人參皂甙Rg1對人胃癌細胞增殖的抑制效應及其分子機制探究一、引言1.1研究背景胃癌是一種常見且嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均位居前列。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，當年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，死亡病例約76.9萬例，分別占所有癌癥新發(fā)病例和死亡病例的5.6%和7.7%，發(fā)病率在各類惡性腫瘤中位居第五，死亡率高居第四。在我國，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤之一，由于人口基數(shù)龐大，胃癌患者數(shù)量眾多，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。胃癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及環(huán)境、遺傳、飲食習慣等多種因素。早期胃癌患者癥狀往往不明顯，或僅表現(xiàn)出一些非特異性的消化道癥狀，如消化不良、上腹部隱痛等，容易被忽視。當患者出現(xiàn)明顯癥狀，如腹痛加劇、嘔血、黑便、消瘦等就醫(yī)時，病情常常已進展至中晚期。中晚期胃癌患者的治療難度較大，預后較差，5年生存率相對較低。我國進展期胃癌的5年生存期約為40%-50%左右，不同地區(qū)和個體之間存在一定差異。這主要是因為中晚期胃癌常伴有腫瘤的局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠處轉(zhuǎn)移，使得手術(shù)難以完全切除腫瘤，且對化療、放療等傳統(tǒng)治療手段的敏感性也有所降低。目前，臨床上針對胃癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療以及免疫治療等。手術(shù)治療是早期胃癌的主要治療手段，通過切除腫瘤組織，有望達到根治的目的。然而，對于中晚期胃癌患者，單純手術(shù)治療的效果往往不理想，需要結(jié)合化療、放療等綜合治療方法?；熆梢酝ㄟ^使用化學藥物殺死癌細胞，但同時也會對正常細胞造成一定的損傷，導致患者出現(xiàn)一系列不良反應，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放療則是利用放射線殺死癌細胞，但也存在對周圍正常組織的輻射損傷等問題。靶向治療和免疫治療雖然為胃癌患者帶來了新的希望，但它們也面臨著靶點特異性、耐藥性以及高昂的治療費用等挑戰(zhàn)。因此，尋找安全、有效、低毒且具有獨特作用機制的新型治療藥物或方法，對于提高胃癌的治療效果、改善患者的預后和生活質(zhì)量具有重要的意義。人參作為傳統(tǒng)的名貴中藥材，在我國已有數(shù)千年的應用歷史，素有“百草之王”的美譽。人參中含有多種化學成分，其中人參皂苷是其主要的活性成分之一，已分離鑒定出的人參皂苷有30余種。人參皂苷具有多種藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗衰老、保護心腦血管、調(diào)節(jié)血糖等，近年來在腫瘤治療領域也展現(xiàn)出了潛在的應用價值。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等，對乳腺癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤均顯示出一定的抑制作用。人參皂苷Rg1是人參中含量較高的一種原人參三醇型皂苷，是人參中最重要的、最具生物活性的單體成分之一。它不僅保留了人參所具有的延緩衰老、改善記憶認知功能、增強免疫、抗疲勞等保健和快速改善亞健康狀態(tài)等機體調(diào)理的正面作用，還在腫瘤治療方面表現(xiàn)出獨特的潛力。已有研究表明，人參皂苷Rg1對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用，但其作用機制尚未完全明確。因此，深入研究人參皂苷Rg1抑制人胃癌細胞增殖的作用及其分子機制，對于開發(fā)新的胃癌治療藥物和方法具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究人參皂甙Rg1對人胃癌細胞增殖的抑制作用及其潛在分子機制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。具體而言，通過細胞實驗和分子生物學技術(shù)，明確人參皂甙Rg1對人胃癌細胞增殖、凋亡、周期等生物學行為的影響，并進一步解析其調(diào)控的關(guān)鍵信號通路和分子靶點，以期揭示人參皂甙Rg1抑制胃癌細胞增殖的內(nèi)在機制。胃癌作為嚴重威脅人類健康的重大疾病，其治療現(xiàn)狀仍面臨諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)治療方法存在療效有限、副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題，迫切需要尋找新的治療思路和藥物。人參皂甙Rg1作為人參中的重要活性成分，具有來源天然、安全性較高等優(yōu)勢，對其進行深入研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義。從理論角度來看，進一步揭示人參皂甙Rg1抑制胃癌細胞增殖的機制，有助于豐富對胃癌發(fā)病機制和天然藥物抗腫瘤作用機制的認識，為腫瘤治療領域的基礎研究提供新的視角和思路，填補相關(guān)理論空白。在實踐方面，本研究結(jié)果有望為胃癌的臨床治療提供新的藥物選擇或輔助治療方案，提高胃癌患者的治療效果和生活質(zhì)量，減輕患者的痛苦和社會經(jīng)濟負擔。同時，也為開發(fā)以人參皂甙Rg1為基礎的新型抗腫瘤藥物奠定基礎，推動天然藥物在腫瘤治療領域的應用和發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，人參皂甙Rg1在腫瘤治療領域的研究受到了廣泛關(guān)注，其對多種腫瘤細胞的抑制作用已被諸多研究所證實。在國外，相關(guān)研究主要聚焦于人參皂甙Rg1對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響及其潛在機制。例如，有研究表明人參皂甙Rg1能夠誘導乳腺癌細胞凋亡，其機制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1可抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力，通過抑制某些信號通路的激活來實現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制。在國內(nèi)，對人參皂甙Rg1的研究同樣深入，除了上述生物學行為的研究外，還涉及人參皂甙Rg1與其他藥物或治療方法聯(lián)合應用的探索。有研究探討了人參皂甙Rg1聯(lián)合化療藥物對肺癌細胞的協(xié)同抑制作用，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用能夠增強化療藥物的療效，降低其毒副作用。在胃癌細胞增殖方面，國內(nèi)外的研究主要圍繞細胞周期調(diào)控、凋亡信號通路、增殖相關(guān)基因和蛋白的表達等展開。研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子化合物和天然產(chǎn)物能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白和激酶的活性，將胃癌細胞阻滯在特定的細胞周期階段，從而抑制其增殖。許多研究也表明，誘導胃癌細胞凋亡是抑制其增殖的重要機制之一，多種凋亡相關(guān)信號通路，如線粒體凋亡通路、死亡受體凋亡通路等，在胃癌細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，當前對于人參皂甙Rg1抑制人胃癌細胞增殖的研究仍存在一些不足。一方面，雖然已有研究表明人參皂甙Rg1對胃癌細胞具有抑制作用，但其具體的分子機制尚未完全明確，仍需進一步深入探究，以確定其作用的關(guān)鍵靶點和信號通路。另一方面，在體內(nèi)實驗和臨床研究方面，相關(guān)報道相對較少，缺乏對人參皂甙Rg1在動物模型和人體中的有效性和安全性的全面評估。此外，人參皂甙Rg1與其他治療方法聯(lián)合應用于胃癌治療的研究還不夠系統(tǒng)和深入，需要更多的研究來探索其聯(lián)合治療的最佳方案和協(xié)同作用機制。二、相關(guān)理論基礎2.1人參皂甙Rg1概述人參皂甙Rg1（GinsenosideRg1）作為人參的主要活性成分之一，屬于四環(huán)三萜類衍生物，其化學名稱為β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(3β,6α,12β)-3,12-二羥基達瑪-24-烯-6,20-二醇，分子式為C_{42}H_{72}O_{14}，分子量為801.01。從結(jié)構(gòu)上看，它由達瑪烷型四環(huán)三萜苷元與糖基通過糖苷鍵連接而成，具有獨特的化學結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予了人參皂甙Rg1豐富的生物學活性。人參皂甙Rg1在人參中的含量因人參的品種、生長環(huán)境、生長年限等因素而有所不同。一般來說，在人參根中，人參皂甙Rg1的含量約為0.5%-2%左右。例如，生長于吉林長白山地區(qū)的5年生人參，其根中人參皂甙Rg1含量經(jīng)高效液相色譜測定可達1.2%左右。在人參的不同部位中，人參皂甙Rg1的分布也存在差異，通常根中的含量相對較高，而莖、葉等部位含量較低。提取人參皂甙Rg1的方法有多種，常見的傳統(tǒng)方法包括溶劑提取法和水浸法。溶劑提取法中，乙醇是常用的提取溶劑。其原理是利用人參皂甙Rg1在乙醇中有較好溶解性的特點，通過將人參原料浸泡在一定濃度的乙醇溶液中，使其中的人參皂甙Rg1溶解出來。在實際操作中，一般采用60%-95%濃度的乙醇溶液，在一定溫度下進行回流提取或超聲輔助提取。有研究表明，以85%乙醇為溶劑，在70℃下回流提取3次，每次2小時，人參皂甙Rg1的提取率可達較高水平。水浸法則是將人參原料直接浸泡在水中，利用水的溶解作用提取人參皂甙Rg1。該方法操作簡單，無需特殊設備，但存在提取率低、時間長的缺點，易受到溫度、時間、原料基質(zhì)等因素影響。如在40℃下將人參根莖浸泡12小時，人參皂甙Rg1的提取率僅為0.35%左右。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，一些新的提取技術(shù)也被應用于人參皂甙Rg1的提取，如超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法。超聲波輔助提取法是利用超聲波的空化作用、機械振動等效應，破壞人參細胞結(jié)構(gòu)，加速人參皂甙Rg1從細胞中釋放到提取溶劑中。該方法具有提取效率高、操作簡便、成本低等優(yōu)點。將三七（人參屬植物，含有人參皂甙Rg1）切成小塊，置于5倍體積的70%乙醇溶液中，使用超聲波輔助提取，在40kHz頻率、80%振幅下處理20min，人參皂甙Rg1的提取率可達1.68%，明顯高于傳統(tǒng)乙醇提取法。超臨界流體萃取法則是以超臨界流體（如二氧化碳）為萃取劑，利用其在超臨界狀態(tài)下兼具液體和氣體特性的優(yōu)勢，對人參皂甙Rg1進行選擇性萃取。該方法具有提取速度快、產(chǎn)品純度高、無溶劑殘留等優(yōu)點，但設備投資大，運行成本高，目前尚未大規(guī)模應用。2.2人胃癌細胞特性人胃癌細胞是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤細胞，具有獨特的生物學特性。在形態(tài)學上，人胃癌細胞與正常胃黏膜上皮細胞存在明顯差異。正常胃黏膜上皮細胞排列緊密，呈規(guī)則的柱狀或立方狀，具有極性，細胞間連接緊密，形成完整的上皮屏障。而胃癌細胞則形態(tài)多樣，常表現(xiàn)為細胞大小不一、形態(tài)不規(guī)則，細胞核增大、染色質(zhì)增多且分布不均，核仁明顯，細胞極性消失，細胞間連接松散。這些形態(tài)學改變使得胃癌細胞更容易脫離原發(fā)病灶，發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。胃癌細胞具有高增殖能力，這是其惡性生物學行為的重要特征之一。與正常細胞相比，胃癌細胞的細胞周期調(diào)控機制出現(xiàn)異常，導致細胞增殖失控。正常細胞的增殖受到嚴格的調(diào)控，細胞周期的各個階段都有特定的調(diào)控因子參與，以確保細胞增殖的有序進行。在G1期，細胞會對自身的狀態(tài)和外界環(huán)境進行評估，只有當條件適宜時才會進入S期進行DNA復制。而胃癌細胞中，一些關(guān)鍵的細胞周期調(diào)控因子如細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達和活性發(fā)生改變，使得細胞能夠繞過正常的調(diào)控機制，持續(xù)進入細胞周期進行增殖。CyclinD1在許多胃癌細胞中表達上調(diào)，它可以與CDK4/6結(jié)合形成復合物，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞增殖。胃癌細胞還具有高侵襲和轉(zhuǎn)移能力。侵襲是指癌細胞突破基底膜，向周圍組織浸潤的過程；轉(zhuǎn)移則是指癌細胞通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)到達遠處器官，并在那里繼續(xù)生長形成轉(zhuǎn)移灶的過程。胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多個步驟和多種分子機制。癌細胞會分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細胞外基質(zhì)和基底膜的成分，為癌細胞的遷移開辟道路。MMP-2和MMP-9在胃癌組織中高表達，它們能夠降解IV型膠原蛋白等基底膜成分，促進胃癌細胞的侵襲。胃癌細胞表面的黏附分子表達也發(fā)生改變，使其與周圍細胞和細胞外基質(zhì)的黏附能力下降，更容易脫離原發(fā)病灶，同時增強與血管內(nèi)皮細胞或淋巴管內(nèi)皮細胞的黏附，從而進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)。胃癌細胞還會分泌一些細胞因子和趨化因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、趨化因子受體CXCR4等，促進腫瘤血管生成和癌細胞向特定器官的轉(zhuǎn)移。VEGF可以刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，形成新生血管，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣，同時也為腫瘤細胞進入血液循環(huán)提供了通道；CXCR4與其配體CXCL12相互作用，引導胃癌細胞向高表達CXCL12的器官如肝臟、肺臟等轉(zhuǎn)移。常見的人胃癌細胞系有多種，不同的細胞系具有各自獨特的生物學特性和應用場景。SGC-7901細胞系是國內(nèi)常用的胃癌細胞系之一，它來源于胃周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。該細胞系具有較高的增殖活性和侵襲能力，在體外培養(yǎng)時呈上皮樣形態(tài)生長。研究表明，SGC-7901細胞對化療藥物的敏感性相對較低，常被用于研究胃癌的耐藥機制以及開發(fā)新的治療策略。AGS細胞系是從一名54歲白人女性胃腺癌患者的胃組織中分離獲得，呈上皮形態(tài)，具有較強的貼壁生長能力。由于其在裸鼠體內(nèi)具有致瘤性，常被用于構(gòu)建胃癌動物模型，以研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機制和評價抗癌藥物的療效。NCI-N87細胞系來源于男性胃癌患者的胃組織，細胞呈粘附生長，具有肝轉(zhuǎn)移特征。該細胞系表達表面糖蛋白癌胚抗原（CEA）和TAG-72，可用于研究胃癌細胞的轉(zhuǎn)移機制以及腫瘤標志物在胃癌診斷和治療中的應用。這些常見的人胃癌細胞系為胃癌的基礎研究和藥物研發(fā)提供了重要的工具。2.3細胞增殖及檢測方法細胞增殖是指細胞通過分裂的方式增加細胞數(shù)量的過程，是細胞生命活動的重要特征之一。在正常生理狀態(tài)下，細胞增殖受到嚴格的調(diào)控，以維持組織和器官的正常生長、發(fā)育和功能。細胞增殖過程涉及DNA復制、染色體分離以及細胞分裂等多個關(guān)鍵步驟，這些步驟受到一系列基因、信號通路和蛋白質(zhì)的精細調(diào)控。在細胞周期中，G1期細胞會進行物質(zhì)準備，如合成RNA和蛋白質(zhì)等；S期進行DNA復制，使細胞的DNA含量加倍；G2期則進一步合成蛋白質(zhì)和進行細胞結(jié)構(gòu)的組裝；M期細胞進行有絲分裂，將復制后的染色體平均分配到兩個子代細胞中。當細胞受到生長因子、激素等外界信號刺激時，會激活一系列細胞內(nèi)信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路等，這些信號通路通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的表達和活性，促進細胞從G1期進入S期，從而啟動細胞增殖過程。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞增殖的調(diào)控機制出現(xiàn)異常，導致腫瘤細胞持續(xù)增殖。在胃癌細胞中，常常出現(xiàn)一些原癌基因的激活和抑癌基因的失活，如原癌基因HER2的過表達，可激活下游的PI3K-AKT-mTOR等信號通路，促進細胞增殖；抑癌基因p53的突變或缺失，則無法正常發(fā)揮對細胞增殖的抑制作用，使得胃癌細胞能夠逃避正常的細胞增殖調(diào)控，無限增殖。檢測細胞增殖的方法眾多，每種方法都有其獨特的原理、優(yōu)缺點和適用場景。MTT法是一種廣泛應用的檢測細胞存活和生長的方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍，分子式C_{18}H_{16}N_5SBr）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。之后使用二甲基亞砜（DMSO）溶解細胞中的甲瓚，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比，從而間接反映活細胞數(shù)量。MTT法的優(yōu)點是靈敏度高、操作相對簡便、成本較低，廣泛應用于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等領域。該方法也存在一些缺點，MTT被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需要特定的溶解液來溶解，這增加了操作步驟和誤差的可能性；MTT法的檢測時間相對較長，一般需要4-6小時，且MTT對細胞有一定毒性，可能會影響細胞的正常生理功能。CCK-8法是一種可用于簡便而準確地進行細胞增殖和毒性分析的方法，常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。其原理是試劑中含有WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽），在電子載體1-MethoxyPMS的作用下，WST-8被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。與MTT法相比，CCK-8法具有明顯優(yōu)勢，WST-8產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物是水溶性的，無需后續(xù)溶解步驟，操作更加簡便；CCK-8法的檢測時間較短，一般1-4小時即可完成檢測，且對細胞毒性小，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定，線性范圍更寬，靈敏度更高。CCK-8法也存在一些局限性，其檢測結(jié)果可能受到細胞內(nèi)某些物質(zhì)的干擾，且試劑價格相對較高。EdU法是一種基于5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）的細胞增殖檢測方法。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應，可以快速檢測細胞DNA復制活性，適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA修復、病毒復制、細胞標記示蹤等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。EdU法的優(yōu)點是檢測過程簡單、快速，無需進行DNA變性處理，不會破壞細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，可與其他熒光標記物同時使用，實現(xiàn)多重染色和分析。其缺點是需要使用熒光顯微鏡或流式細胞儀等專業(yè)設備進行檢測，成本較高，且EdU的摻入可能會對DNA的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定影響。三、實驗材料與方法3.1實驗材料人胃癌細胞系選用SGC-7901細胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該細胞系具有典型的胃癌細胞特征，如高增殖、高侵襲能力等，常用于胃癌相關(guān)研究。人參皂甙Rg1，純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司。其化學結(jié)構(gòu)明確，為后續(xù)研究提供可靠的物質(zhì)基礎。產(chǎn)品經(jīng)過嚴格質(zhì)量檢測，確?；钚院图兌确蠈嶒炓?。細胞培養(yǎng)液采用RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品），它富含多種氨基酸、維生素、糖類等營養(yǎng)成分，能夠為SGC-7901細胞提供適宜的生長環(huán)境。同時，添加10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），為細胞生長提供必要的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)。此外，加入1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，Solarbio公司），防止細胞培養(yǎng)過程中細菌污染。實驗所需的主要試劑還包括MTT（噻唑藍，Sigma公司），用于細胞增殖活性檢測；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），用于溶解MTT形成的甲瓚產(chǎn)物；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Solarbio公司），用于細胞消化傳代；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），用于檢測細胞凋亡；細胞周期檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），用于分析細胞周期分布；RIPA裂解液（Solarbio公司），用于提取細胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司），用于測定蛋白濃度；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、CyclinD1、p21等一抗（CellSignalingTechnology公司），以及相應的HRP標記的羊抗兔二抗（Abcam公司），用于Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達水平。實驗中用到的主要儀器設備有CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞提供穩(wěn)定的37℃、5%CO?培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），確保細胞操作在無菌條件下進行；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標儀（Bio-Rad公司），檢測MTT法中各孔的吸光度值；流式細胞儀（BDBiosciences公司），分析細胞凋亡和細胞周期；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），以及化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司），用于Westernblot實驗。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的人胃癌SGC-7901細胞，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有4mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入1-2mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻，使細胞重懸。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期，且細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。首先，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1-2mL0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在倒置顯微鏡下密切觀察細胞消化情況。當觀察到細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，拿回超凈工作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細胞完全脫落，然后立即加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞均勻分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，重懸細胞，然后按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補充適量的培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞生長狀態(tài)良好，且需要長期保存細胞時，進行細胞凍存。先配制凍存液，凍存液由90%胎牛血清和10%DMSO組成，現(xiàn)用現(xiàn)配。將培養(yǎng)瓶中的細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，離心收集細胞，棄去上清液。用適量的凍存液重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×10?-1×10?個/mL。將細胞懸液分裝入凍存管中，每管1mL，做好標記，注明細胞名稱、凍存日期等信息。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。3.2.2MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至合適濃度，以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL細胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。設置不同濃度的人參皂甙Rg1實驗組，濃度梯度可為0μmol/L（對照組）、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L等。每組設置5-6個復孔。棄去96孔板中的原培養(yǎng)基，向各孔中加入含不同濃度人參皂甙Rg1的新鮮培養(yǎng)基200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時、48小時和72小時。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需先1000rpm離心5分鐘，再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。細胞增殖抑制率計算公式為：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。采用GraphPadPrism軟件進行數(shù)據(jù)分析，以時間為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標繪制細胞生長曲線。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度人參皂甙Rg1組與對照組之間OD值的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。3.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞以1×10?-5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。設置對照組和不同濃度人參皂甙Rg1處理組，處理組濃度同MTT法。棄去6孔板中的原培養(yǎng)基，向各孔中加入含相應濃度人參皂甙Rg1的新鮮培養(yǎng)基2mL，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，收集細胞。用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細胞沉淀中緩慢加入預冷的70%乙醇，邊加邊輕輕振蕩，使細胞充分分散，4℃固定過夜。固定后的細胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇上清液，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞1次。加入300μL含有RNaseA（終濃度為100μg/mL）的PBS緩沖液，37℃水浴鍋中消化30分鐘，以降解細胞內(nèi)的RNA。消化結(jié)束后，加入PI染液（終濃度為50μg/mL），避光孵育15-30分鐘。孵育完成后，過300目細胞篩，將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，待上機檢測。使用流式細胞儀進行檢測，激發(fā)波長為488nm，收集紅色熒光信號。采用ModFit軟件分析細胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細胞比例。通過單因素方差分析比較不同濃度人參皂甙Rg1處理組與對照組之間各時相細胞比例的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。3.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白表達將SGC-7901細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。設置對照組和人參皂甙Rg1處理組，處理組濃度根據(jù)前期實驗結(jié)果選擇合適濃度。棄去6孔板中的原培養(yǎng)基，向處理組孔中加入含相應濃度人參皂甙Rg1的新鮮培養(yǎng)基2mL，對照組加入等量的普通培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS緩沖液漂洗細胞3次，每次輕輕晃動培養(yǎng)板，以充分去除殘留培養(yǎng)基。向每孔中加入150-200μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕晃動培養(yǎng)板，使裂解液與細胞充分接觸。用細胞刮將細胞從孔底刮下，將細胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液至新的離心管中，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。先配制BCA工作液，將試劑A和試劑B按50:1的比例混合均勻。將蛋白標準品（如BSA）用PBS稀釋成不同濃度的標準溶液，如0mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL等。取96孔板，分別加入20μL不同濃度的標準品和適量體積的蛋白樣品，然后向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻。將96孔板置于37℃恒溫箱中孵育30分鐘，使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入4×上樣緩沖液，使上樣緩沖液終濃度為1×，充分混勻。將混合后的樣品在95℃金屬浴中變性5-10分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性，然后迅速置于冰上冷卻。配制合適濃度的SDS凝膠，一般分離膠濃度為10%-12%，濃縮膠濃度為5%。先制備分離膠，將配制好的分離膠溶液緩慢注入玻璃板之間，至所需高度，然后在膠液表面輕輕覆蓋一層水或異丙醇，以隔絕空氣，促進分離膠凝固。待分離膠凝固后，倒掉覆蓋液，用濾紙吸干殘留液體，再制備濃縮膠。將濃縮膠溶液注入分離膠上方，插入梳子，待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠加樣孔中，同時加入蛋白預染Marker作為分子量標準。將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，先在80V恒壓下電泳，使樣品進入濃縮膠，待樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。準備與凝膠大小相同的PVDF膜和濾紙，將PVDF膜先在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10-15分鐘。濾紙也需在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸濕。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以100V恒壓轉(zhuǎn)膜1-2小時，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，一抗為兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、CyclinD1、p21等，按照抗體說明書推薦的稀釋比例進行稀釋，4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入HRP標記的羊抗兔二抗稀釋液中，按照1:5000-1:10000的比例稀釋，室溫孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，再用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘，去除未結(jié)合的二抗。將ECL化學發(fā)光試劑A液和B液等體積混合，滴加在PVDF膜上，使膜均勻覆蓋發(fā)光試劑，室溫孵育1-2分鐘。將PVDF膜放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中，曝光成像，采集蛋白條帶圖像。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，比較不同組之間目的蛋白表達水平的差異。3.2.5實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因表達將SGC-7901細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。設置對照組和人參皂甙Rg1處理組，處理組濃度根據(jù)實驗設計確定。棄去6孔板中的原培養(yǎng)基，向處理組孔中加入含相應濃度人參皂甙Rg1的新鮮培養(yǎng)基2mL，對照組加入等量的普通培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS緩沖液漂洗細胞3次，每次輕輕晃動培養(yǎng)板，以去除殘留培養(yǎng)基。向每孔中加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復吹打，使細胞充分裂解。將細胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全解離。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色水相，含有RNA；中層為白色蛋白層；下層為紅色有機相。小心吸取上層水相至新的離心管中，避免吸取到中間層的蛋白。向含有RNA的水相中加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，可見管底有白色RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL乙醇，輕輕顛倒離心管，然后4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液。將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量的DEPC水，輕輕吹打，使RNA完全溶解。使用核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應體系，一般包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物或oligo(dT)引物、RNA模板和DEPC水。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，放入PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應。反應條件一般為：37℃孵育15-30分鐘（逆轉(zhuǎn)錄反應），85℃加熱5分鐘（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。反應結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列，設計特異性引物。引物設計原則包括：引物長度一般為18-25bp；GC含量在40%-60%之間；引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上相同堿基；避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物序列經(jīng)BLAST比對，確保其特異性。引物由專業(yè)公司合成。在冰上配制qRT-PCR反應體系，一般包括2×SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，加入到96孔板或8連管中。將96孔板或8連管放入實時熒光定量PCR儀中，按照以下反應程序進行擴增：95℃預變性30-60秒；95℃變性5-10秒，60℃退火30-45秒，72℃延伸30-45秒，共進行40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，監(jiān)測熒光信號的變化。采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。首先計算每個樣品目的基因的Ct值和內(nèi)參基因的Ct值，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。然后計算對照組和處理組的ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組。目的基因的相對表達量=2^(-ΔΔCt)。使用GraphPadPrism軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析比較不同組之間目的基因相對表達量的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析本研究使用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。在MTT法檢測細胞增殖實驗中，通過計算細胞增殖抑制率，以時間為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標繪制細胞生長曲線。采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度人參皂甙Rg1組與對照組之間OD值的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，用于判斷不同濃度人參皂甙Rg1對細胞增殖抑制作用的差異是否顯著。在流式細胞術(shù)檢測細胞周期實驗中，采用ModFit軟件分析細胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細胞比例。同樣通過單因素方差分析比較不同濃度人參皂甙Rg1處理組與對照組之間各時相細胞比例的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，以此明確人參皂甙Rg1對細胞周期分布的影響。在蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白表達實驗中，使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，比較不同組之間目的蛋白表達水平的差異。采用獨立樣本t檢驗比較兩組之間的差異，當涉及多組比較時，先進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析，若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis秩和檢驗），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，用于確定人參皂甙Rg1處理后相關(guān)蛋白表達的變化情況。在實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因表達實驗中，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。使用GraphPadPrism軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析比較不同組之間目的基因相對表達量的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，以揭示人參皂甙Rg1對相關(guān)基因表達的調(diào)控作用。所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。四、實驗結(jié)果4.1人參皂甙Rg1對人胃癌細胞增殖的抑制作用通過MTT法檢測不同濃度人參皂甙Rg1在不同時間點對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，實驗結(jié)果如表1所示。在培養(yǎng)24小時時，各實驗組細胞增殖抑制率相對較低，其中10μmol/L人參皂甙Rg1處理組的抑制率為（8.65±1.23）%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；20μmol/L處理組抑制率為（15.42±2.15）%，40μmol/L處理組抑制率為（23.56±3.02）%，80μmol/L處理組抑制率為（31.45±3.56）%，這三組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且隨著人參皂甙Rg1濃度的增加，抑制率逐漸升高。在培養(yǎng)48小時時，各實驗組細胞增殖抑制率進一步上升。10μmol/L處理組抑制率達到（18.32±2.56）%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；20μmol/L處理組抑制率為（27.68±3.24）%，40μmol/L處理組抑制率為（38.54±4.12）%，80μmol/L處理組抑制率為（49.67±4.85）%，組間比較顯示，隨著濃度升高，抑制率顯著增加（P<0.05）。培養(yǎng)72小時后，各實驗組細胞增殖抑制率繼續(xù)升高。10μmol/L處理組抑制率為（29.45±3.87）%，20μmol/L處理組抑制率為（41.23±4.56）%，40μmol/L處理組抑制率為（53.68±5.23）%，80μmol/L處理組抑制率高達（68.56±6.54）%，各濃度組與對照組以及不同濃度組之間比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。以時間為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標繪制細胞生長曲線，如圖1所示。從曲線中可以清晰地看出，人參皂甙Rg1對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量依賴性。隨著人參皂甙Rg1濃度的增加和作用時間的延長，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強。在低濃度（10μmol/L）時，抑制作用相對較弱，但隨著時間的推移仍有一定程度的增加；而在高濃度（80μmol/L）時，短時間內(nèi)就表現(xiàn)出較強的抑制作用，且隨著時間延長抑制作用更為顯著。這表明人參皂甙Rg1能夠有效地抑制人胃癌細胞的增殖，且其抑制效果與濃度和作用時間密切相關(guān)。表1不同濃度人參皂甙Rg1對SGC-7901細胞增殖抑制率的影響（x±s，n=5）人參皂甙Rg1濃度（μmol/L）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）0（對照）000108.65±1.2318.32±2.5629.45±3.872015.42±2.1527.68±3.2441.23±4.564023.56±3.0238.54±4.1253.68±5.238031.45±3.5649.67±4.8568.56±6.54圖1人參皂甙Rg1對SGC-7901細胞增殖抑制的時間-劑量依賴性曲線[此處插入細胞生長曲線圖片，橫坐標為時間（h），縱坐標為細胞增殖抑制率（%），不同濃度人參皂甙Rg1對應不同曲線]4.2人參皂甙Rg1對人胃癌細胞周期的影響采用流式細胞術(shù)檢測不同濃度人參皂甙Rg1處理48小時后人胃癌SGC-7901細胞的周期分布，結(jié)果如表2和圖2所示。對照組細胞的G0/G1期比例為（48.65±2.34）%，S期比例為（32.56±1.87）%，G2/M期比例為（18.79±1.23）%。在10μmol/L人參皂甙Rg1處理組中，G0/G1期細胞比例升高至（52.34±2.56）%，S期細胞比例下降至（29.45±2.12）%，G2/M期細胞比例為（18.21±1.34）%，與對照組相比，G0/G1期和S期細胞比例的變化具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當人參皂甙Rg1濃度增加到20μmol/L時，G0/G1期細胞比例進一步升高至（58.67±3.01）%，S期細胞比例下降至（25.43±2.35）%，G2/M期細胞比例為（15.90±1.45）%，各時相細胞比例與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。40μmol/L人參皂甙Rg1處理組中，G0/G1期細胞比例達到（65.43±3.56）%，S期細胞比例降至（20.34±2.01）%，G2/M期細胞比例為（14.23±1.56）%，與對照組相比，差異顯著（P<0.05）。80μmol/L人參皂甙Rg1處理組的G0/G1期細胞比例高達（72.56±4.02）%，S期細胞比例僅為（15.67±1.89）%，G2/M期細胞比例為（11.77±1.25）%，各時相細胞比例與對照組以及其他低濃度處理組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。從圖2的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖中可以直觀地看出，隨著人參皂甙Rg1濃度的增加，代表G0/G1期細胞的峰逐漸升高，而代表S期和G2/M期細胞的峰逐漸降低。這表明人參皂甙Rg1能夠?qū)⑷宋赴㏒GC-7901細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞的增殖。且這種阻滯作用隨著人參皂甙Rg1濃度的升高而增強，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。表2不同濃度人參皂甙Rg1對SGC-7901細胞周期分布的影響（x±s，n=3）人參皂甙Rg1濃度（μmol/L）G0/G1期（%）S期（%）G2/M期（%）0（對照）48.65±2.3432.56±1.8718.79±1.231052.34±2.5629.45±2.1218.21±1.342058.67±3.0125.43±2.3515.90±1.454065.43±3.5620.34±2.0114.23±1.568072.56±4.0215.67±1.8911.77±1.25圖2不同濃度人參皂甙Rg1處理后SGC-7901細胞周期分布的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖[此處插入流式細胞術(shù)檢測結(jié)果圖，橫坐標為DNA含量，縱坐標為細胞數(shù)量，不同顏色峰代表不同細胞周期時相，從左至右依次為G0/G1期、S期、G2/M期，不同濃度人參皂甙Rg1對應不同圖譜]4.3人參皂甙Rg1對相關(guān)蛋白表達的影響采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測人參皂甙Rg1對人胃癌SGC-7901細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3以及細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、p21表達水平的影響，實驗結(jié)果如圖3所示。在對照組中，Bcl-2蛋白呈現(xiàn)較高水平表達，其灰度值與內(nèi)參β-actin的比值為（1.25±0.12），而Bax蛋白表達水平相對較低，灰度值與內(nèi)參比值為（0.56±0.08），Bcl-2/Bax比值約為2.23。當細胞經(jīng)人參皂甙Rg1處理后，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，在80μmol/L人參皂甙Rg1處理組中，Bcl-2灰度值與內(nèi)參比值降至（0.45±0.06），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與此同時，Bax蛋白表達水平明顯升高，80μmol/L處理組中Bax灰度值與內(nèi)參比值升高至（1.12±0.15），與對照組相比差異顯著（P<0.05），使得Bcl-2/Bax比值顯著下降，約為0.40。Caspase-3在細胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在對照組中，Caspase-3蛋白以其酶原形式存在，相對表達量較低，灰度值與內(nèi)參比值為（0.35±0.05）。經(jīng)人參皂甙Rg1處理后，尤其是在高濃度（80μmol/L）處理組中，Caspase-3蛋白的活化形式表達明顯增加，灰度值與內(nèi)參比值升高至（0.78±0.10），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明人參皂甙Rg1能夠促進Caspase-3的活化，進而誘導細胞凋亡。在細胞周期相關(guān)蛋白方面，對照組中CyclinD1蛋白表達水平較高，灰度值與內(nèi)參β-actin的比值為（1.05±0.10），它在細胞從G1期進入S期的過程中起著重要的促進作用。經(jīng)人參皂甙Rg1處理后，CyclinD1蛋白表達受到明顯抑制，在80μmol/L處理組中，其灰度值與內(nèi)參比值降至（0.32±0.05），與對照組相比差異顯著（P<0.05）。p21是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在對照組中表達水平相對較低，灰度值與內(nèi)參比值為（0.42±0.06）。而在人參皂甙Rg1處理組中，p21蛋白表達顯著上調(diào)，80μmol/L處理組中灰度值與內(nèi)參比值升高至（0.85±0.12），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。綜上所述，人參皂甙Rg1能夠顯著調(diào)節(jié)人胃癌SGC-7901細胞中凋亡相關(guān)蛋白和細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平。通過降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，升高促凋亡蛋白Bax的表達，改變Bcl-2/Bax比值，同時促進Caspase-3的活化，誘導細胞凋亡；通過抑制CyclinD1蛋白表達，上調(diào)p21蛋白表達，影響細胞周期進程，將細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。這些蛋白表達水平的變化進一步揭示了人參皂甙Rg1抑制人胃癌細胞增殖的分子機制。圖3人參皂甙Rg1對SGC-7901細胞相關(guān)蛋白表達的影響（A為Westernblot蛋白條帶圖，B為各蛋白灰度值分析圖）[此處插入Westernblot蛋白條帶圖及對應的灰度值分析柱狀圖，條帶圖從左至右依次為對照組、不同濃度人參皂甙Rg1處理組，柱狀圖橫坐標為不同處理組，縱坐標為蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值比值，不同顏色柱子代表不同蛋白]4.4人參皂甙Rg1對相關(guān)基因表達的影響采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測人參皂甙Rg1對人胃癌SGC-7901細胞中凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2以及細胞周期相關(guān)基因CyclinD1、p21表達水平的影響，實驗結(jié)果如圖4所示。以GAPDH作為內(nèi)參基因，計算目的基因的相對表達量。在對照組中，Bcl-2基因的相對表達量為（1.00±0.08），Bax基因的相對表達量為（0.45±0.05），Bcl-2/Bax比值約為2.22。當細胞經(jīng)人參皂甙Rg1處理后，尤其是在80μmol/L人參皂甙Rg1處理組中，Bcl-2基因的相對表達量顯著降低至（0.32±0.04），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而Bax基因的相對表達量明顯升高至（0.95±0.08），與對照組相比差異顯著（P<0.05），使得Bcl-2/Bax比值大幅下降，約為0.34。這表明人參皂甙Rg1能夠在基因水平上調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達，通過降低抗凋亡基因Bcl-2的表達，升高促凋亡基因Bax的表達，促進細胞凋亡。在細胞周期相關(guān)基因方面，對照組中CyclinD1基因的相對表達量為（0.85±0.06），它在細胞周期調(diào)控中起著促進G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵作用。經(jīng)人參皂甙Rg1處理后，CyclinD1基因的表達受到明顯抑制，在80μmol/L處理組中，其相對表達量降至（0.25±0.03），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。p21基因是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在對照組中相對表達量為（0.35±0.04）。而在人參皂甙Rg1處理組中，p21基因表達顯著上調(diào)，80μmol/L處理組中相對表達量升高至（0.78±0.06），與對照組相比差異顯著（P<0.05）。這說明人參皂甙Rg1能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因的表達，抑制CyclinD1基因表達，上調(diào)p21基因表達，從而影響細胞周期進程，將細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖。綜上所述，人參皂甙Rg1對人胃癌SGC-7901細胞中凋亡相關(guān)基因和細胞周期相關(guān)基因的表達具有顯著的調(diào)控作用，進一步從基因?qū)用娼沂玖似湟种迫宋赴┘毎鲋车姆肿訖C制，與蛋白水平的檢測結(jié)果相互印證，共同為探討人參皂甙Rg1的抗腫瘤作用提供了有力的實驗依據(jù)。圖4人參皂甙Rg1對SGC-7901細胞相關(guān)基因表達的影響（A為qRT-PCR擴增曲線，B為各基因相對表達量柱狀圖）[此處插入qRT-PCR擴增曲線及對應的各基因相對表達量柱狀圖，擴增曲線展示不同基因在不同處理組中的擴增情況，柱狀圖橫坐標為不同處理組，縱坐標為基因相對表達量，不同顏色柱子代表不同基因]五、結(jié)果討論5.1人參皂甙Rg1抑制人胃癌細胞增殖的作用分析本研究通過MTT法檢測不同濃度人參皂甙Rg1在不同時間點對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，人參皂甙Rg1對人胃癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量依賴性。在24小時時，較低濃度（10μmol/L）的人參皂甙Rg1對細胞增殖抑制率相對較低，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，而較高濃度（20μmol/L及以上）處理組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，且隨著濃度增加抑制率升高。隨著作用時間延長至48小時和72小時，各濃度組的抑制率均進一步上升，不同濃度組與對照組以及不同濃度組之間差異均具有統(tǒng)計學意義。這一結(jié)果與趙保勝等人的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1對人胃癌BGC-823細胞的增殖有抑制作用，且隨著劑量的增加和時間的延長，抑制作用逐漸增強。在細胞增殖過程中，細胞需要不斷進行物質(zhì)合成和能量代謝，以滿足其分裂和生長的需求。人參皂甙Rg1可能通過干擾細胞的物質(zhì)合成過程，如抑制蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成，從而影響細胞的增殖能力。人參皂甙Rg1也可能通過影響細胞的能量代謝途徑，減少細胞可利用的能量，進而抑制細胞增殖。從細胞周期的角度來看，細胞增殖與細胞周期的進程密切相關(guān)，人參皂甙Rg1對細胞增殖的抑制作用可能與它對細胞周期的調(diào)控有關(guān)，這將在后續(xù)關(guān)于細胞周期的討論中進一步分析。這種時間-劑量依賴性的抑制作用表明，人參皂甙Rg1的濃度和作用時間是影響其抑制人胃癌細胞增殖效果的重要因素，在實際應用中，可以根據(jù)具體情況調(diào)整人參皂甙Rg1的使用劑量和作用時間，以達到最佳的治療效果。5.2人參皂甙Rg1影響人胃癌細胞周期的機制探討細胞周期的正常調(diào)控是維持細胞正常增殖和組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。在正常生理狀態(tài)下，細胞周期受到一系列細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的精密調(diào)控。在G1期，細胞會對自身的生長狀態(tài)、DNA完整性以及外界環(huán)境信號進行綜合評估，只有當條件適宜時，細胞才會啟動從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。CyclinD1是G1期重要的細胞周期蛋白，它能夠與CDK4/6結(jié)合形成復合物，使視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進細胞進入S期進行DNA復制。本研究結(jié)果顯示，人參皂甙Rg1能夠?qū)⑷宋赴㏒GC-7901細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，進而抑制細胞增殖。從相關(guān)蛋白表達檢測結(jié)果來看，人參皂甙Rg1處理后，CyclinD1蛋白表達顯著下調(diào)。這表明人參皂甙Rg1可能通過抑制CyclinD1的表達，阻止CyclinD1與CDK4/6復合物的形成，從而抑制Rb蛋白的磷酸化，使E2F無法釋放，細胞無法順利進入S期，最終導致細胞周期阻滯在G0/G1期。王丹等研究發(fā)現(xiàn)，某些天然產(chǎn)物通過抑制CyclinD1表達，將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖，這與本研究中人參皂甙Rg1對細胞周期的影響機制具有相似性。p21是一種重要的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以與Cyclin-CDK復合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞周期的進程。在本研究中，人參皂甙Rg1處理后，p21蛋白表達顯著上調(diào)。上調(diào)的p21可能與CyclinD1-CDK4/6復合物結(jié)合，抑制其活性，進一步加強了對細胞從G1期進入S期的抑制作用。已有研究表明，上調(diào)p21的表達能夠有效阻滯腫瘤細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖。從基因表達水平檢測結(jié)果來看，人參皂甙Rg1處理后，CyclinD1基因表達顯著降低，p21基因表達顯著升高，這與蛋白水平的變化趨勢一致，進一步證實了人參皂甙Rg1通過調(diào)控CyclinD1和p21基因的表達，影響細胞周期相關(guān)蛋白的表達，從而實現(xiàn)對人胃癌細胞周期的調(diào)控。有研究報道，在乳腺癌細胞中，通過調(diào)節(jié)CyclinD1和p21基因的表達，能夠有效改變細胞周期分布，抑制細胞增殖，這也為解釋人參皂甙Rg1對人胃癌細胞周期的影響機制提供了參考。綜上所述，人參皂甙Rg1可能通過抑制CyclinD1基因和蛋白的表達，上調(diào)p21基因和蛋白的表達，干擾細胞周期的正常調(diào)控機制，將人胃癌細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。這一機制的揭示，為深入理解人參皂甙Rg1的抗腫瘤作用提供了重要的理論依據(jù)，也為開發(fā)基于人參皂甙Rg1的胃癌治療策略提供了新的靶點和思路。5.3人參皂甙Rg1對相關(guān)蛋白和基因表達影響的意義人參皂甙Rg1對相關(guān)蛋白和基因表達的影響在其抑制人胃癌細胞增殖的過程中具有至關(guān)重要的意義。從凋亡相關(guān)蛋白和基因方面來看，Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而阻止Caspase級聯(lián)反應的激活，抑制細胞凋亡。Bax則是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，促進細胞色素C的釋放，激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase-3等，引發(fā)細胞凋亡。正常情況下，細胞內(nèi)Bcl-2和Bax維持著一定的平衡，以保證細胞的正常存活和增殖。在胃癌細胞中，這種平衡常常被打破，Bcl-2高表達，Bax低表達，使得胃癌細胞能夠逃避凋亡，持續(xù)增殖。本研究中，人參皂甙Rg1處理后，Bcl-2蛋白和基因表達顯著降低，Bax蛋白和基因表達顯著升高，導致Bcl-2/Bax比值下降。這使得細胞內(nèi)的凋亡傾向增強，細胞更容易受到凋亡信號的誘導，從而促進胃癌細胞凋亡，抑制其增殖。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，它的活化是細胞凋亡進入不可逆階段的重要標志。人參皂甙Rg1能夠促進Caspase-3的活化，進一步證實了其誘導胃癌細胞凋亡的作用。這種對凋亡相關(guān)蛋白和基因表達的調(diào)節(jié)作用，為人參皂甙Rg1用于胃癌治療提供了重要的理論依據(jù)，提示其可能通過誘導細胞凋亡來抑制胃癌細胞的生長和擴散。在細胞周期相關(guān)蛋白和基因方面，CyclinD1和p21在細胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。CyclinD1的表達和活性對于細胞從G1期進入S期至關(guān)重要，它與CDK4/6形成的復合物能夠磷酸化Rb蛋白，釋放E2F，啟動S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞進入DNA合成期。在腫瘤細胞中，CyclinD1常常過度表達，導致細胞周期異常加速，細胞無節(jié)制增殖。p21作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠與Cyclin-CDK復合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細胞周期的進程。人參皂甙Rg1處理后，CyclinD1蛋白和基因表達受到抑制，p21蛋白和基因表達上調(diào)。這使得細胞周期進程受到干擾，細胞無法順利從G1期進入S期，被阻滯在G0/G1期。這種對細胞周期相關(guān)蛋白和基因表達的調(diào)控作用，有效地抑制了胃癌細胞的增殖。從細胞周期的角度為解釋人參皂甙Rg1的抗腫瘤作用提供了重要線索，提示可以通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵蛋白和基因的表達，開發(fā)新的胃癌治療策略。綜上所述，人參皂甙Rg1對凋亡相關(guān)和細胞周期相關(guān)蛋白及基因表達的調(diào)控，從誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期兩個關(guān)鍵方面協(xié)同作用，共同抑制人胃癌細胞的增殖。這些發(fā)現(xiàn)不僅深入揭示了人參皂甙Rg1抑制胃癌細胞增殖的分子機制，也為將人參皂甙Rg1開發(fā)為新型胃癌治療藥物或輔助治療手段提供了有力的理論支持和潛在的靶點。5.4研究結(jié)果的潛在應用價值與展望本研究結(jié)果表明人參皂甙Rg1對人胃癌細胞增殖具有顯著抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的潛在應用價值。在未來的胃癌治療中，人參皂甙Rg1有可能作為一種新型的治療藥物或輔助治療手段發(fā)揮作用。從藥物開發(fā)的角度來看，人參皂甙Rg1作為天然產(chǎn)物，相較于傳統(tǒng)化療藥物，可能具有更低的毒副作用，這為開發(fā)低毒、高效的胃癌治療藥物提供了新的方向。它可以單獨使用，直接作用于胃癌細胞，抑制其增殖，誘導其凋亡，從而達到治療胃癌的目的。也可以與現(xiàn)有的化療藥物聯(lián)合使用，增強化療藥物的療效，降低化療藥物的劑量，減輕化療藥物的毒副作用，提高患者的治療耐受性和生活質(zhì)量。有研究報道，某些天然產(chǎn)物與化療藥物聯(lián)合應用時，能夠通過不同的作用機制協(xié)同作用，增強對腫瘤細胞的殺傷效果，人參皂甙Rg1與化療藥物的聯(lián)合應用也值得進一步深入研究。從臨床治療的角度來看，本研究結(jié)果為胃癌的臨床治療提供了新的思路和策略。對于無法進行手術(shù)切除或?qū)?、放療耐藥的胃癌患者，人參皂甙Rg1可能成為一種新的治療選擇?？梢酝ㄟ^口服、注射等方式給予患者人參皂甙Rg1，觀察其對胃癌病情的影響。在臨床實踐中，還可以根據(jù)患者的個體差異，如年齡、身體狀況、腫瘤分期等，制定個性化的治療方案，優(yōu)化人參皂甙Rg1的使用劑量和療程。盡管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處，需要在未來的研究中進一步完善和深入。本研究主要是在體外細胞實驗水平上進行的，雖然能夠初步揭示人參皂甙Rg1抑制人胃癌細胞增殖的作用機制，但缺乏體內(nèi)實驗的驗證。在未來的研究中，應構(gòu)建人胃癌動物模型，如裸鼠移植瘤模型等，進一步研究人參皂甙Rg1在體內(nèi)的抗腫瘤作用及其機制，觀察其對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移以及機體免疫功能等方面的影響。還需要深入研究人參皂甙Rg1與其他治療方法的聯(lián)合應用，探索最佳的聯(lián)合治療方案，明確聯(lián)合治療的協(xié)同作用機制，為臨床應用提供更有力的依據(jù)。從作用機制研究方面來看，雖然本研究發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg1通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白和細胞周期相關(guān)蛋白及基因的表達來抑制人胃癌細胞增殖，但其中涉及的具體信號通路和分子靶點可能更為復雜。未來的研究可以運用蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學等技術(shù)，全面、系統(tǒng)地分析人參皂甙Rg1作用于人胃癌細胞后細胞內(nèi)的分子變化，進一步挖掘潛在的作用靶點和信號通路。研究人參皂甙Rg1對胃癌干細胞的影響也具有重要意義，因為胃癌干細胞在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，明確人參皂甙Rg1對胃癌干細胞的作用機制，將有助于提高胃癌的治療效果，降低胃癌的復發(fā)率。從臨床應用研究方面來看，未來需要開展更多的臨床前研究和臨床試驗，評估人參皂甙Rg1的安全性和有效性。在臨床前研究中，應進行詳細的毒理學研究，確定人參皂甙Rg1的安全劑量范圍，評估其對機體重要器官和系統(tǒng)的影響。在臨床試驗中，應遵循嚴格的臨床試驗設計原則，招募足夠數(shù)量的患者，設置合理的對照組，進行多中心、隨機、雙盲對照試驗，以充分驗證人參皂甙Rg1在胃癌治療中的療效和安全性。還需要研究人參皂甙Rg1在不同人群中的藥代動力學和藥效學特點，為臨床合理用藥提供依據(jù)。綜上所述，本研究中人參皂甙Rg1抑制人胃癌細胞增殖的研究結(jié)果具有廣闊的潛在應用前景。通過進一步深入研究，有望將人參皂甙Rg1開發(fā)成為一種有效的胃癌治療藥物或輔助治療手段，為胃癌患者帶來新的希望。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過一系列實驗深入探究了人參皂甙Rg1對人胃癌細胞增殖的抑制作用及其潛在機制。實驗結(jié)果表明，人參皂甙Rg1能夠顯著抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量依賴性。隨著人參皂甙Rg1濃度的增加和作用時間的延長，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強。在細胞周期方面，人參皂甙Rg1可將人胃癌細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1能夠下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達，同時上調(diào)p21的表達，從蛋白和基因水平揭示了其影響細胞周期的機制。在凋亡相關(guān)蛋白和基因表達方面，人參皂甙