3131I II II請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容有可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件主要起草人：劉惠莉、陶潔、李本強(qiáng)、程靖華、劉佩紅、石迎、林鷙、1豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬德?tīng)査跔畈《捐b別技術(shù)要求病毒（porcinetransmissiblegastroenteritisv25.1.7凝膠成像系統(tǒng)(或紫外透射儀)。5.1.8冰箱(2℃~8℃、—20℃)。5.2試劑5.2.1Trizol,4℃~8℃保存。5.2.3異丙醇，4℃~8℃保存。5.2.475%乙醇，4℃~8℃保存。5.2.5DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，4℃~8℃保存。5.2.65×反轉(zhuǎn)錄混懸液(或反轉(zhuǎn)錄酶、Buffer、RNA酶抑制劑、dNTP和隨機(jī)引物),-20℃保存。5.2.72×PCR反應(yīng)液(或聚合酶、Buffer和dNTP),—20℃保存。5.2.8核酸染料，4℃~8℃保存。5.2.9PBS(應(yīng)符合附錄A),常溫保存。5.2.101×TAE(應(yīng)符合附錄A),常溫保存。5.2.11DEPC處理水(應(yīng)符合附錄A),4℃~8℃保存。5.2.12引物(應(yīng)符合附錄B),—20℃保存。5.2.13陽(yáng)性對(duì)照(含有目的核酸片段的質(zhì)粒，或含有PEDV、TGEV或PDCoV的陽(yáng)性樣品，或標(biāo)準(zhǔn)毒5.2.14陰性對(duì)照(Vero細(xì)胞、PK15細(xì)胞和ST細(xì)胞懸液，或DEPC處理水),—20℃保存。5.3.3吸頭(或帶濾芯吸頭)。6樣品采集與處置6.2樣品采集和預(yù)處理采集樣品在4℃~8℃保存條件下24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。若采集樣品在一周內(nèi)檢測(cè)完畢，則可放置4℃~8℃;若采集樣品需長(zhǎng)期保存，則應(yīng)放置—20℃凍存。37.1.1取量程為1.5mL的滅菌EP管，分別加入待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各200μL,加入7507.1.34℃,在12000×g離心力條件下離心15min,吸取上清400μL,加入等體積異丙醇，混勻，7.1.44℃,在12000×g離心力條件下離心10min,棄上清，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇。7.1.54℃,在12000×g離心力條件下離心10min,棄上清，自然干燥5min。6μLDEPC處理水。置于PCR儀中42℃孵育60min,經(jīng)70℃作用15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶7.3RT-PCR檢測(cè)72℃延伸5min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取出產(chǎn)物進(jìn)行電泳或置于4℃~8℃。使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。在電泳槽中加入1×TAE,取擴(kuò)增產(chǎn)物和DL2000DNA膠成像系統(tǒng)(或紫外透射儀)上觀察，判定結(jié)果并做好記錄。陰性對(duì)照無(wú)任何DNA擴(kuò)增帶，陽(yáng)性對(duì)照在332bp、226bp或504bp位置同時(shí)出現(xiàn)特異性條帶(應(yīng)符合附錄C),則鑒別檢測(cè)結(jié)果成立；反之則此次鑒別檢測(cè)不成立。45