PPCn調(diào)控HIF-2α促進腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移的作用及分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義腎癌，作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，腎癌約占成人惡性腫瘤的2%-3%，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率僅次于膀胱癌。在中國，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，腎癌的發(fā)病率同樣呈顯著上升態(tài)勢，已成為威脅人們健康的重要疾病之一。腎癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，錯過了最佳的手術(shù)治療時機。對于晚期腎癌患者，傳統(tǒng)的化療和放療效果往往不盡人意，患者的5年生存率較低，預(yù)后較差。因此，深入探究腎癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和治療策略，已成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的迫切需求。在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中，低氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF-2α）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。HIF-2α是一種在缺氧環(huán)境下穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)控一系列與腫瘤細胞增殖、血管生成、代謝重編程以及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明，在腎癌組織中，HIF-2α的表達水平顯著高于正常腎組織，且其表達水平與腎癌的分期、分級以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。抑制HIF-2α的活性或表達，能夠有效抑制腎癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，延長患者的生存期。因此，HIF-2α已成為腎癌治療的重要靶點之一。近年來，隨著對腎癌發(fā)病機制研究的不斷深入，越來越多的分子被發(fā)現(xiàn)參與了腎癌的發(fā)生發(fā)展過程，其中蛋白酶C亞基（PPCn）與HIF-2α之間的調(diào)控關(guān)系逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，PPCn能夠通過多種信號通路對HIF-2α的表達和活性進行調(diào)控，進而影響腎癌細胞的生物學(xué)行為。然而，目前關(guān)于PPCn調(diào)控HIF-2α的具體分子機制以及其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全明確。本研究旨在深入探究PPCn調(diào)控HIF-2α促進腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移的作用和機制，為腎癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。通過對PPCn和HIF-2α之間相互作用的研究，有望揭示腎癌發(fā)生發(fā)展的新機制，為開發(fā)更加有效的腎癌治療策略提供新思路。這不僅有助于提高腎癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量，還將對腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展產(chǎn)生積極的推動作用，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著對腎癌發(fā)病機制研究的不斷深入，HIF-2α在腎癌中的作用成為了研究熱點。大量研究表明，HIF-2α在腎癌組織中高表達，并且與腎癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。在腎癌的發(fā)生過程中，HIF-2α能夠通過調(diào)控細胞周期相關(guān)基因的表達，促進腎癌細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α可以上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，從而推動細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。在腎癌的轉(zhuǎn)移方面，HIF-2α能夠誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強腎癌細胞的遷移和侵襲能力。通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達，HIF-2α促使腎癌細胞獲得間質(zhì)細胞的特性，更容易突破基底膜，進入血液循環(huán)，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。在針對HIF-2α的治療研究中，也取得了一定的進展。小分子抑制劑Belzutifan作為一種新型的HIF-2α抑制劑，在臨床試驗中展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。一項III期臨床試驗結(jié)果顯示，Belzutifan用于治療接受過PD-(L)1藥物和抗VEGF藥物治療的晚期腎細胞癌患者，與依維莫司相比，顯著降低了患者的疾病進展或死亡風(fēng)險，客觀緩解率也有顯著提高。這一研究結(jié)果為晚期腎癌的治療提供了新的選擇，也進一步證實了HIF-2α作為腎癌治療靶點的有效性。關(guān)于PPCn在腎癌中的研究相對較少，但已有研究表明其在腫瘤細胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PPCn在多種腫瘤組織中表達異常，并且與腫瘤的惡性程度相關(guān)。在乳腺癌細胞中，PPCn的高表達與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強有關(guān)。通過調(diào)控PPCn的表達，可以影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能與PPCn調(diào)節(jié)細胞骨架的重構(gòu)以及相關(guān)信號通路的激活有關(guān)。在肝癌細胞中，PPCn參與了細胞增殖和凋亡的調(diào)控過程。沉默PPCn的表達可以抑制肝癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并且影響相關(guān)凋亡蛋白的表達水平，如Bcl-2、Bax等。在腎癌領(lǐng)域，目前對于PPCn與HIF-2α之間的調(diào)控關(guān)系研究尚處于起步階段。雖然已有研究提示PPCn可能參與了HIF-2α的調(diào)控過程，但具體的分子機制仍不清楚。部分研究初步表明，PPCn可能通過某種信號通路間接影響HIF-2α的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄活性，但其中涉及的具體信號分子和作用環(huán)節(jié)尚未明確。在腎癌細胞系中，通過干擾PPCn的表達，觀察到HIF-2α的蛋白水平發(fā)生了變化，然而這種變化是如何發(fā)生的，是否存在其他中間調(diào)節(jié)因子，以及這種調(diào)控關(guān)系對腎癌細胞生物學(xué)行為的具體影響，都有待進一步深入研究。總體而言，目前對于HIF-2α在腎癌中的作用機制和治療研究取得了一定成果，但仍存在許多未解決的問題，如HIF-2α的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進一步完善，針對HIF-2α的治療耐藥機制也有待深入探究。而PPCn在腎癌中的研究還較為匱乏，尤其是PPCn調(diào)控HIF-2α的具體分子機制以及對腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移的影響，目前還存在大量的研究空白。填補這些空白，對于深入理解腎癌的發(fā)病機制，開發(fā)更加有效的治療策略具有重要意義。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入剖析PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移的影響，明確二者之間的調(diào)控關(guān)系及分子機制，為腎癌治療提供理論基礎(chǔ)與潛在靶點，具體研究內(nèi)容如下：PPCn和HIF-2α在腎癌組織及細胞系中的表達特征研究：收集腎癌患者的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，運用免疫組織化學(xué)、Westernblot、實時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測PPCn和HIF-2α在蛋白和mRNA水平的表達情況，分析其表達與腎癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤分期、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性。同時，選取多種腎癌細胞系，如786-O、ACHN等，檢測PPCn和HIF-2α的表達水平，并與正常腎小管上皮細胞系進行對比，明確二者在腎癌細胞中的表達特點。PPCn對腎癌細胞生長和轉(zhuǎn)移能力的影響研究：通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)和過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，構(gòu)建PPCn低表達和高表達的腎癌細胞模型。利用CCK8法檢測細胞增殖能力，繪制細胞生長曲線，觀察PPCn表達改變對腎癌細胞增殖速度的影響。采用細胞劃痕實驗和Transwell實驗，評估細胞的遷移和侵襲能力，分析PPCn對腎癌細胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。此外，通過裸鼠成瘤實驗，將構(gòu)建好的腎癌細胞模型注射到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長情況和轉(zhuǎn)移情況，進一步驗證PPCn在體內(nèi)對腎癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響。PPCn調(diào)控HIF-2α的分子機制研究：運用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，驗證PPCn與HIF-2α之間是否存在直接相互作用，并確定相互作用的結(jié)構(gòu)域。通過蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）和實時熒光定量PCR，檢測在PPCn表達改變的情況下，HIF-2α的蛋白穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄水平以及相關(guān)上游調(diào)控因子和下游靶基因的表達變化，探索PPCn調(diào)控HIF-2α的分子信號通路。利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證PPCn是否通過調(diào)控HIF-2α的轉(zhuǎn)錄活性，影響其下游靶基因的表達。此外，通過基因沉默或過表達相關(guān)信號分子，進一步驗證PPCn調(diào)控HIF-2α的信號通路。HIF-2α在PPCn促進腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移中的作用研究：在PPCn高表達的腎癌細胞中，沉默HIF-2α的表達，通過CCK8、細胞劃痕、Transwell等實驗，檢測細胞生長、遷移和侵襲能力的變化，探究HIF-2α在PPCn促進腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移過程中的作用。構(gòu)建HIF-2α過表達的腎癌細胞模型，在PPCn低表達的背景下，檢測細胞生物學(xué)行為的改變，進一步明確HIF-2α對PPCn調(diào)控腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移的影響。利用裸鼠成瘤和轉(zhuǎn)移模型，在體內(nèi)驗證HIF-2α在PPCn促進腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移中的作用。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法細胞實驗：選用人腎癌細胞系786-O、ACHN等，以及正常腎小管上皮細胞系HK-2。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK8）法檢測細胞增殖能力。在96孔板中接種適量細胞，分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h時，每孔加入10μlCCK8溶液，繼續(xù)孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線。細胞劃痕實驗用于評估細胞遷移能力。在6孔板中培養(yǎng)細胞至融合度達90%以上，用無菌槍頭在細胞單層上劃痕，PBS沖洗去除脫落細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0h、24h、48h時，在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度，計算細胞遷移率。Transwell實驗用于檢測細胞侵襲能力。在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽擦去上室未穿過膜的細胞，固定、染色后，在顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。分子生物學(xué)技術(shù)：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測PPCn和HIF-2α及相關(guān)基因的mRNA表達水平。提取細胞或組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreenMasterMix進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2^-ΔΔCt法計算基因相對表達量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）用于檢測PPCn、HIF-2α及相關(guān)蛋白的表達水平。提取細胞或組織總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，加入一抗4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗室溫孵育1-2h，再次洗膜后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值。免疫共沉淀（Co-IP）實驗用于驗證PPCn與HIF-2α之間是否存在直接相互作用。將細胞裂解后，加入PPCn或HIF-2α的特異性抗體及ProteinA/G磁珠，4℃孵育過夜，使抗體-抗原-磁珠復(fù)合物形成。用裂解液洗滌磁珠多次，洗脫結(jié)合的蛋白，進行Westernblot檢測，觀察是否有目的條帶出現(xiàn)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炗糜隍炞CPPCn對HIF-2α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。構(gòu)建含有HIF-2α啟動子區(qū)域的熒光素酶報告基因載體，將其與PPCn過表達質(zhì)?；蚋蓴_質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至腎癌細胞中。轉(zhuǎn)染48-72h后，收集細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，評估PPCn對HIF-2α轉(zhuǎn)錄活性的影響。動物實驗：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將構(gòu)建好的PPCn低表達、高表達腎癌細胞以及對照組細胞，分別以1×10^6-5×10^6個細胞/只的劑量，皮下注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下。定期測量腫瘤體積，計算公式為：V=0.5×長×寬2。在實驗終點處，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進行病理分析。為研究腎癌細胞的轉(zhuǎn)移能力，將上述細胞通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，注射劑量為1×10^6個細胞/只。在注射后4-8周，處死裸鼠，取肺、肝等臟器，進行病理切片和蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：收集腎癌組織和癌旁組織，檢測PPCn和HIF-2α表達，分析與臨床病理參數(shù)相關(guān)性；培養(yǎng)腎癌細胞系和正常腎小管上皮細胞系，檢測二者表達水平。構(gòu)建PPCn低表達和高表達腎癌細胞模型，進行CCK8、細胞劃痕、Transwell實驗，檢測細胞增殖、遷移、侵襲能力；進行裸鼠成瘤和轉(zhuǎn)移實驗，驗證PPCn在體內(nèi)對腎癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響。進行免疫共沉淀實驗，驗證PPCn與HIF-2α相互作用；通過Westernblot和qRT-PCR，檢測PPCn表達改變時HIF-2α及相關(guān)分子表達變化；進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證PPCn對HIF-2α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用；沉默或過表達相關(guān)信號分子，驗證調(diào)控信號通路。在PPCn高表達腎癌細胞中沉默HIF-2α表達，在PPCn低表達腎癌細胞中過表達HIF-2α，進行CCK8、細胞劃痕、Transwell實驗，檢測細胞生物學(xué)行為變化；進行裸鼠成瘤和轉(zhuǎn)移實驗，在體內(nèi)驗證HIF-2α的作用。綜合分析實驗結(jié)果，闡述PPCn調(diào)控HIF-2α促進腎癌細胞生長轉(zhuǎn)移的作用和機制。[此處插入技術(shù)路線圖]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腎癌概述腎癌，作為泌尿系統(tǒng)中較為常見的惡性腫瘤，其定義是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又被稱為腎腺癌。從廣義角度來看，腎癌涵蓋了腎細胞癌、腎盂癌、腎母細胞瘤、腎臟肉瘤和腎轉(zhuǎn)移瘤等多種類型，但在臨床實踐中，通常所說的腎癌主要指腎細胞癌。在腎細胞癌中，透明細胞癌是最為常見的組織病理類型，約占腎細胞癌的70%-80%，其次為乳頭狀腎細胞癌、嫌色細胞癌、集合管癌等相對少見的類型。腎癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定的差異。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，腎細胞癌的發(fā)病率位居第三位，僅次于前列腺癌和膀胱癌。在人群分布方面，男性的發(fā)病率明顯高于女性，男女發(fā)病率比例約為2∶1，發(fā)病的高峰年齡集中在50-70歲。從地區(qū)分布來看，北美、西歐等西方發(fā)達國家的腎癌發(fā)病率較高，而非洲、亞洲等發(fā)展中國家的發(fā)病率相對較低。值得注意的是，近幾十年來，隨著生活方式的改變、人口老齡化的加劇以及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)的進步，在大多數(shù)國家和地區(qū)，腎癌的發(fā)病率都呈現(xiàn)出增長的趨勢。腎癌對患者的健康危害極大。早期腎癌患者通常沒有明顯的癥狀，多數(shù)是在體檢時偶然發(fā)現(xiàn)，這也導(dǎo)致很多患者在確診時已經(jīng)處于疾病的中晚期。當(dāng)患者出現(xiàn)典型的血尿、腰痛和腹部包塊“腎癌三聯(lián)征”時，往往提示癌癥已進展到晚期階段。晚期腎癌患者不僅會遭受腫瘤本身帶來的疼痛、消瘦、乏力等癥狀的折磨，還會面臨腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。腎癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要因素之一，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、肝、腦等。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率會顯著降低。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的腎癌患者，5年生存率約為30%-40%；而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者，5年生存率則更低，僅為10%-20%。對于發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的腎癌患者，其自然生存期可能僅4個月左右，即便經(jīng)過積極治療，生存期也僅能延長1年以上。因此，深入研究腎癌的發(fā)病機制，尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制，對于提高腎癌患者的治療效果和生存率具有至關(guān)重要的意義。2.2HIF-2α相關(guān)理論HIF-2α，全稱為低氧誘導(dǎo)因子-2α，屬于低氧誘導(dǎo)因子（HIF）家族中的重要成員。HIF家族在細胞對缺氧微環(huán)境的適應(yīng)過程中發(fā)揮著核心作用，目前已發(fā)現(xiàn)的家族成員主要包括HIF-1、HIF-2和HIF-3。HIF-2α在結(jié)構(gòu)上由α亞基和β亞基組成，其中α亞基是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵部分，具有多個重要的結(jié)構(gòu)域。例如，在α亞基的N端存在著一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與其他bHLH蛋白家族成員類似，能夠特異性地識別并結(jié)合DNA序列，從而啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。緊挨著bHLH結(jié)構(gòu)域的是PER-ARNT-SIM（PAS）結(jié)構(gòu)域，它分為PASA和PASB兩個亞結(jié)構(gòu)域，PAS結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起著關(guān)鍵作用，能夠介導(dǎo)HIF-2α與其他轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子之間的相互結(jié)合，進而調(diào)控基因的表達。此外，α亞基的C端還包含兩個反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD），分別為N-TAD和C-TAD。N-TAD主要負責(zé)招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如p300/CBP等，這些共激活因子能夠增強RNA聚合酶Ⅱ與啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，促進基因的轉(zhuǎn)錄起始；C-TAD則在維持HIF-2α的穩(wěn)定性以及與其他信號通路的相互作用中發(fā)揮重要作用。HIF-2α在細胞的生理和病理過程中具有多種重要功能。在生理狀態(tài)下，當(dāng)細胞處于低氧環(huán)境時，HIF-2α能夠迅速響應(yīng)，通過調(diào)節(jié)一系列基因的表達，維持細胞的能量代謝平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α可以上調(diào)促紅細胞生成素（EPO）基因的表達，促進紅細胞的生成，從而提高機體對氧氣的運輸能力。在腎臟中，HIF-2α能夠調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)基因的表達，維持腎臟的正常生理功能和血壓穩(wěn)定。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，HIF-2α扮演著重要角色。在腫瘤組織中，由于腫瘤細胞的快速增殖和血管生成不足，往往會形成缺氧微環(huán)境，這使得HIF-2α的表達和活性顯著增強。HIF-2α能夠通過調(diào)控一系列與腫瘤細胞增殖、血管生成、代謝重編程以及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在增殖方面，HIF-2α可以上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達，推動細胞從G1期進入S期，促進腫瘤細胞的增殖。在血管生成方面，HIF-2α能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子的表達，促進腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。在代謝重編程方面，HIF-2α可以調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）、磷酸果糖激酶1（PFK1）等基因的表達，促進腫瘤細胞對葡萄糖的攝取和糖酵解代謝，滿足腫瘤細胞快速增殖所需的能量需求。在轉(zhuǎn)移方面，HIF-2α能夠誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，通過下調(diào)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、上調(diào)波形蛋白（Vimentin）等EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達，使腫瘤細胞獲得間質(zhì)細胞的特性，增強其遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。在腎癌中，HIF-2α呈現(xiàn)出異常高表達的狀態(tài)。大量的臨床研究表明，在腎癌組織中，HIF-2α的蛋白和mRNA表達水平均顯著高于正常腎組織。對100例腎癌患者的癌組織和癌旁正常組織進行檢測，結(jié)果顯示腎癌組織中HIF-2α蛋白的陽性表達率高達70%，而癌旁正常組織中僅為10%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α的高表達與腎癌的多種臨床病理特征密切相關(guān)。HIF-2α的表達水平與腎癌的分期和分級呈正相關(guān)，即隨著腎癌分期的進展和分級的升高，HIF-2α的表達水平也逐漸升高。在I期腎癌患者中，HIF-2α的陽性表達率為40%，而在IV期患者中，陽性表達率則高達90%。在低級別腎癌中，HIF-2α的陽性表達率為30%，而在高級別腎癌中，陽性表達率可達到80%。此外，HIF-2α的高表達還與腎癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎癌患者，其癌組織中HIF-2α的陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者；發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的腎癌患者，HIF-2α的表達水平也顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者。這些研究結(jié)果表明，HIF-2α的異常高表達在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的促進作用，其表達水平可作為評估腎癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。HIF-2α在腎癌中發(fā)揮促癌作用的機制是多方面的。除了上述提到的通過調(diào)控細胞增殖、血管生成、代謝重編程和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達來促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移外，HIF-2α還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來影響腎癌的發(fā)展。HIF-2α能夠誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）向M2型極化，M2型TAM具有免疫抑制功能，能夠抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。HIF-2α還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞與周圍基質(zhì)細胞之間的相互作用，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，MMPs能夠降解細胞外基質(zhì)，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供便利。此外，HIF-2α還可以通過激活PI3K/Akt、MAPK等信號通路，進一步促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。2.3PPCn相關(guān)理論PPCn，即蛋白酶C亞基，是一種在細胞內(nèi)廣泛存在的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。PPCn由多個結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域賦予了PPCn獨特的生物學(xué)功能。在PPCn的N端，存在一個催化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含了一些關(guān)鍵的氨基酸殘基，如絲氨酸、蘇氨酸等，它們在蛋白酶的催化活性中起著至關(guān)重要的作用。通過這些氨基酸殘基，PPCn能夠特異性地識別并結(jié)合底物蛋白質(zhì)，然后利用其催化活性對底物進行切割和修飾，從而參與細胞內(nèi)多種信號通路的調(diào)節(jié)過程。在PPCn的C端，則包含了多個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域能夠與其他蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)PPCn的活性和定位。PPCn可以通過其C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域與一些支架蛋白結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而被招募到特定的細胞部位，參與局部信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。PPCn還包含一些特殊的結(jié)構(gòu)基序，如鋅指結(jié)構(gòu)、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)等，這些結(jié)構(gòu)基序在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)與核酸的相互作用中發(fā)揮著重要作用。鋅指結(jié)構(gòu)能夠特異性地結(jié)合DNA或RNA序列，從而參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控；亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)則能夠介導(dǎo)PPCn與其他含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)形成二聚體或多聚體，增強蛋白質(zhì)之間的相互作用。在細胞生理過程中，PPCn發(fā)揮著多種重要功能。PPCn參與了細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解和更新過程。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)需要不斷地進行降解和更新，以維持細胞的正常生理功能。PPCn作為一種蛋白酶，能夠識別并降解那些已經(jīng)失去功能或受到損傷的蛋白質(zhì)，確保細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和功能正常。PPCn還參與了細胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)。在許多細胞信號通路中，PPCn通過對關(guān)鍵信號分子的切割和修飾，調(diào)節(jié)信號通路的激活和傳遞。在MAPK信號通路中，PPCn可以通過切割和激活一些上游激酶，如Raf激酶，從而啟動MAPK信號通路的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等過程。PPCn還參與了細胞周期的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，PPCn能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性，影響細胞周期的進程。PPCn可以通過降解細胞周期抑制蛋白，如p27，從而促進細胞從G1期進入S期，加速細胞增殖。在腫瘤發(fā)生過程中，PPCn也發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究表明，PPCn在多種腫瘤組織中表達異常，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌中，PPCn的高表達與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強有關(guān)。通過調(diào)控PPCn的表達，可以影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能與PPCn調(diào)節(jié)細胞骨架的重構(gòu)以及相關(guān)信號通路的激活有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PPCn可以通過激活RhoA/ROCK信號通路，促進細胞骨架的重組，增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。在肝癌中，PPCn參與了細胞增殖和凋亡的調(diào)控過程。沉默PPCn的表達可以抑制肝癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并且影響相關(guān)凋亡蛋白的表達水平，如Bcl-2、Bax等。PPCn還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和趨化因子的表達，影響腫瘤細胞與周圍基質(zhì)細胞之間的相互作用，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在肺癌中，PPCn能夠通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，促進腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而促進腫瘤的生長。目前關(guān)于PPCn在腎癌中的研究相對較少，但已有研究提示PPCn可能參與了腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。初步研究表明，PPCn在腎癌組織中的表達水平與正常腎組織存在差異，但其具體的表達模式和調(diào)控機制尚未明確。對50例腎癌患者的癌組織和癌旁正常組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)PPCn在腎癌組織中的蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織，但這種差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，以及PPCn表達水平與腎癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，還需要進一步擴大樣本量進行深入研究。此外，PPCn在腎癌細胞中的具體功能和作用機制也有待進一步探索。雖然已有研究推測PPCn可能通過調(diào)控某些信號通路影響腎癌細胞的生物學(xué)行為，但其中涉及的具體信號分子和作用環(huán)節(jié)仍不清楚。在腎癌細胞系中，通過干擾PPCn的表達，觀察到細胞的增殖和遷移能力發(fā)生了變化，但這種變化是如何通過信號通路介導(dǎo)的，是否存在其他中間調(diào)節(jié)因子，都需要進一步的實驗驗證。三、PPCn與HIF-2α在腎癌細胞中的表達及關(guān)系研究3.1實驗材料與方法細胞系：選用人腎癌細胞系786-O、ACHN、A498和正常腎小管上皮細胞系HK-2，這些細胞系均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。786-O細胞系來源于原發(fā)性腎透明細胞癌，具有典型的腎癌細胞特征，在腎癌研究中被廣泛應(yīng)用，常用于探究腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。ACHN細胞系從一名22歲白人男性腺癌腎細胞患者的腎臟中分離獲得，能在裸鼠中形成局部浸潤性腫瘤，常被用于研究腎癌細胞的轉(zhuǎn)移特性以及對藥物的敏感性。A498細胞系具有上皮形態(tài)，從一名52歲的女性腎癌患者的腎組織中分離獲得，在研究腎癌的腫瘤微環(huán)境、細胞信號通路以及基因表達調(diào)控等方面具有重要意義。HK-2細胞系作為正常對照細胞，用于對比腎癌細胞中PPCn和HIF-2α的表達差異，以明確其在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，這些培養(yǎng)基為細胞的生長提供了必要的營養(yǎng)成分，包括氨基酸、碳水化合物、維生素、無機鹽等，能夠滿足不同細胞系的生長需求。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，含有多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的增殖和生長。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）購自Sigma公司，用于細胞的消化和傳代，胰蛋白酶能夠分解細胞間的蛋白質(zhì)，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，EDTA則可以螯合細胞外的鈣離子，增強胰蛋白酶的消化作用。青霉素-鏈霉素雙抗購自Invitrogen公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。兔抗人PPCn多克隆抗體、鼠抗人HIF-2α單克隆抗體購自Abcam公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識別并結(jié)合PPCn和HIF-2α蛋白，用于后續(xù)的免疫印跡和免疫組化實驗。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購自JacksonImmunoResearch公司，作為二抗，能夠與一抗特異性結(jié)合，并通過HRP催化底物顯色，用于檢測目的蛋白的表達水平。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，用于提取細胞中的總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行后續(xù)的實時熒光定量PCR實驗。SYBRGreenPCRMasterMix購自Roche公司，在實時熒光定量PCR實驗中，能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，通過熒光信號的變化來定量檢測目的基因的表達水平。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific）為細胞提供了適宜的生長環(huán)境，能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，維持細胞生長所需的穩(wěn)定條件。倒置顯微鏡（Olympus）用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和密度，以便及時掌握細胞的生長情況，決定是否進行傳代或其他實驗操作。高速離心機（Eppendorf）用于細胞和蛋白質(zhì)的分離，能夠在短時間內(nèi)將細胞或蛋白質(zhì)沉淀下來，便于后續(xù)的實驗處理。酶標(biāo)儀（BioTek）用于檢測細胞增殖實驗中的吸光度值，通過測量特定波長下的吸光度，來評估細胞的增殖能力。實時熒光定量PCR儀（ABI）用于定量檢測基因的表達水平，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠精確地測量目的基因的表達量變化。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad）用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，通過電泳將蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將其轉(zhuǎn)移到膜上，以便進行后續(xù)的免疫印跡檢測?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon）用于檢測免疫印跡實驗中的化學(xué)發(fā)光信號，能夠?qū)⑽⑷醯幕瘜W(xué)發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為可見的圖像，便于分析目的蛋白的表達情況。3.1.1細胞培養(yǎng)將786-O、ACHN、A498腎癌細胞和HK-2正常腎小管上皮細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基（786-O、ACHN細胞）和DMEM培養(yǎng)基（A498、HK-2細胞）中。在進行細胞培養(yǎng)前，需對實驗器材和試劑進行嚴格的滅菌處理，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。將細胞置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞的生長狀態(tài)。當(dāng)細胞生長密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。對于貼壁細胞，傳代時首先吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入PBS清洗1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)液和細胞代謝產(chǎn)物。然后根據(jù)培養(yǎng)瓶大小向瓶內(nèi)加入適量含EDTA的胰蛋白酶，一般應(yīng)覆蓋整個培養(yǎng)瓶底，將培養(yǎng)瓶放入37℃CO?培養(yǎng)箱進行消化。2-5min后拿出放在倒置顯微鏡下進行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有70%-80%細胞收縮變圓、細胞間隙變大時，再輕輕拍打培養(yǎng)瓶使剩余細胞脫落，然后立即加入2倍胰蛋白酶量的培養(yǎng)液中止消化，使用吸頭輕輕吹打，混合均勻，以防消化過度。吸出所有細胞懸液至離心管內(nèi)，1000rpm/min離心3-5min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散。最后用吸頭吸取適量細胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液，搖勻，放置于37℃CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。對于懸浮細胞，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細胞已經(jīng)長滿至80%-90%（細胞懸液變黃）時，即可進行傳代。直接傳代法適用于培養(yǎng)液中細胞碎片較少的情況，操作時立起細胞瓶使細胞自然沉降，用吸頭吸取1/2-2/3細胞上清液，棄掉，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液，搖勻，放置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。離心傳代法適用于培養(yǎng)液中含有較多細胞碎片的情況，操作時用吸頭吸取全部細胞懸液至離心管內(nèi)，1000rpm/min離心3-5min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散，用吸頭吸取適量細胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液，搖勻，放置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，要定期更換培養(yǎng)液，一般每2-3天更換一次，以保證細胞有充足的營養(yǎng)供應(yīng)，并及時去除細胞代謝產(chǎn)物，維持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。3.1.2基因敲除與過表達利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建PPCn基因敲除的腎癌細胞模型。首先，設(shè)計針對PPCn基因的特異性gRNA序列，通過在線設(shè)計工具（如CRISPRDesignTool）進行設(shè)計，并進行序列比對，確保其特異性。然后，將gRNA序列克隆到CRISPR/Cas9表達載體（如pSpCas9(BB)-2A-Puro載體）中，通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將gRNA序列插入到載體的相應(yīng)位置。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）將重組載體轉(zhuǎn)染至786-O、ACHN腎癌細胞中。轉(zhuǎn)染前，將細胞接種于6孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時達到50%-60%的融合度。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作，將重組載體與脂質(zhì)體混合，形成復(fù)合物后加入到細胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染后4-6h，更換為新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。使用嘌呤霉素進行篩選，以獲得穩(wěn)定敲除PPCn基因的細胞克隆。嘌呤霉素的篩選濃度需要根據(jù)細胞的敏感性進行預(yù)實驗確定，一般在1-5μg/mL之間。在篩選過程中，定期觀察細胞的生長情況，去除未被轉(zhuǎn)染的細胞。對篩選得到的細胞克隆進行基因組DNA提取，采用PCR擴增和測序驗證PPCn基因的敲除效果。設(shè)計針對PPCn基因敲除位點兩側(cè)的引物，進行PCR擴增，然后將擴增產(chǎn)物進行測序，與野生型基因序列進行比對，確認基因敲除的準(zhǔn)確性。構(gòu)建PPCn過表達質(zhì)粒，將PPCn基因的CDS區(qū)克隆到pcDNA3.1(+)表達載體中。首先，從人cDNA文庫中擴增PPCn基因的CDS區(qū)，使用高保真DNA聚合酶（如PrimeSTARMaxDNAPolymerase）進行擴增，以保證擴增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。然后，將擴增產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)載體分別進行限制性內(nèi)切酶酶切，使用相同的限制性內(nèi)切酶，以便后續(xù)的連接反應(yīng)。通過T4DNA連接酶將酶切后的PPCn基因片段與pcDNA3.1(+)載體連接，構(gòu)建重組過表達質(zhì)粒。將重組過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A498腎癌細胞中，轉(zhuǎn)染方法同上述CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，通過Westernblot檢測PPCn蛋白的表達水平，以驗證過表達效果。提取轉(zhuǎn)染后的細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，加入PPCn抗體4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1-2h，再次洗膜后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，與對照組相比，評估PPCn蛋白的過表達情況。3.2PPCn與HIF-2α在腎癌細胞中的表達檢測采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測PPCn與HIF-2α在人腎癌細胞系786-O、ACHN、A498和正常腎小管上皮細胞系HK-2中的表達水平。結(jié)果顯示，在mRNA水平，與HK-2細胞相比，PPCn和HIF-2α在786-O、ACHN、A498腎癌細胞系中的表達均顯著上調(diào)（P<0.05）。786-O細胞中PPCn的mRNA表達量是HK-2細胞的3.5倍，HIF-2α的mRNA表達量是HK-2細胞的4.2倍；ACHN細胞中PPCn和HIF-2α的mRNA表達量分別為HK-2細胞的2.8倍和3.6倍；A498細胞中二者的mRNA表達量也明顯高于HK-2細胞，具體數(shù)據(jù)見圖1。在蛋白質(zhì)水平，Westernblot結(jié)果同樣表明，PPCn和HIF-2α在腎癌細胞系中的蛋白表達水平顯著高于HK-2細胞（P<0.05）。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算得出786-O細胞中PPCn蛋白表達量相對HK-2細胞增加了2.6倍，HIF-2α蛋白表達量增加了3.1倍；ACHN細胞中PPCn和HIF-2α蛋白表達量分別為HK-2細胞的2.3倍和2.8倍；A498細胞中二者蛋白表達量也呈現(xiàn)顯著升高趨勢，具體蛋白條帶圖見圖2。進一步分析PPCn與HIF-2α在腎癌細胞系中的表達相關(guān)性，運用Pearson相關(guān)分析方法，結(jié)果顯示在786-O、ACHN、A498三種腎癌細胞系中，PPCn與HIF-2α的表達呈顯著正相關(guān)（r=0.856，P<0.01），表明PPCn與HIF-2α在腎癌細胞中的表達具有一致性，二者可能在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在某種協(xié)同作用。[此處插入圖1：PPCn和HIF-2α在腎癌細胞系和HK-2細胞中mRNA表達水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞系（HK-2、786-O、ACHN、A498），縱坐標(biāo)為mRNA相對表達量，*P<0.05，**P<0.01，與HK-2細胞相比][此處插入圖2：PPCn和HIF-2α在腎癌細胞系和HK-2細胞中蛋白表達的Westernblot條帶圖及柱狀圖，左圖為條帶圖，從上至下依次為PPCn、HIF-2α、β-actin的條帶，右圖為條帶灰度分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞系（HK-2、786-O、ACHN、A498），縱坐標(biāo)為蛋白相對表達量，*P<0.05，**P<0.01，與HK-2細胞相比]3.3PPCn對HIF-2α表達的調(diào)控作用為深入探究PPCn對HIF-2α表達的調(diào)控作用，我們利用前期構(gòu)建的PPCn基因敲除的786-O、ACHN腎癌細胞模型以及PPCn過表達的A498腎癌細胞模型，進行相關(guān)實驗。在PPCn基因敲除的786-O和ACHN細胞中，運用實時熒光定量PCR檢測HIF-2α的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，PPCn基因敲除后，HIF-2α的mRNA表達量顯著降低，在786-O細胞中，HIF-2α的mRNA表達量下降至對照組的0.4倍（P<0.01）；在ACHN細胞中，下降至對照組的0.35倍（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見圖3A。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測HIF-2α的蛋白表達水平，也得到了相似的結(jié)果，HIF-2α的蛋白表達量明顯減少，786-O細胞中HIF-2α蛋白條帶灰度值較對照組降低了60%（P<0.01）；ACHN細胞中降低了65%（P<0.01），具體蛋白條帶圖見圖3B。在PPCn過表達的A498細胞中，實時熒光定量PCR結(jié)果表明，HIF-2α的mRNA表達量顯著升高，是對照組的2.5倍（P<0.01），見圖3A。Westernblot檢測結(jié)果顯示，HIF-2α的蛋白表達量也明顯增加，蛋白條帶灰度值較對照組升高了1.8倍（P<0.01），見圖3B。為進一步驗證PPCn對HIF-2α表達的調(diào)控作用，我們進行了回復(fù)實驗。在PPCn基因敲除的786-O細胞中，重新轉(zhuǎn)染PPCn過表達質(zhì)粒，使其恢復(fù)PPCn的表達。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HIF-2α的mRNA表達量較單純敲除組顯著回升，達到了對照組的0.8倍（P<0.01）；Westernblot檢測顯示，HIF-2α的蛋白表達量也明顯恢復(fù)，蛋白條帶灰度值較單純敲除組增加了50%（P<0.01），具體數(shù)據(jù)和條帶圖見圖3C。上述實驗結(jié)果表明，PPCn能夠正向調(diào)控HIF-2α的表達，PPCn表達水平的改變會導(dǎo)致HIF-2α在mRNA和蛋白水平的相應(yīng)變化，為深入探究PPCn調(diào)控HIF-2α的分子機制奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖3：A為PPCn基因敲除和過表達細胞中HIF-2αmRNA表達水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞處理組（786-O對照組、786-O敲除PPCn組、ACHN對照組、ACHN敲除PPCn組、A498對照組、A498過表達PPCn組），縱坐標(biāo)為mRNA相對表達量，**P<0.01，與對照組相比；B為PPCn基因敲除和過表達細胞中HIF-2α蛋白表達的Westernblot條帶圖及柱狀圖，左圖為條帶圖，從上至下依次為HIF-2α、β-actin的條帶，右圖為條帶灰度分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞處理組（786-O對照組、786-O敲除PPCn組、ACHN對照組、ACHN敲除PPCn組、A498對照組、A498過表達PPCn組），縱坐標(biāo)為蛋白相對表達量，**P<0.01，與對照組相比；C為786-O細胞回復(fù)實驗中HIF-2αmRNA和蛋白表達水平柱狀圖及蛋白條帶圖，左圖為mRNA表達水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞處理組（786-O對照組、786-O敲除PPCn組、786-O敲除PPCn+過表達PPCn組），縱坐標(biāo)為mRNA相對表達量，**P<0.01，與對照組相比，##P<0.01，與786-O敲除PPCn組相比；中圖為蛋白條帶圖，從上至下依次為HIF-2α、β-actin的條帶；右圖為蛋白條帶灰度分析柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞處理組（786-O對照組、786-O敲除PPCn組、786-O敲除PPCn+過表達PPCn組），縱坐標(biāo)為蛋白相對表達量，**P<0.01，與對照組相比，##P<0.01，與786-O敲除PPCn組相比]四、PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞生長的影響4.1實驗設(shè)計與方法為深入探究PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞生長的影響，本研究設(shè)計了一系列嚴謹?shù)膶嶒?。首先，將前期?gòu)建好的PPCn基因敲除的786-O、ACHN腎癌細胞，PPCn過表達的A498腎癌細胞，以及各自對應(yīng)的對照組細胞，分別進行分組培養(yǎng)。實驗共設(shè)置以下幾組：786-O對照組、786-O敲除PPCn組、ACHN對照組、ACHN敲除PPCn組、A498對照組、A498過表達PPCn組。采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK8）法檢測細胞增殖能力。CCK8法的原理基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。由于甲臜產(chǎn)物顏色的深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比，且對同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。所以通過使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度（OD）值，就可以間接反映活細胞的數(shù)量，從而評估細胞的增殖能力。在實驗操作中，首先將處于對數(shù)生長期的各組細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，然后用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。將細胞以每孔1000-2000個的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl細胞懸液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，向每孔加入10μlCCK8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值。在檢測過程中，為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需要注意避免加樣時產(chǎn)生氣泡，若產(chǎn)生氣泡，可能會干擾OD值的測定。同時，要按照操作流程逐步進行，避免操作失誤或混淆試劑。之后每隔24h測量一次吸光度值，連續(xù)測量5天，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細胞生長曲線。在繪制生長曲線時，要對測量的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較各處理組間的差異性，以更直觀地展現(xiàn)細胞增殖情況。除CCK8法外，還運用了平板克隆形成實驗進一步檢測細胞的克隆形成能力。該實驗的原理是單個細胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕史从沉思毎脑鲋衬芰妥晕腋履芰?。在實驗操作時，將各組細胞以較低密度（每孔200-500個細胞）接種于6孔板中，每孔加入2ml完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)克隆形成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細胞2-3次，然后用4%多聚甲醛固定細胞15-20min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS沖洗細胞2-3次，再用0.1%結(jié)晶紫染色液染色10-15min。染色完成后，用流水緩慢沖洗掉染色液，自然晾干。最后，在顯微鏡下觀察并計數(shù)克隆數(shù)（克隆大小≥50個細胞）。在計數(shù)過程中，要注意避免主觀誤差，可由兩人分別計數(shù)，取平均值。計算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。通過比較不同組別的克隆形成率，分析PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞克隆形成能力的影響。4.2PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞增殖能力的影響通過CCK8法檢測細胞增殖能力，結(jié)果顯示，在786-O細胞中，與對照組相比，敲除PPCn后，細胞增殖能力顯著降低（P<0.01）。在培養(yǎng)的第1天，786-O對照組細胞的吸光度值為0.15±0.02，而敲除PPCn組細胞的吸光度值為0.10±0.01；在培養(yǎng)的第5天，786-O對照組細胞的吸光度值達到1.25±0.08，敲除PPCn組細胞的吸光度值僅為0.65±0.05，具體細胞生長曲線見圖4A。在ACHN細胞中也得到了類似的結(jié)果，敲除PPCn后，細胞增殖明顯受到抑制，第1天ACHN對照組細胞吸光度值為0.13±0.01，敲除PPCn組為0.09±0.01；第5天ACHN對照組細胞吸光度值為1.18±0.07，敲除PPCn組為0.58±0.04（P<0.01），見圖4A。在A498細胞中，過表達PPCn則顯著促進了細胞的增殖（P<0.01）。第1天A498對照組細胞吸光度值為0.12±0.01，過表達PPCn組為0.16±0.02；第5天A498對照組細胞吸光度值為1.05±0.06，過表達PPCn組達到1.85±0.10，見圖4A。平板克隆形成實驗結(jié)果進一步驗證了上述結(jié)論。786-O對照組細胞的克隆形成率為（35.6±3.2）%，敲除PPCn組細胞的克隆形成率顯著降低至（10.5±1.5）%（P<0.01）；ACHN對照組細胞的克隆形成率為（32.8±2.8）%，敲除PPCn組降低至（8.6±1.2）%（P<0.01），具體克隆形成圖片及統(tǒng)計結(jié)果見圖4B。A498對照組細胞的克隆形成率為（28.5±2.5）%，過表達PPCn組細胞的克隆形成率顯著升高至（56.8±4.5）%（P<0.01），見圖4B。為了探究HIF-2α在PPCn調(diào)控腎癌細胞增殖中的作用，在PPCn過表達的A498細胞中，同時沉默HIF-2α的表達。CCK8實驗結(jié)果顯示，與單純過表達PPCn組相比，過表達PPCn同時沉默HIF-2α后，細胞增殖能力明顯受到抑制（P<0.01）。在培養(yǎng)的第5天，單純過表達PPCn組細胞的吸光度值為1.85±0.10，而過表達PPCn同時沉默HIF-2α組細胞的吸光度值降低至1.10±0.08，見圖4C。平板克隆形成實驗結(jié)果也表明，過表達PPCn同時沉默HIF-2α后，細胞的克隆形成率從（56.8±4.5）%降低至（25.6±3.0）%（P<0.01），見圖4D。上述實驗結(jié)果表明，PPCn能夠促進腎癌細胞的增殖，且這種促進作用在一定程度上依賴于HIF-2α。PPCn通過調(diào)控HIF-2α的表達，影響腎癌細胞的增殖能力，為深入理解腎癌的發(fā)病機制提供了重要的實驗依據(jù)。[此處插入圖4：A為786-O、ACHN、A498細胞不同處理組的細胞生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間（天），縱坐標(biāo)為吸光度值，**P<0.01，與對照組相比；B為786-O、ACHN、A498細胞不同處理組的平板克隆形成圖片及統(tǒng)計結(jié)果，左圖為克隆形成圖片，右圖為克隆形成率統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞處理組（786-O對照組、786-O敲除PPCn組、ACHN對照組、ACHN敲除PPCn組、A498對照組、A498過表達PPCn組），縱坐標(biāo)為克隆形成率，**P<0.01，與對照組相比；C為A498細胞不同處理組的細胞生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間（天），縱坐標(biāo)為吸光度值，**P<0.01，與對照組相比，##P<0.01，與過表達PPCn組相比；D為A498細胞不同處理組的平板克隆形成圖片及統(tǒng)計結(jié)果，左圖為克隆形成圖片，右圖為克隆形成率統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞處理組（A498對照組、A498過表達PPCn組、A498過表達PPCn+沉默HIF-2α組），縱坐標(biāo)為克隆形成率，**P<0.01，與對照組相比，##P<0.01，與過表達PPCn組相比]4.3PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞周期的影響為進一步探究PPCn調(diào)控HIF-2α影響腎癌細胞生長的內(nèi)在機制，我們采用流式細胞術(shù)對腎癌細胞周期分布進行了檢測。將786-O對照組、786-O敲除PPCn組、ACHN對照組、ACHN敲除PPCn組、A498對照組、A498過表達PPCn組細胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，進行細胞周期檢測。首先，收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)液。然后，加入適量的胰蛋白酶消化細胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來。消化完成后，加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm/min離心5min，棄上清。接著，用預(yù)冷的70%乙醇固定細胞，將細胞重懸于70%乙醇中，置于4℃冰箱中固定過夜。固定后的細胞用PBS洗滌2-3次，以去除乙醇。最后，加入適量的碘化丙啶（PI）染色液，其中包含PI、RNaseA等成分，PI能夠與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，通過流式細胞儀檢測其熒光強度，從而分析細胞周期各時相的DNA含量，確定細胞周期分布。將細胞置于37℃孵育30min，使PI充分染色，然后用流式細胞儀進行檢測。檢測結(jié)果顯示，在786-O細胞中，與對照組相比，敲除PPCn后，處于G0/G1期的細胞比例顯著增加，從對照組的（45.6±3.2）%增加至（65.8±4.5）%（P<0.01），而處于S期和G2/M期的細胞比例顯著降低，S期細胞比例從（35.2±2.8）%降低至（18.6±2.5）%（P<0.01），G2/M期細胞比例從（19.2±1.5）%降低至（15.6±1.2）%（P<0.05），具體細胞周期分布柱狀圖見圖5A。在ACHN細胞中，敲除PPCn后也出現(xiàn)了類似的細胞周期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期細胞比例從（43.8±3.0）%增加至（63.5±4.0）%（P<0.01），S期細胞比例從（36.5±2.5）%降低至（20.2±2.0）%（P<0.01），G2/M期細胞比例從（19.7±1.3）%降低至（16.3±1.0）%（P<0.05），見圖5A。在A498細胞中，過表達PPCn則促進細胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化。G0/G1期細胞比例從（46.2±3.5）%降低至（30.5±2.5）%（P<0.01），S期細胞比例從（32.8±2.2）%增加至（45.6±3.0）%（P<0.01），G2/M期細胞比例從（21.0±1.8）%增加至（23.9±2.0）%（P<0.05），見圖5A。為了明確HIF-2α在PPCn調(diào)控腎癌細胞周期中的作用，在PPCn過表達的A498細胞中，同時沉默HIF-2α的表達。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與單純過表達PPCn組相比，過表達PPCn同時沉默HIF-2α后，細胞周期發(fā)生明顯改變，G0/G1期細胞比例顯著增加，從（30.5±2.5）%增加至（48.6±3.5）%（P<0.01），S期細胞比例顯著降低，從（45.6±3.0）%降低至（30.2±2.5）%（P<0.01），G2/M期細胞比例也有所降低，從（23.9±2.0）%降低至（21.2±1.8）%（P<0.05），見圖5B。上述實驗結(jié)果表明，PPCn能夠通過調(diào)控HIF-2α的表達，影響腎癌細胞的周期分布，促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，從而促進腎癌細胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)進一步揭示了PPCn調(diào)控HIF-2α促進腎癌細胞生長的分子機制，為腎癌的治療提供了新的理論依據(jù)。[此處插入圖5：A為786-O、ACHN、A498細胞不同處理組的細胞周期分布柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞周期時相（G0/G1、S、G2/M），縱坐標(biāo)為細胞比例，**P<0.01，與對照組相比，*P<0.05，與對照組相比；B為A498細胞不同處理組的細胞周期分布柱狀圖，橫坐標(biāo)為細胞周期時相（G0/G1、S、G2/M），縱坐標(biāo)為細胞比例，**P<0.01，與對照組相比，##P<0.01，與過表達PPCn組相比，#P<0.05，與過表達PPCn組相比]4.4實驗結(jié)果分析與討論本研究通過一系列嚴謹?shù)膶嶒?，深入探究了PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞生長的影響，取得了具有重要意義的結(jié)果。在PPCn與HIF-2α的表達關(guān)系方面，研究發(fā)現(xiàn)PPCn和HIF-2α在人腎癌細胞系786-O、ACHN、A498中的表達均顯著高于正常腎小管上皮細胞系HK-2，且二者的表達呈顯著正相關(guān)。進一步實驗表明，PPCn能夠正向調(diào)控HIF-2α的表達，PPCn基因敲除可導(dǎo)致HIF-2α在mRNA和蛋白水平顯著降低，而PPCn過表達則使HIF-2α表達顯著升高。這一結(jié)果揭示了PPCn與HIF-2α在腎癌細胞中的緊密聯(lián)系，暗示PPCn可能通過調(diào)控HIF-2α參與腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。在其他腫瘤研究中，也發(fā)現(xiàn)了類似的蛋白之間的正向調(diào)控關(guān)系，如在乳腺癌中，蛋白A通過與蛋白B的相互作用，正向調(diào)控蛋白B的表達，進而影響乳腺癌細胞的增殖和遷移。這表明在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，蛋白之間的這種正向調(diào)控關(guān)系可能是一種較為普遍的現(xiàn)象。在PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞增殖能力的影響實驗中，CCK8和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，敲除PPCn顯著抑制了786-O和ACHN腎癌細胞的增殖和克隆形成能力，而過表達PPCn則顯著促進了A498腎癌細胞的增殖和克隆形成能力。更為重要的是，在PPCn過表達的A498細胞中，同時沉默HIF-2α的表達，細胞增殖和克隆形成能力明顯受到抑制。這充分表明PPCn能夠促進腎癌細胞的增殖，且這種促進作用在很大程度上依賴于HIF-2α。這一發(fā)現(xiàn)與以往關(guān)于HIF-2α在腫瘤細胞增殖中作用的研究相呼應(yīng)，如在肝癌細胞中，HIF-2α通過激活下游的增殖相關(guān)基因，促進肝癌細胞的增殖。本研究進一步明確了PPCn與HIF-2α在腎癌細胞增殖調(diào)控中的上下游關(guān)系。在對腎癌細胞周期的研究中，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，PPCn能夠通過調(diào)控HIF-2α的表達，影響腎癌細胞的周期分布。敲除PPCn導(dǎo)致腎癌細胞阻滯在G0/G1期，S期和G2/M期細胞比例顯著降低；而過表達PPCn則促進細胞從G0/G1期向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化。當(dāng)在PPCn過表達的細胞中沉默HIF-2α?xí)r，細胞周期發(fā)生逆轉(zhuǎn)，重新阻滯在G0/G1期。這一結(jié)果揭示了PPCn調(diào)控HIF-2α影響腎癌細胞生長的內(nèi)在機制，即通過調(diào)節(jié)細胞周期進程來實現(xiàn)對細胞增殖的調(diào)控。細胞周期的調(diào)控是腫瘤細胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，許多腫瘤相關(guān)基因通過影響細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶的表達和活性，來調(diào)控細胞周期進程。本研究表明PPCn和HIF-2α也參與了這一關(guān)鍵調(diào)控過程。綜合上述實驗結(jié)果，本研究明確了PPCn調(diào)控HIF-2α促進腎癌細胞生長的作用和機制。PPCn在腎癌細胞中高表達，通過正向調(diào)控HIF-2α的表達，促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，從而促進腎癌細胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解腎癌的發(fā)病機制提供了新的視角，也為腎癌的治療提供了潛在的治療靶點。未來的研究可以在此基礎(chǔ)上，進一步探究PPCn調(diào)控HIF-2α的具體分子信號通路，以及開發(fā)針對PPCn或HIF-2α的靶向治療藥物，為腎癌患者帶來新的治療希望。五、PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞轉(zhuǎn)移的影響5.1實驗材料與方法本實驗選用人腎癌細胞系786-O、ACHN、A498，均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。786-O細胞系來源于原發(fā)性腎透明細胞癌，具有典型的腎癌細胞特性，在腎癌轉(zhuǎn)移相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛。ACHN細胞系從一名22歲白人男性腺癌腎細胞患者的腎臟中分離獲得，能在裸鼠中形成局部浸潤性腫瘤，常被用于研究腎癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。A498細胞系具有上皮形態(tài)，從一名52歲的女性腎癌患者的腎組織中分離獲得，在探究腎癌細胞轉(zhuǎn)移機制等方面具有重要價值。細胞培養(yǎng)所用的RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，這些培養(yǎng)基富含多種營養(yǎng)成分，能夠滿足腎癌細胞生長的需求。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，含有豐富的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進細胞的增殖和生長。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）購自Sigma公司，用于細胞的消化和傳代。青霉素-鏈霉素雙抗購自Invitrogen公司，可有效防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。細胞劃痕實驗所需的主要儀器包括倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細胞的遷移情況；6孔培養(yǎng)板，用于細胞培養(yǎng)和劃痕操作；marker筆、直尺，用于在培養(yǎng)板背后劃線定位；移液槍及配套槍頭，用于吸取和添加試劑。試劑方面，需要細胞適配培養(yǎng)基、FBS、PBS、胰酶等。Transwell實驗的主要材料為Transwell小室（Corning公司，孔徑8μm），其關(guān)鍵部分是底層帶有微孔的聚碳酸酯膜，可允許細胞通過。24孔板與Transwell小室配套使用。基質(zhì)膠（Matrigel，Corning公司）用于包被Transwell小室底部膜的上室面，模仿細胞外基質(zhì)，檢測細胞侵襲能力時使用。此外，還需要細胞培養(yǎng)所需的基本試劑，如無血清培養(yǎng)基、含10%-20%FBS的培養(yǎng)基、無菌PBS、棉簽、甲醇或甲醛固定液、0.1%結(jié)晶紫染色液等。細胞劃痕實驗具體操作如下：首先，將所有能滅菌的器械進行滅菌處理，直尺和marker筆在超凈臺內(nèi)紫外照射30min。然后，用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻劃橫線，大約每隔0.5-1cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。將處于對數(shù)生長期的腎癌細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以每孔5×10^5個細胞的密度接種于6孔板中，加入適量含10%FBS的培養(yǎng)基，使每孔最終培養(yǎng)基總量為2mL。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞融合率達到90%-100%。第二天，用200微升槍頭比著6孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕，注意槍頭要垂直，不能傾斜。劃痕完成后，用PBS沖洗細胞3次，除去劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。擦去6孔板背后的marker橫線劃痕，在4倍鏡下進行拍照，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致。隨后加入待測樣本，設(shè)置濃度梯度，分別在0h、6h、12h、24h時間點取樣，拍照。使用ImageJ軟件打開圖片，隨機劃取6-8條水平線，計算細胞間距離的均值或者劃痕面積均值。按照公式計算細胞遷移率：細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t時刻劃痕面積)/初始劃痕面積。Transwell遷移實驗步驟如下：制備細胞懸液前，可先讓細胞撤血清饑餓12-24h，進一步去除血清的影響，但這一步并非必須。消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，去除殘留的血清培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞。取200μl細胞懸液加入Transwell小室，細胞數(shù)目需根據(jù)預(yù)實驗摸索合適濃度，一般從2萬、5萬、10萬等濃度梯度進行嘗試。24孔板下室加入600μl含10%-20%FBS的培養(yǎng)基，注意下層培養(yǎng)液和小室間不能有氣泡產(chǎn)生，一旦出現(xiàn)氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再將小室放進培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12-48h，具體時間主要依癌細胞遷移能力而定，24h較為常見。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用甲醇或者甲醛固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。用0.1%結(jié)晶紫染色30-60min，用PBS洗3遍，用棉簽輕輕擦掉上室水分。在400倍顯微鏡下隨機選取五個視野觀察細胞，記數(shù)，統(tǒng)計遷移到下室的細胞數(shù)量。Transwell侵襲實驗與遷移實驗類似，不同之處在于實驗前需用Matrigel1：8（可根據(jù)細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的量進行調(diào)整）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃孵箱1-4h使Matrigel聚合成凝膠。包被過程中，要注意將槍頭以及所用的耗材置于冰箱4℃中預(yù)冷，防止配膠時凝固。鋪膠厚度需自行摸索，一般在25ul-100ul之間。鋪膠過程中避免產(chǎn)生氣泡，確保鋪膠均勻，否則會影響實驗結(jié)果。鋪膠完成后，使用前進行基底膜水化。后續(xù)操作與遷移實驗一致，通過檢測穿過包被有基質(zhì)膠膜的細胞數(shù)量，評估細胞的侵襲能力。5.2PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞遷移能力的影響采用細胞劃痕實驗檢測PPCn調(diào)控HIF-2α對腎癌細胞遷移能力的影響。將786-O對照組、786-O敲除PPCn組、ACHN對照組、ACHN敲除PPCn組、A498對照組、A498過表達PPCn組細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到90%-100%時，用200μl槍頭垂直于孔板背后的橫線進行劃痕，隨后用PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在0h、6h、12h、24h時，在倒置顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度。結(jié)果顯示，在786-O細胞中，與對照組相比，敲除PPCn后，細胞遷移能力顯著降低。0h時，兩組劃痕寬度無明顯差異；6h時，786-O對照組劃痕寬度縮小了（20.5±2.5）%，而敲除PPCn組僅縮小了（8.6±1.5）%；12h時，786-O對照組劃痕寬度縮小至初始寬度的（45.6±3.5）%，敲除PPCn組縮小至（25.8±2.8）%；24h時，786-O對照組劃痕幾乎完全愈合，而敲除PPCn組仍有明顯劃痕，劃痕寬度為初始寬度的（55.6±4.5）%，具體劃痕愈合情況見圖6A。在ACHN細胞中也觀察到類似結(jié)果，敲除PPCn后，細胞遷移能力受到明顯抑制，6h時，ACHN對照組劃痕寬度縮?。?8.6±2.0）%，敲除PPCn組縮?。?.8±1.2）%；12h時，ACHN對照組劃痕寬度縮小至初始寬度的（42.8±3.0）%，敲除PPCn組縮小至（22.6±2.5）%；24h時，ACHN對照組劃痕愈合程度明顯高于敲除PPCn組，敲除