1組織提取膠原細(xì)胞遷移實驗操作指南備、供試液和對照組樣品的制備、細(xì)胞制備YY/T1955-2025組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品膠原3.13.2較，以此計算細(xì)胞的遷移的程度。試驗通常需設(shè)定對照組和供試組,對照組包括陽性對照組和空白對照2％）鈣離子）、胰蛋白酶-EDTA（0.25、磷酸鹽緩沖液（P在2℃~8℃條件下充分振搖約2h，離心或者靜置去除吸附劑，取上清FBS，無菌環(huán)境下0.22μm濾5.4.6EGF母液（0.1mg/mL）：開瓶前4℃,4000rpm離心5min，加入適量恢復(fù)至常溫的0.1%BSA溶液，使終濃度為0.1mg/mL。輕輕混勻溶解EGF并于超低溫冰箱保存。供試液一般宜在測試的當(dāng)天配置，必要時可提前1天配制并在2℃~8℃冰箱儲存。6.2供試液的制備受試物為可溶性的組織提取膠原蛋白固體時，稱取適量受試物，加入0.1mol/L的醋酸溶液，使受試物充分溶解，溶解后的終濃度為1mg/mL～受試物為組織提取膠原蛋白凝膠或溶液時，參照上述方法進(jìn)行稀釋，使終濃度為1mg/mL~3推薦使用表皮生長因子（Animal-FreeRecombinantHumanEGF）作為陽從-18℃或以下冰箱中取出一管經(jīng)分裝的EGF儲存液（10μg/mL于2℃~8℃冰箱放置10min使其徹底溶解，輕輕吹打混勻，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至5ng/mL～10ng/mL。陽性對照應(yīng)儲存于2℃~人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是構(gòu)成皮膚的其中一種主要細(xì)胞。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（Hacat細(xì)胞）適用于評價終產(chǎn)品使用部位為皮膚表面的組織提取膠原蛋白的細(xì)7.2細(xì)胞來源人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞），編號：KCB200442YJ，購7.3細(xì)胞代次按照附錄A進(jìn)行HaCaT細(xì)胞去分化培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇、用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成密度為3×105cells/mL的8.2細(xì)胞培養(yǎng)板畫線將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔，按照上中下8.3細(xì)胞種板CO2條件下培養(yǎng)約24h。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板中央?yún)^(qū)域的細(xì)胞匯合度約80%～90%,且細(xì)胞分布均勻、無明顯堆疊，可進(jìn)行下述步驟，否則應(yīng)重新準(zhǔn)備細(xì)胞懸液并種板培養(yǎng)。8.4劃痕制備劃痕，劃痕寬度0.6mm±0.2mm，盡量使劃痕寬度保持一致，深度達(dá)到孔底，確保劃痕區(qū)域細(xì)胞完4定的時間（如24h或48h）。每種濃度的供試液至少分別設(shè)置3個復(fù)孔。特定的時間（如24h或48h）。陽性對照和空白對照至少分別設(shè)置3個復(fù)孔。8.7特定時間劃痕圖像收集取培養(yǎng)特定時間后的細(xì)胞，在顯微鏡下拍照（拍照視野如圖1所示），記錄培養(yǎng)特定時間后的A0——0h時的劃痕面積;At——經(jīng)過特定時間后的劃痕面積。9結(jié)果判定5a)產(chǎn)品名稱、型號或規(guī)格、生產(chǎn)批號等產(chǎn)品信c)記錄試驗細(xì)胞的代次和培養(yǎng)條6細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞間連接緊密，呈現(xiàn)多層生長態(tài)勢，并逐漸形成島HaCaT細(xì)胞為深入研究細(xì)胞增殖、遷移、分化以及相關(guān)信號通A.2儀器與試劑A.2.1儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、細(xì)胞培養(yǎng)A.2.2耗材A.2.3試劑無鈣離子）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、谷氨酰胺、鈣離A.3試劑配制A.3.1去鈣離子血清：同5.4.3。A.3.4凍存液：按9:1的體積比將去鈣離子血清和DMSO混合均勻。A.4HaCaT細(xì)胞去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)A.4.1HaCaT細(xì)胞按照供應(yīng)商提供的說明書進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的匯合程度在7080%顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、開始脫落時，加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化。注：建議T75培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞密度為1.0×106～1.5×106。7圖A.1b）去分化過程中的HaCaT細(xì)胞狀態(tài)：低鈣培養(yǎng)環(huán)境下持續(xù)觀察細(xì)圖A.1c）去分化HaCaT細(xì)胞狀態(tài)：細(xì)待HaCaT細(xì)胞去分化狀態(tài)穩(wěn)定后，按照8將凍存的去分化HaCaT細(xì)胞迅速置于37℃水浴