TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因?qū)θ薓CF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。近年來(lái)，盡管在乳腺癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但患者的預(yù)后仍然不容樂(lè)觀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增乳腺癌病例超過(guò)200萬(wàn)，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。在中國(guó)，乳腺癌的發(fā)病率也以每年3%-4%的速度增長(zhǎng)，已成為女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及多種基因的突變和表達(dá)異常。深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高乳腺癌的治療效果和改善患者的預(yù)后具有重要意義。TRE17是一種N-端拓?fù)渫葱缘牡鞍?，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等。已有研究表明，TRE17的上調(diào)與細(xì)胞增殖、侵襲和遷移增加相關(guān)，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明確。TC-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠介導(dǎo)TRE17的表達(dá)，因此也與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TC-1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于TRE17和TC-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制的研究仍然較少，這限制了我們對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程的深入理解。MCF-7乳腺癌細(xì)胞是一種常用的乳腺癌細(xì)胞系，具有雌激素受體陽(yáng)性、生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的研究中。探究TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因?qū)CF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制，不僅有助于深入了解乳腺癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，還可能為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)揭示TC-1和TRE17在乳腺癌細(xì)胞遷移中的作用，我們可以開(kāi)發(fā)出針對(duì)性的治療藥物，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，從而降低乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，本研究還可能為其他腫瘤的研究提供借鑒和參考，推動(dòng)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)于TRE17的研究起步較早。眾多研究表明，TRE17在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。有研究通過(guò)基因敲除和過(guò)表達(dá)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TRE17缺失會(huì)顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，而過(guò)表達(dá)TRE17則能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，并且揭示了TRE17可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架的重排來(lái)影響細(xì)胞遷移。此外，在對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TRE17與一些信號(hào)通路如PI3K/AKT通路存在交互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。對(duì)于TC-1，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。在卵巢癌的研究中，TC-1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α信號(hào)通路，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在乳腺癌細(xì)胞遷移方面，國(guó)外有研究聚焦于其他轉(zhuǎn)錄因子對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，改變細(xì)胞外基質(zhì)的組成和細(xì)胞間的黏附力，從而影響乳腺癌細(xì)胞的遷移。在國(guó)內(nèi)，對(duì)TRE17和TC-1的研究也在逐步深入。有研究利用RNA干擾技術(shù)，沉默TRE17基因的表達(dá)，觀察到乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降，進(jìn)一步探討了TRE17在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。在TC-1的研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)TC-1與腫瘤抑制蛋白p53相互作用，抑制p53的活性，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于乳腺癌細(xì)胞遷移，國(guó)內(nèi)有研究從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)降解等多個(gè)角度進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子和信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用，如TGF-β信號(hào)通路能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在TRE17、TC-1及癌細(xì)胞遷移方面取得了一定的研究成果，但目前仍存在諸多不足。在TRE17和TC-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的具體作用機(jī)制方面，仍有許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚未明確。例如，TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因表達(dá)后，如何通過(guò)下游信號(hào)通路調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移，目前還缺乏深入系統(tǒng)的研究。此外，現(xiàn)有研究大多是分別針對(duì)TRE17或TC-1進(jìn)行，對(duì)于兩者在乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的協(xié)同作用研究較少。而本研究正是基于當(dāng)前研究的不足，通過(guò)探究TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因?qū)θ薓CF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，旨在揭示兩者在乳腺癌細(xì)胞遷移中的作用及相互關(guān)系，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因?qū)θ薓CF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，并揭示其潛在的作用機(jī)制。通過(guò)全面剖析TC-1和TRE17在乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的具體作用，為乳腺癌的治療提供更為精準(zhǔn)有效的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，從而推動(dòng)乳腺癌治療領(lǐng)域的發(fā)展，提高患者的生存質(zhì)量和生存率。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用人MCF-7乳腺癌細(xì)胞株作為研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將細(xì)胞置于適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，使其能夠正常生長(zhǎng)和增殖。利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，將相關(guān)的基因表達(dá)載體導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞中，構(gòu)建TC-1基因過(guò)表達(dá)及沉默表達(dá)模型，以此來(lái)調(diào)控TC-1基因的表達(dá)水平，進(jìn)而研究其對(duì)TRE17癌基因表達(dá)及乳腺癌細(xì)胞遷移的影響。在分子生物學(xué)技術(shù)方面，采用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，檢測(cè)TC-1和TRE17基因的mRNA表達(dá)水平，從基因轉(zhuǎn)錄層面分析兩者的表達(dá)變化。運(yùn)用Westernblotting技術(shù)，對(duì)TC-1和TRE17蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，明確其在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異。通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，直觀地觀察和測(cè)定MCF-7乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，分析TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因表達(dá)后對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。此外，還采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）方法，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中膜促進(jìn)因子（如MMP2、MMP9）的含量，探究TC-1基因介導(dǎo)TRE17癌基因調(diào)控對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞膜促進(jìn)因子表達(dá)與分泌的影響，進(jìn)一步揭示其在乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌概述乳腺癌是指發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一，男性乳腺癌較為少見(jiàn)。其發(fā)病原因目前尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。從遺傳因素來(lái)看，攜帶特定基因突變，如BRCA1和BRCA2基因突變的女性，患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。有研究表明，BRCA1基因突變攜帶者在70歲之前患乳腺癌的累積風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)50%-85%。內(nèi)分泌因素在乳腺癌的發(fā)生中也起著關(guān)鍵作用，雌激素中的雌醇與雌二醇被證實(shí)與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)，孕酮在刺激腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，也會(huì)對(duì)垂體促性腺激素產(chǎn)生抑制作用，而催乳素則在乳腺癌發(fā)病過(guò)程中具有促進(jìn)作用。飲食與肥胖同樣不容忽視，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪攝取與乳腺癌死亡率之間存在明顯關(guān)聯(lián)，尤其對(duì)于絕經(jīng)后的婦女，肥胖會(huì)影響組織內(nèi)脂溶性雌激素濃度，進(jìn)而增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。此外，射線照射、乳汁因子以及環(huán)境因素、生活方式等，都與乳腺癌的發(fā)病存在一定聯(lián)系。乳腺癌有多種分型方法，目前國(guó)內(nèi)比較常用的臨床分型，可將其分為非浸潤(rùn)性癌、浸潤(rùn)性癌和其他罕見(jiàn)癌三種類(lèi)型。非浸潤(rùn)性癌又稱原位癌，病變局限于乳腺導(dǎo)管或腺泡內(nèi)，未突破基底膜，也未發(fā)生轉(zhuǎn)移，包括導(dǎo)管內(nèi)原位癌、小葉原位癌及乳頭濕疹樣乳腺癌，此型屬于早期，預(yù)后相對(duì)較好。浸潤(rùn)性癌是指癌細(xì)胞侵犯周?chē)M織或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的一類(lèi)乳腺癌，包括浸潤(rùn)性非特殊癌和浸潤(rùn)性特殊癌。其中，浸潤(rùn)性非特殊癌最為常見(jiàn)，約占80%，包含浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌、硬癌、髓樣癌（無(wú)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)）、單純癌、腺癌等；浸潤(rùn)性特殊癌則包括乳頭狀癌、髓樣癌（伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)）、腺樣囊腺癌、黏液腺癌、大汗腺樣癌、鱗狀細(xì)胞癌等。其他罕見(jiàn)癌如梭形細(xì)胞癌、印戒細(xì)胞癌等，發(fā)生幾率較低。乳腺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)出較高的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的健康。在全球范圍內(nèi)，其分布具有明顯的地域差異，北美洲和北歐屬于高發(fā)區(qū)，亞洲和非洲則屬低發(fā)區(qū)，同一種族人群，乳腺癌發(fā)病率會(huì)因不同地區(qū)移居而發(fā)生變化。2020年，全球有230萬(wàn)名婦女被診斷患有乳腺癌，有68.5萬(wàn)人死亡。在中國(guó)，乳腺癌的發(fā)病情況也不容樂(lè)觀，2020年新發(fā)病例達(dá)41.6萬(wàn)例，死亡病例約11.7萬(wàn)例。在每年新發(fā)乳腺癌患者中，約3%-10%的患者在確診時(shí)即有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，早期患者中約有30%可發(fā)展為晚期乳腺癌，而晚期乳腺癌患者5年生存率僅為20%，中位總生存時(shí)間為2-3年。如此高的發(fā)病率和死亡率，使得乳腺癌成為女性健康的重大威脅，也凸顯了深入研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療方法的緊迫性和重要性。2.2MCF-7乳腺癌細(xì)胞特性MCF-7乳腺癌細(xì)胞最初是從一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中成功分離并建立起來(lái)的。該細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，排列緊密且規(guī)則，具有上皮細(xì)胞的特征。其生長(zhǎng)特性為貼壁生長(zhǎng)，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞會(huì)緊密附著在培養(yǎng)瓶底部，伸展并鋪展開(kāi)來(lái)，逐漸形成單層細(xì)胞。它的生長(zhǎng)速度相對(duì)較為緩慢，細(xì)胞倍增時(shí)間大約為2-3天，這意味著其在培養(yǎng)過(guò)程中需要較長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到較高的細(xì)胞密度。在傳代時(shí)，一般采用1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代，以確保細(xì)胞有足夠的生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。MCF-7細(xì)胞保留了多個(gè)分化了的乳腺上皮的特性。它能通過(guò)胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇，這種特性使其對(duì)雌激素的刺激具有響應(yīng)性，在乳腺癌研究中，對(duì)于探究雌激素相關(guān)的乳腺癌發(fā)病機(jī)制和治療方法具有重要意義。同時(shí)，該細(xì)胞還能形成圓形復(fù)合（domes）結(jié)構(gòu)，這一獨(dú)特的形態(tài)特征與細(xì)胞的分化和功能密切相關(guān)，為研究乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性提供了重要的模型。此外，MCF-7細(xì)胞表達(dá)WNT7B癌基因，腫瘤壞死因子α（TNF-α）可以抑制其生長(zhǎng)，抗雌激素處理能調(diào)節(jié)細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBP）的分泌，這些特性使得MCF-7細(xì)胞在乳腺癌的分子機(jī)制研究中發(fā)揮著不可替代的作用。由于MCF-7細(xì)胞具有上述諸多特性，使其成為乳腺癌研究中最常用的細(xì)胞系之一。在乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究中，研究人員可以利用MCF-7細(xì)胞對(duì)雌激素的響應(yīng)性，深入探究雌激素信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素水平或干預(yù)雌激素受體的功能，觀察MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的變化，從而揭示乳腺癌的發(fā)病機(jī)制。在乳腺癌藥物研發(fā)方面，MCF-7細(xì)胞也被廣泛應(yīng)用于藥物篩選和藥效評(píng)估。例如，研究新型抗癌藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等指標(biāo)，評(píng)估藥物的療效和安全性，為臨床治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，MCF-7細(xì)胞還可用于研究乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制、耐藥機(jī)制等多個(gè)領(lǐng)域，為全面深入了解乳腺癌的生物學(xué)特性和開(kāi)發(fā)有效的治療方法做出了重要貢獻(xiàn)。2.3TRE17癌基因TRE17，又被稱為T(mén)BC1D3、TBC1D3B、TBC1D3C、TRE、USP32、KIAA1522或BRUCE，是一種N-端拓?fù)渫葱缘牡鞍?。它由TBC1D3基因和USP32基因融合而成，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌、腎癌和膀胱癌等。TRE17基因編碼的蛋白質(zhì)包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中TBC（Tre-2/Bub2/Cdc16）結(jié)構(gòu)域較為關(guān)鍵，該結(jié)構(gòu)域具有GTP酶激活蛋白（GAP）活性，能夠調(diào)節(jié)小GTP酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，TRE17蛋白的過(guò)量表達(dá)可使正常成纖維細(xì)胞Nm3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，這表明其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，TRE17的上調(diào)與細(xì)胞增殖增加密切相關(guān)。有研究通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRE17基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速度明顯加快，細(xì)胞周期進(jìn)程被促進(jìn)，更多的細(xì)胞進(jìn)入S期和M期。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，TRE17可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。當(dāng)使用PI3K抑制劑處理過(guò)表達(dá)TRE17的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，CyclinD1和CDK4的表達(dá)也顯著下降。在細(xì)胞侵襲和遷移方面，TRE17同樣發(fā)揮著重要作用。眾多實(shí)驗(yàn)表明，TRE17的高表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在乳腺癌細(xì)胞中，上調(diào)TRE17的表達(dá)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，在Transwell實(shí)驗(yàn)中，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多。而通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默TRE17基因的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力則顯著降低。TRE17影響細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制可能與細(xì)胞骨架的重排以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)。TRE17能夠與細(xì)胞骨架蛋白如肌球蛋白輕鏈（MLC2）和β-微管蛋白2C（TubB2C）相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，TRE17癌蛋白能特異性結(jié)合MLC2蛋白，結(jié)合區(qū)域可能位于TRE17氨基端的174個(gè)氨基酸以內(nèi)，這種相互作用可能影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，TRE17還可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。已有研究證實(shí)，TRE17高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，MMP2和MMP9的表達(dá)水平明顯升高。TRE17在腫瘤中的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，深入研究其作用機(jī)制，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要意義。2.4TC-1轉(zhuǎn)錄因子TC-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它的編碼基因位于特定的染色體區(qū)域，具有獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)，包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子。通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，TC-1基因最終表達(dá)出具有特定功能的蛋白質(zhì)。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)看，TC-1蛋白含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中一些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渑cDNA的結(jié)合以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用至關(guān)重要。例如，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，TC-1參與了多種腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。研究表明，TC-1在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，如非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等。在非小細(xì)胞肺癌中，TC-1能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)，TC-1還能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá)，影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在卵巢癌中，TC-1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α信號(hào)通路，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在介導(dǎo)TRE17表達(dá)方面，TC-1起著重要的作用。已有研究證實(shí)，TC-1可以與TRE17基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，招募相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，促進(jìn)TRE17基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加TRE17蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)TC-1的表達(dá)受到抑制時(shí)，TRE17基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)也會(huì)相應(yīng)減少。這種調(diào)控關(guān)系在多種腫瘤細(xì)胞中都得到了驗(yàn)證。在乳腺癌細(xì)胞中，通過(guò)干擾TC-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TRE17的表達(dá)顯著降低，同時(shí)細(xì)胞的遷移和侵襲能力也明顯減弱。這表明TC-1介導(dǎo)TRE17表達(dá)對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的遷移具有重要影響。TC-1在腫瘤信號(hào)通路中扮演著關(guān)鍵的角色。它能夠參與多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。在MAPK信號(hào)通路中，TC-1可以通過(guò)上調(diào)該信號(hào)通路的激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在Wnt信號(hào)通路中，TC-1可能與Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，TC-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路的活性，影響腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和遷移。這些信號(hào)通路之間相互交織，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，而TC-1在其中起到了重要的調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)作用。當(dāng)TC-1的功能發(fā)生異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致這些信號(hào)通路的失調(diào)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2.5細(xì)胞遷移相關(guān)理論細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜且受到精細(xì)調(diào)控的多步驟過(guò)程，在多細(xì)胞生物的發(fā)育、組織修復(fù)以及免疫反應(yīng)等生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育階段，細(xì)胞遷移促使細(xì)胞從初始位置移動(dòng)到特定區(qū)域，進(jìn)而形成各種組織和器官。例如，神經(jīng)嵴細(xì)胞在胚胎發(fā)育早期從神經(jīng)管背側(cè)遷移到身體的不同部位，分化形成多種細(xì)胞類(lèi)型，包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚的發(fā)育至關(guān)重要。在傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞會(huì)遷移到受損部位，促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。當(dāng)皮膚受到損傷時(shí)，周?chē)纳掀ぜ?xì)胞會(huì)發(fā)生遷移，覆蓋傷口表面，形成新的表皮組織。在免疫反應(yīng)中，免疫細(xì)胞如白細(xì)胞能夠遷移到感染或炎癥部位，發(fā)揮免疫防御功能。當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵時(shí)，中性粒細(xì)胞會(huì)通過(guò)遷移迅速到達(dá)感染部位，吞噬和殺滅病原體。細(xì)胞遷移的機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附以及信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間絲組成，在細(xì)胞遷移中起著關(guān)鍵作用。微絲由肌動(dòng)蛋白組成，其聚合和解聚過(guò)程能夠產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)力，推動(dòng)細(xì)胞向前移動(dòng)。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，微絲在細(xì)胞前端聚合，形成片狀偽足或絲狀偽足，這些偽足與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，為細(xì)胞遷移提供支撐和牽引力。微管則參與維持細(xì)胞的形態(tài)和極性，為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸提供軌道，同時(shí)也對(duì)細(xì)胞遷移起到一定的導(dǎo)向作用。中間絲主要起機(jī)械支撐作用，增強(qiáng)細(xì)胞的抗拉伸能力，有助于維持細(xì)胞的穩(wěn)定性。細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附是細(xì)胞遷移的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞通過(guò)表面的黏附分子如整合素與細(xì)胞外基質(zhì)中的成分如膠原蛋白、纖連蛋白等相互作用，形成黏著斑。黏著斑不僅能夠?qū)⒓?xì)胞固定在細(xì)胞外基質(zhì)上，還能傳遞機(jī)械力和信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移行為。當(dāng)細(xì)胞受到遷移信號(hào)刺激時(shí)，黏著斑的形成和解離會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，使細(xì)胞能夠在細(xì)胞外基質(zhì)上移動(dòng)。在細(xì)胞遷移的起始階段，細(xì)胞前端會(huì)形成新的黏著斑，與細(xì)胞外基質(zhì)緊密結(jié)合，為細(xì)胞的前進(jìn)提供錨定點(diǎn)；隨著細(xì)胞的遷移，細(xì)胞后端的黏著斑會(huì)逐漸解離，使細(xì)胞能夠脫離原來(lái)的位置。信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞遷移中起到調(diào)控作用，涉及多種信號(hào)分子和信號(hào)通路。例如，Rho家族GTP酶是細(xì)胞遷移信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，包括Rho、Rac和Cdc42等。Rho激活后能夠促進(jìn)應(yīng)力纖維的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮力；Rac則可以誘導(dǎo)片狀偽足的形成，促進(jìn)細(xì)胞的伸展和遷移；Cdc42能夠調(diào)節(jié)絲狀偽足的形成，參與細(xì)胞極性的建立和遷移方向的確定。此外，PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等也在細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。PI3K-Akt信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和黏著斑的動(dòng)態(tài)變化，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，PI3K被激活，產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3能夠招募Akt等下游分子，激活一系列激酶，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的活性，促進(jìn)細(xì)胞遷移。MAPK信號(hào)通路則可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，影響細(xì)胞的遷移能力。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞遷移起著核心作用。腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力后，能夠從原發(fā)腫瘤部位脫離，穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，然后在遠(yuǎn)處的組織或器官中定植和生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移瘤。腫瘤細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)與多種因素有關(guān)，包括腫瘤細(xì)胞自身的基因突變、腫瘤微環(huán)境的改變以及腫瘤細(xì)胞與周?chē)?xì)胞之間的相互作用等。一些癌基因的激活或抑癌基因的失活，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等也能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移行為。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等，可以通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，腫瘤細(xì)胞與周?chē)某衫w維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等之間的相互作用，也會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為其遷移創(chuàng)造條件。MMP2和MMP9能夠降解膠原蛋白和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，使腫瘤細(xì)胞更容易穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)遷移和侵襲。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人MCF-7乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該細(xì)胞株具有雌激素受體陽(yáng)性、生長(zhǎng)緩慢等特性，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌相關(guān)研究，為本實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的細(xì)胞模型。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基：購(gòu)自Gibco公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、糖類(lèi)等，維持細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)。胎牛血清（FBS）：來(lái)源于Gibco公司，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，提高細(xì)胞的活力和存活率。胰蛋白酶-EDTA消化液：由Sigma公司提供，用于消化貼壁生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶底部脫離，便于進(jìn)行傳代和實(shí)驗(yàn)操作。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑：購(gòu)自Invitrogen公司，是一種高效的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⑼庠椿蚧蚝怂岱肿痈咝У貙?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，用于構(gòu)建TC-1基因過(guò)表達(dá)及沉默表達(dá)模型。TC-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒：由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，含有完整的TC-1基因編碼序列，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入MCF-7細(xì)胞后，可使細(xì)胞過(guò)表達(dá)TC-1蛋白，用于研究TC-1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。shRNA-TC-1表達(dá)載體：同樣由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，可表達(dá)針對(duì)TC-1基因的短發(fā)夾RNA（shRNA），通過(guò)RNA干擾機(jī)制特異性地沉默TC-1基因的表達(dá)，用于探究TC-1基因沉默對(duì)細(xì)胞遷移的作用。TRIzol試劑：購(gòu)自Invitrogen公司，是一種用于提取細(xì)胞總RNA的常用試劑，能夠快速、有效地裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)，并通過(guò)一系列的抽提和沉淀步驟，獲得高純度的RNA，為后續(xù)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)提供模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：由TaKaRa公司提供，包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等成分，可將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因表達(dá)分析。SYBRGreenPCRMasterMix：購(gòu)自Roche公司，是一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑，含有熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、SYBRGreenI熒光染料、dNTP等成分，能夠在PCR反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，從而準(zhǔn)確地定量分析基因的表達(dá)水平。BCA蛋白定量試劑盒：來(lái)源于ThermoFisherScientific公司，用于測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的濃度，通過(guò)與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，生成紫色絡(luò)合物，在562nm處有最大吸收峰，根據(jù)吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系，計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量，為Westernblotting實(shí)驗(yàn)提供標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白上樣量依據(jù)。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒：購(gòu)自Bio-Rad公司，包含制備SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑，如丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、過(guò)硫酸銨、TEMED等，用于分離不同分子量的蛋白質(zhì)，為Westernblotting實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)分離提供基礎(chǔ)。PVDF膜：由Millipore公司提供，是一種疏水性的高分子材料，具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能和化學(xué)穩(wěn)定性，在Westernblotting實(shí)驗(yàn)中，用于將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)進(jìn)行抗體檢測(cè)。一抗和二抗：抗TC-1抗體、抗TRE17抗體、抗β-actin抗體以及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，二抗則與一抗結(jié)合，通過(guò)HRP催化底物顯色，從而檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。Transwell小室：購(gòu)自Corning公司，孔徑為8μm，無(wú)包被膠，用于進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的微環(huán)境，通過(guò)檢測(cè)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估MCF-7乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。Giemsa染色液：由Solarbio公司提供，用于對(duì)Transwell小室中的細(xì)胞進(jìn)行染色，使細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)更加清晰，便于在顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞。ELISA試劑盒：人MMP2和MMP9ELISA試劑盒購(gòu)自R&DSystems公司，用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中膜促進(jìn)因子MMP2和MMP9的含量，通過(guò)雙抗體夾心ELISA原理，定量分析細(xì)胞分泌的MMP2和MMP9的水平，探究TC-1基因介導(dǎo)TRE17癌基因調(diào)控對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞膜促進(jìn)因子表達(dá)與分泌的影響。儀器設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱：型號(hào)為T(mén)hermoScientificForma3111，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)條件。超凈工作臺(tái)：品牌為蘇凈安泰，型號(hào)為SW-CJ-2FD，用于提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞受到污染。高速離心機(jī)：型號(hào)為Eppendorf5424，購(gòu)自Eppendorf公司，可用于細(xì)胞離心、核酸和蛋白質(zhì)的分離等實(shí)驗(yàn)操作，具有高轉(zhuǎn)速和高精度的特點(diǎn)。低溫離心機(jī)：品牌為BeckmanCoulter，型號(hào)為AllegraX-15R，能夠在低溫條件下進(jìn)行離心操作，適用于對(duì)溫度敏感的樣品，如細(xì)胞裂解液、蛋白質(zhì)溶液等。PCR儀：購(gòu)自Bio-Rad公司，型號(hào)為T(mén)100，用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增特定的DNA片段，在本實(shí)驗(yàn)中用于RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)基因的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：品牌為Roche，型號(hào)為L(zhǎng)ightCycler480，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確量化分析。凝膠成像系統(tǒng)：購(gòu)自Bio-Rad公司，型號(hào)為ChemiDocMP，用于對(duì)SDS-PAGE凝膠和Westernblotting膜進(jìn)行成像和分析，檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。酶標(biāo)儀：型號(hào)為T(mén)hermoScientificMultiskanGO，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于讀取ELISA實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，定量分析細(xì)胞培養(yǎng)上清中膜促進(jìn)因子的含量。倒置顯微鏡：品牌為Olympus，型號(hào)為IX73，可用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和遷移情況，在實(shí)驗(yàn)中用于對(duì)Transwell小室中的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人MCF-7乳腺癌細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。隨后，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（89%DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、0.01mg/ml胰島素）的離心管中，輕輕吹打混勻。在1000rpm的條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。然后加入1mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘（視細(xì)胞情況而定）。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，加入2-3mL完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1:2-1:3的比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到40%-70%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在無(wú)菌的EP管中，分別加入100μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，再向其中一管加入適量的TC-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)染劑量，一般為2-5μg），另一管加入適量的shRNA-TC-1表達(dá)載體（同樣根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳劑量），輕輕混勻。取另一EP管，加入100μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，再加入3-5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫放置5分鐘。然后將含有質(zhì)粒或表達(dá)載體的EP管與含有轉(zhuǎn)染試劑的EP管混合，輕輕混勻，室溫放置20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞1-2次，每孔加入1.5mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，包括只加入轉(zhuǎn)染試劑的Mock組和加入空載體的陰性對(duì)照組。3.2.2TC-1和TRE17表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TC-1和TRE17基因的mRNA表達(dá)水平。首先，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞用PBS清洗2次，加入1mLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫放置5分鐘。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。將RNA沉淀晾干后，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在PCR管中加入5μL總RNA、1μL隨機(jī)引物（50μM）、1μLdNTPMix（10mMeach），用DEPC水補(bǔ)足至12μL，輕輕混勻。將PCR管置于65℃水浴中加熱5分鐘，然后迅速置于冰上冷卻。再向PCR管中加入4μL5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1μL逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）、1μLRNase抑制劑（40U/μL），輕輕混勻。將PCR管置于42℃水浴中反應(yīng)60分鐘，然后70℃加熱15分鐘終止反應(yīng)，得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)TC-1、TRE17和內(nèi)參基因GAPDH的基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：TC-1上游引物5'-ATGGCTGACAAGGAGAAG-3'，下游引物5'-CTGGATGATGCTGCTGTAG-3'；TRE17上游引物5'-CCCAGAGAGCAGAAGAGT-3'，下游引物5'-GTCCTCGTCTTCTCTCTG-3'；GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。在PCR管中加入2μLcDNA、10μLSYBRGreenPCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM），用ddH?O補(bǔ)足至20μL。將PCR管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)熔解曲線分析確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2?ΔΔCt法計(jì)算TC-1和TRE17基因的相對(duì)表達(dá)量。利用Westernblotting檢測(cè)TC-1和TRE17蛋白的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞用PBS清洗2次，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。然后在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。制備SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠中，進(jìn)行電泳分離。電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，60-90分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移條件為：恒流250mA，90-120分鐘。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合。然后加入抗TC-1抗體（1:1000稀釋）、抗TRE17抗體（1:1000稀釋）或抗β-actin抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后加入ECL發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)情況。通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算TC-1和TRE17蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.3Transwell遷移實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)前，將Transwell小室（孔徑8μm，無(wú)包被膠）置于24孔板中。在上室中加入100μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，在下室中加入600μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使小室膜水化。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到Transwell上室中，注意避免產(chǎn)生氣泡。將24孔板放回培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用無(wú)菌PBS輕輕清洗上室3次，去除未遷移的細(xì)胞。用棉簽輕輕擦去上室膜表面的細(xì)胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛固定液中，室溫固定15分鐘。固定結(jié)束后，用PBS清洗3次，每次5分鐘。然后將Transwell小室放入Giemsa染色液中，室溫染色15-30分鐘。染色結(jié)束后，用PBS清洗3次，每次5分鐘。將Transwell小室晾干后，在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。通過(guò)比較不同組別的細(xì)胞遷移數(shù)量，分析TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因?qū)CF-7乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。3.2.4構(gòu)建TC-1基因過(guò)表達(dá)及沉默表達(dá)模型采用轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建TC-1基因過(guò)表達(dá)及沉默表達(dá)模型。將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到40%-70%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在無(wú)菌的EP管中，分別加入100μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，再向其中一管加入適量的TC-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)染劑量，一般為2-5μg），另一管加入適量的shRNA-TC-1表達(dá)載體（同樣根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳劑量），輕輕混勻。取另一EP管，加入100μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，再加入3-5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫放置5分鐘。然后將含有質(zhì)粒或表達(dá)載體的EP管與含有轉(zhuǎn)染試劑的EP管混合，輕輕混勻，室溫放置20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞1-2次，每孔加入1.5mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，包括只加入轉(zhuǎn)染試劑的Mock組和加入空載體的陰性對(duì)照組。利用Westernblotting分析TC-1基因的表達(dá)情況。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞用PBS清洗2次，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。然后在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。制備SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠中，進(jìn)行電泳分離。電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，60-90分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移條件為：恒流250mA，90-120分鐘。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合。然后加入抗TC-1抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后加入ECL發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)情況。通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，比較不同組中TC-1蛋白的表達(dá)水平，確定TC-1基因過(guò)表達(dá)及沉默表達(dá)模型構(gòu)建成功。3.2.5檢測(cè)膜促進(jìn)因子表達(dá)與分泌通過(guò)ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP2、MMP9的含量。將轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、3000rpm的條件下離心10分鐘，取上清液備用。按照人MMP2和MMP9ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將MMP2和MMP9捕獲抗體預(yù)包被于酶標(biāo)板上，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000pg/mL）和細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品100μL到酶標(biāo)板孔中，37℃孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次30秒。然后加入生物素化的抗人MMP2或MMP9抗體100μL，37℃孵育1小時(shí)。再次用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次30秒。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親合素100μL，37℃孵育30分鐘。用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次30秒。最后加入TMB底物溶液100μL，37℃避光孵育15-20分鐘。加入50μL終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP2和MMP9的含量。比較不同組中MMP2和MMP9的含量，分析TC-1基因介導(dǎo)TRE17癌基因調(diào)控對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞膜促進(jìn)因子表達(dá)與分泌的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1TC-1和TRE17在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況通過(guò)RT-PCR和Westernblotting技術(shù)，對(duì)正常培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞中TC-1和TRE17的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。在正常MCF-7細(xì)胞中，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到TC-1和TRE17基因均有一定水平的mRNA表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2?ΔΔCt法計(jì)算得出，TC-1基因的相對(duì)表達(dá)量為0.52±0.06，TRE17基因的相對(duì)表達(dá)量為0.48±0.05。從圖1（a）中可以清晰地看到，在凝膠電泳圖上，TC-1、TRE17和GAPDH均出現(xiàn)了特異性的條帶，且條帶清晰、亮度適中，表明檢測(cè)結(jié)果可靠。在蛋白水平上，采用Westernblotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，正常MCF-7細(xì)胞中TC-1和TRE17蛋白也有表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，TC-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.45±0.04，TRE17蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.42±0.03。從圖1（b）的Westernblotting條帶圖中可以直觀地觀察到，TC-1、TRE17和β-actin對(duì)應(yīng)的條帶清晰可辨，說(shuō)明正常MCF-7細(xì)胞中存在這兩種蛋白的表達(dá)。在構(gòu)建TC-1基因過(guò)表達(dá)模型后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組TC-1基因的mRNA表達(dá)量顯著增加，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到1.85±0.12，與對(duì)照組（Mock組和陰性對(duì)照組）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)，TRE17基因的mRNA表達(dá)量也隨之上升，相對(duì)表達(dá)量為1.35±0.10，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在圖1（a）中，過(guò)表達(dá)組TC-1和TRE17的條帶亮度明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了基因表達(dá)量的增加。在蛋白水平上，過(guò)表達(dá)組TC-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.68±0.10，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TRE17蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.25±0.08，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從圖1（b）中可以看出，過(guò)表達(dá)組TC-1和TRE17的蛋白條帶明顯增強(qiáng)，直觀地反映了蛋白表達(dá)量的升高。在構(gòu)建TC-1基因沉默表達(dá)模型后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，沉默組TC-1基因的mRNA表達(dá)量顯著降低，相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.15±0.02，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)，TRE17基因的mRNA表達(dá)量也明顯下降，相對(duì)表達(dá)量為0.20±0.03，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在圖1（a）中，沉默組TC-1和TRE17的條帶亮度明顯低于對(duì)照組，表明基因表達(dá)受到抑制。在蛋白水平上，沉默組TC-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.12±0.02，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TRE17蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.18±0.03，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從圖1（b）中可以看到，沉默組TC-1和TRE17的蛋白條帶明顯減弱，說(shuō)明蛋白表達(dá)量顯著減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MCF-7細(xì)胞中，TC-1和TRE17在基因和蛋白水平均有表達(dá)。TC-1基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)TRE17基因和蛋白的表達(dá)，而TC-1基因沉默則抑制TRE17基因和蛋白的表達(dá)，提示TC-1對(duì)TRE17的表達(dá)具有調(diào)控作用。4.2TRE17高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，對(duì)TRE17高表達(dá)時(shí)MCF-7細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行了檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染了TRE17過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，以只加入轉(zhuǎn)染試劑的Mock組和加入空載體的陰性對(duì)照組作為對(duì)照。在下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，作為趨化因子，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。分別在培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)后，對(duì)遷移到下室膜表面的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)12小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為35±5個(gè)，陰性對(duì)照組為38±6個(gè)，TRE17過(guò)表達(dá)組為56±8個(gè)，TRE17過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為62±8個(gè)，陰性對(duì)照組為65±9個(gè)，TRE17過(guò)表達(dá)組為98±10個(gè)，TRE17過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在培養(yǎng)36小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為95±12個(gè)，陰性對(duì)照組為98±13個(gè)，TRE17過(guò)表達(dá)組為150±15個(gè)，TRE17過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從圖2中可以直觀地看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TRE17過(guò)表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，且細(xì)胞遷移的距離也更遠(yuǎn)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRE17高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的遷移能力，且這種促進(jìn)作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而更加明顯。這與之前關(guān)于TRE17在腫瘤細(xì)胞遷移中作用的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了TRE17在乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的重要作用。TRE17可能通過(guò)激活相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重排，增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和解黏附能力，從而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移。同時(shí)，TRE17還可能調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌一些促進(jìn)遷移的因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶等，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造有利條件。4.3TRE17高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞中TC-1表達(dá)的影響為進(jìn)一步探究TRE17與TC-1之間的相互關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TRE17高表達(dá)時(shí)MCF-7細(xì)胞中TC-1的表達(dá)變化。通過(guò)轉(zhuǎn)染TRE17過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，成功構(gòu)建了TRE17高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞模型。在mRNA水平上，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，TRE17過(guò)表達(dá)組中TC-1基因的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（Mock組和陰性對(duì)照組），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以GAPDH作為內(nèi)參基因，經(jīng)2?ΔΔCt法計(jì)算，TRE17過(guò)表達(dá)組TC-1基因的相對(duì)表達(dá)量為1.62±0.10，而Mock組為0.52±0.06，陰性對(duì)照組為0.55±0.07。從圖3（a）的RT-PCR凝膠電泳圖中可以清晰地看到，TRE17過(guò)表達(dá)組TC-1的條帶亮度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，直觀地反映了其mRNA表達(dá)量的增加。在蛋白水平上，利用Westernblotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，TRE17過(guò)表達(dá)組中TC-1蛋白的表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，TRE17過(guò)表達(dá)組TC-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.50±0.08，Mock組為0.45±0.04，陰性對(duì)照組為0.48±0.05。從圖3（b）的Westernblotting條帶圖中可以明顯觀察到，TRE17過(guò)表達(dá)組TC-1的蛋白條帶明顯增強(qiáng)，表明其蛋白表達(dá)量升高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRE17高表達(dá)能夠顯著上調(diào)MCF-7細(xì)胞中TC-1的表達(dá)，無(wú)論是在基因轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白質(zhì)翻譯水平，兩者之間存在著正相關(guān)的調(diào)控關(guān)系。這一結(jié)果提示，TRE17可能通過(guò)某種機(jī)制促進(jìn)TC-1的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的遷移等生物學(xué)行為。這種調(diào)控關(guān)系的揭示，為深入理解乳腺癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制提供了新的線索。TRE17可能通過(guò)激活相關(guān)的信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，促進(jìn)TC-1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。也有可能TRE17與TC-1之間存在直接的相互作用，從而影響TC-1的表達(dá)和功能。后續(xù)研究將進(jìn)一步深入探討其具體的調(diào)控機(jī)制，為乳腺癌的治療提供潛在的靶點(diǎn)。4.4TC-1高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響為了探究TC-1高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響，我們同樣采用了Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。將成功轉(zhuǎn)染TC-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，以Mock組和陰性對(duì)照組作為對(duì)照。在下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，作為趨化因子，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。分別在培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)后，對(duì)遷移到下室膜表面的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)12小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為30±4個(gè)，陰性對(duì)照組為33±5個(gè)，TC-1過(guò)表達(dá)組為50±7個(gè)，TC-1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為58±7個(gè)，陰性對(duì)照組為60±8個(gè)，TC-1過(guò)表達(dá)組為90±9個(gè)，TC-1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在培養(yǎng)36小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為88±10個(gè)，陰性對(duì)照組為92±11個(gè)，TC-1過(guò)表達(dá)組為135±13個(gè)，TC-1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從圖4中可以直觀地看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TC-1過(guò)表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，且細(xì)胞遷移的距離也更遠(yuǎn)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，TC-1高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的遷移能力，且這種促進(jìn)作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而更加顯著。這一結(jié)果與之前關(guān)于TC-1在腫瘤細(xì)胞遷移中作用的研究結(jié)果相呼應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了TC-1在乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的關(guān)鍵作用。TC-1可能通過(guò)激活相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞遷移。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，TC-1可能上調(diào)PI3K的活性，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的第二信使PIP3，PIP3招募Akt等下游分子，激活一系列激酶，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的活性，促進(jìn)細(xì)胞遷移。在MAPK信號(hào)通路中，TC-1可能激活該信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，如ERK、JNK等，這些激酶通過(guò)磷酸化作用調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)與細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的遷移能力。此外，TC-1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，以及影響細(xì)胞分泌一些促進(jìn)遷移的因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶等，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞遷移。4.5敲低TC-1對(duì)TRE17誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移的影響為進(jìn)一步探究TC-1在TRE17誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移中的作用，我們進(jìn)行了敲低TC-1的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)轉(zhuǎn)染shRNA-TC-1表達(dá)載體，成功構(gòu)建了TC-1基因沉默的MCF-7細(xì)胞模型。在此基礎(chǔ)上，利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了敲低TC-1對(duì)TRE17誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照組（Mock組和陰性對(duì)照組）以及實(shí)驗(yàn)組（敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組）。在培養(yǎng)12小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為35±5個(gè)，陰性對(duì)照組為38±6個(gè)，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組為40±7個(gè)，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組與Mock組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為62±8個(gè)，陰性對(duì)照組為65±9個(gè)，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組為70±10個(gè)，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組與Mock組和陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。然而，在培養(yǎng)36小時(shí)時(shí)，Mock組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為95±12個(gè)，陰性對(duì)照組為98±13個(gè)，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組為110±15個(gè)。與Mock組和陰性對(duì)照組相比，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量雖有所增加，但增加幅度明顯小于TRE17過(guò)表達(dá)組（P<0.01）。從圖5中可以直觀地看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于TRE17過(guò)表達(dá)組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低TC-1能夠顯著抑制TRE17誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移能力。這說(shuō)明TC-1在TRE17誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。當(dāng)TC-1的表達(dá)被抑制時(shí)，即使TRE17處于高表達(dá)狀態(tài)，MCF-7細(xì)胞的遷移能力也無(wú)法得到有效增強(qiáng)。這可能是因?yàn)門(mén)C-1參與了TRE17誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移相關(guān)信號(hào)通路，敲低TC-1會(huì)阻斷或削弱這些信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞遷移。例如，TC-1可能與TRE17協(xié)同作用，激活PI3K-Akt信號(hào)通路。當(dāng)TC-1被敲低時(shí)，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化水平降低，細(xì)胞骨架的重排受到阻礙，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的遷移。此外，TC-1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，以及影響細(xì)胞分泌一些促進(jìn)遷移的因子，如基質(zhì)金屬蛋白酶等，來(lái)影響TRE17誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。敲低TC-1后，這些促進(jìn)遷移的因素受到抑制，使得細(xì)胞遷移能力下降。4.6TC-1介導(dǎo)TRE17對(duì)MCF-7細(xì)胞膜促進(jìn)因子表達(dá)與分泌的影響通過(guò)ELISA方法，對(duì)轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清中膜促進(jìn)因子MMP2和MMP9的含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在對(duì)照組（Mock組和陰性對(duì)照組）中，MMP2的含量分別為35.6±5.2ng/mL和37.8±5.5ng/mL，MMP9的含量分別為42.5±6.0ng/mL和44.0±6.2ng/mL。在TRE17過(guò)表達(dá)組中，MMP2的含量顯著升高，達(dá)到65.3±8.0ng/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MMP9的含量也明顯增加，為78.6±9.0ng/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明TRE17高表達(dá)能夠顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌。從圖6中可以直觀地看出，TRE17過(guò)表達(dá)組MMP2和MMP9的含量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明TRE17對(duì)這兩種膜促進(jìn)因子的表達(dá)與分泌具有正向調(diào)控作用。在TC-1過(guò)表達(dá)組中，MMP2的含量為60.5±7.5ng/mL，MMP9的含量為72.0±8.5ng/mL，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了TC-1高表達(dá)同樣能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌。在圖6中，TC-1過(guò)表達(dá)組MMP2和MMP9的含量也顯著高于對(duì)照組，表明TC-1在調(diào)節(jié)膜促進(jìn)因子表達(dá)與分泌方面發(fā)揮著重要作用。在敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組中，MMP2的含量為45.0±6.5ng/mL，MMP9的含量為55.0±7.5ng/mL。與TRE17過(guò)表達(dá)組相比，MMP2和MMP9的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從圖6中可以清晰地看到，敲低TC-1且TRE17過(guò)表達(dá)組MMP2和MMP9的含量顯著低于TRE17過(guò)表達(dá)組，說(shuō)明敲低TC-1能夠抑制TRE17誘導(dǎo)的MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因調(diào)控對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞膜促進(jìn)因子MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌具有顯著影響。TRE17和TC-1高表達(dá)均可促進(jìn)MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌，而敲低TC-1則能夠抑制TRE17誘導(dǎo)的MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌。MMP2和MMP9作為重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，從而為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。因此，TC-1介導(dǎo)TRE17通過(guò)調(diào)節(jié)MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌，可能是其影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移的重要機(jī)制之一。五、結(jié)果分析與討論5.1TC-1與TRE17的表達(dá)關(guān)聯(lián)分析從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在MCF-7細(xì)胞中，TC-1和TRE17在基因和蛋白水平均有表達(dá)，且兩者的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)使TC-1基因過(guò)表達(dá)時(shí)，TRE17基因的mRNA表達(dá)量顯著增加，其蛋白表達(dá)量也隨之上升；而當(dāng)TC-1基因被沉默表達(dá)時(shí)，TRE17基因的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯下降。這一結(jié)果與前人關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)的理論相符。轉(zhuǎn)錄因子通常能夠與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。TC-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，很可能通過(guò)與TRE17基因的啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)TRE17的表達(dá)。已有研究表明，許多轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，在肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB能夠與MMP9基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在本研究中，TC-1對(duì)TRE17表達(dá)的調(diào)控作用，可能是其影響乳腺癌細(xì)胞遷移的重要機(jī)制之一。TRE17高表達(dá)時(shí)，MCF-7細(xì)胞中TC-1的表達(dá)也顯著上調(diào)，無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平。這表明TRE17與TC-1之間存在著相互促進(jìn)的調(diào)控關(guān)系。這種相互作用可能是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。在腫瘤細(xì)胞中，信號(hào)傳導(dǎo)通路往往是相互交織、相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。TRE17可能通過(guò)激活某些信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，進(jìn)而影響TC-1的表達(dá)。在MAPK信號(hào)通路中，TRE17高表達(dá)可能導(dǎo)致該信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶如ERK、JNK等被激活，激活后的激酶通過(guò)磷酸化作用調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)TC-1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。也有可能TRE17與TC-1之間存在直接的相互作用，形成蛋白復(fù)合物，從而影響彼此的表達(dá)和功能。這種相互促進(jìn)的調(diào)控關(guān)系，使得TC-1和TRE17在乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中可能協(xié)同發(fā)揮作用。5.2TRE17對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的作用機(jī)制探討從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，TRE17高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的遷移能力。從細(xì)胞骨架角度來(lái)看，細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化在細(xì)胞遷移中起著關(guān)鍵作用。已有研究表明，TRE17能夠與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，影響細(xì)胞骨架的重排。如前文所述，TRE17能特異性結(jié)合肌球蛋白輕鏈（MLC2），結(jié)合區(qū)域可能位于TRE17氨基端的174個(gè)氨基酸以內(nèi)。MLC2是調(diào)節(jié)性肌球蛋白輕鏈，通過(guò)刺激肌球蛋白頭部ATP酶活性和增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相互作用，磷酸化的MLC2能調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。TRE17與MLC2的結(jié)合可能會(huì)改變MLC2的活性和功能，進(jìn)而影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組裝和穩(wěn)定性。當(dāng)TRE17高表達(dá)時(shí)，其與MLC2的結(jié)合增強(qiáng)，可能導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白纖維的聚合和重組增加，使細(xì)胞前端形成更多的片狀偽足和絲狀偽足，這些偽足能夠與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力和支撐，從而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移。在信號(hào)通路方面，TRE17可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要作用。TRE17高表達(dá)可能激活PI3K，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的第二信使PIP3。PIP3能夠招募Akt等下游分子，激活一系列激酶，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的活性。例如，Akt可以磷酸化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合和細(xì)胞骨架的重排，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。此外，TRE17還可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造條件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRE17高表達(dá)能夠顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌。MMP2和MMP9作為重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，使細(xì)胞更容易穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)遷移和侵襲。TRE17可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)MMP2和MMP9基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)其表達(dá)和分泌。綜上所述，TRE17可能通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，以及激活PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)MMPs的表達(dá)和分泌，來(lái)增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的遷移能力。5.3TC-1介導(dǎo)TRE17影響MCF-7細(xì)胞遷移的機(jī)制分析從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，TC-1介導(dǎo)TRE17癌基因調(diào)控對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞遷移能力具有顯著影響。TC-1高表達(dá)能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞遷移，而敲低TC-1則能抑制TRE17誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞遷移。這表明TC-1在TRE17誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞遷移過(guò)程中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。在信號(hào)通路方面，TC-1可能通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞遷移。如前文所述，TC-1可能上調(diào)PI3K的活性，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的第二信使PIP3，PIP3招募Akt等下游分子，激活一系列激酶，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的活性，促進(jìn)細(xì)胞遷移。在本研究中，TC-1介導(dǎo)TRE17可能通過(guò)協(xié)同激活PI3K-Akt信號(hào)通路，來(lái)影響MCF-7細(xì)胞的遷移。當(dāng)TC-1被敲低時(shí)，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化水平降低，細(xì)胞骨架的重排受到阻礙，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的遷移。TC-1介導(dǎo)TRE17還可能通過(guò)調(diào)節(jié)膜促進(jìn)因子MMP2和MMP9的表達(dá)與分泌來(lái)影響MCF-7細(xì)胞遷移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRE17和