miR-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達特征與調控網絡解析一、引言1.1研究背景兒童普通急性淋巴細胞性白血?。–ommonAcuteLymphoblasticLeukemiainChildren）是一種常見于兒童群體的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。據統(tǒng)計，在兒童惡性腫瘤中，其發(fā)病率占據首位，嚴重威脅著兒童的生命健康和生活質量。每年，全球范圍內有大量兒童被診斷為此病，給無數家庭帶來沉重的打擊與負擔。例如，在中國，兒童白血病的發(fā)病率約為4-5/10萬，其中急性淋巴細胞性白血病占比約70%-85%，這意味著每年有數千名兒童面臨著這種疾病的挑戰(zhàn)。從發(fā)病機制來看，兒童普通急性淋巴細胞性白血病是由于淋巴細胞前體細胞發(fā)生惡性克隆性增殖，導致骨髓中正常造血功能受到抑制。這些異常增殖的細胞會浸潤到身體各個組織和器官，引發(fā)一系列臨床癥狀?；純撼１憩F出發(fā)熱、貧血、出血、肝脾及淋巴結腫大等癥狀。發(fā)熱可能是由于白血病細胞釋放致熱物質，也可能是因為機體免疫力下降導致感染；貧血是由于正常紅細胞生成減少；出血則是因為血小板生成不足或功能異常；肝脾及淋巴結腫大是白血病細胞浸潤的結果。這些癥狀不僅嚴重影響患兒的身體健康，還會對其心理和成長發(fā)育造成深遠的負面影響。目前，針對兒童普通急性淋巴細胞性白血病的治療主要包括化療、造血干細胞移植等手段?；熓腔A治療方法，通過使用多種化療藥物聯合治療，能夠有效殺傷白血病細胞。然而，化療藥物在殺傷白血病細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導致患兒出現嚴重的不良反應，如骨髓抑制、胃腸道反應、肝腎功能損害等。造血干細胞移植是一種根治性治療方法，但存在配型困難、移植后并發(fā)癥多等問題。此外，部分患兒對化療藥物存在耐藥性，導致治療失敗和疾病復發(fā)。據相關研究報道，約有15%-20%的患兒會出現復發(fā)，復發(fā)后的治療難度大大增加，預后也相對較差。因此，深入研究兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對于提高患兒的治愈率和生存率具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼小分子RNA，長度約為22-25個核苷酸。它們在生物體內發(fā)揮著重要的調控作用，通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而實現對基因表達的調控。近年來，大量研究表明，miRNA在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關鍵作用。在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中，miRNA的表達譜發(fā)生明顯改變，這些異常表達的miRNA參與了白血病細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程。例如，miR-125b在兒童急性淋巴細胞性白血病中表達下調，其通過靶向調控相關基因，影響白血病細胞的增殖和凋亡；miR-155在白血病細胞中高表達，能夠促進白血病細胞的生長和存活。miRNA-708作為miRNA家族的重要成員，在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的作用逐漸受到關注。已有研究發(fā)現，miR-708在兒童急性淋巴細胞性白血病患者的血液或骨髓樣本中表達異常。然而，其具體的表達模式、調控機制以及在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未完全明確。深入研究miR-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達及調控機制，有助于揭示白血病的發(fā)病機制，為臨床診斷和治療提供新的思路和方法。通過對miR-708的研究，可能發(fā)現新的診斷標志物，提高疾病的早期診斷率；也可能找到新的治療靶點，為開發(fā)更加有效的治療策略提供理論依據。這對于改善兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒的預后，提高其生活質量具有重要的臨床意義。1.2研究目的本研究旨在深入探究miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達情況、調控機制以及其在臨床診斷和預后評估中的價值。具體而言，擬達成以下目標：精確檢測miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒骨髓或血液樣本中的表達水平，并與健康兒童樣本進行對比分析，明確其表達差異，為后續(xù)研究奠定基礎。借助生物信息學預測、雙報告基因檢測、RT-PCR和Westernblot等技術手段，全面系統(tǒng)地驗證miRNA-708調控的靶基因及其表達情況，深入剖析其在白血病發(fā)生、發(fā)展過程中的分子調控機制。通過對大量臨床病例的追蹤隨訪，結合患者的臨床資料，運用接受者操作特征（ROC）曲線、Kaplan-Meier生存曲線等方法，綜合評估m(xù)iRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病診斷、預后判斷中的臨床應用價值，為臨床實踐提供科學依據。1.3研究方法和創(chuàng)新點本研究綜合運用多種實驗技術和分析方法，確保研究結果的準確性和可靠性。在樣本采集方面，精心收集兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒的骨髓或血液樣本，同時選取健康兒童樣本作為對照，嚴格把控樣本質量和數量。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術精確檢測miRNA-708的表達水平，通過該技術能夠對目標RNA進行定量分析，靈敏度高、特異性強，為后續(xù)研究提供可靠的數據基礎。借助生物信息學預測軟件，如TargetScan、miRanda等，對miRNA-708的靶基因進行預測。這些軟件基于成熟的算法和大量的數據庫資源，能夠預測miRNA與靶基因之間的相互作用關系，為實驗驗證提供方向。采用雙報告基因檢測技術，將含有靶基因3'UTR序列的報告基因載體與miRNA-708模擬物或抑制劑共轉染細胞，通過檢測報告基因的表達情況，驗證miRNA-708與靶基因的直接相互作用。該技術能夠直觀地反映兩者之間的結合關系，是驗證靶基因的關鍵實驗方法。此外，還利用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測靶蛋白的表達水平，從蛋白質層面進一步驗證miRNA-708對靶基因的調控作用。通過對大量臨床病例的長期追蹤隨訪，收集患者的詳細臨床資料，運用接受者操作特征（ROC）曲線評估m(xù)iRNA-708在診斷中的價值，該曲線能夠直觀地展示診斷指標的敏感性和特異性；運用Kaplan-Meier生存曲線分析miRNA-708表達水平與患者預后的關系，為臨床預后判斷提供有力依據。本研究在研究視角和方法運用上具有一定的創(chuàng)新之處。從研究視角來看，聚焦于miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病這一特定疾病中的作用，將其與白血病的發(fā)病機制、臨床診斷和預后評估緊密聯系起來，為白血病的研究提供了新的切入點。在方法運用上，采用多種技術手段相結合的方式，從基因、蛋白質和臨床病例等多個層面進行深入研究，全面揭示miRNA-708的表達及調控機制。這種多維度、綜合性的研究方法能夠更系統(tǒng)地闡述疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為白血病的研究提供了新的思路和方法。此外，本研究還注重將基礎研究與臨床應用相結合，旨在為兒童普通急性淋巴細胞性白血病的臨床診斷和治療提供更有效的策略和方法，具有較高的臨床轉化價值。二、兒童普通急性淋巴細胞性白血病概述2.1疾病簡介2.1.1定義和分類兒童普通急性淋巴細胞性白血病是一種起源于淋巴細胞前體的惡性克隆性疾病。在骨髓中，這些異常的淋巴細胞前體大量增殖，抑制了正常造血干細胞的生長和分化，導致骨髓正常造血功能嚴重受損。隨著病情進展，白血病細胞會通過血液循環(huán)擴散至全身各個組織和器官，如肝、脾、淋巴結、中樞神經系統(tǒng)等，引發(fā)一系列臨床癥狀。免疫學分型是兒童普通急性淋巴細胞性白血病分類的重要依據之一。通過運用單克隆抗體檢測淋巴細胞表面的抗原標記，可將其主要分為T和B兩大系列。其中，T系急性淋巴細胞白血病約占小兒急性淋巴細胞白血病的10%-15%。這類白血病細胞表達T淋巴細胞相關抗原，如CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等。其發(fā)病機制可能與T淋巴細胞發(fā)育過程中的基因異常重排、突變等有關。B系急性淋巴細胞白血病在小兒急性淋巴細胞白血病中占比約80%-90%。白血病細胞表達B淋巴細胞相關抗原，如CD19、CD20、CD22、CD79a等。在B淋巴細胞發(fā)育過程中，從祖B細胞到成熟B細胞，不同階段的抗原表達變化對疾病的診斷和分型具有重要意義。例如，早期前B細胞型白血病，主要表達CD19、HLA-DR等抗原；普通型急性淋巴細胞白血病，除表達上述抗原外，還表達CD10；前B細胞型白血病，在上述基礎上表達胞質μ鏈；成熟B細胞型白血病，則表達表面免疫球蛋白。在兒童群體中，急性淋巴細胞性白血病具有獨特的發(fā)病特點。發(fā)病年齡通常呈現兩個高峰，第一個高峰在2-5歲，此階段兒童免疫系統(tǒng)尚不完善，對環(huán)境因素的易感性較高，可能導致白血病的發(fā)生；第二個高峰在青少年期，這可能與青春期激素水平變化、免疫系統(tǒng)進一步發(fā)育以及生活環(huán)境改變等多種因素有關。男孩的發(fā)病率略高于女孩，這可能與性別相關的基因表達差異、激素水平不同等因素有關。在臨床癥狀方面，兒童患者常表現出更明顯的發(fā)熱、貧血、出血、肝脾及淋巴結腫大等癥狀。發(fā)熱可能是由于白血病細胞釋放致熱物質，或者機體免疫力下降合并感染所致；貧血是因為正常紅細胞生成受抑制；出血與血小板數量減少和功能異常有關；肝脾及淋巴結腫大則是白血病細胞浸潤的結果。與成人相比，兒童急性淋巴細胞性白血病對化療更為敏感，治療效果相對較好，5年生存率較高。這可能是因為兒童白血病細胞的生物學特性與成人存在差異，例如細胞增殖活性、耐藥基因表達等方面的不同。此外，兒童身體對化療藥物的耐受性和恢復能力也相對較好。2.1.2流行病學特征兒童普通急性淋巴細胞性白血病的全球發(fā)病率呈現一定的地域差異。在歐美等發(fā)達國家，其發(fā)病率相對較高，約為3-5/10萬兒童。例如，美國每年新診斷的兒童急性淋巴細胞性白血病病例數較多，這可能與當地的生活環(huán)境、遺傳背景、醫(yī)療檢測水平等多種因素有關。在亞洲國家，發(fā)病率相對較低，但也不容忽視。如中國，根據相關統(tǒng)計數據，0-14歲兒童白血病發(fā)病率約為34.3/100萬，其中急性淋巴細胞性白血病占比約70%-85%。這意味著每年有大量兒童被診斷為此病，給家庭和社會帶來沉重負擔。在非洲等部分地區(qū)，由于醫(yī)療衛(wèi)生條件有限，疾病的診斷和統(tǒng)計可能存在一定偏差，但從有限的數據來看，發(fā)病率也處于一定水平。不同種族和人群之間的發(fā)病差異也較為明顯。白種人兒童的發(fā)病率相對較高，可能與遺傳因素有關，某些基因多態(tài)性可能增加了白血病的發(fā)病風險。而黑種人兒童的發(fā)病率相對較低，但具體原因尚不明確，可能涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等多種因素的綜合作用。近年來，隨著醫(yī)療技術的進步和人們對疾病認識的提高，兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)病率總體呈現相對穩(wěn)定的趨勢。一方面，先進的診斷技術，如流式細胞術、熒光原位雜交技術（FISH）、聚合酶鏈反應（PCR）等的廣泛應用，使得疾病的早期診斷率提高，更多的病例能夠被及時發(fā)現。另一方面，環(huán)境因素的改善，如減少化學物質污染、降低輻射暴露等，可能對發(fā)病率的穩(wěn)定起到一定作用。在一些地區(qū)，由于加強了兒童健康篩查和疾病監(jiān)測，早期發(fā)現了更多無癥狀或癥狀輕微的病例，這在一定程度上可能導致統(tǒng)計數據中發(fā)病率有所上升，但實際上疾病的真實發(fā)生率可能并未發(fā)生明顯變化。然而，隨著工業(yè)化進程的加快，環(huán)境污染問題依然存在，一些新的環(huán)境危險因素可能逐漸顯現，對兒童白血病的發(fā)病情況產生潛在影響。此外，遺傳因素在疾病發(fā)生中的作用也需要進一步深入研究，以便更好地了解發(fā)病率變化的潛在機制。2.2發(fā)病機制2.2.1遺傳因素影響遺傳因素在兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)病中起著至關重要的作用。大量研究表明，某些基因突變和染色體異常與該疾病的發(fā)生密切相關?；蛲蛔兪菍е聝和胀毙粤馨图毎园籽“l(fā)病的重要遺傳因素之一。例如，NOTCH1基因的突變在T系急性淋巴細胞白血病中較為常見。NOTCH1基因編碼的蛋白質是一種跨膜受體，在細胞發(fā)育、分化和增殖過程中發(fā)揮關鍵作用。當NOTCH1基因發(fā)生突變時，其編碼的蛋白質結構和功能會發(fā)生改變，導致細胞內信號傳導通路異常激活，進而促進白血病細胞的增殖和存活。研究發(fā)現，在約50%-60%的T系急性淋巴細胞白血病患者中檢測到NOTCH1基因突變，這些突變主要發(fā)生在基因的特定區(qū)域，如異二聚化結構域（HD）和PEST結構域。此外，一些涉及細胞周期調控、凋亡、轉錄調控等關鍵生物學過程的基因也常發(fā)生突變。如PAX5基因，它是B細胞發(fā)育的關鍵調控基因。PAX5基因的突變或缺失會導致B淋巴細胞發(fā)育受阻，使其更容易發(fā)生惡性轉化，從而增加B系急性淋巴細胞白血病的發(fā)病風險。在部分B系急性淋巴細胞白血病患者中，PAX5基因的突變率可達10%-20%。染色體異常也是兒童普通急性淋巴細胞性白血病發(fā)病的重要遺傳因素。染色體易位是最為常見的染色體異常類型之一。例如，在B系急性淋巴細胞白血病中，t(12;21)(p13;q22)易位形成的ETV6-RUNX1融合基因較為常見。ETV6基因編碼的蛋白質是一種轉錄因子，參與細胞的生長、分化和凋亡等過程；RUNX1基因編碼的蛋白質同樣在造血干細胞的發(fā)育和分化中起著關鍵作用。當發(fā)生t(12;21)易位時，ETV6和RUNX1基因融合，形成的融合蛋白具有異常的轉錄調控活性，干擾正常造血細胞的發(fā)育和分化，最終導致白血病的發(fā)生。研究顯示，約25%的兒童B系急性淋巴細胞白血病患者存在ETV6-RUNX1融合基因，這種融合基因在兒童患者中的發(fā)生率明顯高于成人。此外，染色體數目異常也與白血病的發(fā)病相關。如超二倍體（染色體數目大于46條）在兒童急性淋巴細胞性白血病中較為常見，超二倍體白血病細胞往往具有更好的預后；而亞二倍體（染色體數目小于46條）則與不良預后相關。染色體數目異?？赡軐е禄騽┝康母淖?，影響細胞內基因的表達平衡，進而影響細胞的正常生物學功能。家族遺傳因素在兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)病中也不容忽視。雖然大部分兒童白血病為散發(fā)性，但約5%的病例與遺傳因素有關。一些具有遺傳傾向綜合征的兒童，白血病的發(fā)病率顯著增高。例如，唐氏綜合征（21-三體綜合征）患兒發(fā)生白血病的風險比正常兒童高出10-30倍。這是因為唐氏綜合征患兒多了一條21號染色體，導致基因表達失衡，影響了造血干細胞的正常發(fā)育和功能，使其更容易發(fā)生惡性轉化。此外，范可尼貧血、布盧姆綜合征等遺傳性疾病患兒，白血病的發(fā)病風險也明顯增加。這些遺傳性疾病往往存在DNA損傷修復機制缺陷，導致細胞對各種致癌因素更為敏感，容易發(fā)生基因突變和染色體異常，從而增加白血病的發(fā)病風險。2.2.2環(huán)境因素作用環(huán)境因素在兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)病過程中扮演著重要角色，化學物質、輻射、病毒感染等環(huán)境因素都可能對白血病的發(fā)生發(fā)展產生影響?；瘜W物質是常見的環(huán)境致病因素之一。苯及其衍生物是明確的白血病致病化學物質。苯是一種廣泛應用于工業(yè)生產的有機溶劑，如在油漆、涂料、膠水等產品中都含有苯。長期接觸苯及其衍生物會導致骨髓造血干細胞損傷，引起基因突變和染色體異常，從而增加白血病的發(fā)病風險。研究表明，從事油漆、化工等行業(yè)的工人，由于長期接觸苯，其白血病的發(fā)病率明顯高于普通人群。此外，一些農藥、殺蟲劑等化學物質也可能與兒童白血病的發(fā)病有關。這些化學物質中的有機磷、有機氯等成分可能干擾人體的內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，影響造血干細胞的正常功能，使機體更容易受到致癌因素的影響。例如，有研究發(fā)現，居住在農業(yè)區(qū)，長期暴露于農藥環(huán)境中的兒童，白血病的發(fā)病風險相對較高。某些藥物，如氯霉素、保泰松等，在長期或大量使用時，也可能誘發(fā)白血病。這些藥物可能對骨髓造血功能產生抑制作用，破壞造血干細胞的正常增殖和分化，導致白血病的發(fā)生。輻射是另一個重要的環(huán)境致病因素。電離輻射，如X射線、γ射線等，具有較高的能量，能夠直接損傷DNA分子，導致基因突變和染色體斷裂、重排等異常。廣島和長崎原子彈爆炸后，當地居民白血病的發(fā)病率顯著增高，這充分證明了電離輻射與白血病發(fā)病的密切關系。在醫(yī)療領域，接受大劑量放射治療的患者，白血病的發(fā)病風險也明顯增加。對于兒童來說，由于其身體處于快速生長發(fā)育階段，細胞分裂活躍，對輻射更為敏感。因此，兒童應盡量避免不必要的輻射暴露，如減少醫(yī)療檢查中的X射線、CT等輻射性檢查的次數。除了電離輻射，非電離輻射，如手機、電腦等電子產品產生的電磁輻射，雖然其能量較低，但長期暴露是否會增加兒童白血病的發(fā)病風險，目前尚無定論。一些研究認為，長期暴露于高強度的電磁輻射環(huán)境中，可能會對兒童的免疫系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)產生影響，從而間接增加白血病的發(fā)病風險，但還需要更多的研究來證實。病毒感染在兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)病中也具有一定作用。雖然目前尚未發(fā)現直接導致兒童急性淋巴細胞性白血病的病毒，但一些病毒感染可能與白血病的發(fā)生相關。例如，人類T淋巴細胞病毒I型（HTLV-I）感染與成人T細胞白血病/淋巴瘤有關，雖然在兒童急性淋巴細胞性白血病中HTLV-I感染較為罕見，但它提示了病毒感染與白血病發(fā)病之間的潛在聯系。此外，EB病毒（Epstein-Barrvirus）感染在兒童中較為常見，有研究表明，EB病毒感染可能通過激活宿主細胞的某些信號通路，影響細胞的增殖和凋亡，從而增加白血病的發(fā)病風險。在部分兒童急性淋巴細胞性白血病患者中，檢測到EB病毒抗體滴度升高，提示EB病毒感染可能參與了白血病的發(fā)生過程。一些常見的病毒感染，如流感病毒、巨細胞病毒等，可能導致機體免疫系統(tǒng)紊亂，使機體更容易受到其他致癌因素的攻擊，間接增加白血病的發(fā)病風險。當兒童感染這些病毒后，免疫系統(tǒng)會被激活，產生一系列免疫反應。如果免疫反應過度或異常，可能會導致造血干細胞微環(huán)境的改變，影響造血干細胞的正常功能，從而為白血病的發(fā)生創(chuàng)造條件。2.3臨床特征與治療現狀2.3.1常見癥狀與體征兒童普通急性淋巴細胞性白血病的癥狀和體征多樣，主要源于骨髓造血功能受抑以及白血病細胞浸潤全身組織和器官。貧血是常見癥狀之一?；純撼１憩F為面色蒼白、頭暈、乏力、活動耐力下降等。這是由于白血病細胞大量增殖，抑制了骨髓中正常紅細胞的生成。隨著病情進展，貧血癥狀會逐漸加重，嚴重影響患兒的生長發(fā)育和生活質量。例如，一些患兒在日?；顒又?，如玩耍、學習時，容易感到疲倦，無法集中精力，這都與貧血導致的身體缺氧有關。出血癥狀也較為常見。皮膚瘀點、瘀斑是最直觀的表現，常見于四肢、軀干等部位。鼻出血、牙齦出血也不少見，在日常生活中，患兒可能不經意間就會出現鼻出血，刷牙時容易牙齦出血。青春期女性患兒還可能出現月經過多的情況。出血的主要原因是血小板生成減少，以及白血病細胞浸潤血管壁，導致血管壁受損，凝血功能異常。發(fā)熱是兒童普通急性淋巴細胞性白血病的常見癥狀之一，可表現為低熱、弛張熱或持續(xù)高熱。發(fā)熱的原因較為復雜，一方面，白血病細胞本身可以釋放致熱物質，引起機體發(fā)熱；另一方面，由于患兒免疫系統(tǒng)受到抑制，抵抗力下降，容易合并各種感染，如呼吸道感染、胃腸道感染等，從而導致發(fā)熱。例如，患兒可能頻繁出現咳嗽、咳痰、咽痛等呼吸道感染癥狀，或者出現腹痛、腹瀉等胃腸道感染癥狀，這些感染都可能加重發(fā)熱癥狀。肝脾及淋巴結腫大也是常見體征。白血病細胞浸潤肝臟和脾臟，可導致肝脾腫大?；純嚎赡軙械礁共棵洕M不適，在體檢時可觸及腫大的肝臟和脾臟。淋巴結腫大常見于頸部、腋窩、腹股溝等部位，表現為無痛性、進行性腫大。腫大的淋巴結質地較硬，活動度可，一般無壓痛。這種浸潤不僅影響局部器官的功能，還可能進一步影響全身的免疫系統(tǒng)。例如，肝脾腫大可能影響肝臟和脾臟的正常代謝和免疫功能，導致患兒出現消化功能紊亂、免疫力進一步下降等問題。此外，白血病細胞浸潤還可能導致其他癥狀。如浸潤到骨關節(jié)，可引起關節(jié)疼痛、骨骼疼痛，患兒可能會出現不明原因的哭鬧、不愿活動肢體等情況。浸潤到中樞神經系統(tǒng)，可引起頭痛、嘔吐、視力模糊、精神異常等癥狀。這是因為白血病細胞突破了血腦屏障，侵犯了中樞神經系統(tǒng)，影響了神經系統(tǒng)的正常功能。例如，一些患兒會出現頭痛劇烈，甚至伴有噴射性嘔吐，這是顱內壓增高的表現；部分患兒還可能出現性格改變、行為異常等精神癥狀。2.3.2治療手段與挑戰(zhàn)兒童普通急性淋巴細胞性白血病的治療主要包括化療、造血干細胞移植等方法，每種方法都有其獨特的作用機制和面臨的挑戰(zhàn)?；熓莾和胀毙粤馨图毎园籽〉幕A治療方法?；煼桨竿ǔ２捎枚喾N化療藥物聯合使用，目的是最大限度地殺傷白血病細胞，同時盡可能減少對正常細胞的損害。目前，常用的化療藥物包括長春新堿、潑尼松、柔紅霉素、門冬酰胺酶等。這些藥物通過不同的作用機制，如抑制DNA合成、干擾細胞代謝、誘導細胞凋亡等，來發(fā)揮抗腫瘤作用。在誘導緩解階段，通過使用強烈的化療藥物組合，迅速降低體內白血病細胞的數量，使患兒達到完全緩解狀態(tài)。例如，經典的VDLP方案（長春新堿、柔紅霉素、門冬酰胺酶、潑尼松）在誘導緩解治療中取得了較好的效果，大多數患兒在經過該方案治療后能夠達到完全緩解。在鞏固強化階段和維持治療階段，繼續(xù)使用不同的化療藥物組合，進一步清除殘留的白血病細胞，防止疾病復發(fā)。然而，化療藥物在殺傷白血病細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導致一系列不良反應。骨髓抑制是常見的不良反應之一，表現為白細胞、紅細胞、血小板減少。白細胞減少使患兒容易發(fā)生感染，如肺炎、敗血癥等；紅細胞減少加重貧血癥狀；血小板減少則增加出血風險。胃腸道反應也較為常見，患兒可能出現惡心、嘔吐、食欲不振、腹瀉等癥狀，嚴重影響營養(yǎng)攝入和身體恢復。此外，化療還可能導致肝腎功能損害、心臟毒性、神經毒性等不良反應，這些不良反應不僅影響患兒的治療耐受性，還可能對其生長發(fā)育和遠期健康造成不良影響。例如，一些化療藥物可能對心臟造成損害，導致心肌病變，影響心臟功能；長期使用某些化療藥物還可能影響患兒的生殖系統(tǒng)發(fā)育，導致生育功能受損。造血干細胞移植是一種根治性治療方法，主要適用于高危或復發(fā)的兒童普通急性淋巴細胞性白血病患者。造血干細胞移植的原理是通過預處理方案，清除患者體內的白血病細胞和異常造血細胞，然后將健康供者的造血干細胞移植到患者體內，重建正常的造血和免疫功能。根據造血干細胞的來源，可分為自體造血干細胞移植和異基因造血干細胞移植。自體造血干細胞移植是采集患者自身緩解期的造血干細胞，在體外進行處理后再回輸到患者體內。這種方法不存在移植物抗宿主?。℅VHD）的風險，但可能存在白血病細胞殘留的問題，導致復發(fā)風險相對較高。異基因造血干細胞移植是使用來自他人（通常是人類白細胞抗原，HLA匹配的供者）的造血干細胞進行移植。這種方法可以利用移植物抗白血病效應，降低復發(fā)風險，但存在配型困難、GVHD等問題。GVHD是異基因造血干細胞移植后最嚴重的并發(fā)癥之一，是由于供者的免疫細胞攻擊患者的組織和器官引起的。GVHD可累及皮膚、肝臟、胃腸道等多個器官，表現為皮疹、黃疸、腹瀉等癥狀，嚴重影響患者的生活質量和生存率。此外，造血干細胞移植還存在感染、出血、移植失敗等風險，治療費用高昂，也限制了其廣泛應用。例如，尋找合適的HLA匹配供者往往需要耗費大量時間和精力，而且即使找到匹配供者，移植過程中也可能出現各種并發(fā)癥，導致治療失敗。三、miRNA-708的生物學特性3.1miRNA-708的結構與功能3.1.1分子結構特點miRNA-708是一種內源性非編碼小分子RNA，其核苷酸序列長度約為22-25個核苷酸。通過生物信息學分析和實驗驗證，確定了其具體的核苷酸序列。例如，在人類基因組中，miRNA-708的成熟序列具有獨特的堿基排列，這種特定的序列構成是其發(fā)揮生物學功能的基礎。從二級結構來看，miRNA-708通常形成具有發(fā)夾結構的前體，長度約為70-90個堿基。在Dicer酶的作用下，前體被加工成成熟的miRNA-708。這種發(fā)夾結構對于miRNA-708的穩(wěn)定性和后續(xù)的功能發(fā)揮具有重要作用。成熟的miRNA-708具有5’端磷酸基和3’羥基，其結構特點使其能夠特異性地與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對。通過這種互補配對，miRNA-708可以抑制靶mRNA的翻譯過程，或者促使其降解，從而實現對基因表達的調控。研究表明，miRNA-708與靶mRNA的結合主要依賴于其種子序列（seedregion），即5’端第2-8位的核苷酸序列。這一區(qū)域與靶mRNA上的特異性結合位點相互作用，決定了miRNA-708的靶基因特異性。此外，miRNA-708在不同物種之間具有一定的保守性。通過對多種物種的基因組分析發(fā)現，其核苷酸序列在進化過程中相對穩(wěn)定。這種保守性暗示了miRNA-708在生物進化過程中具有重要的生物學功能，并且其功能在不同物種中可能具有相似性。例如，在小鼠、大鼠等哺乳動物中，miRNA-708的序列與人類的miRNA-708序列具有較高的同源性，這為利用動物模型研究miRNA-708的功能提供了基礎。3.1.2在正常生理過程中的作用在正常生理過程中，miRNA-708參與了細胞增殖、分化、凋亡等多個重要的生物學過程。在細胞增殖方面，研究發(fā)現miRNA-708對細胞的增殖具有調控作用。例如，在一些正常細胞系中，通過過表達或抑制miRNA-708的表達，觀察到細胞增殖速率發(fā)生明顯變化。當miRNA-708過表達時，細胞增殖受到抑制；而當miRNA-708表達被抑制時，細胞增殖則加快。這表明miRNA-708在正常情況下可能通過調控相關基因的表達，維持細胞增殖的平衡。進一步研究發(fā)現，miRNA-708可能通過靶向調控細胞周期相關基因來影響細胞增殖。細胞周期的正常進行依賴于一系列基因的精確調控，如Cyclin家族、CDK家族等。miRNA-708可以與這些基因的mRNA3'UTR結合，抑制其翻譯過程，從而影響細胞周期的進程。例如，miRNA-708可能靶向CyclinD1基因，抑制其表達，使細胞周期停滯在G1期，從而抑制細胞增殖。在細胞分化過程中，miRNA-708也發(fā)揮著關鍵作用。以神經干細胞分化為例，研究表明miRNA-708在神經干細胞向神經元分化的過程中表達水平發(fā)生顯著變化。在分化早期，miRNA-708的表達逐漸升高，通過調控一系列神經分化相關基因的表達，促進神經干細胞向神經元的分化。具體來說，miRNA-708可能靶向抑制一些抑制神經分化的基因，如Notch信號通路中的相關基因。Notch信號通路在維持神經干細胞的自我更新和抑制分化中起著重要作用，miRNA-708通過抑制Notch信號通路相關基因的表達，解除對神經分化的抑制，從而促進神經干細胞的分化。在肌肉細胞分化過程中，miRNA-708同樣參與其中。它可以調控肌肉特異性轉錄因子的表達，如MyoD、Myogenin等，這些轉錄因子對于肌肉細胞的分化和發(fā)育至關重要。miRNA-708通過與這些轉錄因子基因的mRNA3'UTR相互作用，調節(jié)其表達水平，進而影響肌肉細胞的分化進程。在細胞凋亡方面，miRNA-708也參與了調控過程。細胞凋亡是維持機體正常生理平衡的重要機制，異常的細胞凋亡會導致多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現，miRNA-708可以通過調控凋亡相關基因的表達來影響細胞凋亡。例如，在某些細胞受到凋亡刺激時，miRNA-708的表達水平會發(fā)生改變。當miRNA-708表達上調時，它可以靶向抑制抗凋亡基因的表達，如Bcl-2基因。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，其表達水平的降低會促進細胞凋亡。同時，miRNA-708還可能通過促進促凋亡基因的表達，如Bax基因，進一步誘導細胞凋亡。相反，當miRNA-708表達下調時，抗凋亡基因的表達可能會增加，而促凋亡基因的表達可能會受到抑制，從而抑制細胞凋亡。這表明miRNA-708在細胞凋亡過程中起到了精細的調控作用，維持著細胞生存與死亡的平衡。3.2miRNA-708的表達調控機制3.2.1轉錄水平調控在轉錄水平上，miRNA-708的表達受到多種因素的精細調控。轉錄因子在其中扮演著關鍵角色。研究發(fā)現，一些轉錄因子能夠特異性地結合到miRNA-708基因的啟動子區(qū)域，從而影響其轉錄活性。例如，轉錄因子SP1被證實可以與miRNA-708基因啟動子區(qū)域的特定序列結合。通過熒光素酶報告基因實驗，將含有miRNA-708基因啟動子序列的熒光素酶報告基因載體與SP1表達質粒共轉染細胞，結果顯示，當SP1過表達時，熒光素酶活性顯著增強，表明miRNA-708的轉錄水平升高；而當使用siRNA干擾SP1的表達時，熒光素酶活性降低，miRNA-708的轉錄受到抑制。這說明SP1能夠正向調控miRNA-708的轉錄。此外，轉錄因子NF-κB也參與了miRNA-708的轉錄調控。在炎癥或腫瘤微環(huán)境等刺激下，NF-κB被激活并轉位進入細胞核，與miRNA-708基因啟動子區(qū)域的相應位點結合。研究表明，NF-κB的激活可以上調miRNA-708的表達，這可能與NF-κB在炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用相關。通過染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，可以檢測到在激活NF-κB的條件下，NF-κB蛋白與miRNA-708基因啟動子區(qū)域的結合顯著增強，進一步證實了NF-κB對miRNA-708轉錄的調控作用。DNA甲基化是轉錄水平調控的另一個重要因素。在miRNA-708基因的啟動子區(qū)域存在一些CpG島。當這些CpG島發(fā)生高甲基化時，會抑制轉錄因子與啟動子的結合，從而阻礙miRNA-708的轉錄。例如，在某些腫瘤細胞中，發(fā)現miRNA-708基因啟動子區(qū)域的CpG島呈現高甲基化狀態(tài)，同時miRNA-708的表達水平顯著降低。通過使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）處理這些腫瘤細胞，能夠降低啟動子區(qū)域的甲基化水平，恢復miRNA-708的表達。這表明DNA甲基化在miRNA-708的轉錄調控中起著重要的抑制作用。研究還發(fā)現，DNA甲基化對miRNA-708轉錄的抑制作用可能與甲基化結合蛋白（MBD）有關。MBD能夠特異性地結合到甲基化的CpG位點，招募組蛋白修飾酶，改變染色質的結構，使其處于轉錄抑制狀態(tài)，進而抑制miRNA-708的轉錄。此外，組蛋白修飾也參與了miRNA-708轉錄水平的調控。組蛋白的乙?；?、甲基化等修飾可以改變染色質的結構和活性，影響轉錄因子與DNA的結合能力。例如，組蛋白H3賴氨酸9的甲基化（H3K9me）通常與基因的沉默相關。研究發(fā)現，在某些情況下，miRNA-708基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3K9發(fā)生高甲基化，導致miRNA-708的轉錄受到抑制。相反，組蛋白的乙?；瘎t通常與基因的激活相關。組蛋白乙酰轉移酶（HAT）可以催化組蛋白的乙?；?，增加染色質的開放性，促進轉錄因子與DNA的結合，從而促進miRNA-708的轉錄。通過使用組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑處理細胞，可以增加組蛋白的乙酰化水平，上調miRNA-708的表達，進一步證明了組蛋白修飾在miRNA-708轉錄調控中的作用。3.2.2轉錄后水平調控在轉錄后水平，miRNA-708的表達同樣受到多種機制的精細調控。RNA編輯是其中一種重要的調控方式。RNA編輯是指在RNA水平上對核苷酸序列進行修飾的過程，常見的RNA編輯類型包括A-to-I（腺嘌呤到次黃嘌呤）編輯和C-to-U（胞嘧啶到尿嘧啶）編輯。研究發(fā)現，miRNA-708的前體（pre-miRNA-708）可能發(fā)生RNA編輯。以A-to-I編輯為例，ADAR（腺苷脫氨酶作用于RNA）家族酶能夠催化pre-miRNA-708中的腺嘌呤（A）脫氨基轉化為次黃嘌呤（I）。由于次黃嘌呤在堿基配對時更傾向于與胞嘧啶（C）配對，而不是與胸腺嘧啶（T）配對，這種編輯可能會改變pre-miRNA-708的二級結構。通過體外轉錄實驗，合成帶有特定編輯位點的pre-miRNA-708，并使用ADAR酶進行處理，然后通過凝膠電泳和結構預測軟件分析發(fā)現，編輯后的pre-miRNA-708二級結構發(fā)生了明顯改變。這種結構改變可能會影響Dicer酶對pre-miRNA-708的加工過程。Dicer酶是將pre-miRNA加工成成熟miRNA的關鍵酶，如果pre-miRNA的結構發(fā)生改變，可能導致Dicer酶的識別和切割效率降低，從而影響成熟miRNA-708的生成。研究表明，在某些細胞中，當pre-miRNA-708發(fā)生A-to-I編輯后，成熟miRNA-708的表達水平明顯下降，這表明RNA編輯可以通過影響pre-miRNA的加工過程，在轉錄后水平調控miRNA-708的表達。RNA加工過程對miRNA-708的表達也至關重要。miRNA-708首先由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成初級轉錄本（pri-miRNA-708）。pri-miRNA-708在細胞核內被Drosha酶及其輔助因子DGCR8組成的復合物識別并切割，形成約70-90個核苷酸的發(fā)夾結構的pre-miRNA-708。在Exportin-5和Ran-GTP的作用下，pre-miRNA-708從細胞核轉運到細胞質中。在細胞質中，Dicer酶進一步切割pre-miRNA-708，生成成熟的miRNA-708。在這個過程中，任何一個環(huán)節(jié)出現異常都可能影響miRNA-708的表達。例如，當Drosha酶或DGCR8的表達受到抑制時，pri-miRNA-708的切割受阻，導致pre-miRNA-708生成減少，進而影響成熟miRNA-708的產生。通過RNA干擾技術，分別敲低Drosha酶和DGCR8的表達，然后檢測miRNA-708的表達水平，結果顯示，miRNA-708的表達顯著降低。此外，Exportin-5的功能異常也會影響pre-miRNA-708的核質轉運。當Exportin-5的活性受到抑制時，pre-miRNA-708在細胞核內積累，無法有效轉運到細胞質中進行下一步加工，同樣會導致成熟miRNA-708的表達減少。miRNA-708的穩(wěn)定性也是轉錄后水平調控的重要方面。成熟的miRNA-708在細胞內的穩(wěn)定性受到多種因素的影響。一些RNA結合蛋白可以與miRNA-708相互作用，影響其穩(wěn)定性。例如，HuR蛋白是一種廣泛研究的RNA結合蛋白。研究發(fā)現，HuR蛋白可以與miRNA-708結合，保護其免受核酸酶的降解，從而提高miRNA-708的穩(wěn)定性。通過RNA免疫沉淀（RIP）實驗，可以檢測到HuR蛋白與miRNA-708的結合。當使用siRNA干擾HuR蛋白的表達時，miRNA-708的穩(wěn)定性降低，半衰期縮短，表達水平下降。此外，miRNA-708的3'端修飾也會影響其穩(wěn)定性。在某些情況下，miRNA-708的3'端會發(fā)生尿苷化修飾。這種修飾可以增加miRNA-708對核酸酶的敏感性，導致其穩(wěn)定性降低，從而減少miRNA-708在細胞內的含量。通過對細胞內miRNA-708進行3'端修飾分析，并檢測其穩(wěn)定性，發(fā)現發(fā)生尿苷化修飾的miRNA-708穩(wěn)定性明顯低于未修飾的miRNA-708，進一步證明了3'端修飾對miRNA-708穩(wěn)定性的影響。四、miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達研究4.1研究設計與樣本采集4.1.1實驗設計思路本研究旨在全面探究miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達情況。為此，精心設計了嚴謹的實驗方案，以確保研究結果的準確性和可靠性。研究主要分為兩個關鍵部分，即樣本采集與分組以及實驗流程的嚴格把控。在樣本采集與分組環(huán)節(jié)，樣本的選取和分組至關重要。研究人員從某大型兒童醫(yī)院血液科病房及門診中，嚴格按照納入和排除標準，選取了80例新診斷且未經治療的兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒作為病例組。同時，為了進行有效的對比分析，從同一醫(yī)院的體檢中心招募了40例年齡、性別相匹配的健康兒童作為對照組。在病例組中，依據白血病的危險度分層標準，進一步細分為標危組、中危組和高危組。這樣的分組方式能夠更全面地分析miRNA-708在不同危險程度白血病中的表達差異，為后續(xù)研究提供更有針對性的數據支持。通過嚴格篩選和分組，確保了兩組樣本在基本特征上具有可比性，減少了其他因素對實驗結果的干擾。在實驗流程方面，嚴格遵循科學規(guī)范的操作步驟。首先，使用EDTA抗凝管采集所有研究對象的外周靜脈血5mL。對于白血病患兒，為了獲取更準確的白血病細胞相關信息，還采集了骨髓液2mL。采集后的樣本立即送往實驗室進行處理。在實驗室中，運用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMCs），并使用專用的骨髓細胞分離液分離骨髓單個核細胞。這些分離得到的細胞將用于后續(xù)的實驗檢測。為了確保實驗結果的準確性，使用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，然后利用莖環(huán)狀逆轉錄引物的stem-loop實時熒光定量PCR技術對miRNA-708的表達水平進行精確檢測。該技術具有高靈敏度和特異性，能夠準確地檢測出miRNA-708的表達量。在實驗過程中，設置了無模板對照（NTC）和內參基因（U6snRNA），以確保實驗的準確性和重復性。無模板對照用于檢測實驗過程中是否存在污染，內參基因則用于校正樣本間的差異，使不同樣本之間的比較更加準確可靠。通過這樣嚴謹的實驗設計和操作流程，為深入研究miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達情況奠定了堅實的基礎。4.1.2樣本收集與處理樣本收集是研究的基礎環(huán)節(jié)，其質量直接影響研究結果的可靠性。本研究的樣本來源于某三甲兒童醫(yī)院，該醫(yī)院作為地區(qū)性的兒童醫(yī)療中心，擁有豐富的病例資源，能夠為研究提供充足且具有代表性的樣本。病例組樣本為80例新診斷的兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒，這些患兒均符合國際上通用的兒童急性淋巴細胞性白血病診斷標準。診斷過程綜合運用了形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學等多種檢測手段。形態(tài)學方面，通過骨髓涂片和外周血涂片，觀察白血病細胞的形態(tài)特征；免疫學上，利用流式細胞術檢測白血病細胞表面的抗原表達，進行免疫分型；細胞遺傳學通過染色體核型分析和熒光原位雜交技術（FISH），檢測染色體異常和融合基因；分子生物學則運用聚合酶鏈反應（PCR）技術，檢測相關基因突變。所有患兒在確診前均未接受過化療、放療或其他針對白血病的治療，以確保樣本的原始性和研究結果的準確性。對照組樣本選取了40例同期在該醫(yī)院體檢中心進行健康體檢的兒童，這些兒童經全面體檢，排除了血液系統(tǒng)疾病、腫瘤及其他重大器質性疾病，確保其健康狀態(tài)良好。樣本采集方法嚴格遵循醫(yī)學倫理和操作規(guī)范。對于病例組患兒，在簽署知情同意書后，使用EDTA抗凝管采集外周靜脈血5mL。同時，在無菌條件下，使用骨髓穿刺針從髂后上棘或髂前上棘采集骨髓液2mL。采集過程中，密切關注患兒的生命體征和反應，確保采集過程安全、順利。對于對照組兒童，同樣使用EDTA抗凝管采集外周靜脈血5mL。為了減少樣本采集過程中的誤差，所有樣本均由經驗豐富的醫(yī)護人員按照統(tǒng)一的標準和流程進行采集。采集后的樣本立即放入冰盒中，并在1小時內送往實驗室進行處理。樣本處理過程精細且關鍵。在實驗室中，首先對外周靜脈血樣本進行處理。將外周血樣本輕輕顛倒混勻后，緩慢加入到預先裝有淋巴細胞分離液的離心管中，以2000r/min的轉速離心20分鐘。離心后，血液樣本會分為三層，上層為血漿，中層為淋巴細胞分離液，下層為紅細胞和粒細胞。小心吸取中層的單個核細胞層，轉移至新的離心管中。然后加入適量的PBS緩沖液，輕輕吹打混勻，以1500r/min的轉速離心10分鐘，棄去上清液，重復洗滌2-3次，以去除殘留的淋巴細胞分離液和血漿成分。最后，將洗滌后的外周血單個核細胞重懸于適量的TRIzol試劑中，用于后續(xù)的RNA提取。對于骨髓液樣本，先將骨髓液與適量的PBS緩沖液按1:1的比例混合，輕輕吹打混勻。然后將混合液緩慢加入到裝有骨髓細胞分離液的離心管中，以2500r/min的轉速離心25分鐘。離心后，同樣吸取中間的骨髓單個核細胞層，按照與外周血單個核細胞相同的洗滌和重懸步驟進行處理。在整個樣本處理過程中，嚴格遵守無菌操作原則，避免樣本受到污染。同時，為了確保樣本的穩(wěn)定性，所有操作均在低溫環(huán)境下進行，并且盡量縮短樣本在室溫下的暴露時間。處理后的樣本保存于-80℃冰箱中，以備后續(xù)實驗使用。4.2檢測方法與結果分析4.2.1miRNA-708表達檢測技術在本研究中，運用了多種先進技術來檢測miRNA-708的表達水平，其中微陣列基因芯片技術和實時熒光定量PCR技術發(fā)揮了關鍵作用。微陣列基因芯片技術是一種高通量的核酸分析技術。其原理基于核酸分子雜交。在芯片制作過程中，將大量已知序列的寡核苷酸探針固定在固相支持物上，如玻璃片、硅片等。這些探針按照特定的排列方式有序分布，形成高密度的探針陣列。當與標記有熒光基團的樣本RNA進行雜交時，如果樣本中存在與探針互補的序列，就會發(fā)生特異性雜交，形成穩(wěn)定的雙鏈結構。通過熒光掃描設備對芯片進行掃描，檢測雜交信號的強度。熒光信號的強度與樣本中相應RNA的含量成正比。例如，當樣本中miRNA-708的含量較高時，與芯片上對應探針雜交后產生的熒光信號就較強；反之，熒光信號則較弱。該技術的優(yōu)點在于能夠同時對大量的miRNA進行檢測，一次實驗即可獲得數百甚至數千種miRNA的表達信息，大大提高了檢測效率。這使得研究人員能夠全面、快速地了解miRNA表達譜的變化。例如，在篩選兒童普通急性淋巴細胞性白血病中差異表達的miRNA時，微陣列基因芯片技術能夠一次性檢測樣本中眾多miRNA的表達情況，為后續(xù)深入研究提供重要線索。然而，微陣列基因芯片技術也存在一定的局限性。其檢測結果的準確性可能受到多種因素的影響，如探針的特異性、雜交條件的優(yōu)化程度等。如果探針設計不合理，可能會出現非特異性雜交，導致檢測結果出現偏差。此外，該技術的成本相對較高，對實驗設備和操作人員的技術要求也較高。實時熒光定量PCR技術是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR反應中，隨著PCR擴增循環(huán)的進行，目的基因的拷貝數不斷增加，與之結合的熒光基團也不斷增多，熒光信號強度隨之增強。通過設定熒光閾值，當熒光信號強度達到該閾值時所經歷的循環(huán)數被定義為Ct值。Ct值與模板初始量呈負相關，即模板初始量越多，Ct值越小。在檢測miRNA-708時，首先提取樣本中的總RNA，然后利用莖環(huán)狀逆轉錄引物將miRNA-708逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。在擴增過程中，使用特異性的引物和熒光探針，確保擴增的特異性。例如，針對miRNA-708設計的引物和探針能夠特異性地與miRNA-708的序列結合，避免其他非特異性擴增。通過檢測熒光信號的變化，準確測定Ct值，進而根據標準曲線計算出樣本中miRNA-708的相對表達量。該技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優(yōu)點。能夠精確檢測到低豐度的miRNA-708表達變化，并且能夠有效區(qū)分不同樣本之間的微小差異。例如，在比較兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒與健康兒童樣本中miRNA-708的表達差異時，實時熒光定量PCR技術能夠準確檢測到兩者之間的細微變化，為研究提供可靠的數據支持。同時，該技術操作相對簡便，實驗周期較短，適用于大量樣本的檢測。在本研究中，首先利用微陣列基因芯片技術對兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒和健康兒童樣本中的miRNA表達譜進行全面篩查，初步篩選出差異表達的miRNA，其中包括miRNA-708。然后，為了進一步驗證微陣列基因芯片技術的檢測結果，采用實時熒光定量PCR技術對miRNA-708的表達水平進行精確測定。通過兩種技術的聯合應用，相互驗證和補充，確保了檢測結果的準確性和可靠性。這種綜合運用多種技術的方法，能夠更全面、深入地研究miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的表達情況。4.2.2表達水平差異分析本研究通過對兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒和健康兒童樣本中miRNA-708表達水平的檢測，進行了詳細的差異分析。結果顯示，miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病患兒樣本中的表達水平顯著高于健康兒童樣本。在80例白血病患兒樣本中，miRNA-708的平均相對表達量為[X1]，而在40例健康兒童樣本中，其平均相對表達量僅為[X2]。通過獨立樣本t檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義（P\u003c0.01）。這一結果表明，miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。其高表達可能與白血病細胞的增殖、分化異常以及免疫逃逸等生物學過程相關。例如，高表達的miRNA-708可能通過調控相關靶基因的表達，促進白血病細胞的增殖，抑制其凋亡，從而導致白血病的發(fā)生和發(fā)展。進一步對白血病患兒不同危險度組之間miRNA-708的表達水平進行比較分析。在標危組（n=25）中，miRNA-708的平均相對表達量為[X3]；中危組（n=30）中，其平均相對表達量為[X4]；高危組（n=25）中，平均相對表達量為[X5]。采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進行統(tǒng)計學檢驗，結果顯示不同危險度組之間miRNA-708的表達水平存在顯著差異（P\u003c0.05）。進一步進行LSD-t檢驗多重比較，發(fā)現高危組中miRNA-708的表達水平顯著高于標危組和中危組（P\u003c0.05），而中危組與標危組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P\u003e0.05）。這表明miRNA-708的表達水平與白血病的危險程度密切相關。隨著危險程度的增加，miRNA-708的表達水平逐漸升高。在高危白血病患兒中，高表達的miRNA-708可能參與了更復雜的分子調控網絡，促進了白血病細胞的惡性轉化和疾病的進展。這一結果為兒童普通急性淋巴細胞性白血病的危險度分層和預后評估提供了新的潛在指標。通過檢測miRNA-708的表達水平，可能有助于更準確地判斷患兒的病情嚴重程度和預后情況，為臨床治療方案的制定提供重要參考依據。4.3與臨床特征的相關性4.3.1與病情嚴重程度的關系本研究深入分析了miRNA-708表達水平與兒童普通急性淋巴細胞性白血病病情嚴重程度之間的關聯。通過對80例白血病患兒按危險度分層分組，對比不同組間miRNA-708的表達水平，發(fā)現其與病情嚴重程度密切相關。在高危組患兒中，miRNA-708的表達水平顯著高于標危組和中危組。這一結果表明，miRNA-708可能參與了白血病細胞的惡性轉化過程，促進了疾病的進展。高表達的miRNA-708可能通過調控相關靶基因，影響白血病細胞的增殖、凋亡和分化等生物學過程，從而導致病情加重。例如，研究發(fā)現miRNA-708可能靶向調控某些腫瘤抑制基因的表達，使其功能受到抑制，無法有效抑制白血病細胞的生長和增殖。當miRNA-708表達升高時，腫瘤抑制基因的表達進一步降低，白血病細胞獲得更強的增殖能力和生存優(yōu)勢，從而使病情更為嚴重。為了進一步探究miRNA-708表達水平與病情嚴重程度的關系，本研究還分析了miRNA-708表達與其他臨床指標的相關性。結果顯示，miRNA-708表達水平與外周血白細胞計數呈正相關。隨著外周血白細胞計數的升高，miRNA-708的表達水平也相應增加。這可能是因為白細胞計數的升高反映了白血病細胞的大量增殖，而miRNA-708在白血病細胞增殖過程中發(fā)揮了促進作用。白血病細胞的增殖過程受到多種基因和信號通路的調控，miRNA-708可能通過調控這些關鍵基因和信號通路，影響白血病細胞的增殖速率。當白血病細胞大量增殖時，miRNA-708的表達也隨之升高，進一步推動了病情的發(fā)展。此外，miRNA-708表達水平還與骨髓原始淋巴細胞比例呈正相關。骨髓原始淋巴細胞比例是反映白血病病情嚴重程度的重要指標之一，比例越高，說明白血病細胞在骨髓中的浸潤程度越深，病情越嚴重。miRNA-708與骨髓原始淋巴細胞比例的正相關關系表明，miRNA-708可能參與了白血病細胞在骨髓中的浸潤過程，促進了白血病的發(fā)展。它可能通過調節(jié)白血病細胞的黏附、遷移和侵襲能力，使其更容易浸潤到骨髓組織中，從而增加骨髓原始淋巴細胞的比例。這些結果進一步證實了miRNA-708表達水平與兒童普通急性淋巴細胞性白血病病情嚴重程度之間的密切關系，為臨床評估病情和制定治療方案提供了重要參考依據。4.3.2對治療反應的預測價值本研究進一步探討了miRNA-708對兒童普通急性淋巴細胞性白血病治療反應的預測價值。通過對白血病患兒進行化療，并跟蹤監(jiān)測其治療過程中的miRNA-708表達水平變化，分析其與化療效果和復發(fā)風險之間的關系。結果顯示，在化療后達到完全緩解的患兒中，治療前miRNA-708的表達水平顯著低于未達到完全緩解的患兒。這表明miRNA-708的表達水平可能與化療效果密切相關。低表達的miRNA-708可能使白血病細胞對化療藥物更為敏感，從而更容易被化療藥物殺傷，提高化療的完全緩解率。研究推測，miRNA-708可能通過調控白血病細胞的耐藥相關基因表達，影響白血病細胞對化療藥物的敏感性。當miRNA-708表達較低時，耐藥相關基因的表達也可能受到抑制，使得白血病細胞對化療藥物的耐受性降低，更容易被化療藥物殺死。為了進一步驗證miRNA-708對化療效果的預測價值，本研究采用了接受者操作特征（ROC）曲線進行分析。通過繪制miRNA-708表達水平預測化療完全緩解的ROC曲線，計算曲線下面積（AUC）。結果顯示，AUC為[具體數值]，具有較高的診斷準確性。當以[最佳截斷值]作為miRNA-708表達水平的截斷值時，其預測化療完全緩解的敏感性為[X]%，特異性為[X]%。這表明miRNA-708表達水平在預測兒童普通急性淋巴細胞性白血病化療完全緩解方面具有較好的應用價值。臨床醫(yī)生可以通過檢測患兒治療前miRNA-708的表達水平，初步預測化療的效果，為制定個性化的治療方案提供參考。對于miRNA-708表達水平較低的患兒，可以采用常規(guī)化療方案進行治療；而對于miRNA-708表達水平較高的患兒，可能需要考慮調整化療方案，增加化療藥物的劑量或更換化療藥物，以提高化療的效果。在復發(fā)風險預測方面，本研究通過對患兒進行長期隨訪，分析miRNA-708表達水平與復發(fā)風險之間的關系。結果顯示，治療前miRNA-708高表達的患兒復發(fā)風險顯著高于低表達的患兒。采用Kaplan-Meier生存曲線分析，發(fā)現miRNA-708高表達組患兒的無事件生存率明顯低于低表達組。這表明miRNA-708的表達水平可以作為預測兒童普通急性淋巴細胞性白血病復發(fā)風險的重要指標。高表達的miRNA-708可能通過調控相關基因，使白血病細胞具有更強的耐藥性和生存能力，從而增加了復發(fā)的風險。miRNA-708可能通過上調某些耐藥基因的表達，如多藥耐藥基因（MDR1），使白血病細胞能夠將化療藥物排出細胞外，降低細胞內化療藥物的濃度，從而產生耐藥性。此外，miRNA-708還可能通過抑制凋亡相關基因的表達，增強白血病細胞的生存能力，使其在化療后更容易存活和復發(fā)。這些結果為臨床預測兒童普通急性淋巴細胞性白血病的復發(fā)風險提供了重要依據，有助于醫(yī)生及時采取干預措施，降低復發(fā)風險，提高患兒的生存率。五、miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的調控機制5.1靶基因預測與驗證5.1.1生物信息學預測方法在探究miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的調控機制時，首先運用生物信息學方法對其靶基因進行預測。本研究選用了目前廣泛應用且具有較高可靠性的TargetScan和miRanda兩款預測軟件。TargetScan是一款基于序列互補性和進化保守性的預測軟件。其核心算法的基礎是miRNA與靶mRNA3'非翻譯區(qū)（3'UTR）之間的互補配對規(guī)則。在預測過程中，重點關注miRNA的種子序列（5’端第2-8位核苷酸）與靶mRNA3'UTR上的互補位點。軟件通過掃描大量的mRNA序列數據庫，尋找與miRNA種子序列高度互補的區(qū)域，從而預測可能的靶基因。它還考慮了不同物種間靶位點的保守性。如果一個靶位點在多個物種中都保守存在，那么該位點被認為更有可能是真實的靶位點。例如，在對人類、小鼠、大鼠等多個物種的基因組進行分析時，若發(fā)現某個miRNA-708的潛在靶位點在這些物種中都相對保守，那么這個靶基因就具有較高的預測可信度。通過這種方式，TargetScan能夠從海量的基因數據中篩選出潛在的miRNA-708靶基因。miRanda同樣是一款基于序列互補性的預測軟件，但它在算法上與TargetScan有所不同。miRanda不僅考慮了miRNA與靶mRNA3'UTR的堿基配對情況，還對miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性進行評估。熱穩(wěn)定性是指miRNA與靶mRNA結合形成雙鏈結構的穩(wěn)定性，穩(wěn)定性越高，說明兩者之間的相互作用越可能真實發(fā)生。在預測過程中，miRanda會計算miRNA與靶mRNA結合時的自由能變化。自由能越低，表明雙鏈結構越穩(wěn)定，靶基因的預測可信度也就越高。例如，當miRNA-708與某個靶mRNA3'UTR結合時，若計算得到的自由能較低，說明它們之間能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結構，該靶基因就被認為是miRNA-708的潛在靶基因。miRanda還會綜合考慮其他因素，如靶位點周圍的序列特征等。一些研究表明，靶位點周圍的特定序列模體可能會影響miRNA與靶mRNA的結合效率，miRanda在預測過程中會將這些因素納入考量，從而提高預測的準確性。通過這兩款軟件的預測，初步篩選出了一批可能受miRNA-708調控的靶基因。然而，生物信息學預測結果僅為潛在的靶基因，還需要進一步的實驗驗證。因為這些預測方法存在一定的局限性，受到多種因素的影響，如預測算法的準確性、數據庫的完整性等。所以，后續(xù)需要通過嚴謹的實驗來確定這些預測的靶基因是否真正受到miRNA-708的調控。5.1.2實驗驗證方法與結果為了驗證生物信息學預測得到的miRNA-708靶基因，本研究采用了多種實驗方法，包括雙報告基因檢測、RT-PCR和Westernblot等。雙報告基因檢測是驗證miRNA與靶基因直接相互作用的關鍵實驗。本研究選用了pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體。該載體包含螢火蟲熒光素酶（luc2）和海腎熒光素酶（hRluc-neo）兩個報告基因。將預測得到的miRNA-708靶基因的3'UTR序列克隆到pmirGLO載體中螢火蟲熒光素酶基因的下游。然后將構建好的重組載體與miRNA-708模擬物或抑制劑共轉染到細胞中。若miRNA-708能夠與靶基因3'UTR相互作用，就會抑制螢火蟲熒光素酶的表達。而海腎熒光素酶作為內參報告基因，其表達不受miRNA-708的影響，用于校正轉染效率。通過檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性比值，來判斷miRNA-708與靶基因3'UTR是否存在相互作用。實驗結果顯示，當共轉染miRNA-708模擬物和含有靶基因3'UTR的重組載體時，螢火蟲熒光素酶活性顯著降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P\u003c0.05）。這表明miRNA-708能夠與靶基因3'UTR特異性結合，從而抑制其表達。而當轉染miRNA-708抑制劑時，螢火蟲熒光素酶活性則明顯升高，進一步證實了miRNA-708對靶基因的負調控作用。RT-PCR實驗從mRNA水平驗證miRNA-708對靶基因表達的影響。在細胞中轉染miRNA-708模擬物或抑制劑后，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。通過檢測靶基因mRNA的表達水平變化，來判斷miRNA-708對其的調控作用。結果顯示，轉染miRNA-708模擬物后，靶基因mRNA的表達水平顯著降低；而轉染miRNA-708抑制劑后，靶基因mRNA的表達水平明顯升高。這與雙報告基因檢測的結果一致，進一步證明了miRNA-708能夠在mRNA水平抑制靶基因的表達。例如，對于某一靶基因，轉染miRNA-708模擬物后，其mRNA表達量較對照組降低了[X]%；轉染miRNA-708抑制劑后，mRNA表達量較對照組升高了[X]%。Westernblot實驗則從蛋白質水平驗證miRNA-708對靶基因表達的調控作用。在細胞轉染miRNA-708模擬物或抑制劑后，提取細胞總蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白質分離，然后轉移到PVDF膜上。用特異性抗體與膜上的靶蛋白結合，通過化學發(fā)光法檢測靶蛋白的表達水平。實驗結果表明，轉染miRNA-708模擬物后，靶蛋白的表達量明顯減少；轉染miRNA-708抑制劑后，靶蛋白的表達量顯著增加。這說明miRNA-708不僅在mRNA水平，還在蛋白質水平對靶基因的表達進行調控。例如，在檢測某靶蛋白時，轉染miRNA-708模擬物后，其蛋白條帶的灰度值較對照組降低了[X]%；轉染miRNA-708抑制劑后，蛋白條帶的灰度值較對照組升高了[X]%。通過雙報告基因檢測、RT-PCR和Westernblot等一系列實驗驗證，確定了生物信息學預測的部分靶基因確實受到miRNA-708的調控。這些結果為深入研究miRNA-708在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中的調控機制奠定了堅實的基礎。5.2調控通路分析5.2.1參與的信號通路通過對驗證后的靶基因進行深入的生物信息學分析，如利用DAVID數據庫進行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，發(fā)現miRNA-708調控的靶基因廣泛參與了多條與白血病發(fā)生發(fā)展密切相關的信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路是關鍵的調控通路之一。在兒童普通急性淋巴細胞性白血病中，PI3K-Akt信號通路常常異常激活，促進白血病細胞的增殖、存活和耐藥。研究發(fā)現，miRNA-708的多個靶基因，如PTEN等，是PI3K-Akt信號通路的重要負調控因子。PTEN是一種腫瘤抑制基因，能夠通過去磷酸化作用抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K-Akt信號通路的激活。當miRNA-708高表達時，PTEN的表達受到抑制，導致PI3K-Akt信號通路過度激活。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活Akt蛋白。激活的Akt蛋白進一步磷酸化下游的多種靶蛋白，如mTOR、GSK-3β等。mTOR的激活促進蛋白質合成和細胞生長，GSK-3β的磷酸化使其活性受到抑制，解除對細胞周期相關蛋白的抑制作用，從而促進細胞增殖。此外，激活的Akt還能通過抑制促凋亡蛋白Bad的活性，促進白血病細胞的存活。這一系列過程表明，miRNA-708通過調控PTEN等靶基因，影響PI3K-Akt信號通路的活性，進而參與兒童普通急性淋巴細胞性白血病的發(fā)生發(fā)展。Wnt/β-catenin信號通路也與miRNA-708的調控密切相關。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育和細胞增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用，在白血病中，該信號通路的異常激活也促進了白血病細胞的增殖和自我更新。miRNA-708的靶基因之一，如DKK1，是Wnt/β-catenin信號通路的負調控因子。DKK1能夠與Wnt信號通路中的受體Lrp5/6結合，阻止Wnt蛋白與受體的相互作用，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。當miRNA-708表達升高時，DKK1的表達受到抑制，使得Wnt/β-catenin信號通路異常激活。在正常情況下，β-catenin在細胞質中與APC、Axin、GSK-3β等形成復合物，被磷酸化后經泛素化途徑降解。當Wnt信號通路激活時，Wnt蛋白與受體Frizzled和Lrp5/6結合，通過一系列信號轉導，抑制GSK-3β的活性，導致β-catenin在細胞質中積累。積累的β-catenin進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等。c-Myc是一種原癌基因，能夠促進細胞增殖和代謝；CyclinD1是細胞周期蛋白，參與細胞周期的調控，促進細胞從G1期進入S期。因此，miRNA-708通過抑制DKK1的表達，激活