3-1重組DNA技術的基本工具基因工程選擇性必修3巴甫洛夫1849.9.26—1936.2.

教學目標課前聚焦1.闡明重組DNA技術所需的三種基本工具的作用。2.認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術創(chuàng)新。3.進行DNA的粗提取與鑒定。

本節(jié)聚焦重組DNA技術所需的三種基本工具是什么？它們的作用是什么？基因工程載體需要具備什么條件？害蟲死亡從社會中來資料：蘇云金桿菌中存在一種毒蛋白基因，編碼出的毒蛋白能殺死害蟲。能不能將“殺蟲基因”導入到棉花細胞中，使棉花自身產生抗蟲蛋白來抵抗棉鈴蟲呢?DNA目的基因切割受體細胞內DNA拼接DNA導入基因工程基因工程：是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫

重組DNA技術。對基因工程的概念的理解轉基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程原理結果重組DNA技術、轉基因技術生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導入→表達創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品基因重組知識回顧基因是有遺傳效應的DNA片段知識回顧U腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）AGC核苷酸核糖核苷酸T腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）AGC脫氧核苷酸DNA的結構：知識回顧DNA的結構：TAGCATCGATGCTACG磷酸二酯鍵3，3，5，5，知識回顧蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因能通過拼接在普通棉花中，表達出轉基因抗蟲棉的基礎是？大腸桿菌和人的遺傳物質都是

。為什么不同生物的DNA分子能夠拼接在一起？為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？DNA理論基礎1.DNA的基本組成單位相同(都是四種脫氧核苷酸)2.都遵循堿基互補配對原則3.DNA分子的空間結構都是規(guī)則的雙螺旋結構

理論基礎1.基因是控制生物性狀的結構與功能單位2.遺傳信息傳遞都遵循中心法則3.生物界幾乎共用一套遺傳密碼基因工程蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因拼接在普通棉花中，需要借助以下工具：工具分子手術刀分子縫合針分子運輸車限制性內切核酸酶：DNA連接酶：載體：準確切割DNA分子,得到所需的目的基因能將目的基因連接到載體上能將目的基因導入受體細胞中限制性內切核酸酶——“分子手術刀”

限制性內切核酸酶（簡稱__________）限制酶蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因拼接在普通棉花中，需要借助以下工具：限制酶主要是從原核生物中分離純化出來。限制酶是細胞的一種防御性工具。當原核細胞遭到外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效。來源：限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制酶的命名：

EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個字母R型菌株從中分離的第一個限制酶例如：流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制酶的作用結果①產生黏性末端

識別序列為GAATTC切割部位為GA之間黏性末端當限制酶在它識別序列的中軸線兩側將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是黏性末端。GCAATTTATACG5'3'3'5'GCTTAAAATTCG

EcoRI限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制酶的作用結果①產生平末端當限制酶在它識別序列的中軸線處將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產生的是平末端。

識別序列為CCCGGG切割部位為CG之間平末端CGCCGGGCGCGC5'3'3'5'CGCCGGGCGCGC

SmaI限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制酶的作用結果CTTCATGAATTCCGTACCCGGGCCTAA

GAAGTACTTAAGGCATGGGCCCGGATTEcoRⅠ限制酶酶切位點黏性末端GGCATGGGAATTCCGTACCCCTTCATG

GAAGTACTTAA平末端SmaⅠ限制酶酶切位點GGGCCTAACCCGGATT…TACCC…ATGGG限制性內切核酸酶——“分子手術刀”限制酶的識別序列特點：通常為6個核苷酸，也有的為4個或8個核苷酸特點：①都可以找到一條中心軸線；②中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，這就是回文序列。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’回文序列：在切割部位，一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈5’往3’讀的順序完全一致。當堂訓練1.限制酶

(填“能”或“不能”)切割原核細胞自身的DNA，試推測其理由是

練習1.BamHⅠ和BclⅠ是兩種限制酶，其識別序列及切割位點如下表所示：限制酶BamHⅠBclⅠ識別序列及切割位點

不能原核細胞DNA中不存在限制酶的識別序列或能被識別的序列被修飾了2.推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？原核生物容易受到外源DNA的入侵，限制酶可以切割外源DNA,使之失效，從而保證自身的安全。當堂訓練3.若某鏈狀DNA分子中含有兩個BamHⅠ的識別序列，該DNA分子將被切成

個片段，共斷裂

個磷酸二酯鍵。

練習1.BamHⅠ和BclⅠ是兩種限制酶，其識別序列及切割位點如下表所示：限制酶BamHⅠBclⅠ識別序列及切割位點

4.請畫出BclⅠ切割后產生的末端

。34不同限制酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端，稱為同尾酶DNA連接酶——“分子縫合針”

現有來自兩種生物的DNA片段1和DNA片段2，用同一種限制酶處理后，DNA片段1和2帶有______的黏性末端。在一個混合體系中，DNA片段1和2隨機碰撞在一起時，黏性末端之間會自發(fā)形成______，但不同DNA片段骨架上的缺口無法自動連接。DNA連接酶的作用是：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被________切開的兩個__________之間的____________。相同氫鍵限制酶核苷酸磷酸二酯鍵DNA連接酶——“分子縫合針”類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源________________________功能只縫合____________縫合____________和____________結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯鍵3′3′5′5′5′5′5′5′T4DNA連接酶5′5′5′5′3′3′5′5′T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶的作用示意圖DNA聚合酶的作用示意圖DNA連接酶——“分子縫合針”同尾酶DNA連接酶——“分子縫合針”名稱作用部位作用結果限制酶磷酸酯鍵

將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸酯鍵

將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸酯鍵

將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸酯鍵

將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈歸納總結：幾種相關酶的比較當堂訓練練習2.

已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—。（1）則能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。（3）DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA連接酶可得到DNA1和DNA2的重組DNA片段，該重組DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割，_______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。能不一定能能不一定—GGATCX——CCTAGX——XGATCX——XCTAGX——G—CCTAGGATCX—

X——GGATCC——CCTAGG—基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”將外源基因送入受體細胞,

在受體細胞內對目的基因進行大量復制作用：種類：通常是用質粒，噬菌體、動植物病毒也可以質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。擬核質粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因復制起點注：真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。一段特殊的DNA序列，DNA聚合酶的識別和結合位點基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”質粒作為運載體的優(yōu)點：①質粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點，

便于_________________________________；②質粒含有復制原點，可在受體細胞中進行自我復制，

或整合到受體細胞_______________；③質粒DNA分子上有特殊的____________，如四環(huán)素

抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，供重組DNA的

_____________。④對受體細胞無害、易分離外源DNA片段（目的基因)插入標記基因鑒定和篩選染色體DNA上基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”思考：形成一個重組質粒會形成_____個磷酸酯鍵？4【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。一、提取的基本思路二、

實驗原理DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，

能溶于2mol/LNaCl溶液。在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現

藍色。0DNA溶解度NaCl濃度0.14mol/L2mol/L【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定②

試劑：三、材料用具析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現配現用試劑作用研磨液體積分數為95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺試劑蒸餾水DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等注意：①

選材：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定四、方法步驟稱取30g洋蔥,切碎,然后放入研缽中,倒入10mL研磨液,充分研磨取材研磨過濾分離鑒定在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。(或離心后，取上清液)研磨的目的：破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定四、方法步驟取材研磨過濾分離鑒定在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%)，靜置2-3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分(或用離心法取沉淀物)攪拌時應輕緩、并沿一個方向：減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子酒精預冷的作用：低溫抑制核酸水解酶活性，抑制DNA降解；低溫抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定四、方法步驟組別試劑處理結果對照組實驗組取材研磨過濾分離鑒定實驗組對照組水浴加熱溶液藍色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關。2mol/L的NaCl溶液5mL2mol/L的NaCl溶液5mL4mL的二苯胺試劑4mL的二苯胺試劑絲狀物或沉淀物【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定五、注意事項1.利用動物細胞提取DNA時，破碎細胞的方法：動物細胞無細胞壁，可直接使其_________。2.以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止__________。3.提純DNA時，選用體積分數為95%的冷酒精的原因：體積分數為95%的冷酒精__________更佳。4.實驗中進行了2次靜置或離心，目的是將_______和__________分開，第1次操作后，DNA存在于________中；第2次操作后DNA存在于_________________或_____________中。5.加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇_______________，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。吸水漲破提純效果DNA雜質分子上清液析出的白色絲狀物離心管沉淀血液凝固DNA分子的斷裂【探究

實踐】DNA粗提取與鑒定總結歸納限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標記基因；④能自我復制或能整合到宿主DNA上。質粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結果：形成黏性末端或平末端連接部位：

磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

對點訓練【例3】下圖所示為某限制性內切核酸酶切割某DNA分子的過程,從圖中可知,該限制酶能識別的堿基序列及切點是(

)

A.3?-CTTAAG-5?,切點在C和T之間B.5?-CTTAAG-3?,切點在G和A之間C.5?-GAATTC-3?,切點在G和A之間D.5?-GAATTC-3?,切點在C和T之間C對點訓練【例4】關于限制酶和DNA連接酶的說法中,正確的是(

)A.限制酶切割后一定能產生黏性末端B.DNA連接酶可恢復DNA分子中的氫鍵C.在基因工程中DNA聚合酶可以替代DNA連接酶D.其化學本質都是蛋白質【例5】質粒是基因工程最常用的載體,下列關于質粒的說法,正確的是 (

)A.質粒在宿主細胞內都要整合到染色體DNA上B.質粒是獨立于細菌擬核DNA之外的小型細胞器C.基因工程使用的質粒一定含有標記基因和復制原點D.質粒上堿基之間的數量存在A+G=U+CCD基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”練習3、普通的細菌一般是對抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中______（能/不能）生長。如果給普通細菌導入一個含有四環(huán)素抗性基因的質粒，四環(huán)素抗性基因的____________可使細菌獲得抵抗四環(huán)素的性狀。敏感不能表達產物基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”練習4.2016課標I卷40

某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致相應的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答下列問題：基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”練習4.2016課標I卷40

結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌?；蜻M入受體細胞的載體----“分子運輸車”練習4.2016課標I卷40

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞不能區(qū)分的，其原因是__________________________________________________________；并且____________________和_____________________________的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是__________________________________。二者均不含氨芐青霉素抗性基因，二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不能生長

在該培養(yǎng)基上均能生長

含有質粒載體

含有插入了目的基因的重組質粒

在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有＿＿＿＿的固體培養(yǎng)基。四環(huán)素基因進入受體細胞的載體----“分子運輸車”練習4.2016課標I卷40影印接種法關于限制酶的選擇：單酶切和雙酶切練習5.圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因導入受體細胞的質粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關限制酶的作用部位如圖所示，現欲培養(yǎng)轉基因抗病植株，回答下列問題。（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞__________和—__________________________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________________。目的基因質粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一側含有黏性末端，不能插入到質粒中關于限制酶的選擇：單酶切和雙酶切（3）由于反應體系中含有大量的外源DNA片段和質粒，加入PstI一種限制酶后，會得到大量的目的基因片段和質粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會形成目的基因與質粒連接的環(huán)狀產物外，還會形成________________________連接的環(huán)狀產物以及_______________________連接的環(huán)狀產物。此外，目的基因與質粒的連接既可以是正向連接，也可以是______________，后者可能會導致目的基因無法正常表達。練習5.圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因導入受體細胞的質粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關限制酶的作用部位如圖所示，現欲培養(yǎng)轉基因抗病植株，回答下列問題。目的基因與目的基