TGF-β1通過誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)直腸癌（ColorectalCancer，CRC）作為全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例達(dá)193萬例，死亡病例約93.5萬例，其發(fā)病率和死亡率分別位居所有惡性腫瘤的第三位和第二位。在中國，結(jié)直腸癌的發(fā)病形勢(shì)同樣嚴(yán)峻，新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2020年新發(fā)病例約55.5萬，死亡病例約28.6萬。盡管在診斷和治療技術(shù)上取得了顯著的進(jìn)步，如手術(shù)方式的改進(jìn)、化療藥物的研發(fā)以及靶向治療和免疫治療的應(yīng)用，但結(jié)直腸癌患者的總體生存率仍然有待提高，尤其是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，5年生存率僅為14%左右。腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-AssociatedFibroblasts，CAFs）作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，是一類異質(zhì)性的細(xì)胞群體，主要來源于組織駐留的成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、周細(xì)胞以及骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞等。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CAFs被多種細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子等激活，發(fā)生表型和功能的改變?；罨腃AFs能夠分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分、生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子等，通過旁分泌和自分泌的方式與腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等相互作用，從而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及免疫逃逸。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TransformingGrowthFactor-β1，TGF-β1）是一種多功能的細(xì)胞因子，在腫瘤微環(huán)境中含量豐富。TGF-β1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重作用，在腫瘤早期，它可以通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制免疫反應(yīng)等機(jī)制發(fā)揮抑癌作用；而在腫瘤晚期，TGF-β1則主要通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力、促進(jìn)血管生成以及抑制免疫細(xì)胞的活性等方式，發(fā)揮促癌作用。研究表明，TGF-β1可以通過激活多種信號(hào)通路，如Smad信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路等，誘導(dǎo)CAFs的活化和增殖。蛋白基因產(chǎn)物9.5（ProteinGeneProduct9.5，PGP9.5）是一種泛素羧基末端水解酶，最初被發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PGP9.5在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，PGP9.5的表達(dá)水平明顯高于正常組織，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和浸潤深度呈正相關(guān)。然而，目前關(guān)于TGF-β1、CAFs和PGP9.5三者之間的關(guān)系以及它們?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全明確。深入研究TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲的分子機(jī)制，對(duì)于揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及開發(fā)有效的治療策略具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。一方面，有助于我們更加深入地理解腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間的相互作用以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向；另一方面，有望為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略，通過干預(yù)TGF-β1-CAFs-PGP9.5信號(hào)軸，阻斷結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，提高結(jié)直腸癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在結(jié)直腸癌的研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）和蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）各自都受到了廣泛的關(guān)注，相關(guān)研究不斷深入，但三者之間的聯(lián)系以及其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中完整的作用機(jī)制，仍存在諸多待探索之處。TGF-β1作為一種多功能細(xì)胞因子，在結(jié)直腸癌中的研究由來已久。早期研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在結(jié)直腸癌的起始階段扮演著腫瘤抑制因子的角色，它能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡來限制癌細(xì)胞的增殖。如在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中，TGF-β1與其受體結(jié)合后，激活Smad信號(hào)通路，促使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（如p21和p15）的表達(dá)，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。然而，隨著腫瘤的進(jìn)展，TGF-β1卻表現(xiàn)出明顯的促癌作用。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β1水平升高，它可以誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。一項(xiàng)針對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的研究表明，外源性添加TGF-β1能夠上調(diào)N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而提高其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，TGF-β1還能通過抑制免疫細(xì)胞的活性，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），幫助癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。CAFs作為腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，近年來在結(jié)直腸癌研究中備受矚目。大量研究表明，CAFs與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。從功能上看，CAFs能夠分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，改變腫瘤微環(huán)境的物理性質(zhì)，為癌細(xì)胞的生長和遷移提供支持。同時(shí)，CAFs還能分泌一系列生長因子和細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長因子（HGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些因子通過旁分泌作用于癌細(xì)胞，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。在臨床樣本研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中CAFs的數(shù)量明顯多于癌旁正常組織，且其數(shù)量與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究還揭示了CAFs具有高度的異質(zhì)性，不同亞群的CAFs可能在結(jié)直腸癌的不同階段發(fā)揮不同的作用，但其具體的亞群分類和功能差異仍有待進(jìn)一步明確。PGP9.5在結(jié)直腸癌中的研究相對(duì)較新，但已經(jīng)取得了一些重要的發(fā)現(xiàn)。研究表明，PGP9.5在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)直腸組織，且其表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。張小兵等人通過免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從正常腸黏膜、腺瘤到進(jìn)展期結(jié)直腸癌，PGP9.5蛋白表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。PGP9.5的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和浸潤深度相關(guān)，提示其在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲的具體分子機(jī)制尚不完全清楚，仍需要深入研究。盡管TGF-β1、CAFs和PGP9.5在結(jié)直腸癌中的各自作用已有不少研究報(bào)道，但關(guān)于三者之間的相互關(guān)系及具體作用機(jī)制仍存在諸多空白與不足。雖然已知TGF-β1可以誘導(dǎo)CAFs的活化，但其誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5的具體信號(hào)通路以及分子機(jī)制尚未見報(bào)道。此外，CAFs表達(dá)的PGP9.5如何作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和侵襲，以及這一過程中是否涉及其他細(xì)胞因子或信號(hào)通路的參與，也有待進(jìn)一步探索。在臨床應(yīng)用方面，目前還缺乏基于TGF-β1-CAFs-PGP9.5信號(hào)軸的有效治療策略和生物標(biāo)志物，限制了對(duì)結(jié)直腸癌患者的精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估。因此，深入研究三者之間的關(guān)系及其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，具有重要的理論和臨床意義。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在深入探討TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲的具體分子機(jī)制，明確TGF-β1、CAFs和PGP9.5三者之間的相互關(guān)系，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，具體包括：驗(yàn)證TGF-β1是否能夠誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5，并確定其誘導(dǎo)的最佳條件和時(shí)間節(jié)點(diǎn)，為后續(xù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。闡明TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5的信號(hào)通路，明確關(guān)鍵的信號(hào)分子和調(diào)控機(jī)制，深入理解這一過程的內(nèi)在分子機(jī)制。探究CAFs表達(dá)的PGP9.5對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，以及其作用的具體方式和相關(guān)分子機(jī)制，揭示PGP9.5在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用。評(píng)估TGF-β1-CAFs-PGP9.5信號(hào)軸作為結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)的可行性，為開發(fā)新的治療策略提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床治療提供新的思路和方向。1.3.2研究內(nèi)容TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化并表達(dá)PGP9.5的研究：通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將CAFs分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度的TGF-β1刺激，對(duì)照組不做處理。采用免疫熒光、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)CAFs的活化標(biāo)志物（如α-SMA、FAP等）以及PGP9.5的表達(dá)水平，確定TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化和表達(dá)PGP9.5的最佳濃度和時(shí)間。利用RNA干擾技術(shù)沉默TGF-β1受體基因，觀察其對(duì)CAFs活化和PGP9.5表達(dá)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證TGF-β1在這一過程中的作用。TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5的信號(hào)通路研究：運(yùn)用通路抑制劑和激動(dòng)劑處理CAFs，分別抑制或激活可能參與的信號(hào)通路（如Smad、MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路），檢測(cè)PGP9.5的表達(dá)變化，初步篩選出與TGF-β1誘導(dǎo)PGP9.5表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路。通過基因過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)分子在TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5過程中的作用。利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)，探究信號(hào)通路中關(guān)鍵分子之間的相互作用及對(duì)PGP9.5基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。CAFs表達(dá)的PGP9.5對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及機(jī)制研究：將表達(dá)PGP9.5的CAFs與結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，設(shè)置正常CAFs與結(jié)直腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)組和單獨(dú)培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞組作為對(duì)照，采用CCK-8、EdU等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)分析結(jié)直腸癌細(xì)胞在與表達(dá)PGP9.5的CAFs共培養(yǎng)前后的差異表達(dá)蛋白和基因，篩選出可能參與PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲的相關(guān)分子和信號(hào)通路。利用RNA干擾、基因敲除等技術(shù)沉默或敲除相關(guān)分子，驗(yàn)證其在PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲過程中的作用機(jī)制。TGF-β1-CAFs-PGP9.5信號(hào)軸在結(jié)直腸癌治療中的潛在應(yīng)用研究：建立結(jié)直腸癌小鼠模型，分別給予TGF-β1抑制劑、PGP9.5抑制劑以及二者聯(lián)合處理，觀察小鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，評(píng)估TGF-β1-CAFs-PGP9.5信號(hào)軸作為治療靶點(diǎn)的有效性。檢測(cè)小鼠腫瘤組織中相關(guān)分子的表達(dá)水平以及腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤情況，探討聯(lián)合治療對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。分析臨床結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中TGF-β1、CAFs中PGP9.5的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療提供參考依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法細(xì)胞培養(yǎng)與處理：從結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織中分離培養(yǎng)CAFs，采用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表型。將人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（如HT-29、SW480等）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（如1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL等）的TGF-β1處理CAFs不同時(shí)間（如24h、48h、72h等），對(duì)照組加入等量的PBS。RNA干擾技術(shù)：設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-β1受體、關(guān)鍵信號(hào)分子（如Smad2、Smad3、ERK1/2、Akt等）以及PGP9.5的小干擾RNA（siRNA），利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至CAFs中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)干擾效率。基因過表達(dá)技術(shù)：構(gòu)建TGF-β1、關(guān)鍵信號(hào)分子以及PGP9.5的過表達(dá)載體，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入CAFs或結(jié)直腸癌細(xì)胞中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)過表達(dá)效果。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，加入相應(yīng)的一抗（如α-SMA、FAP、PGP9.5、p-Smad2/3、Smad2/3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Akt、Akt等抗體）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜后，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2h。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，通過比較Ct值計(jì)算目的基因（如TGF-β1、PGP9.5、α-SMA、FAP以及信號(hào)通路相關(guān)基因等）的相對(duì)表達(dá)量。免疫熒光染色：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞，5%BSA封閉后，加入相應(yīng)的一抗（如α-SMA、FAP、PGP9.5等抗體）4℃孵育過夜。次日，用PBS洗膜后，加入相應(yīng)的熒光二抗室溫孵育1-2h。DAPI染核后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法和EdU法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。CCK-8法：將結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，與不同處理的CAFs進(jìn)行共培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）加入CCK-8試劑，孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值。EdU法：按照EdU試劑盒說明書操作，將結(jié)直腸癌細(xì)胞與不同處理的CAFs共培養(yǎng)后，加入EdU孵育2h。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%TritonX-100通透細(xì)胞，加入Click反應(yīng)液孵育30min。DAPI染核后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比例。細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：在上室加入Matrigel基質(zhì)膠，待其凝固后，加入不同處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24-48h后，用棉簽擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室穿膜細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：操作與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，但上室不鋪Matrigel基質(zhì)膠。劃痕實(shí)驗(yàn)：將結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿單層后，用無菌槍頭在細(xì)胞層上劃一道直線。用PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如0h、24h、48h等）拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）：提取細(xì)胞總蛋白，加入相應(yīng)的抗體和ProteinA/G磁珠，4℃孵育過夜。次日，用磁力架分離磁珠，用裂解緩沖液洗滌磁珠3-5次。最后，加入SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性，進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，分析蛋白之間的相互作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建含有PGP9.5基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告載體，將其與過表達(dá)或干擾關(guān)鍵信號(hào)分子的載體共轉(zhuǎn)染至CAFs中。轉(zhuǎn)染48-72h后，按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書操作，用熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性，分析關(guān)鍵信號(hào)分子對(duì)PGP9.5基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用4-6周齡的BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，建立結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型或原位移植瘤模型。將結(jié)直腸癌細(xì)胞或與不同處理的CAFs混合后接種于小鼠體內(nèi)。待腫瘤生長至一定體積后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予TGF-β1抑制劑（如LY364947）、PGP9.5抑制劑（如小分子化合物）以及二者聯(lián)合處理，對(duì)照組給予等量的生理鹽水。定期測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行稱重、病理分析以及相關(guān)分子檢測(cè)。臨床標(biāo)本分析：收集結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁正常組織標(biāo)本，以及患者的臨床病理資料（如年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)本中TGF-β1、CAFs中PGP9.5的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：第一階段：獲取結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和細(xì)胞系，分離培養(yǎng)CAFs并鑒定其表型。用不同濃度和時(shí)間的TGF-β1處理CAFs，通過免疫熒光、Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)CAFs的活化標(biāo)志物（α-SMA、FAP）和PGP9.5的表達(dá)水平，確定TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化和表達(dá)PGP9.5的最佳條件。第二階段：利用RNA干擾技術(shù)沉默TGF-β1受體基因，驗(yàn)證TGF-β1在誘導(dǎo)CAFs活化和表達(dá)PGP9.5中的作用。運(yùn)用通路抑制劑和激動(dòng)劑處理CAFs，篩選與TGF-β1誘導(dǎo)PGP9.5表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路。通過基因過表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)分子在TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5過程中的作用。利用Co-IP和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，探究信號(hào)通路中關(guān)鍵分子之間的相互作用及對(duì)PGP9.5基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。第三階段：將表達(dá)PGP9.5的CAFs與結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，采用CCK-8、EdU、Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。通過蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析結(jié)直腸癌細(xì)胞在與表達(dá)PGP9.5的CAFs共培養(yǎng)前后的差異表達(dá)蛋白和基因，篩選出可能參與PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲的相關(guān)分子和信號(hào)通路。利用RNA干擾、基因敲除等技術(shù)沉默或敲除相關(guān)分子，驗(yàn)證其在PGP9.5促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲過程中的作用機(jī)制。第四階段：建立結(jié)直腸癌小鼠模型，給予TGF-β1抑制劑、PGP9.5抑制劑以及二者聯(lián)合處理，觀察小鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。檢測(cè)小鼠腫瘤組織中相關(guān)分子的表達(dá)水平以及腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤情況。收集臨床結(jié)直腸癌患者標(biāo)本，分析TGF-β1、CAFs中PGP9.5的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。[此處插入技術(shù)路線圖]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1結(jié)直腸癌概述結(jié)直腸癌（ColorectalCancer，CRC），又被稱為大腸癌，是一種源于結(jié)腸和直腸上皮組織的惡性腫瘤。作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌的新發(fā)病例達(dá)193萬例，死亡病例約93.5萬例，發(fā)病率和死亡率分別位列所有惡性腫瘤的第三位和第二位。在中國，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活方式的改變以及人口老齡化的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)病形勢(shì)日益嚴(yán)峻。2020年中國結(jié)直腸癌新發(fā)病例約55.5萬，死亡病例約28.6萬，發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在一些大城市，如北京、上海、廣州等地，結(jié)直腸癌的發(fā)病率甚至位居惡性腫瘤的第二位或第三位。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及生活方式等多個(gè)方面。遺傳因素在結(jié)直腸癌的發(fā)病中起著重要作用，約15%-30%的結(jié)直腸癌患者具有家族遺傳傾向。家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性疾病與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。在FAP患者中，由于APC基因的突變，導(dǎo)致腸道內(nèi)出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，這些息肉如果不及時(shí)治療，幾乎100%會(huì)發(fā)展為結(jié)直腸癌。環(huán)境因素和生活方式也是結(jié)直腸癌的重要危險(xiǎn)因素。長期高脂肪、高蛋白、低纖維飲食，缺乏運(yùn)動(dòng)，肥胖，吸煙，過量飲酒等都與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。膳食纖維可以促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，減少有害物質(zhì)在腸道內(nèi)的停留時(shí)間，從而降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；而高脂肪、高蛋白飲食則會(huì)增加腸道內(nèi)膽汁酸和脂肪酸的含量，這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)腸道黏膜造成損傷，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。結(jié)直腸癌的病理類型主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、未分化癌等，其中腺癌占絕大多數(shù)，約90%以上。根據(jù)腫瘤的生長方式和形態(tài)，結(jié)直腸癌可分為隆起型、潰瘍型、浸潤型和膠樣型。隆起型腫瘤呈息肉狀或菜花狀向腸腔內(nèi)生長，表面常伴有潰瘍；潰瘍型腫瘤以潰瘍形成為主，邊緣不規(guī)則，底部凹凸不平；浸潤型腫瘤主要向腸壁深層浸潤，使腸壁增厚、變硬，腸腔狹窄；膠樣型腫瘤外觀呈半透明膠凍狀，主要由大量黏液物質(zhì)組成。在臨床上，結(jié)直腸癌的癥狀因腫瘤的部位、大小和分期而異。早期結(jié)直腸癌患者可能沒有明顯癥狀，隨著腫瘤的進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)便血、腹瀉、便秘、腹痛、腹脹、貧血、消瘦等癥狀。便血是結(jié)直腸癌最常見的癥狀之一，表現(xiàn)為大便表面帶血或便后滴血，血色鮮紅或暗紅；腹瀉和便秘交替出現(xiàn)也是結(jié)直腸癌的常見癥狀，這是由于腫瘤刺激腸道，導(dǎo)致腸道功能紊亂引起的。目前，結(jié)直腸癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是結(jié)直腸癌的主要治療手段，對(duì)于早期結(jié)直腸癌患者，手術(shù)切除腫瘤后，5年生存率可達(dá)90%以上。對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者，手術(shù)聯(lián)合化療、放療等綜合治療可以提高患者的生存率和生活質(zhì)量?；熓峭ㄟ^使用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等。放療是利用高能射線殺死癌細(xì)胞，主要用于局部晚期結(jié)直腸癌患者或術(shù)后輔助治療。靶向治療和免疫治療是近年來結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展，靶向治療藥物如貝伐單抗、西妥昔單抗等可以特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；免疫治療藥物如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等可以激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。盡管結(jié)直腸癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，對(duì)于提高結(jié)直腸癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。2.2TGF-β1相關(guān)理論轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TransformingGrowthFactor-β1，TGF-β1）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族中最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為廣泛的成員之一。在人體的生理和病理過程中，TGF-β1都扮演著極為關(guān)鍵的角色，尤其是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，其作用機(jī)制復(fù)雜且多樣。從結(jié)構(gòu)上看，TGF-β1是一種由兩個(gè)相同亞基組成的同源二聚體蛋白質(zhì)，每個(gè)亞基含有112個(gè)氨基酸，通過二硫鍵相互連接。其前體蛋白由390個(gè)氨基酸組成，在合成后需要經(jīng)過一系列的加工和修飾過程，包括信號(hào)肽的切除、糖基化修飾等，最終形成具有生物活性的成熟TGF-β1。TGF-β1的空間結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨(dú)特的β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了它與受體特異性結(jié)合并激活下游信號(hào)通路的能力。TGF-β1具有廣泛的生物學(xué)功能，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解等過程都有著重要的調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β1參與胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等多種生理過程。在胚胎發(fā)育過程中，TGF-β1對(duì)細(xì)胞的分化和組織器官的形成起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，它可以引導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向分化，如促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等方向分化。在組織修復(fù)過程中，TGF-β1能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而促進(jìn)傷口的愈合。在免疫調(diào)節(jié)方面，TGF-β1是一種重要的免疫抑制因子，它可以抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，防止過度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。TGF-β1主要通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合來激活下游信號(hào)通路，其信號(hào)通路主要包括經(jīng)典的Smad信號(hào)通路和非經(jīng)典的Smad信號(hào)通路。在經(jīng)典的Smad信號(hào)通路中，TGF-β1首先與細(xì)胞表面的II型受體（TGF-βRII）結(jié)合，形成TGF-β1-TGF-βRII復(fù)合物。隨后，I型受體（TGF-βRI）被招募到復(fù)合物中，TGF-βRII磷酸化TGF-βRI，使其激活。激活的TGF-βRI進(jìn)一步磷酸化下游的Smad2和Smad3蛋白，磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物，然后進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。非經(jīng)典的Smad信號(hào)通路則不依賴于Smad蛋白，主要包括Ras/MAPK、PI3K/Akt、RhoA/ROCK等信號(hào)通路。TGF-β1可以通過激活這些信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和存活等過程。例如，TGF-β1可以激活Ras/MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活；激活PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1具有復(fù)雜的雙重作用。在腫瘤發(fā)生的早期階段，TGF-β1主要發(fā)揮腫瘤抑制作用。它可以通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，如誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等。TGF-β1能夠上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p15、p21和p57的表達(dá)，這些抑制劑可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的停滯。同時(shí)，TGF-β1還可以通過激活線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TGF-β1可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素c，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，TGF-β1還可以通過抑制血管生成、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方式，抑制腫瘤的生長和發(fā)展。然而，隨著腫瘤的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞往往會(huì)獲得對(duì)TGF-β1生長抑制作用的抵抗，此時(shí)TGF-β1則主要發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β1水平升高，它可以通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β1可以誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，TGF-β1通過激活Smad信號(hào)通路和非Smad信號(hào)通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、ZEB1和ZEB2等的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，TGF-β1還可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。TGF-β1可以刺激腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新的血管。TGF-β1還可以通過抑制免疫細(xì)胞的活性，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。TGF-β1可以抑制T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，使其無法有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。2.3CAFs相關(guān)理論癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-AssociatedFibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）中關(guān)鍵的基質(zhì)細(xì)胞成分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CAFs的來源具有多樣性。組織駐留的成纖維細(xì)胞是CAFs最主要的來源之一，在腫瘤微環(huán)境中多種信號(hào)的刺激下，如腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、生長因子以及細(xì)胞外基質(zhì)的改變等，這些成纖維細(xì)胞被激活，發(fā)生表型和功能的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為CAFs。脂肪細(xì)胞也可以通過轉(zhuǎn)分化過程成為CAFs，在腫瘤微環(huán)境的影響下，脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生改變，獲得成纖維細(xì)胞的特征，參與腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建。周細(xì)胞同樣能夠轉(zhuǎn)化為CAFs，周細(xì)胞在維持血管穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)血管生成方面發(fā)揮重要作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，周細(xì)胞受到腫瘤微環(huán)境信號(hào)的誘導(dǎo)，分化為CAFs，為腫瘤細(xì)胞提供支持。此外，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤相關(guān)趨化因子的吸引下，遷移到腫瘤組織，并分化為CAFs，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。CAFs具有獨(dú)特的特征。在形態(tài)上，CAFs通常呈現(xiàn)出細(xì)長、梭形的外觀，與正常成纖維細(xì)胞相比，其細(xì)胞體積更大，胞質(zhì)豐富，含有更多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，這表明CAFs具有更強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成和分泌能力。在分子標(biāo)志物方面，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）是CAFs最常用的標(biāo)志物之一，其表達(dá)水平的升高被認(rèn)為是成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志。成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）也是CAFs的重要標(biāo)志物，F(xiàn)AP具有二肽基肽酶和膠原酶的活性，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1（FSP1）等也常被用于鑒定CAFs。然而，需要注意的是，這些標(biāo)志物并非CAFs所特有的，在不同的組織和腫瘤類型中，CAFs的標(biāo)志物表達(dá)可能存在差異，且CAFs具有高度的異質(zhì)性，不同亞群的CAFs可能具有不同的標(biāo)志物表達(dá)譜。CAFs在腫瘤微環(huán)境中具有多種重要功能。CAFs能夠分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，這些細(xì)胞外基質(zhì)成分不僅為腫瘤細(xì)胞提供物理支撐，還可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的整合素等受體相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等行為。研究表明，CAFs分泌的Ⅰ型膠原蛋白可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能與激活FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。CAFs還能分泌一系列生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子，如肝細(xì)胞生長因子（HGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些因子通過旁分泌作用于腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，調(diào)節(jié)腫瘤的生長、血管生成、免疫逃逸和轉(zhuǎn)移等過程。HGF可以與腫瘤細(xì)胞表面的c-Met受體結(jié)合，激活下游的Ras/MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移。VEGF是一種重要的促血管生成因子，CAFs分泌的VEGF可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，CAFs還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，如抑制T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。CAFs分泌的TGF-β可以抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，使其無法有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。2.4PGP9.5相關(guān)理論蛋白基因產(chǎn)物9.5（ProteinGeneProduct9.5，PGP9.5），作為一種泛素羧基末端水解酶，在生命活動(dòng)和疾病進(jìn)程中展現(xiàn)出獨(dú)特而重要的作用，尤其在腫瘤領(lǐng)域，其研究逐漸成為熱點(diǎn)。從分子結(jié)構(gòu)上看，PGP9.5由位于人類染色體1p36.2上的基因編碼，其編碼產(chǎn)物包含250個(gè)氨基酸，分子量約為27kD。該蛋白具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，其催化結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)水解泛素羧基末端的肽鍵，從而參與蛋白質(zhì)的降解和再循環(huán)過程。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了PGP9.5在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持方面的關(guān)鍵功能，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)，影響細(xì)胞的多種生理過程。在生理功能方面，PGP9.5最初被發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中。在神經(jīng)元中，PGP9.5參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成、運(yùn)輸和釋放過程，對(duì)神經(jīng)信號(hào)的傳遞起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，在神經(jīng)末梢，PGP9.5能夠與突觸小泡相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而保證神經(jīng)信號(hào)的有效傳遞。在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，PGP9.5同樣參與激素的合成和分泌調(diào)控，維持內(nèi)分泌系統(tǒng)的穩(wěn)定。此外，PGP9.5還在細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和凋亡過程中發(fā)揮作用，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或處于病理狀態(tài)時(shí)，PGP9.5的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的降解和信號(hào)通路，影響細(xì)胞的存活和凋亡。近年來，PGP9.5在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了顯著進(jìn)展。越來越多的研究表明，PGP9.5在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，PGP9.5的高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的不良預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)對(duì)乳腺癌患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，PGP9.5陽性表達(dá)的患者，其無病生存期和總生存期明顯短于PGP9.5陰性表達(dá)的患者，提示PGP9.5可能成為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。在肺癌中，PGP9.5不僅參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移過程，還與肺癌的耐藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PGP9.5可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的抗氧化酶和氧化酶的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的多重耐藥性。在結(jié)直腸癌中，PGP9.5的表達(dá)水平同樣明顯高于正常組織，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和浸潤深度呈正相關(guān)。張小兵等人通過免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從正常腸黏膜、腺瘤到進(jìn)展期結(jié)直腸癌，PGP9.5蛋白表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。進(jìn)一步的研究表明，PGP9.5可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。該信號(hào)通路的激活可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖；同時(shí)，激活的Akt蛋白可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bad的活性，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力。此外，PGP9.5還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三、TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化并分泌PGP9.5的研究3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；人正常結(jié)直腸成纖維細(xì)胞系CCD-18Co和人癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞系CAF-02由本實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，自由攝食和飲水。主要試劑：TGF-β1重組蛋白購自PeproTech公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA溶液購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜購自Beyotime公司；兔抗人α-SMA抗體、兔抗人FAP抗體、兔抗人PGP9.5抗體、鼠抗人GAPDH抗體購自Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購自JacksonImmunoResearch公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；小干擾RNA（siRNA）針對(duì)TGF-β1受體（siTGF-βR）、Smad2（siSmad2）、Smad3（siSmad3）、ERK1/2（siERK1/2）、Akt（siAkt）以及陰性對(duì)照siRNA（siNC）購自GenePharma公司；TGF-β1信號(hào)通路抑制劑LY364947、ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126、PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002購自Selleck公司；Transwell小室購自Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司；CCK-8試劑盒、EdU試劑盒購自RiboBio公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自BDBiosciences公司。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）、Transwell小室培養(yǎng)板（Corning）。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)：將CCD-18Co和CAF-02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，HCT116和SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）的TGF-β1重組蛋白處理CAFs24h、48h或72h，對(duì)照組加入等量的PBS。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇：細(xì)胞凍存時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清，加入含10%DMSO、20%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?-5×10?/mL，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1mL，按照程序降溫法進(jìn)行凍存，先將凍存管置于4℃冰箱30min，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱2h，最后放入-80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)，使其快速融化，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入5mL含10%FBS的培養(yǎng)基，1000r/min離心5min，棄上清，加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：構(gòu)建TGF-β1過表達(dá)載體，以人cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增TGF-β1基因片段，將其克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建成功的載體和空載體分別轉(zhuǎn)染至CAFs中，采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。針對(duì)TGF-β1受體、Smad2、Smad3、ERK1/2、Akt等基因設(shè)計(jì)并合成siRNA，將siRNA和陰性對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染至CAFs中，轉(zhuǎn)染方法同載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后，提取細(xì)胞RNA或蛋白質(zhì)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR或Westernblot檢測(cè)干擾效率。檢測(cè)方法免疫熒光染色：將CAFs接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，5%BSA封閉30min，加入兔抗人α-SMA抗體、兔抗人FAP抗體或兔抗人PGP9.5抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗3次，每次5min，加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫孵育1h，PBS洗3次，每次5min，DAPI染核5min，PBS洗3次，每次5min，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，加入兔抗人α-SMA抗體、兔抗人FAP抗體、兔抗人PGP9.5抗體、兔抗人p-Smad2/3抗體、兔抗人Smad2/3抗體、兔抗人p-ERK1/2抗體、兔抗人ERK1/2抗體、兔抗人p-Akt抗體、兔抗人Akt抗體或鼠抗人GAPDH抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗或HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，通過比較Ct值計(jì)算目的基因（如TGF-β1、PGP9.5、α-SMA、FAP以及信號(hào)通路相關(guān)基因等）的相對(duì)表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3.1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3posthoctest進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化為探究TGF-β1對(duì)CAFs活化的影響，本實(shí)驗(yàn)將CAFs分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別加入0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的TGF-β1重組蛋白處理24h，通過免疫熒光染色檢測(cè)CAFs活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組中α-SMA表達(dá)較弱，呈現(xiàn)出微弱的綠色熒光；隨著TGF-β1濃度的增加，α-SMA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖1A）。進(jìn)一步通過Westernblot檢測(cè)α-SMA和FAP的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中α-SMA和FAP的蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且呈濃度依賴性（圖1B、1C）。當(dāng)TGF-β1濃度為10ng/mL時(shí)，α-SMA和FAP的蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的3.2倍和2.5倍（P<0.05）。這些結(jié)果表明，TGF-β1能夠誘導(dǎo)CAFs活化，且在一定范圍內(nèi)，隨著TGF-β1濃度的增加，CAFs的活化程度增強(qiáng)。為了確定TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化的最佳時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)將CAFs用10ng/mL的TGF-β1處理0h、24h、48h、72h，通過Westernblot檢測(cè)α-SMA和FAP的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長，α-SMA和FAP的蛋白表達(dá)水平逐漸升高，在48h時(shí)達(dá)到峰值，隨后略有下降（圖1D、1E）。在48h時(shí)，α-SMA和FAP的蛋白表達(dá)水平分別是0h時(shí)的3.5倍和2.8倍（P<0.05）。綜上所述，TGF-β1能夠有效誘導(dǎo)CAFs活化，且在10ng/mL、48h時(shí)誘導(dǎo)效果最佳。[此處插入圖1：TGF-β1誘導(dǎo)CAFs活化的結(jié)果圖，包括免疫熒光圖和Westernblot圖]3.2.2TGF-β1過表達(dá)載體構(gòu)建為了進(jìn)一步研究TGF-β1在CAFs中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了TGF-β1過表達(dá)載體。以人cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增TGF-β1基因片段，將其克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在約1.2kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的TGF-β1基因片段大小一致（圖2A）。將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中TGF-β1基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示完全一致，表明TGF-β1過表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2B）。將構(gòu)建成功的TGF-β1過表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染至CAFs中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)TGF-β1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，TGF-β1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組中TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（圖2C、2D）。TGF-β1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組中TGF-β1的mRNA表達(dá)水平是空載體轉(zhuǎn)染組的5.6倍，蛋白表達(dá)水平是空載體轉(zhuǎn)染組的4.8倍（P<0.05）。這些結(jié)果表明，TGF-β1過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染至CAFs中，且能夠有效提高TGF-β1的表達(dá)水平。[此處插入圖2：TGF-β1過表達(dá)載體構(gòu)建的電泳圖和測(cè)序結(jié)果圖，以及轉(zhuǎn)染后TGF-β1表達(dá)水平檢測(cè)圖]3.2.3TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5在確定TGF-β1能夠誘導(dǎo)CAFs活化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究TGF-β1對(duì)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5的影響。將CAFs分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別加入0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的TGF-β1重組蛋白處理48h，通過免疫熒光染色檢測(cè)PGP9.5的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組中PGP9.5表達(dá)較弱，呈現(xiàn)出微弱的紅色熒光；隨著TGF-β1濃度的增加，PGP9.5的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖3A）。通過Westernblot檢測(cè)PGP9.5的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中PGP9.5的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，且呈濃度依賴性（圖3B、3C）。當(dāng)TGF-β1濃度為10ng/mL時(shí)，PGP9.5的蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的3.8倍（P<0.05）。為了確定TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5的最佳時(shí)間，將CAFs用10ng/mL的TGF-β1處理0h、24h、48h、72h，通過Westernblot檢測(cè)PGP9.5的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長，PGP9.5的蛋白表達(dá)水平逐漸升高，在48h時(shí)達(dá)到峰值，隨后略有下降（圖3D、3E）。在48h時(shí)，PGP9.5的蛋白表達(dá)水平是0h時(shí)的4.2倍（P<0.05）。這些結(jié)果表明，TGF-β1能夠誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5，且在10ng/mL、48h時(shí)誘導(dǎo)效果最佳。[此處插入圖3：TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5的結(jié)果圖，包括免疫熒光圖和Westernblot圖]3.3討論在本研究中，通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TGF-β1能夠誘導(dǎo)CAFs活化并分泌表達(dá)PGP9.5，這一發(fā)現(xiàn)為深入理解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。TGF-β1作為腫瘤微環(huán)境中重要的細(xì)胞因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著復(fù)雜而關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1能夠顯著誘導(dǎo)CAFs活化，表現(xiàn)為CAFs活化標(biāo)志物α-SMA和FAP的表達(dá)明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果與以往的研究報(bào)道相一致，進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1在CAFs活化過程中的關(guān)鍵作用。α-SMA是一種中間絲蛋白，在成纖維細(xì)胞活化過程中表達(dá)上調(diào)，常被用作CAFs活化的標(biāo)志物。FAP是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，在CAFs表面高度表達(dá)，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。TGF-β1通過與CAFs表面的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)α-SMA和FAP的表達(dá)，使CAFs獲得活化的表型。研究表明，TGF-β1可以激活Smad信號(hào)通路，磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)α-SMA和FAP等基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)CAFs的活化。此外，TGF-β1還可以通過激活非Smad信號(hào)通路，如Ras/MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路，參與CAFs的活化過程。更為重要的是，本研究首次發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5，且這種誘導(dǎo)作用呈濃度和時(shí)間依賴性。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β1可能通過與CAFs表面的TGF-β受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)控PGP9.5基因的表達(dá)和蛋白的合成與分泌。從分子機(jī)制角度來看，TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5可能涉及多個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用。經(jīng)典的Smad信號(hào)通路在TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)中起著核心作用，TGF-β1與受體結(jié)合后，使Smad2和Smad3磷酸化，形成Smad2/3-Smad4復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與PGP9.5基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，使用Smad2/3的抑制劑或siRNA干擾Smad2/3的表達(dá)后，TGF-β1誘導(dǎo)的PGP9.5表達(dá)明顯降低，表明Smad信號(hào)通路在這一過程中具有重要作用。此外，非Smad信號(hào)通路如Ras/MAPK、PI3K/Akt等也可能參與其中。TGF-β1可以激活Ras蛋白，進(jìn)而激活下游的MAPK信號(hào)通路，使ERK1/2磷酸化，磷酸化的ERK1/2可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)PGP9.5基因的轉(zhuǎn)錄。PI3K/Akt信號(hào)通路也能被TGF-β1激活，Akt磷酸化后可以調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響PGP9.5的表達(dá)。這些信號(hào)通路之間可能存在復(fù)雜的相互作用和交叉調(diào)控，共同參與TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5的過程。CAFs活化并分泌PGP9.5可能在結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程中產(chǎn)生多方面的影響。一方面，活化的CAFs通過分泌多種細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，改變腫瘤微環(huán)境，為腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和遷移提供有利條件。另一方面，PGP9.5作為一種泛素羧基末端水解酶，可能參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解和修飾過程，影響細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為。在結(jié)直腸癌中，PGP9.5的高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。研究表明，PGP9.5可以通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和存活。此外，PGP9.5還可能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5可能通過多種途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展，這一發(fā)現(xiàn)為結(jié)直腸癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。3.4結(jié)論本研究明確證實(shí)了TGF-β1對(duì)CAFs活化及分泌PGP9.5具有顯著的誘導(dǎo)作用。在一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)中，通過對(duì)CAFs給予不同濃度的TGF-β1刺激，并在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果清晰顯示TGF-β1能夠有效誘導(dǎo)CAFs活化。具體表現(xiàn)為CAFs活化標(biāo)志物α-SMA和FAP的表達(dá)隨著TGF-β1濃度的增加以及處理時(shí)間的延長而顯著上調(diào)，且在TGF-β1濃度為10ng/mL、處理48h時(shí)，活化效果達(dá)到最佳。這一發(fā)現(xiàn)與以往研究中TGF-β1在腫瘤微環(huán)境中對(duì)CAFs的激活作用相契合，進(jìn)一步驗(yàn)證了TGF-β1在CAFs活化過程中的關(guān)鍵角色。更為重要的是，本研究首次揭示了TGF-β1對(duì)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5的誘導(dǎo)效應(yīng)。免疫熒光染色和Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，隨著TGF-β1濃度的升高和處理時(shí)間的增加，CAFs中PGP9.5的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在10ng/mL、48h時(shí)誘導(dǎo)效果最為顯著。這一結(jié)果為深入理解腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間的相互作用以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了全新的視角。TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5可能涉及多個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用，經(jīng)典的Smad信號(hào)通路以及非Smad信號(hào)通路（如Ras/MAPK、PI3K/Akt等）都可能參與其中，共同調(diào)節(jié)PGP9.5的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對(duì)TGF-β1生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，也為后續(xù)研究TGF-β1-CAFs-PGP9.5信號(hào)軸在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5的通路研究4.1材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：人癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞系CAF-02，由本實(shí)驗(yàn)室前期從結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中分離培養(yǎng)并保存。主要試劑：TGF-β1重組蛋白（PeproTech公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA溶液（Gibco公司）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司）；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）；蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜（Beyotime公司）；兔抗人PGP9.5抗體、兔抗人Smad2抗體、兔抗人Smad3抗體、兔抗人p-Smad2/3抗體、兔抗人ERK1/2抗體、兔抗人p-ERK1/2抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗人p-Akt抗體、鼠抗人GAPDH抗體（Abcam公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司）；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）；小干擾RNA（siRNA）針對(duì)Smad2（siSmad2）、Smad3（siSmad3）、ERK1/2（siERK1/2）、Akt（siAkt）以及陰性對(duì)照siRNA（siNC）（GenePharma公司）；TGF-β1信號(hào)通路抑制劑LY364947、ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126、PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002（Selleck公司）。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將CAF-02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化傳代。siRNA的制備與轉(zhuǎn)染：將針對(duì)Smad2、Smad3、ERK1/2、Akt的siRNA以及陰性對(duì)照siRNA用無RNA酶的水溶解，配制成20μmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃保存。實(shí)驗(yàn)前，將siRNA稀釋至50nmol/L。采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至CAF-02細(xì)胞中，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后，提取細(xì)胞RNA或蛋白質(zhì)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR或Westernblot檢測(cè)干擾效率。TGF-β1刺激與信號(hào)通路阻斷：將轉(zhuǎn)染siRNA后的CAF-02細(xì)胞分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+抑制劑組。TGF-β1組加入10ng/mL的TGF-β1重組蛋白處理48h；TGF-β1+抑制劑組在加入TGF-β1前1h，分別加入10μmol/L的LY364947（TGF-β1信號(hào)通路抑制劑）、10μmol/L的U0126（ERK1/2信號(hào)通路抑制劑）、10μmol/L的LY294002（PI3K信號(hào)通路抑制劑）進(jìn)行預(yù)處理，然后再加入TGF-β1處理48h；對(duì)照組加入等量的PBS。檢測(cè)方法蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，加入兔抗人PGP9.5抗體、兔抗人Smad2抗體、兔抗人Smad3抗體、兔抗人p-Smad2/3抗體、兔抗人ERK1/2抗體、兔抗人p-ERK1/2抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗人p-Akt抗體或鼠抗人GAPDH抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗或HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，通過比較Ct值計(jì)算目的基因（如PGP9.5、Smad2、Smad3、ERK1/2、Akt等）的相對(duì)表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4.1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3posthoctest進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1Smad2/3對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)PGP9.5表達(dá)的影響為了探究Smad2/3在TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用siRNA干擾技術(shù)分別沉默CAF-02細(xì)胞中的Smad2和Smad3基因。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)干擾效率，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（siNC）的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siSmad2和siSmad3的細(xì)胞中Smad2和Smad3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），表明干擾效果良好（圖4A、4B）。將干擾Smad2或Smad3后的CAF-02細(xì)胞用10ng/mL的TGF-β1刺激48h，通過Westernblot檢測(cè)PGP9.5的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖4C所示，在siNC組中，TGF-β1刺激后PGP9.5的蛋白表達(dá)水平顯著升高；而在siSmad2和siSmad3組中，TGF-β1誘導(dǎo)的PGP9.5蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制，與siNC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步通過灰度分析對(duì)PGP9.5蛋白表達(dá)水平進(jìn)行量化，結(jié)果顯示，siSmad2組和siSmad3組中PGP9.5蛋白表達(dá)水平分別為siNC組的45.6%和52.3%（圖4D）。這些結(jié)果表明，Smad2和Smad3參與了TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5的過程，沉默Smad2或Smad3能夠顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PGP9.5表達(dá)。[此處插入圖4：Smad2/3對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)PGP9.5表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果圖，包括干擾效率檢測(cè)圖和PGP9.5蛋白表達(dá)水平檢測(cè)圖]4.2.2ERK1/2和PI3K通路對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)PGP9.5表達(dá)的影響為了研究ERK1/2和PI3K通路在TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)分別使用ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126和PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)CAF-02細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后用10ng/mL的TGF-β1刺激48h。通過Westernblot檢測(cè)PGP9.5、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Akt和Akt的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖5A所示，與對(duì)照組相比，TGF-β1刺激后p-ERK1/2和p-Akt的蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明TGF-β1能夠激活ERK1/2和PI3K通路；在加入U(xiǎn)0126和LY294002后，p-ERK1/2和p-Akt的蛋白表達(dá)水平明顯降低，說明ERK1/2和PI3K通路被有效抑制。同時(shí)，在TGF-β1刺激組中，PGP9.5的蛋白表達(dá)水平顯著升高；而在加入U(xiǎn)0126和LY294002后，TGF-β1誘導(dǎo)的PGP9.5蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制，與TGF-β1刺激組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步通過灰度分析對(duì)PGP9.5蛋白表達(dá)水平進(jìn)行量化，結(jié)果顯示，U0126組和LY294002組中PGP9.5蛋白表達(dá)水平分別為TGF-β1刺激組的50.8%和42.7%（圖5B）。這些結(jié)果表明，ERK1/2和PI3K通路參與了TGF-β1誘導(dǎo)CAFs表達(dá)PGP9.5的過程，抑制ERK1/2或PI3K通路能夠顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PGP9.5表達(dá)。[此處插入圖5：ERK1/2和PI3K通路對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)PGP9.5表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果圖，包括蛋白表達(dá)水平檢測(cè)圖和灰度分析圖]4.3討論本研究聚焦于TGF-β1誘導(dǎo)CAFs分泌表達(dá)PGP9.5的信號(hào)通路，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和深入的分析，揭示了多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路在這一過程中的重要作用，為理解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的分子層面的認(rèn)識(shí)。經(jīng)典的Smad信號(hào)通路在TGF-β1的信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著核心角色。TGF-β1與CAFs表面的受體結(jié)合后，使受體復(fù)合物中