第二章

細(xì)胞工程概念：細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法，通過細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品的一門綜合性生物工程。植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程1902年，哈伯蘭特提出了細(xì)胞全能性的理論，

但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)嘗試沒有成功。1958年，斯圖爾德等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細(xì)胞可以分化為胚，

為細(xì)胞全能性理論提供了強(qiáng)有力的支持。1960年，科金用真菌的纖維素酶分解番茄根的細(xì)胞壁，

成功獲得了原生質(zhì)體。1964年，古哈等在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時(shí)，

首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的胚。1971年，卡爾森誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，

獲得了第一株體細(xì)胞種間雜種植株。1974年，土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒被發(fā)現(xiàn)。之后,

該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進(jìn)

植物細(xì)胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合?？萍继剿髦贰ぶ参锛?xì)胞工程發(fā)展歷程2.1.1植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)本節(jié)聚焦：1.植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是什么？2.什么是植物組織培養(yǎng)技術(shù)和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)？3.怎樣進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)？溫故知新：細(xì)胞的全能性1.概念：細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生

或

分化成

的潛能,即細(xì)胞的全能性。2.原因：一般來說，生物體的每個(gè)細(xì)胞中都含有發(fā)育成為

完整個(gè)體所需的

。完整生物體其他各種細(xì)胞全部遺傳信息生物體生長發(fā)育過程中,所有的細(xì)胞都能表現(xiàn)出全能性嗎？思考不是。如：芽原基的細(xì)胞只能發(fā)育為芽，葉原基的細(xì)胞只能發(fā)育為葉。原因：在特定的時(shí)間和空間條件下，細(xì)胞中的基因會(huì)選擇性地表達(dá)。溫故知新：細(xì)胞的全能性火焰蘭的快速繁殖如何才能讓細(xì)胞表現(xiàn)出全能性？思考植物組織培養(yǎng)技術(shù)①離體②人工配置的培養(yǎng)基③適宜的培養(yǎng)條件④無菌等植物組織培養(yǎng)技術(shù)011.概念：指將

的植物器官、組織或細(xì)胞等，

培養(yǎng)在

上，給予

，

誘導(dǎo)其形成

的技術(shù)。2.過程：離體人工配制的培養(yǎng)基適宜的培養(yǎng)條件完整植株統(tǒng)稱外植體實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)技術(shù)菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐1.

：在一定植物激素和營養(yǎng)等條件的誘導(dǎo)下，已經(jīng)分化的細(xì)胞可以經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，再分化成芽和根等器官，進(jìn)而發(fā)育成完整的植株。植物細(xì)胞的全能性請(qǐng)簡單概括出植物組織培養(yǎng)的技術(shù)流程圖。思考外植體愈傷組織芽、根植株脫分化再分化實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)技術(shù)菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐①愈傷組織：細(xì)胞排列疏松且無規(guī)則、高度液泡化、

、呈

團(tuán)塊。②脫分化：已經(jīng)分化的細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)，

失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成

細(xì)胞（愈傷組織）的過程。③再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，

又可以重新

出根、芽等器官的過程。未分化不定形的薄壁組織未分化分化愈傷組織無葉綠體植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐生長素/細(xì)胞分裂素

結(jié)果比值高比值低比值適中2.激素的作用：植物激素中

和

是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素，它們的

、

等都會(huì)影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向；生長素細(xì)胞分裂素濃度比例有利于根的分化，抑制芽的形成有利于芽的分化，抑制根的形成促進(jìn)愈傷組織的形成注意：由愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞分化時(shí)，一般要先誘導(dǎo)其生芽，然后誘導(dǎo)其生根。實(shí)驗(yàn)原理①外植體：②體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精：③質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右的次氯酸鈉溶液:④無菌水:⑤培養(yǎng)基（參見本書附錄1）

：水和無機(jī)鹽

：蔗糖、氨基酸、維生素等特定濃度和比例的激素(

)瓊脂（

培養(yǎng)基）植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐材料用具幼嫩的菊花莖段(容易誘導(dǎo)形成愈傷組織)對(duì)手、超凈工作臺(tái)、外植體進(jìn)行消毒對(duì)外植體進(jìn)行消毒清洗外植體無機(jī)營養(yǎng)成分有機(jī)營養(yǎng)成分生長素和細(xì)胞分裂素固體植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐①培養(yǎng)基名稱：

；②物理性質(zhì)：

；③碳源：

。MS固體培養(yǎng)基蔗糖植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐菊花組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)外植體脫分化形成愈傷組織的培養(yǎng)基中加入蔗糖等有機(jī)物的原因是？思考材料用具①作為碳源，提供能量。注：此時(shí)外植體不能進(jìn)行光合作用制造有機(jī)物。②調(diào)節(jié)滲透壓。a.雙手和超凈工作臺(tái)臺(tái)面:

。b.外植體:→

充分沖洗；→

消毒30s；→立即用

清洗2～3次；→

處理30min；→立即用

清洗2～3次。植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟用酒精擦拭流水酒精無菌水次氯酸鈉溶液無菌水①消毒工作植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟②外植體切段消毒過的外植體置于

.

吸去外植體表面水分用解剖刀切成

長的小段無菌培養(yǎng)皿無菌濾紙0.5~1cm植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟③外植體接種在酒精燈火焰旁（

），將外植體的1/3～1/2（

），插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中（生長素/細(xì)胞分裂素比值

）封口膜封蓋瓶口，并做好標(biāo)記無菌區(qū)域形態(tài)學(xué)下端適中注意：接種時(shí)注意外植體的方向，不要倒插！植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟④誘導(dǎo)脫分化將外植體置于

的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況18~22℃注：脫分化過程一般不需要光照，

有光易形成維管組織，

不易形成愈傷組織。植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟⑤誘導(dǎo)再分化15～20d后，將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上。（生長素/細(xì)胞分裂素比值

）形成試管苗長出芽后，再將其轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上。（生長素/細(xì)胞分裂素比值

）低高注意：再分化過程中，每日需要給予適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的光照(誘導(dǎo)葉綠素的合成)！先生芽，再生根。原因：若先生根，后面不易生芽。植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟⑥移栽試管苗打開封口膜或瓶蓋,讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長幾日每天觀察并記錄生長情況用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到

等環(huán)境中，待其長壯后再移栽入土消毒的蛭石或珍珠巖植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐方法步驟⑥移栽試管苗珍珠巖【資料】蛭石具有良好的保溫性能和透氣性，吸水能力強(qiáng)?！举Y料】珍珠巖透氣性強(qiáng)，具有很好的排水性。植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐接種3～4d后，檢查外植體的生長情況，統(tǒng)計(jì)有多少外植體被污染，有多少能正常生長，并分析它們被污染的原因。思考①培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底；②外植體消毒不徹底；③操作過程不符合無菌操作要求等。注：實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基和所有器械都要滅菌。接種操作必須在酒精燈火焰旁進(jìn)行，并且每次使用后的器械都要滅菌。被污染的培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)技術(shù)01菊花的組織培養(yǎng)探究·實(shí)踐培育的試管苗能直接移栽到露地嗎？應(yīng)如何操作？思考既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系煉苗無土栽培提示：不能，在移栽前一般需要

,目的是提高組培苗對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)性。新移栽的試管苗要在溫室過渡幾天，待其長壯后再移植到大田或盆中。另外要注意移栽技術(shù)的關(guān)鍵是：

,一般使用

的辦法。(1)植物體的任何細(xì)胞都具有全能性，也都能表現(xiàn)出全能性()(2)在植物組織培養(yǎng)時(shí)，對(duì)外植體要進(jìn)行滅菌處理()(3)若用菊花莖切段作為外植體，應(yīng)將其形態(tài)學(xué)上端插入誘導(dǎo)愈傷組織的

培養(yǎng)基中()(4)誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基和誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基完全一樣()植物組織培養(yǎng)技術(shù)·判斷正誤P23×不一定；01×消毒處理；×形態(tài)學(xué)下端；×生長素與細(xì)胞分裂素的比值不同；1.下列關(guān)于菊花組織培養(yǎng)的敘述，正確的是()A．用自然生長的莖進(jìn)行組織培養(yǎng)需要用適宜濃度的乙醇和次氯酸鈉的混合液消毒B．培養(yǎng)瓶用專用封口膜封口可防止外界雜菌侵入并阻止瓶內(nèi)外的氣體交換C．再生植株需要去除根部殘留的培養(yǎng)基進(jìn)行鍛煉后才能移種大田D．試管苗鍛煉時(shí)采用蛭石作為栽培基質(zhì)的原因是蛭石帶菌量低且營養(yǎng)豐富植物組織培養(yǎng)技術(shù)·落實(shí)思維方法P2301C外植體消毒:酒精消毒-無菌水清洗-次氯酸鈉-無菌水清洗，×;不影響氣體交換，×;蛭石保水透氣，但不含營養(yǎng)，×;2．如圖是植物組織培養(yǎng)過程示意圖，下列相關(guān)說法正確的是()A．上述植物組織培養(yǎng)過程依據(jù)的生物學(xué)原理是植物細(xì)胞具有全能性B．需要對(duì)外植體進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理，以防止雜菌污染C．外植體若是月季的花藥，則圖中的①過程需要光照D．外植體若是菊花的根尖組織，因細(xì)胞中沒有葉綠體，

故培養(yǎng)成的新植株葉片無色植物組織培養(yǎng)技術(shù)·落實(shí)思維方法P2301A消毒，×;①脫分化-不需要光照且應(yīng)避光培養(yǎng)，×;有全套基因，細(xì)胞分化過程中，基因的選擇性表達(dá)會(huì)使葉片呈綠色，×;植物組織培養(yǎng)技術(shù)·綜合強(qiáng)化小本P10001右圖表示菊花莖段細(xì)胞通過無菌操作接種到試管培養(yǎng)基上后，在一定的條件下，形成試管苗的培育過程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：(1)要促進(jìn)細(xì)胞分裂生長，培養(yǎng)基中應(yīng)有營養(yǎng)物質(zhì)和激素。營養(yǎng)物質(zhì)包括

和小分子有機(jī)物，激素包括細(xì)胞分裂素和

兩類植物激素。(2)此過程依據(jù)的原理是

。A和B階段主要進(jìn)行的分裂方式是

，B階段除了細(xì)胞分裂外，還進(jìn)行細(xì)胞

等。無機(jī)物生長素植物細(xì)胞的全能性有絲分裂分化植物組織培養(yǎng)技術(shù)·綜合強(qiáng)化小本P10001右圖表示菊花莖段細(xì)胞通過無菌操作接種到試管培養(yǎng)基上后，在一定的條件下，形成試管苗的培育過程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：(3)此過程要無菌操作，主要是指對(duì)

進(jìn)行滅菌處理。B階段需要光照，原因是

。(4)試管苗的根細(xì)胞沒有葉綠素，而葉的葉肉細(xì)胞具有葉綠素，這是基因

的結(jié)果。培養(yǎng)基芽發(fā)育成葉，葉肉細(xì)胞中葉綠素的合成需要光照條件選擇性表達(dá)從社會(huì)中來

20世紀(jì)60年代，科學(xué)家嘗試將番茄和馬鈴薯雜交，希望培育出一種地上結(jié)番茄、地下長馬鈴薯的“超級(jí)作物”。討論：用傳統(tǒng)的有性雜交方法能得到雜種后代嗎？為什么？不能,因?yàn)閮煞N生物之間存在著生殖隔離；

植物體細(xì)胞雜交技術(shù)有沒有方法可以打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，獲得“番茄-馬鈴薯雜種植株”呢？思考番茄-馬鈴薯（想象圖）植物體細(xì)胞雜交技術(shù)021.概念：植物體細(xì)胞雜交是指將

，

在一定條件下融合成

，

并把雜種細(xì)胞培育成

的技術(shù)。2.實(shí)例：白菜-甘藍(lán)、普通小麥-長穗偃[yǎn]麥草等雜種植株。不同來源的植物體細(xì)胞雜種細(xì)胞[資料]白菜-甘藍(lán)生長期短，耐熱、易貯藏。新植物體目的植物體細(xì)胞雜交技術(shù)02要想將植物體細(xì)胞進(jìn)行融合，首要解決的是什么問題呢？思考有效去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁(主要成分：纖維素和果膠)。纖維素酶果膠酶酶解法原生質(zhì)體：除去細(xì)胞壁后植物細(xì)胞剩余部分。細(xì)胞壁＝—注：原生質(zhì)體≠原生質(zhì)層植物體細(xì)胞雜交技術(shù)021.原理：

。2.方法：①物理法：

、

。②化學(xué)法：

、

。3.結(jié)果：獲得

。關(guān)鍵環(huán)節(jié)原生質(zhì)體之間如何融合呢？思考電融合法細(xì)胞膜具有流動(dòng)性雜種細(xì)胞離心法聚乙二醇（PEG）融合法高Ca2+-高pH融合法植物體細(xì)胞雜交技術(shù)023.過程：③脫分化④再分化⑤移栽植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)原理標(biāo)志過程細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性植物細(xì)胞的全能性再生出新的細(xì)胞壁培育出雜種植株意義：打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種,培育植物新品種。植物體細(xì)胞雜交技術(shù)02【拓展思考①】A種原生質(zhì)體與B種原生質(zhì)體融合后，有

種類型(只考慮兩兩融合)，分別是

，其中我們需要的是

，所以原生質(zhì)體融合后，我們要對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行

。3AA、BB、ABAB對(duì)融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選例：可利用葉綠體顏色等原生質(zhì)體的物理特異性差異為標(biāo)志對(duì)雜種細(xì)胞進(jìn)行篩選。植物體細(xì)胞雜交技術(shù)02【拓展思考②】A細(xì)胞具有2x條染色體，2個(gè)染色體組，基因型為Aabb。B細(xì)胞含有2y條染色體，2個(gè)染色體組，基因型為ccDd，則通過植物體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的新植株的:染色體條數(shù)：

；染色體組數(shù)：

；基因型：

；屬于可遺傳變異類型中的

。植物體細(xì)胞雜交過程中沒有有性生殖細(xì)胞的結(jié)合，因此應(yīng)為

生殖。2x+2y4個(gè)AabbccDd染色體數(shù)目變異注：雜種植株屬于異源多倍體。無性規(guī)律：都采用直接相加的方法。(1)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的目的是獲得雜種細(xì)胞()(2)植物體細(xì)胞雜交利用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)()(3)植物原生質(zhì)體融合的原理是植物細(xì)胞的全能性()(4)利用物理法或化學(xué)法可以直接誘導(dǎo)兩個(gè)植物細(xì)胞融合()植物體細(xì)胞雜交技術(shù)·判斷正誤P24×獲得雜種植株；02√×細(xì)胞膜具有流動(dòng)性；×應(yīng)先用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁，獲得具有活力的原生質(zhì)體，再用物理法或化學(xué)法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合；3．人參皂苷是人參的主要活性成分。科研人員分別誘導(dǎo)人參根與胡蘿卜根產(chǎn)生愈傷組織并進(jìn)行細(xì)胞融合，以提高人參皂苷的產(chǎn)率。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．細(xì)胞融合前應(yīng)去除細(xì)胞壁B．高Ca2＋—高pH溶液可促進(jìn)細(xì)胞融合C．融合的細(xì)胞即為雜交細(xì)胞D．雜交細(xì)胞可能具有生長快速的優(yōu)勢植物體細(xì)胞雜交技術(shù)·落實(shí)思維方法P2502C只考慮細(xì)胞兩兩融合，融合的細(xì)胞中有人參根－人參根細(xì)胞、人參根－胡蘿卜根細(xì)胞、胡蘿卜根－胡蘿卜根細(xì)胞，只有人參根－胡蘿卜根細(xì)胞才是雜種細(xì)胞，×;4．如圖為植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的流程圖，其中甲和乙分別表示兩種二倍體植物細(xì)胞，所含有的染色體組分別是AA和BB。據(jù)圖分析，下列敘述錯(cuò)誤的是()A．經(jīng)過程①獲得的a、b稱為原生質(zhì)體，過程②利用了細(xì)胞膜的流動(dòng)性B．c細(xì)胞只有AABB這一種類型C．過程④和⑤分別是脫分化和再分化D．獲得的植株d，因?yàn)樵跍p數(shù)分裂時(shí)同源染色體能正常配對(duì)，

所以理論上是可育的植物體細(xì)胞雜交技術(shù)·落實(shí)思維方法P2502若只考慮兩兩融合，則融合的細(xì)胞有三種類型：AAAA、BBBB、AABB，×;B1.下圖是利用甲、乙兩種植物的各自優(yōu)勢,通過植物細(xì)胞工程技術(shù)培育高產(chǎn)、耐鹽的雜種植株的實(shí)驗(yàn)流程圖。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.進(jìn)行a處理時(shí)能用胰蛋白酶B.b是誘導(dǎo)融合后得到的雜種細(xì)胞C.c是培養(yǎng)后得到的具有耐鹽性狀的幼芽D.進(jìn)行d選擇時(shí)要將植株種在高鹽環(huán)境中2.科學(xué)家在制備原生質(zhì)體時(shí)，有時(shí)使用蝸牛消化道提取液來降解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。據(jù)此分析，蝸牛消化道提取液中可能含有什么成分?隨堂小練·書本P38A纖維素酶和果膠酶，×;纖維素酶和果膠酶。隨堂小練·書本P38二、拓展應(yīng)用“番茄-馬鈴著”雜種植株沒有如科學(xué)家所想象的那樣，地上結(jié)番茄，地下長馬鈴薯,這是為什么?提示：生物體內(nèi)基因的表達(dá)

（“是”或“不是”）孤立的，

它們之間是

的。

所以“番茄-馬鈴薯”雜種植株的細(xì)胞中雖然具備兩個(gè)物種的遺傳物質(zhì)，

但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)相互干擾，

它們不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá)。不是相互調(diào)控、相互影響【微點(diǎn)強(qiáng)化】植物細(xì)胞工程與育種單倍體育種傳統(tǒng)雜交育種植物體細(xì)胞雜交育種誘變育種多倍體育種傳統(tǒng)雜交育種1.主要流程：

；2.培育周期：

；3.變異類型：

；4.優(yōu)點(diǎn)：

；5.缺點(diǎn)：

；人工雜交+自交+篩選一般需要5～6年基因重組操作較為簡單培育周期較長01雜交育種有沒有產(chǎn)生新基因？思考沒有產(chǎn)生新基因，也沒有出現(xiàn)新性狀。誘變育種021.主要流程：

；2.培育周期：

；3.變異類型：

；4.優(yōu)點(diǎn)：

；5.缺點(diǎn)：

；物理、化學(xué)誘變基因突變無法確定突變率高，可在短時(shí)間內(nèi)獲得更多優(yōu)良的變異類型變異不定向，可預(yù)見性小，需要處理大量材料單倍體育種031.主要流程：

；2.培育周期：

；3.變異類型：

；4.優(yōu)點(diǎn)：

；5.缺點(diǎn)：

；花藥離體培養(yǎng)(單倍體幼苗)一般需要兩年基因重組+染色體數(shù)目變異大大縮短育種年限技術(shù)含量高，不易操作由配子發(fā)育而來，體細(xì)胞中的染色體數(shù)目與本物種配子染色體數(shù)目相同的個(gè)體。什么是單倍體？思考一般是純合子一般高度不育+人工誘導(dǎo)染色體加倍(正常植株)多倍體育種041.主要流程：

；2.培育周期：

；3.變異類型：

；4.優(yōu)點(diǎn)：

；5.缺點(diǎn)：

；用秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗形成多倍體一般需要兩年染色體數(shù)目變異提高營養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)育延遲，結(jié)實(shí)率低由受精卵發(fā)育而來，體細(xì)胞中含三個(gè)或三個(gè)以上染色體組的個(gè)體。什么是多倍體？思考植物體細(xì)胞