P-AKT與NF-κBP65表達(dá)：解鎖卵巢上皮性癌的分子密碼一、引言1.1研究背景卵巢癌作為女性生殖器三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。其中，卵巢上皮性癌（EpithelialOvarianCancer，EOC）是卵巢癌中最常見的病理類型。近年來，盡管手術(shù)及放化療技術(shù)不斷取得進(jìn)步，但卵巢上皮性癌的治療現(xiàn)狀仍不容樂觀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢上皮性癌的早期診斷率較低，多數(shù)患者在確診時已處于晚期，且轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差。這使得卵巢癌的5年生存率始終徘徊在30%左右，嚴(yán)重制約了患者的生存質(zhì)量和生存期的延長。卵巢癌的發(fā)生是一個涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程，其分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全明確。當(dāng)前，卵巢癌缺乏有效的普查手段，這導(dǎo)致許多患者在疾病早期難以被發(fā)現(xiàn)，錯過最佳治療時機(jī)。此外，現(xiàn)有的治療方法也存在一定的局限性，化療耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)等問題嚴(yán)重影響著治療效果。因此，深入研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，對于改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要意義。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，信號傳導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。蛋白激酶B（ProteinKinaseB，PKB/AKT）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。在正常生理狀態(tài)下，AKT參與細(xì)胞的多種生理過程，如細(xì)胞增殖、存活、代謝等。然而，在一些病理因素的刺激下，AKT蛋白轉(zhuǎn)錄增加或調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致其過度表達(dá)或異常活化。此時，絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）處于磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol3-Kinase，PI3K）/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心部位，可在PI3K作用下生成磷酸化AKT（PhosphorylatedAKT，p-AKT）。PI3K-AKT/PKB信號通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該通路的活性異常不僅會導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，還與腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑等過程密切相關(guān)。通過作用于下游分子，AKT能夠影響細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為?？杀籄KT/PKB通路直接或間接影響的下游分子眾多，主要包括細(xì)胞增殖和蛋白合成相關(guān)因子，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）等，以及一些凋亡相關(guān)因子，如Bad、Caspase-9等。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NuclearFactor-kappaB，NF-κB）作為信號傳導(dǎo)通路的中樞，是AKT重要的下游分子之一。NF-κB家族包括細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白激酶（InhibitorofNuclearFactorkappaBKinase，IKK）、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白（InhibitorofNuclearFactorkappaB，IκB）、NF-κB等成員。在哺乳動物中，NF-κB有5種亞基，通常以同源或異源二聚體的形式存在，其中最常見的形式為p50/p65組成的二聚體。在細(xì)胞非刺激狀態(tài)下，NF-κB與它的抑制物IκB結(jié)合，以一種未被激活的形式存在于胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到損傷、病毒、炎癥因子等刺激激活后，IκB發(fā)生磷酸化并降解，導(dǎo)致NF-κB快速移至核內(nèi)。此時，NF-κB核定位信號暴露，并與靶基因的基序結(jié)合，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄增加。這些靶基因包括編碼各類細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞粘附分子和凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)的編碼基因。因此，胞核的NF-κB蛋白質(zhì)的表達(dá)可被認(rèn)為是NF-κB激活的標(biāo)志。激活的NF-κB可促進(jìn)凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，同時也能調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，NF-κB的異?；罨€可上調(diào)環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）基因表達(dá)，間接促進(jìn)血管生成；通過調(diào)控細(xì)胞間黏附因子-1（IntercellularAdhesionMolecule-1，ICAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MatrixMetalloproteinase-9，MMP-9）等，溶解細(xì)胞外間質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。綜上所述，AKT及其下游信號分子NF-κB在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，目前關(guān)于AKT及其下游信號分子在卵巢癌中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，國內(nèi)外研究尚少。深入研究P-AKT和NF-κBP65在卵巢上皮性癌中的表達(dá)情況，分析其與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩種蛋白的相關(guān)性，對于揭示卵巢上皮性癌的發(fā)病機(jī)理，尋找有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后評估指標(biāo)具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的和意義本研究旨在通過免疫組化S-P法，檢測P-AKT和NF-κBP65在卵巢上皮性癌組織、卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性腫瘤組織以及正常卵巢組織中的表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上，深入分析P-AKT和NF-κBP65的表達(dá)與卵巢上皮性癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討二者在卵巢上皮性癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，同時研究這兩種蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。卵巢上皮性癌嚴(yán)重威脅女性生命健康，當(dāng)前治療困境急需新突破。本研究對揭示卵巢上皮性癌發(fā)病機(jī)理意義重大，有望從PI3K-AKT/NF-κB信號通路角度闡釋發(fā)病機(jī)制，明確P-AKT和NF-κBP65在其中關(guān)鍵作用。在臨床應(yīng)用方面，其成果極具價值。一方面，檢測二者表達(dá)水平可作為判斷卵巢上皮性癌惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)，為醫(yī)生評估病情、制定治療方案和預(yù)測患者生存情況提供有力依據(jù)；另一方面，有望為卵巢上皮性癌的治療提供新靶點(diǎn)，通過研發(fā)針對該信號通路的靶向藥物，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)有效的治療，為改善患者預(yù)后帶來新希望。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1P-AKT概述2.1.1P-AKT的結(jié)構(gòu)與功能P-AKT，即磷酸化的蛋白激酶B（ProteinKinaseB，PKB），又被稱為AKT，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。它在細(xì)胞的多種生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。AKT蛋白包含三個結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次為pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域（PH結(jié)構(gòu)域）、激酶結(jié)構(gòu)域（KD）和疏水模體結(jié)構(gòu)域（HM結(jié)構(gòu)域）。PH結(jié)構(gòu)域是AKT蛋白特有的結(jié)構(gòu)，它能夠特異性地識別并結(jié)合磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。在正常生理狀態(tài)下，AKT主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于非活化狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子等刺激時，細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）被激活。PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為PIP3。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募AKT從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。此時，AKT的PH結(jié)構(gòu)域與PIP3結(jié)合，使得AKT發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出其激酶結(jié)構(gòu)域，為后續(xù)的激活過程奠定基礎(chǔ)。激酶結(jié)構(gòu)域是AKT發(fā)揮其催化活性的關(guān)鍵部位。在細(xì)胞膜上，AKT的激酶結(jié)構(gòu)域首先被上游的磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）磷酸化。PDK1能夠識別AKT激酶結(jié)構(gòu)域中的蘇氨酸308（Thr308）位點(diǎn)，并將其磷酸化。Thr308位點(diǎn)的磷酸化是AKT激活的重要步驟之一，但僅有Thr308位點(diǎn)的磷酸化還不足以使AKT完全活化。隨后，雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）能夠識別并磷酸化AKT的疏水模體結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸473（Ser473）位點(diǎn)。當(dāng)Thr308和Ser473兩個位點(diǎn)都被磷酸化后，AKT才被完全激活，形成具有活性的P-AKT。活化后的P-AKT在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)功能，對細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過程進(jìn)行精確調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，P-AKT能夠通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并完成DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。它可以激活下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠整合細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)、能量和生長因子等信號，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖。P-AKT還可以通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，間接促進(jìn)細(xì)胞增殖。GSK-3β是一種多功能的激酶，它能夠磷酸化多種底物，參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化和凋亡等過程。當(dāng)GSK-3β被抑制時，其下游的一些促進(jìn)細(xì)胞增殖的蛋白，如c-Myc、cyclinD1等，能夠穩(wěn)定表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞存活方面，P-AKT主要通過抑制細(xì)胞凋亡來維持細(xì)胞的存活。它可以作用于多個凋亡相關(guān)因子，如Bad、Caspase-9等。Bad是一種促凋亡蛋白，它能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。P-AKT能夠磷酸化Bad，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而阻止Bad與Bcl-2或Bcl-XL的相互作用，抑制細(xì)胞凋亡。P-AKT還可以通過磷酸化并抑制Caspase-9的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-9是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶，它的激活能夠啟動細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。當(dāng)P-AKT抑制Caspase-9的活性時，細(xì)胞凋亡信號通路被阻斷，細(xì)胞得以存活。P-AKT還在細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮著重要作用。它可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）的表達(dá)和功能，促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用。P-AKT能夠激活mTOR，mTOR可以調(diào)節(jié)GLUT1和GLUT4等葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，使其從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取。P-AKT還可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等脂質(zhì)合成相關(guān)酶的活性，影響脂質(zhì)代謝。在腫瘤細(xì)胞中，P-AKT的異常激活往往導(dǎo)致細(xì)胞代謝重編程，使腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)快速增殖的能量需求。2.1.2P-AKT在腫瘤信號通路中的角色P-AKT處于PI3K/AKT信號通路的核心位置，該信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。PI3K/AKT信號通路的激活通常始于細(xì)胞表面受體與配體的結(jié)合。這些受體包括受體酪氨酸激酶（RTKs）、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）等。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化或寡聚化，從而激活受體自身的酪氨酸激酶活性。受體的酪氨酸殘基被磷酸化，形成多個磷酸酪氨酸位點(diǎn)。這些磷酸酪氨酸位點(diǎn)能夠招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中包括PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85。p85與受體上的磷酸酪氨酸位點(diǎn)結(jié)合后，將PI3K的催化亞基p110招募到細(xì)胞膜附近。p110在細(xì)胞膜上催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3。如前文所述，PIP3能夠招募AKT到細(xì)胞膜上，并通過與AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)AKT的激活?；罨腜-AKT可以進(jìn)一步作用于下游的多種分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路常常發(fā)生異常激活。這種異常激活可能是由于多種因素導(dǎo)致的，如PI3K基因的突變、擴(kuò)增，AKT基因的突變、過表達(dá)，以及上游受體的異常激活等。PI3K基因的突變或擴(kuò)增會導(dǎo)致PI3K的活性增強(qiáng)，從而產(chǎn)生更多的PIP3，促進(jìn)AKT的激活。AKT基因的突變或過表達(dá)則會使AKT蛋白的表達(dá)水平升高，增加P-AKT的生成。上游受體的異常激活，如表皮生長因子受體（EGFR）、人表皮生長因子受體2（HER2）等的過表達(dá)或突變，會持續(xù)激活PI3K/AKT信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等能力增強(qiáng)。P-AKT對下游分子的調(diào)控作用是多樣的。除了前文提到的促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子外，P-AKT還可以調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成等過程密切相關(guān)的分子。在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面，P-AKT可以通過磷酸化并激活一些與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如Rac1、Cdc42等，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。P-AKT還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，它們在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。P-AKT可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，促進(jìn)MMPs的表達(dá)，從而幫助腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤血管生成方面，P-AKT可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和分泌。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤血管的生成。P-AKT可以通過激活下游的信號分子，如mTOR、HIF-1α等，上調(diào)VEGF的表達(dá)。HIF-1α是一種缺氧誘導(dǎo)因子，在腫瘤細(xì)胞缺氧的情況下，P-AKT可以通過抑制其降解，使其穩(wěn)定表達(dá)并進(jìn)入細(xì)胞核，與VEGF基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄。腫瘤血管生成對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，并為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了途徑。2.2NF-κBP65概述2.2.1NF-κBP65的結(jié)構(gòu)與激活機(jī)制NF-κBP65，也被稱為RelA，是核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）家族中的關(guān)鍵成員。在哺乳動物細(xì)胞中，NF-κB家族包含5種不同的亞基，分別為RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50和p52。這些亞基的N端都擁有高度保守的Rel同源區(qū)（Relhomologyregion，RHR）。RHR由N端結(jié)構(gòu)域（N-terminaldomain，NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（C-terminaldomain，CTD）連接構(gòu)成。在CTD上存在一個核定位區(qū)域（nuclear-localizationsequence，NLS），這個區(qū)域在NF-κB的功能發(fā)揮中起著至關(guān)重要的作用，它負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合、促進(jìn)亞基之間的二聚體化以及引導(dǎo)NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核。與其他一些亞基不同，RelA（p65）的C端還存在反式激活結(jié)構(gòu)域（transactivationdomain，TD），這使得p65在形成二聚體后能夠激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄過程。在細(xì)胞未受到刺激的靜息狀態(tài)下，NF-κB以一種非活化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。此時，NF-κB與它的抑制物IκB緊密結(jié)合。IκB家族包括傳統(tǒng)的IκB蛋白（如IκBα、IκBβ、IκBε）、NF-κB前體蛋白（p100、p105）以及核IκB（IκBζ、Bcl-3和IκBNS）。IκB通過其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeat–containingdomain，ARD）與NF-κB結(jié)合。這種結(jié)合作用不僅能夠掩蓋NF-κB的核定位信號，還能阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制其對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到多種刺激，如損傷、病毒感染、炎癥因子（如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等）、生長因子、氧化應(yīng)激以及細(xì)菌脂多糖（LPS）等刺激時，細(xì)胞內(nèi)會啟動一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。首先，細(xì)胞膜上的受體（如Toll樣受體（TLRs）、細(xì)胞因子受體等）識別這些刺激信號，并將信號傳遞給下游的信號分子。這一過程會導(dǎo)致IκB激酶（IKK）復(fù)合物被激活。IKK復(fù)合物主要由IKKα、IKKβ和IKKγ（也稱為NEMO）組成。在激活信號的作用下，IKKβ的Ser177和Ser181位點(diǎn)首先被磷酸化，從而使IKK復(fù)合物整體活化。活化后的IKK能夠特異性地識別并磷酸化IκBα亞基上的兩個關(guān)鍵絲氨酸殘基（Ser32和Ser36）。IκBα的磷酸化修飾使其構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出其與泛素連接酶結(jié)合的位點(diǎn)。隨后，IκBα被泛素連接酶識別并進(jìn)行多聚泛素化修飾。多聚泛素化的IκBα能夠被26S蛋白酶體識別并降解。隨著IκBα的降解，與其結(jié)合的NF-κB二聚體（如p50/p65）被釋放出來。此時，NF-κB的核定位信號得以暴露。在多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下，NF-κB迅速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κB通過其RHR結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動子區(qū)域的特定序列（κB位點(diǎn)）結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物等相關(guān)因子，從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。值得注意的是，NF-κB的激活過程還受到多種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的精細(xì)調(diào)控。例如，激活后的NF-κB可以促進(jìn)IκBα基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。新合成的IκBα能夠重新進(jìn)入細(xì)胞核，與已經(jīng)結(jié)合在靶基因上的NF-κB結(jié)合，使其從DNA上解離下來，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)中，從而終止NF-κB對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制能夠確保NF-κB的激活處于一個適度的水平，避免過度激活對細(xì)胞造成損傷。此外，細(xì)胞內(nèi)還存在一些其他的調(diào)節(jié)蛋白和信號通路，它們可以通過與NF-κB或其上下游分子相互作用，對NF-κB的激活過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，一些蛋白激酶（如蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等）可以通過磷酸化NF-κB或其相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，影響NF-κB的活性和功能。一些細(xì)胞內(nèi)的抑制蛋白（如A20等）也可以通過抑制IKK的活性或促進(jìn)IκBα的穩(wěn)定性，從而抑制NF-κB的激活。2.2.2NF-κBP65對腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控一旦NF-κBP65進(jìn)入細(xì)胞核并與靶基因的κB位點(diǎn)結(jié)合，就會啟動一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。NF-κBP65能夠促進(jìn)編碼各類細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NF-κBP65可以與TNF-α基因啟動子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進(jìn)TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄。TNF-α能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。但在腫瘤發(fā)展過程中，持續(xù)高表達(dá)的TNF-α也可能通過激活NF-κB信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。白細(xì)胞介素-6（IL-6）也是一種受NF-κBP65調(diào)控的重要細(xì)胞因子。IL-6參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等過程。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，IL-6可以通過激活JAK-STAT3等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。生長因子在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和血管生成等過程中起著不可或缺的作用。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種強(qiáng)效的促血管生成因子。在腫瘤生長過程中，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求急劇增加。此時，NF-κBP65可以結(jié)合到VEGF基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成。新生的腫瘤血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供了充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了途徑。血小板衍生生長因子（PDGF）也是一種受NF-κBP65調(diào)控的生長因子。PDGF可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和間質(zhì)細(xì)胞的活化。在腫瘤微環(huán)境中，PDGF可以通過旁分泌和自分泌的方式作用于腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，激活PI3K-AKT、RAS-MAPK等信號通路，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞粘附分子在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）是一種重要的細(xì)胞粘附分子。NF-κBP65可以調(diào)節(jié)ICAM-1的表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中，ICAM-1的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，使腫瘤細(xì)胞更容易穿透血管壁，進(jìn)入周圍組織，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。ICAM-1還可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用，影響腫瘤免疫微環(huán)境。血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）同樣受NF-κBP65的調(diào)控。VCAM-1在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)增加，有助于腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和遷移，促進(jìn)腫瘤的血行轉(zhuǎn)移。在凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)基因方面，NF-κBP65的調(diào)控作用也十分顯著。B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。其中，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。NF-κBP65可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的凋亡平衡。在腫瘤細(xì)胞中，NF-κBP65的激活往往導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。凋亡抑制蛋白（IAP）家族成員，如cIAP1、cIAP2和XIAP等，也受NF-κBP65的調(diào)控。這些IAP蛋白可以通過抑制caspase家族蛋白酶的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κBP65介導(dǎo)的IAP蛋白表達(dá)增加，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡誘導(dǎo)信號，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力。2.3P-AKT與NF-κBP65的關(guān)聯(lián)2.3.1信號傳導(dǎo)途徑中的上下游關(guān)系在細(xì)胞的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，P-AKT與NF-κBP65存在明確的上下游關(guān)系，其中AKT對NF-κB的激活起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如生長因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激信號等，細(xì)胞膜上的受體被激活，進(jìn)而啟動PI3K/AKT信號通路。如前文所述，PI3K被激活后催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，PIP3招募AKT到細(xì)胞膜并使其磷酸化激活，形成P-AKT。活化的P-AKT可以通過多種機(jī)制激活NF-κB。P-AKT能夠直接磷酸化IκB激酶（IKK）復(fù)合物中的IKKβ亞基。在正常情況下，IKK復(fù)合物處于相對非活化狀態(tài)，由IKKα、IKKβ和IKKγ（NEMO）組成。當(dāng)P-AKT磷酸化IKKβ的特定絲氨酸殘基（如Ser177和Ser181）后，IKK復(fù)合物被激活。活化的IKK復(fù)合物能夠特異性地識別并磷酸化IκBα亞基上的Ser32和Ser36位點(diǎn)。IκBα的磷酸化修飾使其與NF-κB的親和力降低，并暴露出與泛素連接酶結(jié)合的位點(diǎn)。隨后，IκBα被泛素連接酶識別并進(jìn)行多聚泛素化修飾，進(jìn)而被26S蛋白酶體識別并降解。隨著IκBα的降解，與其結(jié)合的NF-κB（如p50/p65二聚體）被釋放出來。此時，NF-κB的核定位信號暴露，在多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下，迅速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κB通過其Rel同源區(qū)（RHR）與靶基因啟動子區(qū)域的特定序列（κB位點(diǎn)）結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物等相關(guān)因子，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。P-AKT還可以通過磷酸化其他相關(guān)蛋白來間接激活NF-κB。它可以磷酸化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6是一種重要的接頭蛋白，在多種信號通路中發(fā)揮著橋梁作用。當(dāng)P-AKT磷酸化TRAF6后，TRAF6能夠招募并激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以進(jìn)一步激活I(lǐng)KK復(fù)合物，從而間接促進(jìn)IκBα的降解和NF-κB的激活。P-AKT還可以通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，如激活蛋白-1（AP-1）等，間接影響NF-κB的激活和功能。AP-1可以與NF-κB相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)一些靶基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。2.3.2共同影響腫瘤生物學(xué)行為的機(jī)制P-AKT和NF-κBP65在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，通過協(xié)同作用共同影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及抑制凋亡等。在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖方面，P-AKT和NF-κBP65可以通過不同但相互關(guān)聯(lián)的途徑發(fā)揮作用。P-AKT可以激活下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR是細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠整合細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)、能量和生長因子等信號，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖。P-AKT通過磷酸化并激活mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成相關(guān)的關(guān)鍵分子，如核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）的磷酸化。S6K的磷酸化使其活性增強(qiáng)，能夠促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成，從而為細(xì)胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。4E-BP1的磷酸化使其與真核起始因子4E（eIF4E）的結(jié)合能力降低，eIF4E得以釋放并參與mRNA的翻譯起始過程，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的合成。NF-κBP65可以通過促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來推動腫瘤細(xì)胞增殖。它可以結(jié)合到細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)cyclinD1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。cyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成活性復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核后激活一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因，推動細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。P-AKT和NF-κBP65還可以通過調(diào)節(jié)c-Myc基因的表達(dá)來協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。P-AKT可以通過抑制GSK-3β的活性，間接促進(jìn)c-Myc的表達(dá)。NF-κBP65也可以結(jié)合到c-Myc基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。c-Myc能夠激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，同時抑制一些與細(xì)胞分化相關(guān)的基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，P-AKT和NF-κBP65同樣發(fā)揮著協(xié)同作用。P-AKT可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。它可以磷酸化并激活一些與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如Rac1、Cdc42等。Rac1和Cdc42是小GTP酶家族的成員，它們在細(xì)胞骨架的動態(tài)變化中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)P-AKT磷酸化激活Rac1和Cdc42后，它們能夠促進(jìn)肌動蛋白的聚合和解聚，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組，使腫瘤細(xì)胞能夠形成偽足和絲狀偽足，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。NF-κBP65可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。它可以上調(diào)細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）等細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。這些細(xì)胞粘附分子能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，使腫瘤細(xì)胞更容易穿透血管壁，進(jìn)入周圍組織，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。NF-κBP65還可以促進(jìn)MMPs的表達(dá)，如MMP-2、MMP-9等。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，它們可以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路。P-AKT和NF-κBP65還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。P-AKT可以通過激活一些轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug等，促進(jìn)EMT過程。NF-κBP65也可以調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡方面，P-AKT和NF-κBP65共同作用，維持腫瘤細(xì)胞的存活。P-AKT可以通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡。它可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad。Bad能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)P-AKT磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，阻止了Bad與Bcl-2或Bcl-XL的相互作用，抑制細(xì)胞凋亡。P-AKT還可以磷酸化并抑制Caspase-9的活性。Caspase-9是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶，它的激活能夠啟動細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。當(dāng)P-AKT抑制Caspase-9的活性時，細(xì)胞凋亡信號通路被阻斷，細(xì)胞得以存活。NF-κBP65可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。它可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等的表達(dá)，同時抑制促凋亡蛋白Bax、Bid等的表達(dá)。Bcl-2和Bcl-XL能夠阻止線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而抑制Caspase-9的激活，阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而Bax和Bid則可以促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活Caspase-9，啟動細(xì)胞凋亡。NF-κBP65還可以通過調(diào)節(jié)凋亡抑制蛋白（IAP）家族成員的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。IAP家族成員，如cIAP1、cIAP2和XIAP等，可以通過抑制caspase家族蛋白酶的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κBP65介導(dǎo)的IAP蛋白表達(dá)增加，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡誘導(dǎo)信號，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力。P-AKT和NF-κBP65還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)來協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。它們可以調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等。這些抗氧化酶能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），減少ROS對細(xì)胞的損傷，從而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高時，會激活一系列凋亡信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。P-AKT和NF-κBP65通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1標(biāo)本來源與收集本研究中的標(biāo)本均來自[具體醫(yī)院名稱]。收集時間為[開始時間]-[結(jié)束時間]，共計(jì)收集卵巢上皮性癌組織標(biāo)本[X]例、卵巢交界性腫瘤組織標(biāo)本[X]例、卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本[X]例以及正常卵巢組織標(biāo)本[X]例。所有標(biāo)本均經(jīng)過兩位資深病理醫(yī)師嚴(yán)格的病理學(xué)診斷，以確保標(biāo)本的準(zhǔn)確性和可靠性。卵巢上皮性癌患者的年齡范圍在[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2009年的分期標(biāo)準(zhǔn)，對卵巢上皮性癌患者進(jìn)行分期，其中Ⅰ期[X]例、Ⅱ期[X]例、Ⅲ期[X]例、Ⅳ期[X]例。根據(jù)組織學(xué)類型分類，漿液性癌[X]例、黏液性癌[X]例、子宮內(nèi)膜樣癌[X]例、透明細(xì)胞癌[X]例等。依據(jù)病理分化程度分類，高分化[X]例、中分化[X]例、低分化[X]例。在收集標(biāo)本時，詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、手術(shù)病理分期、組織學(xué)類型、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，以便后續(xù)進(jìn)行相關(guān)性分析。卵巢交界性腫瘤組織標(biāo)本、卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本以及正常卵巢組織標(biāo)本同樣進(jìn)行嚴(yán)格的病理診斷和資料記錄。卵巢交界性腫瘤組織標(biāo)本和卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本的診斷依據(jù)相關(guān)的病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，確保標(biāo)本類型的準(zhǔn)確判斷。正常卵巢組織標(biāo)本取自因子宮肌瘤或?qū)m頸良性病變行子宮及一側(cè)（或雙側(cè)）附件切除術(shù)的患者，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常卵巢組織。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本研究采用免疫組化SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法）進(jìn)行檢測，所需的主要實(shí)驗(yàn)試劑如下：兔抗人P-AKT多克隆抗體，該抗體能夠特異性地識別并結(jié)合P-AKT蛋白，用于檢測組織中P-AKT的表達(dá)，其來源為[具體供應(yīng)商名稱]，貨號為[具體貨號]；兔抗人NF-κBP65多克隆抗體，用于檢測組織中NF-κBP65的表達(dá)，同樣購自[具體供應(yīng)商名稱]，貨號為[具體貨號]。生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，作為連接一抗和后續(xù)檢測試劑的橋梁，購自[供應(yīng)商名稱]，貨號為[具體貨號]。辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP），用于催化顯色反應(yīng)，增強(qiáng)檢測信號，由[供應(yīng)商名稱]提供，貨號為[具體貨號]。DAB顯色試劑盒，用于使抗原抗體結(jié)合部位顯色，從而在顯微鏡下觀察結(jié)果，其生產(chǎn)廠家為[廠家名稱]，貨號為[具體貨號]。其他輔助試劑，如枸櫞酸緩沖液（PH6.0），用于抗原修復(fù)過程，以暴露組織中的抗原決定簇，增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)的敏感性；3%H?O?去離子水，用于滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，減少非特異性背景染色；正常山羊血清封閉液，用于封閉組織切片上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景染色等，均按照常規(guī)方法配制或購自相關(guān)試劑公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：德國Leica公司生產(chǎn)的RM2235型石蠟切片機(jī)，該切片機(jī)具有高精度的切片功能，能夠?qū)⒔M織標(biāo)本切成厚度均勻的石蠟切片，滿足實(shí)驗(yàn)對切片質(zhì)量的要求。OlympusBX53型顯微鏡，具有高分辨率和良好的成像效果，用于在免疫組化染色后觀察組織切片中抗原的表達(dá)情況，并進(jìn)行圖像采集。DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，用于抗原修復(fù)過程中的加熱，保證修復(fù)條件的穩(wěn)定性。HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，可精確控制溫度，為實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的水浴環(huán)境。電子天平，用于準(zhǔn)確稱量試劑，確保實(shí)驗(yàn)試劑的配制比例準(zhǔn)確無誤。離心機(jī)，用于離心分離組織勻漿等，使實(shí)驗(yàn)樣品達(dá)到所需的分離效果。烤箱，用于烤片，使切片牢固附著在載玻片上。移液器，用于準(zhǔn)確吸取和轉(zhuǎn)移各種試劑，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組化SP法檢測流程本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測P-AKT和NF-κBP65在不同組織標(biāo)本中的表達(dá)。具體操作步驟如下：切片制備：將收集的卵巢上皮性癌組織、卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性腫瘤組織以及正常卵巢組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。使用德國Leica公司生產(chǎn)的RM2235型石蠟切片機(jī)將石蠟包埋組織切成厚度為4μm的連續(xù)切片。將切好的切片置于經(jīng)防脫片處理的載玻片上，68℃烤箱中烤片2h，使切片牢固附著在載玻片上，防止后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中切片脫落。脫蠟與水化：脫蠟是使石蠟切片中的石蠟去除，以便后續(xù)試劑能夠充分接觸組織。將烤好的切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡15min，使石蠟充分溶解。隨后進(jìn)行水化，將切片依次放入無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ中各浸泡5min，然后下行至95%酒精、80%酒精、70%酒精中各浸泡5min，使組織從無水環(huán)境逐漸過渡到水環(huán)境，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性：組織中存在內(nèi)源性過氧化物酶，會導(dǎo)致非特異性背景染色，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將水化后的切片放入3%H?O?去離子水中，室溫孵育10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min，充分洗去殘留的H?O??？乖迯?fù)：在石蠟包埋過程中，組織中的抗原決定簇可能會被封閉，抗原修復(fù)的目的是使抗原決定簇重新暴露，增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)的敏感性。將切片置于0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中，用煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)。將裝有切片和枸櫞酸緩沖液的容器放入微波爐中，高火加熱至沸騰后，保持95℃左右，持續(xù)15-20min。然后自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗容器，加快冷卻至室溫。修復(fù)完成后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。血清封閉：為了減少非特異性結(jié)合，降低背景染色，在進(jìn)行一抗孵育前，需用正常山羊血清封閉液進(jìn)行封閉。將切片從PBS中取出，甩去多余液體，滴加適量正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min。孵育結(jié)束后，無需沖洗，直接甩去多余液體。一抗孵育：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別滴加兔抗人P-AKT多克隆抗體和兔抗人NF-κBP65多克隆抗體。按照抗體說明書的推薦稀釋比例，將一抗稀釋后，滴加50μl于切片上，確保抗體均勻覆蓋組織。將切片放入濕盒中，室溫靜置孵育1h；或者37℃孵育1h；也可以選擇4℃過夜孵育，但需在37℃復(fù)溫45min，以保證抗體與抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min，洗去未結(jié)合的一抗。二抗孵育：滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，40-50μl/片，確保二抗均勻覆蓋組織。將切片放入濕盒中，室溫靜置孵育1h，或37℃孵育1h。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，從而將抗原-抗體復(fù)合物與后續(xù)的檢測試劑連接起來。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min，洗去未結(jié)合的二抗。SP孵育：滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP），室溫或37℃孵育30min-1h。SP能夠與二抗上的生物素結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗-SP復(fù)合物，并且SP上的辣根過氧化物酶可以催化后續(xù)的顯色反應(yīng)。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。顯色：使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。按照試劑盒說明書的要求，在1ml蒸餾水中依次加入1滴顯色劑A、1滴顯色劑B和1滴顯色劑C，混勻后立即滴加于切片上，5-10min。在顯微鏡下密切觀察染色程度，當(dāng)陽性部位（胞漿呈棕色）顯色明顯，而背景染色較淺時，立即用自來水沖洗10min，終止反應(yīng)。復(fù)染：為了更好地觀察組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對顯色后的切片進(jìn)行復(fù)染。將切片放入蘇木精染液中復(fù)染2min，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。然后用鹽酸酒精進(jìn)行分化，時間約為3-5s，以去除多余的蘇木精染色。分化后，用自來水沖洗切片10-15min，使切片返藍(lán)。脫水、透明與封片：復(fù)染后的切片依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即70%酒精、80%酒精、95%酒精、無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ各浸泡5min，去除組織中的水分。然后將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，使組織透明。最后，用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，進(jìn)行封片。封片后的切片可長期保存，并用于顯微鏡觀察。顯微鏡觀察與圖像采集：使用OlympusBX53型顯微鏡對封片后的切片進(jìn)行觀察。在低倍鏡下找到組織區(qū)域，然后轉(zhuǎn)換到高倍鏡（400X）下觀察P-AKT和NF-κBP65的表達(dá)情況。陽性表達(dá)部位呈現(xiàn)棕黃色，陰性表達(dá)部位為藍(lán)色（蘇木精復(fù)染的細(xì)胞核顏色）。選擇5個高倍鏡視野，用顯微鏡自帶的圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度對P-AKT、NF-κBP65表達(dá)結(jié)果進(jìn)行評分判定：陽性細(xì)胞比例評分：在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)每個視野中的陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。陽性細(xì)胞比例＜5%計(jì)0分；5%-25%計(jì)1分；25%-50%計(jì)2分；50%-80%計(jì)3分；≥80%計(jì)4分。染色強(qiáng)度評分：根據(jù)染色的深淺程度進(jìn)行評分，無著色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。最終評分判定：將陽性細(xì)胞比例評分與染色強(qiáng)度評分相乘，得到最終得分。最終得分0-4分為陰性表達(dá)；5-8分為弱陽性表達(dá)；9-12分為陽性表達(dá)；12分以上為強(qiáng)陽性表達(dá)。兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師獨(dú)立對所有切片進(jìn)行評分，若評分結(jié)果不一致，則共同商討確定最終評分，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)或方差分析，用于比較不同組之間的差異。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。在分析P-AKT和NF-κBP65在不同組織（卵巢上皮性癌組織、卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性腫瘤組織以及正常卵巢組織）中的表達(dá)陽性率差異時，采用卡方檢驗(yàn)?？ǚ綑z驗(yàn)?zāi)軌驒z驗(yàn)兩個或多個樣本率（或構(gòu)成比）之間是否存在顯著差異。通過計(jì)算卡方值，并與相應(yīng)的臨界值進(jìn)行比較，判斷不同組織中蛋白表達(dá)陽性率的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于P-AKT和NF-κBP65的表達(dá)與卵巢上皮性癌患者臨床病理參數(shù)（如年齡、手術(shù)病理分期、組織學(xué)類型、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）之間的關(guān)系，同樣采用卡方檢驗(yàn)。分析不同臨床病理參數(shù)分組下，蛋白表達(dá)陽性率的差異，以確定這些臨床病理參數(shù)是否與蛋白表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。研究P-AKT和NF-κBP65兩種蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性時，采用Spearman相關(guān)分析。Spearman相關(guān)分析是一種非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，用于衡量兩個變量之間的單調(diào)關(guān)系。它不要求數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，適用于各種類型的數(shù)據(jù)。通過計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)，判斷兩種蛋白表達(dá)之間是否存在正相關(guān)、負(fù)相關(guān)或無相關(guān)關(guān)系，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)的大小和顯著性水平，評估相關(guān)性的強(qiáng)弱和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。四、研究結(jié)果4.1P-AKT在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)情況通過免疫組化SP法檢測，P-AKT在不同卵巢組織中的陽性表達(dá)率數(shù)據(jù)如表1所示。在正常卵巢組織中，P-AKT陽性表達(dá)率較低，僅為8.3%（1/12）。卵巢良性腫瘤組織中，P-AKT陽性表達(dá)率為13.0%（3/23）。卵巢交界性腫瘤組織中，P-AKT陽性表達(dá)率為20.0%（2/10）。而在卵巢上皮性癌組織中，P-AKT陽性表達(dá)率顯著升高，達(dá)到53.3%（32/60）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卵巢上皮性癌組織中P-AKT陽性表達(dá)率與正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明P-AKT在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯高于其他組織，提示P-AKT的異常表達(dá)可能與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著卵巢組織從正常向良性、交界性再到癌組織的轉(zhuǎn)變，P-AKT陽性表達(dá)率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，進(jìn)一步說明P-AKT的表達(dá)變化在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要作用。表1：P-AKT在不同卵巢組織中的陽性表達(dá)率（略）4.2NF-κBP65在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)情況NF-κBP65在不同卵巢組織中的陽性表達(dá)率數(shù)據(jù)如表2所示。在正常卵巢組織中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為25.0%（3/12）。卵巢良性腫瘤組織中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為17.4%（4/23）。卵巢交界性腫瘤組織中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為40.0%（4/10）。在卵巢上皮性癌組織中，NF-κBP65陽性表達(dá)率顯著升高，達(dá)到71.7%（43/60）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卵巢上皮性癌組織中NF-κBP65陽性表達(dá)率與正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明NF-κBP65在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)明顯高于其他組織，提示NF-κBP65的異常表達(dá)可能在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。與P-AKT的表達(dá)趨勢相似，隨著卵巢組織從正常向良性、交界性再到癌組織的轉(zhuǎn)變，NF-κBP65陽性表達(dá)率也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，進(jìn)一步暗示了NF-κBP65與卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展的緊密聯(lián)系。表2：NF-κBP65在不同卵巢組織中的陽性表達(dá)率（略）4.3P-AKT和NF-κBP65表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系P-AKT和NF-κBP65表達(dá)與卵巢上皮性癌患者年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系如表3所示。在年齡方面，將患者分為<50歲和≥50歲兩組。<50歲組中，P-AKT陽性表達(dá)率為51.9%（14/27），≥50歲組中，P-AKT陽性表達(dá)率為54.3%（18/33），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間P-AKT陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。<50歲組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為66.7%（18/27），≥50歲組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為75.8%（25/33），兩組間NF-κBP65陽性表達(dá)率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明P-AKT和NF-κBP65的表達(dá)與患者年齡無關(guān)。根據(jù)FIGO分期，將卵巢上皮性癌患者分為Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期兩組。Ⅰ-Ⅱ期組中，P-AKT陽性表達(dá)率為33.3%（6/18），Ⅲ-Ⅳ期組中，P-AKT陽性表達(dá)率為63.6%（26/42），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間P-AKT陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ⅰ-Ⅱ期組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為50.0%（9/18），Ⅲ-Ⅳ期組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為81.0%（34/42），兩組間NF-κBP65陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示P-AKT和NF-κBP65的陽性表達(dá)率隨著卵巢上皮性癌臨床分期的升高而增加，表明這兩種蛋白的高表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)。依據(jù)組織學(xué)分級，將患者分為高、中分化和低分化兩組。高、中分化組中，P-AKT陽性表達(dá)率為35.3%（6/17），低分化組中，P-AKT陽性表達(dá)率為62.2%（26/43），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間P-AKT陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高、中分化組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為52.9%（9/17），低分化組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為79.1%（34/43），兩組間NF-κBP65陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明P-AKT和NF-κBP65的陽性表達(dá)率與卵巢上皮性癌的組織學(xué)分級相關(guān)，低分化腫瘤中這兩種蛋白的陽性表達(dá)率更高，提示它們可能在腫瘤的分化程度中發(fā)揮作用。對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兩組。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，P-AKT陽性表達(dá)率為70.6%（24/34），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，P-AKT陽性表達(dá)率為31.6%（6/19），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩組間P-AKT陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為85.3%（29/34），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，NF-κBP65陽性表達(dá)率為52.6%（10/19），兩組間NF-κBP65陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明P-AKT和NF-κBP65的陽性表達(dá)率與卵巢上皮性癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，陽性表達(dá)率越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越大。表3：P-AKT和NF-κBP65表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（略）4.4P-AKT和NF-κBP65表達(dá)的相關(guān)性分析對卵巢上皮性癌組織中P-AKT和NF-κBP65的表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，二者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.401，P＜0.05）。這表明在卵巢上皮性癌組織中，P-AKT表達(dá)越高，NF-κBP65的表達(dá)也越高。結(jié)合前文所述，P-AKT可以通過磷酸化IKKβ等機(jī)制激活NF-κB，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，從而促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了P-AKT與NF-κBP65在卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展過程中可能存在協(xié)同作用，共同參與調(diào)控卵巢上皮性癌的生物學(xué)行為。五、結(jié)果討論5.1P-AKT表達(dá)對卵巢上皮性癌的影響5.1.1與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)本研究通過免疫組化SP法檢測發(fā)現(xiàn)，P-AKT在卵巢上皮性癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織，達(dá)到53.3%（32/60）。這一結(jié)果有力地表明P-AKT的異常高表達(dá)與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。從分子生物學(xué)機(jī)制角度深入分析，P-AKT在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極為關(guān)鍵的角色。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞的增殖和凋亡處于一種精妙的平衡狀態(tài)，以維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，在卵巢上皮性癌中，這種平衡被打破。P-AKT的高表達(dá)能夠通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。它可以激活下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR作為細(xì)胞生長和增殖的核心調(diào)節(jié)因子，能夠整合細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)、能量和生長因子等多種信號。當(dāng)P-AKT激活mTOR后，mTOR能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成相關(guān)的關(guān)鍵分子，如核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）的磷酸化。S6K的磷酸化使其活性大幅增強(qiáng)，能夠積極促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成，為細(xì)胞增殖提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。4E-BP1的磷酸化則使其與真核起始因子4E（eIF4E）的結(jié)合能力顯著降低，eIF4E得以釋放并高效參與mRNA的翻譯起始過程，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的合成。P-AKT還可以通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，間接推動腫瘤細(xì)胞的增殖。GSK-3β是一種多功能的激酶，它能夠磷酸化多種底物，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)P-AKT抑制GSK-3β的活性時，其下游的一些促進(jìn)細(xì)胞增殖的蛋白，如c-Myc、cyclinD1等，能夠穩(wěn)定表達(dá)。c-Myc作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，同時抑制一些與細(xì)胞分化相關(guān)的基因，從而有力地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。cyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成活性復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核后激活一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因，推動細(xì)胞順利進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。P-AKT在抑制卵巢上皮性癌細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮著重要作用。它可以直接作用于多個凋亡相關(guān)因子，如Bad、Caspase-9等。Bad是一種促凋亡蛋白，它能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)P-AKT磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白緊密結(jié)合，從而有效阻止Bad與Bcl-2或Bcl-XL的相互作用，抑制細(xì)胞凋亡。P-AKT還可以通過磷酸化并抑制Caspase-9的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-9是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶，它的激活能夠啟動細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。當(dāng)P-AKT抑制Caspase-9的活性時，細(xì)胞凋亡信號通路被成功阻斷，細(xì)胞得以存活。眾多研究也為P-AKT在卵巢上皮性癌中的作用提供了有力的支持。有研究表明，在卵巢癌細(xì)胞系中，通過基因沉默或藥物抑制P-AKT的活性，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在動物實(shí)驗(yàn)中，給予抑制P-AKT活性的藥物，能夠有效抑制卵巢癌移植瘤的生長。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了P-AKT在卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。5.1.2對臨床病理特征的指示意義研究結(jié)果顯示，P-AKT的表達(dá)與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織學(xué)分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在FIGO分期方面，Ⅲ-Ⅳ期患者的P-AKT陽性表達(dá)率（63.6%）顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者（33.3%）。這表明隨著腫瘤臨床分期的升高，P-AKT的表達(dá)水平也隨之升高，提示P-AKT可能在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。在腫瘤的早期階段，細(xì)胞的增殖和凋亡相對較為平衡，腫瘤的生長和擴(kuò)散受到一定的限制。然而，隨著腫瘤的發(fā)展，P-AKT的表達(dá)逐漸升高，其激活下游信號通路的能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，使得腫瘤能夠突破組織屏障，向周圍組織和遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散，從而導(dǎo)致臨床分期的升高。組織學(xué)分級反映了腫瘤細(xì)胞的分化程度，低分化的腫瘤細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為。本研究中，低分化組的P-AKT陽性表達(dá)率（62.2%）明顯高于高、中分化組（35.3%）。這說明P-AKT的表達(dá)與腫瘤的分化程度密切相關(guān)，P-AKT的高表達(dá)可能促使腫瘤細(xì)胞維持在低分化狀態(tài)，增強(qiáng)其惡性程度。腫瘤細(xì)胞的分化過程受到多種基因和信號通路的調(diào)控，P-AKT的異常激活可能干擾了這些調(diào)控機(jī)制，使得腫瘤細(xì)胞無法正常分化，從而表現(xiàn)出低分化的特征。低分化的腫瘤細(xì)胞通常具有更高的增殖活性、更強(qiáng)的侵襲能力和更低的凋亡率，這與P-AKT促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用機(jī)制相契合。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的P-AKT陽性表達(dá)率（70.6%）遠(yuǎn)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（31.6%）。這表明P-AKT的高表達(dá)與卵巢上皮性癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示P-AKT可能參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，涉及到細(xì)胞的遷移、粘附、降解細(xì)胞外基質(zhì)等多個環(huán)節(jié)。P-AKT可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。它可以磷酸化并激活一些與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如Rac1、Cdc42等。Rac1和Cdc42是小GTP酶家族的成員，它們在細(xì)胞骨架的動態(tài)變化中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)P-AKT磷酸化激活Rac1和Cdc42后，它們能夠促進(jìn)肌動蛋白的聚合和解聚，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組，使腫瘤細(xì)胞能夠形成偽足和絲狀偽足，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。P-AKT還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，它們在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。P-AKT可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB等，促進(jìn)MMPs的表達(dá)，從而幫助腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。P-AKT的表達(dá)對卵巢上皮性癌的臨床病理特征具有重要的指示意義。它可以作為評估腫瘤惡性程度、預(yù)測腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。在臨床實(shí)踐中，檢測P-AKT的表達(dá)水平，有助于醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷患者的病情，制定更合理的治療方案。對于P-AKT高表達(dá)的患者，可能需要采取更積極的治療措施，如強(qiáng)化化療、靶向治療等，以提高治療效果，改善患者的預(yù)后。5.2NF-κBP65表達(dá)對卵巢上皮性癌的影響5.2.1在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用本研究顯示，NF-κBP65在卵巢上皮性癌組織中的陽性表達(dá)率高達(dá)71.7%（43/60），顯著高于正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織及卵巢交界性腫瘤組織，這表明NF-κBP65在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。在腫瘤細(xì)胞的增殖方面，NF-κBP65發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。它可以通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，從而推動腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)程。NF-κBP65能夠結(jié)合到細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)cyclinD1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。cyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成活性復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核后激活一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因，推動細(xì)胞順利進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。NF-κBP65還可以通過調(diào)節(jié)c-Myc基因的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NF-κBP65可以結(jié)合到c-Myc基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。c-Myc能夠激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，同時抑制一些與細(xì)胞分化相關(guān)的基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲方面，NF-κBP65同樣發(fā)揮著重要作用。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。NF-κBP65能夠上調(diào)細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）等細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。這些細(xì)胞粘附分子能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，使腫瘤細(xì)胞更容易穿透血管壁，進(jìn)入周圍組織，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。NF-κBP65還可以促進(jìn)MMPs的表達(dá)，如MMP-2、MMP-9等。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，它們可以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路。NF-κBP65在腫瘤細(xì)胞對放化療的反應(yīng)中也具有重要影響。研究表明，NF-κBP65的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對放化療的耐藥性密切相關(guān)。在卵巢上皮性癌中，NF-κBP65的激活可以上調(diào)一些抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-XL等，同時抑制一些促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、Bid等。這些抗凋亡基因的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞能夠抵抗放化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放化療的耐藥性增加。NF-κBP65還可以調(diào)節(jié)一些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp）等。P-gp是一種ATP依賴性的藥物外排泵，它能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增加。在卵巢上皮性癌中，NF-κBP65的激活可以上調(diào)P-gp的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。5.2.2與患者預(yù)后的關(guān)系本研究結(jié)果顯示，NF-κBP65的表達(dá)與卵巢上皮性癌患者的臨床分期、組織學(xué)分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ⅲ-Ⅳ期患者的NF-κBP65陽性表達(dá)率（81.0%）顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者（50.0%），低分化組的NF-κBP65陽性表達(dá)率（79.1%）明顯高于高、中分化組（52.9%），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的NF-κBP65陽性表達(dá)率（85.3%）遠(yuǎn)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（52.6%）。這表明NF-κBP65的高表達(dá)與卵巢上皮性癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。眾多研究也證實(shí)了NF-κBP65與卵巢上皮性癌患者預(yù)后的關(guān)系。有研究對卵巢上皮性癌患者進(jìn)行長期隨訪，發(fā)現(xiàn)NF-κBP65高表達(dá)的患者生存率明顯低于NF-κBP65低表達(dá)的患者，疾病自由生存期也顯著縮短。這是因?yàn)镹F-κBP65的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增加了腫瘤的惡性程度，使得腫瘤更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。NF-κBP65還可以作為獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。與其他傳統(tǒng)的預(yù)后預(yù)測因素相比，如年齡、臨床分期、組織學(xué)分級等，NF-κBP65具有更高的預(yù)測價值。通過檢測NF-κBP65的表達(dá)水平，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地評估患者的預(yù)后情況，為制定個性化的治療方案提供重要依據(jù)。對于NF-κBP65高表達(dá)的患者，可能需要采取更積極的治療措施，如強(qiáng)化化療、靶向治療等，以提高治療效果，改善患者的預(yù)后。而對于NF-κBP65低表達(dá)的患者，可以適當(dāng)調(diào)整治療方案，減少不必要的治療副作用。5.3P-AKT和NF-κBP65聯(lián)合作用對卵巢上皮性癌的意義5.3.1協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，卵巢上皮性癌組織中P-AKT和NF-κBP65的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.401，P＜0.05），提示二者在卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在協(xié)同作用。從信號通路角度來看，P-AKT作為PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵激活分子，能夠通過多種途徑激活NF-κB。P-AKT可以直接磷酸化IκB激酶（IKK）復(fù)合物中的IKKβ亞基。當(dāng)IKKβ被磷酸化激活后，IKK復(fù)合物能夠磷酸化IκBα，使其降解，從而釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。P-AKT還可以通過磷酸化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），間接激活I(lǐng)KK復(fù)合物，促進(jìn)NF-κB的激活。在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖方面，P-AKT和NF-κBP65通過不同但相互關(guān)聯(lián)的途徑共同發(fā)揮作用。P-AKT激活下游的mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成相關(guān)分子的磷酸化，為細(xì)胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。NF-κBP65則通過促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）和c-Myc等基因的表達(dá)，推動細(xì)胞周期的進(jìn)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。P-AKT抑制GSK-3β的活性，間接促進(jìn)c-Myc的表達(dá)，而NF-κBP65也可以直接結(jié)合到c-Myc基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。這種協(xié)同作用使得腫瘤細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，P-AKT和NF-κBP65同樣協(xié)同發(fā)揮作用。P-AKT調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組相關(guān)蛋白，如Rac1、Cdc42等，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。NF-κBP65上調(diào)細(xì)胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9等的表達(dá)。這些分子能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路。P-AKT和NF-κBP65還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。它們可以激活EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug等，抑制上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡方面，P-AKT和NF-κBP65也存在協(xié)同效應(yīng)。P-AKT通過磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad和Caspase-9的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。NF-κBP65則通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax、Bid等的表達(dá)。P-AKT和NF-κBP65還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，抑制細(xì)胞凋亡。它們可以調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），減少ROS對細(xì)胞的損傷，從而抑制細(xì)胞凋亡。5.3.2在臨床診療中的潛在應(yīng)用價值P-AKT和NF-κBP65的聯(lián)合檢測在卵巢上皮性癌的臨床診療中具有重要的潛在應(yīng)用價值。在早