟組織，用10%的中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4μm。進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色，觀察肝臟組織的一般結(jié)構(gòu)和炎癥程度；采用Masson染色，觀察肝臟組織中膠原纖維的沉積情況。在H&E染色切片中，正常肝臟組織肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；而肝纖維化模型小鼠肝臟組織可見肝細(xì)胞廣泛變性、壞死，肝血竇毛細(xì)血管化，匯管區(qū)纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部肝小葉結(jié)構(gòu)消失。Masson染色結(jié)果顯示，正常肝臟組織膠原纖維呈淡藍(lán)色，主要分布在匯管區(qū)和中央靜脈周圍；肝纖維化模型小鼠肝臟組織可見大量藍(lán)色的膠原纖維增生，匯管區(qū)與中央靜脈間形成不完全的纖維間隔，大量纖細(xì)的膠原深入肝小葉內(nèi)并包繞肝細(xì)胞。通過組織病理學(xué)檢查，證實(shí)了肝纖維化模型的成功建立。4.1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法巨噬細(xì)胞的分離采用小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）分離培養(yǎng)方法。具體步驟如下：脫頸處死小鼠，將小鼠置于75%乙醇中浸泡5min進(jìn)行滅菌消毒處理。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，固定小鼠上肢，用剪刀從腹部中線剪開，取其雙側(cè)股骨和脛骨，剔除骨上附著的肌肉和組織，注意保持股骨及脛骨的完整性。用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液。將骨髓細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，去除組織塊和雜質(zhì)。將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5min，棄上清。用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗和20ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液。將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)7天后，可觀察到貼壁的巨噬細(xì)胞，形態(tài)呈圓形或橢圓形，部分細(xì)胞伸出偽足。為了干預(yù)P2Y6受體的表達(dá)和功能，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)和藥物干預(yù)方法。針對(duì)P2Y6受體設(shè)計(jì)特異性的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞中，以降低P2Y6受體的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染方法如下：按照Lipofectamine3000試劑說明書，將P2Y6siRNA和Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，然后將兩者混合，室溫孵育15min，形成RNAi復(fù)合物。將復(fù)合物加入到培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)P2Y6受體的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證siRNA的干擾效果。使用P2Y6受體特異性激動(dòng)劑UDP和拮抗劑MRS2578對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)。將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別加入不同濃度的UDP（10μM、50μM、100μM）和MRS2578（1μM、5μM、10μM），作用不同時(shí)間（6h、12h、24h）后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。4.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法檢測(cè)肝纖維化程度的指標(biāo)和方法包括：肝組織病理學(xué)檢查，采用H&E染色觀察肝臟組織的一般結(jié)構(gòu)和炎癥程度，Masson染色觀察肝臟組織中膠原纖維的沉積情況，天狼星紅染色定量分析膠原含量；血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PIIINP）、Ⅳ型膠原（CIV）和層粘連蛋白（LN）等指標(biāo)，評(píng)估肝臟功能和纖維化程度；肝臟硬度測(cè)量，使用小動(dòng)物超聲彈性成像儀，檢測(cè)肝臟硬度值，間接反映肝纖維化程度。檢測(cè)巨噬細(xì)胞功能的指標(biāo)和方法有：細(xì)胞增殖能力檢測(cè)，采用CCK-8法，將巨噬細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)不同時(shí)間后，加入CCK-8試劑，孵育1-2h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率；細(xì)胞遷移能力檢測(cè)，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，將巨噬細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，對(duì)下室遷移的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量；吞噬功能檢測(cè)，將巨噬細(xì)胞與熒光標(biāo)記的大腸桿菌或凋亡細(xì)胞共孵育，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記物的攝取情況，評(píng)估其吞噬能力；細(xì)胞因子分泌檢測(cè)，采用ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子的含量。檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)的指標(biāo)和方法如下：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)P2Y6受體、巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物（如iNOS、Arg-1等）、纖維化相關(guān)基因（如α-SMA、COL1A1等）以及信號(hào)通路相關(guān)分子（如PLCβ、PKC、ERK1/2等）的mRNA表達(dá)水平；蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)上述分子的蛋白表達(dá)水平，通過提取細(xì)胞或組織總蛋白，進(jìn)行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育、化學(xué)發(fā)光顯影等步驟，檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，分析蛋白表達(dá)變化；免疫組化檢測(cè)肝組織中P2Y6受體、α-SMA、COL1A1等蛋白的表達(dá)和定位，通過對(duì)肝組織切片進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉、一抗和二抗孵育、DAB顯色等步驟，在顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)的陽性部位和強(qiáng)度。4.2P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響4.2.1對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響在肝纖維化進(jìn)程中，P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的調(diào)控作用至關(guān)重要。為了深入探究這一作用，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。在體外實(shí)驗(yàn)中，將分離培養(yǎng)的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）分為對(duì)照組、UDP刺激組（激活P2Y6受體）和MRS2578+UDP刺激組（抑制P2Y6受體后再激活）。結(jié)果顯示，UDP刺激組巨噬細(xì)胞表面的免疫共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)顯著增加，這表明巨噬細(xì)胞被有效活化。CD80和CD86是巨噬細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物，它們的高表達(dá)能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。而在MRS2578+UDP刺激組，巨噬細(xì)胞表面CD80和CD86的表達(dá)明顯低于UDP刺激組，這說明P2Y6受體被抑制后，巨噬細(xì)胞的活化受到了顯著抑制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響。將小鼠分為正常對(duì)照組、肝纖維化模型組和P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組。通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型組肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞表面的CD80和CD86表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，表明在肝纖維化過程中，巨噬細(xì)胞處于活化狀態(tài)。而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞表面CD80和CD86的表達(dá)顯著低于肝纖維化模型組，這進(jìn)一步證實(shí)了抑制P2Y6受體可以有效抑制肝纖維化過程中巨噬細(xì)胞的活化。巨噬細(xì)胞活化后，其分泌的細(xì)胞因子和趨化因子也會(huì)發(fā)生顯著變化。在體外實(shí)驗(yàn)中，UDP刺激組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子的含量明顯升高，這些細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，能夠招募更多的炎癥細(xì)胞到肝臟，加劇肝臟炎癥。而在MRS2578+UDP刺激組，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的含量顯著降低。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，肝纖維化模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的水平明顯高于正常對(duì)照組，而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組小鼠血清中這些促炎細(xì)胞因子的水平顯著低于肝纖維化模型組。這些結(jié)果表明，P2Y6受體的激活能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，從而加劇炎癥反應(yīng)；而抑制P2Y6受體則可以減少促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕炎癥反應(yīng)。4.2.2對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的影響是其調(diào)控肝纖維化進(jìn)程的重要機(jī)制之一。在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)分離培養(yǎng)的小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）進(jìn)行不同處理。對(duì)照組巨噬細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；UDP刺激組巨噬細(xì)胞用100μM的UDP刺激24h；MRS2578+UDP刺激組巨噬細(xì)胞先加入5μM的P2Y6受體拮抗劑MRS2578預(yù)處理1h，再加入100μM的UDP刺激24h。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量。結(jié)果顯示，UDP刺激組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子的含量顯著高于對(duì)照組。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，它可以直接損傷靶細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，還能激活其他免疫細(xì)胞，放大炎癥信號(hào)；IL-6能夠激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，同時(shí)也加劇了肝臟炎癥；IL-1β則可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的活化和募集，加重肝臟炎癥損傷。而在MRS2578+UDP刺激組，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中這些促炎細(xì)胞因子的含量明顯低于UDP刺激組。這表明P2Y6受體的激活能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，而抑制P2Y6受體則可以減少促炎細(xì)胞因子的分泌。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響。將小鼠分為正常對(duì)照組、肝纖維化模型組和P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組。在造模8周后，采集小鼠血清，采用ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子的含量。結(jié)果顯示，肝纖維化模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的水平明顯高于正常對(duì)照組。而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組小鼠血清中這些促炎細(xì)胞因子的水平顯著低于肝纖維化模型組。這進(jìn)一步證實(shí)了在肝纖維化過程中，P2Y6受體的激活會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌更多的促炎細(xì)胞因子，加重肝臟炎癥；而抑制P2Y6受體則可以有效降低巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕肝臟炎癥。除了促炎細(xì)胞因子，P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子也有影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，UDP刺激組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-10（IL-10）等抗炎細(xì)胞因子的含量明顯低于對(duì)照組。IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，它能夠抑制炎癥細(xì)胞的活化和促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕炎癥反應(yīng)。而在MRS2578+UDP刺激組，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的含量顯著高于UDP刺激組。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，肝纖維化模型組小鼠血清中IL-10的水平明顯低于正常對(duì)照組，而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組小鼠血清中IL-10的水平顯著高于肝纖維化模型組。這些結(jié)果表明，P2Y6受體的激活會(huì)抑制巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子，而抑制P2Y6受體則可以促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的分泌，有助于調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕肝臟炎癥損傷。4.2.3對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能在清除病原體和細(xì)胞碎片、維持肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能具有重要影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過將巨噬細(xì)胞與熒光標(biāo)記的大腸桿菌共孵育，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記物的攝取情況，以此評(píng)估巨噬細(xì)胞的吞噬功能。將小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）分為對(duì)照組、UDP刺激組（激活P2Y6受體）和MRS2578+UDP刺激組（抑制P2Y6受體后再激活）。結(jié)果顯示，UDP刺激組巨噬細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記大腸桿菌的吞噬率顯著高于對(duì)照組。這表明P2Y6受體的激活能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。而在MRS2578+UDP刺激組，巨噬細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記大腸桿菌的吞噬率明顯低于UDP刺激組。這說明抑制P2Y6受體后，巨噬細(xì)胞的吞噬功能受到顯著抑制。為了進(jìn)一步探究P2Y6受體影響巨噬細(xì)胞吞噬功能的機(jī)制，通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UDP刺激組巨噬細(xì)胞中與細(xì)胞骨架重排相關(guān)的蛋白，如肌動(dòng)蛋白（actin）和肌球蛋白（myosin）的磷酸化水平明顯升高。細(xì)胞骨架的重排對(duì)于巨噬細(xì)胞的吞噬過程至關(guān)重要，它能夠使巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜更好地包裹病原體，形成吞噬體，進(jìn)而提高吞噬效率。而在MRS2578+UDP刺激組，巨噬細(xì)胞中actin和myosin的磷酸化水平顯著低于UDP刺激組。這表明P2Y6受體可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排相關(guān)蛋白的磷酸化水平，影響巨噬細(xì)胞的吞噬功能。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，進(jìn)一步驗(yàn)證P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。將小鼠分為正常對(duì)照組、肝纖維化模型組和P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組。通過免疫熒光染色檢測(cè)肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬情況。結(jié)果顯示，肝纖維化模型組肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬能力明顯高于正常對(duì)照組。這可能是由于肝纖維化過程中，肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞和壞死組織，巨噬細(xì)胞為了維持肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其吞噬功能被激活。而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬能力顯著低于肝纖維化模型組。這進(jìn)一步證實(shí)了抑制P2Y6受體可以降低巨噬細(xì)胞的吞噬功能。在肝纖維化過程中，巨噬細(xì)胞吞噬功能的改變對(duì)肝臟的修復(fù)和再生具有重要影響。巨噬細(xì)胞通過吞噬清除凋亡細(xì)胞和壞死組織，可以減少炎癥反應(yīng)的持續(xù)刺激，有利于肝臟組織的修復(fù)。然而，過度激活的巨噬細(xì)胞吞噬功能可能導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的過度釋放，加重肝臟炎癥損傷。P2Y6受體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)控，在肝纖維化的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中起著關(guān)鍵的平衡作用。4.3P2Y6受體對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響4.3.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析為深入探究P2Y6受體對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響，本研究借助四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠被隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝纖維化模型組和P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組。在歷經(jīng)8周的造模周期后，對(duì)小鼠肝臟組織進(jìn)行全面分析。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示出顯著差異。正常對(duì)照組小鼠肝臟組織呈現(xiàn)出典型的正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞排列緊密且整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，匯管區(qū)無異常變化，幾乎未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。肝纖維化模型組小鼠肝臟組織則出現(xiàn)了明顯的病理改變，肝細(xì)胞廣泛發(fā)生變性、壞死，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，肝血竇毛細(xì)血管化，導(dǎo)致血液流通受阻，匯管區(qū)纖維組織大量增生，形成明顯的纖維間隔，炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量浸潤(rùn)，局部肝小葉結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，呈現(xiàn)出典型的肝纖維化病理特征。而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組小鼠肝臟組織的病理改變明顯減輕，肝細(xì)胞變性、壞死程度顯著降低，纖維組織增生減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯下降，肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)較為完整，這充分表明抑制P2Y6受體能夠有效緩解肝纖維化的病理進(jìn)程。通過Masson染色對(duì)肝臟組織中膠原纖維的沉積情況進(jìn)行觀察，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。正常對(duì)照組小鼠肝臟組織中膠原纖維呈淡藍(lán)色，主要局限于匯管區(qū)和中央靜脈周圍，分布稀疏且規(guī)則。肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中可見大量藍(lán)色的膠原纖維廣泛增生，匯管區(qū)與中央靜脈間形成了粗大且連續(xù)的纖維間隔，大量膠原纖維深入肝小葉內(nèi)，將肝細(xì)胞緊密包裹，嚴(yán)重破壞了肝臟的正常結(jié)構(gòu)。P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組小鼠肝臟組織中膠原纖維的沉積量顯著減少，纖維間隔變薄且不連續(xù)，肝小葉內(nèi)的膠原纖維明顯減少，肝細(xì)胞的包裹程度減輕，說明抑制P2Y6受體能夠顯著減少肝纖維化過程中膠原纖維的沉積。血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果也有力地支持了P2Y6受體對(duì)肝纖維化進(jìn)程的影響。肝纖維化模型組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著升高，這兩種酶是肝細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物，其升高表明肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，肝功能出現(xiàn)明顯異常。透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PIIINP）、Ⅳ型膠原（CIV）和層粘連蛋白（LN）等纖維化指標(biāo)也顯著升高，這些指標(biāo)的升高反映了肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的大量合成和沉積，是肝纖維化的重要標(biāo)志。而P2Y6受體拮抗劑干預(yù)組小鼠血清中ALT、AST水平明顯降低，表明肝細(xì)胞損傷程度減輕，肝功能得到改善。HA、PIIINP、CIV和