810nm與670nm激光對白色念珠菌作用的體外對比探究：機制與效果剖析一、引言1.1研究背景白色念珠菌（Candidaalbicans）作為一種常見的條件致病性真菌，廣泛存在于自然界以及人體的口腔、腸道、陰道等黏膜部位。在正常生理狀態(tài)下，白色念珠菌與人體處于共生平衡，并不會引發(fā)疾病。然而，當機體免疫力下降，如患有艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病等慢性疾病，長期使用廣譜抗生素、免疫抑制劑或接受放化療等，導致體內菌群失調時，白色念珠菌便會大量繁殖，突破機體的防御屏障，從而引發(fā)感染。白色念珠菌感染可累及人體多個部位，造成不同程度的危害。在口腔，可引發(fā)鵝口瘡，多見于嬰幼兒、老年人以及免疫功能低下者，表現(xiàn)為口腔黏膜表面覆蓋白色乳凝塊樣小點或小片狀物，可逐漸融合成大片，不易擦去，強行剝離后局部黏膜潮紅、粗糙，可有溢血，患兒常因疼痛而煩躁不安、啼哭、哺乳困難。在陰道，白色念珠菌感染引發(fā)的外陰陰道假絲酵母菌病是女性常見的陰道炎類型之一，主要癥狀為外陰瘙癢、灼痛，白帶增多且呈豆腐渣樣，嚴重影響患者的生活質量和心理健康，還可能在孕期增加早產、胎膜早破等風險。若白色念珠菌侵入血液，引起念珠菌血癥，進而播散至全身各器官，如心臟、腎臟、肺部等，可導致心內膜炎、腎盂腎炎、肺炎等深部組織和器官感染，病死率較高。目前，針對白色念珠菌感染的傳統(tǒng)治療方法主要依賴抗真菌藥物，如唑類、多烯類、棘白菌素類等。這些藥物在臨床應用中取得了一定的療效，但隨著抗真菌藥物的廣泛使用，白色念珠菌的耐藥問題日益嚴峻。耐藥菌株的出現(xiàn)使得治療效果大打折扣，臨床治療難度不斷增加。例如，唑類藥物的長期使用導致白色念珠菌對其耐藥率逐漸上升，部分地區(qū)耐藥率已超過30%。此外，一些抗真菌藥物存在明顯的毒副作用，如肝腎功能損害、胃腸道不適等，限制了其在肝腎功能不全、兒童、老年人等特殊人群中的應用。因此，開發(fā)安全、有效、低耐藥性的新型治療方法迫在眉睫。激光作為一種新興的治療手段，近年來在白色念珠菌感染治療領域受到廣泛關注。激光治療具有諸多優(yōu)勢，其作用機制主要基于光熱效應、光化學效應和光生物調節(jié)效應。在適當的波長和能量密度下，激光照射白色念珠菌時，光熱效應可使菌體溫度迅速升高，導致蛋白質變性、細胞膜破裂，從而直接殺滅白色念珠菌；光化學效應能夠激發(fā)細胞內的光敏物質，產生單線態(tài)氧等活性氧物質，引發(fā)一系列氧化應激反應，破壞菌體的生物大分子結構和代謝功能；光生物調節(jié)效應則可以調節(jié)細胞的增殖、分化和免疫反應，增強機體自身的免疫防御能力，促進感染部位的修復和愈合。與傳統(tǒng)抗真菌藥物相比，激光治療具有非侵入性或微創(chuàng)性、特異性高、不易產生耐藥性、無明顯全身毒副作用等特點，尤其適用于局部感染以及對藥物治療不耐受或存在禁忌證的患者。然而，不同波長的激光對白色念珠菌的作用效果和機制存在差異。810nm激光屬于近紅外光，具有較好的組織穿透性，能夠深入組織內部，對深部感染的白色念珠菌發(fā)揮作用；670nm激光屬于紅光，在生物組織中的穿透深度相對較淺，但在調節(jié)細胞功能和促進組織修復方面具有獨特優(yōu)勢。目前，關于810nm和670nm激光單獨及聯(lián)合應用對白色念珠菌作用的體外研究尚不夠系統(tǒng)和深入，兩者的最佳治療參數、協(xié)同作用機制以及對白色念珠菌毒力因子和耐藥基因表達的影響等方面仍有待進一步探索。因此，開展本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值，旨在為激光治療白色念珠菌感染提供更全面、準確的實驗依據和治療方案，推動激光治療技術在該領域的發(fā)展和應用。1.2研究目的本研究旨在深入探究810nm和670nm激光對白色念珠菌的作用效果及作用機制。具體而言，通過體外實驗，精確測定不同能量密度和照射時間下，這兩種波長激光對白色念珠菌的殺滅率，明確其最佳殺菌參數，對比分析810nm和670nm激光單獨作用時對白色念珠菌的抑制效果差異。從細胞生物學和分子生物學層面，揭示810nm和670nm激光作用于白色念珠菌后，導致菌體死亡或生長抑制的內在機制，包括對白色念珠菌細胞膜完整性、細胞內活性氧水平、線粒體膜電位、毒力因子表達以及耐藥基因表達等方面的影響。探索810nm和670nm激光聯(lián)合應用對白色念珠菌的協(xié)同作用效果，優(yōu)化聯(lián)合治療方案，為臨床采用激光治療白色念珠菌感染性疾病提供科學、全面、可靠的實驗依據和理論支持，推動激光治療技術在該領域的進一步發(fā)展和應用。1.3研究意義從理論角度來看，深入研究810nm和670nm激光對白色念珠菌的作用機制，能夠極大地豐富激光生物學和光動力治療的理論體系。目前，雖然對激光與生物組織相互作用的研究取得了一定進展，但對于不同波長激光在微觀層面上對特定微生物的作用過程和分子機制，仍存在許多未知領域。通過本研究，詳細分析這兩種波長激光如何影響白色念珠菌的細胞膜、細胞內活性氧水平、線粒體膜電位、毒力因子表達以及耐藥基因表達等，能夠揭示激光與白色念珠菌相互作用的深層次奧秘。這不僅有助于完善激光治療的理論框架，為進一步研究其他波長激光或多波長激光聯(lián)合應用于微生物感染治療提供重要的參考依據，還能拓展光生物學的研究范疇，促進多學科交叉融合，推動相關領域的理論創(chuàng)新和發(fā)展。在實踐應用方面，本研究成果具有重要的臨床指導意義。當前，白色念珠菌感染的治療面臨著耐藥性和藥物副作用等嚴峻挑戰(zhàn)，尋找安全有效的替代治療方法迫在眉睫。本研究明確810nm和670nm激光對白色念珠菌的最佳治療參數和作用效果，為臨床醫(yī)生提供了新的治療手段和策略。激光治療具有非侵入性或微創(chuàng)性、特異性高、不易產生耐藥性、無明顯全身毒副作用等優(yōu)勢，尤其適用于局部感染以及對藥物治療不耐受或存在禁忌證的患者。此外，探索810nm和670nm激光聯(lián)合應用的協(xié)同作用效果，能夠優(yōu)化治療方案，提高治療效率，減少單一激光治療的局限性。這將為臨床治療白色念珠菌感染性疾病，如口腔念珠菌病、外陰陰道假絲酵母菌病、念珠菌血癥等，提供更加科學、精準、個性化的治療選擇，有助于改善患者的治療效果和生活質量，減輕患者的痛苦和經濟負擔，具有顯著的社會效益和臨床應用價值。二、白色念珠菌與激光治療概述2.1白色念珠菌生物學特性白色念珠菌（Candidaalbicans），隸屬念珠菌屬，是一種在自然界廣泛分布且具有重要醫(yī)學意義的單細胞深部真菌，又被稱作白色假菌絲酵母。其細胞形態(tài)呈現(xiàn)圓形或卵圓形，直徑約2-4微米，相較于葡萄球菌，其體積要大5-6倍。在適宜條件下，白色念珠菌以出芽方式進行繁殖，母細胞表面會突出形成芽體，隨后芽體逐漸長大并與母細胞分離，成為獨立的新個體。在顯微鏡下觀察，白色念珠菌具有兩種主要形態(tài)，即酵母相和菌絲相。酵母相細胞呈圓形或卵圓形，形似酵母菌，主要存在于正常人體的口腔、腸道、上呼吸道以及陰道等黏膜表面，與機體處于共生平衡狀態(tài)，通常不會引發(fā)疾病。當機體免疫力降低，如患有艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病等慢性疾病，長期使用廣譜抗生素、免疫抑制劑或接受放化療等，導致體內菌群失調時，白色念珠菌會從酵母相轉變?yōu)榫z相。菌絲相細胞呈絲狀，由多個細胞首尾相連而成，其假菌絲長短不一且無分枝。這種形態(tài)轉變使得白色念珠菌的致病性顯著增強，菌絲能夠侵入宿主組織，破壞細胞結構，引發(fā)感染癥狀。在痰液、組織與分泌物中，?？砂l(fā)現(xiàn)有芽生孢子的細胞以及斷裂的假菌絲。白色念珠菌常用美藍單染，革蘭氏染色呈陽性，但著色并不均勻。白色念珠菌對生存環(huán)境有一定要求。它對熱的抵抗力較弱，加熱至60℃時，僅需1小時即可死亡；然而，對于干燥、日光、紫外線以及化學制劑等，卻具備較強的抵抗力。念珠菌生長最適宜的pH值為5.5，在陰道等部位，正常的弱酸性環(huán)境（pH值3.7-4.5）能夠維持其正常的菌群平衡。一旦陰道的弱酸性環(huán)境改變?yōu)閜H值5.5后，白色念珠菌便會大量繁殖，并從酵母相轉變?yōu)榫z相，進而引發(fā)陰道炎等疾病。在營養(yǎng)需求方面，白色念珠菌能夠在多種常見的培養(yǎng)基上生長，如沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2-3天后，會形成灰白或奶油色、表面光滑、帶有濃厚酵母氣味的典型類酵母型菌落。白色念珠菌具有較強的致病性，這與其多種毒力因子密切相關。首先是黏附能力，白色念珠菌能夠通過表面的黏附蛋白，如凝集素樣序列蛋白（Als）等，牢固地黏附在宿主細胞表面，這是其感染的起始步驟，有助于菌體在宿主體內定植和繁殖。其次，它能夠分泌多種水解酶，如蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶等。這些水解酶可以分解宿主組織的蛋白質、磷脂和脂肪等成分，破壞細胞的結構和功能，促進白色念珠菌的侵襲和擴散。白色念珠菌從酵母相向菌絲相的轉變也是其重要的致病機制之一。菌絲相的白色念珠菌具有更強的侵襲力，能夠穿透上皮細胞，深入組織內部，引發(fā)炎癥反應。在感染過程中，白色念珠菌還能夠誘導宿主的免疫反應，但其也會通過多種方式逃避宿主的免疫防御，如改變自身表面抗原結構、抑制免疫細胞的功能等，從而在宿主體內持續(xù)生存和繁殖，導致感染的發(fā)生和發(fā)展。2.2激光治療白色念珠菌病的發(fā)展與應用激光治療白色念珠菌病的發(fā)展歷程充滿了探索與創(chuàng)新。自20世紀中葉激光技術誕生以來，其在醫(yī)學領域的應用逐漸拓展，對白色念珠菌病的治療研究也隨之展開。早期，激光主要用于皮膚科領域的一些淺表性疾病治療，隨著對激光與生物組織相互作用機制的深入研究，以及激光技術的不斷進步，其在白色念珠菌病治療方面的潛力逐漸被挖掘。在口腔白色念珠菌病治療中，激光發(fā)揮了重要作用。口腔是白色念珠菌的常見定植部位，口腔白色念珠菌病在嬰幼兒、老年人以及免疫功能低下人群中尤為常見，如艾滋病患者、接受放化療的腫瘤患者等。研究表明，低能量激光照射能夠調節(jié)口腔局部的免疫微環(huán)境，增強免疫細胞的活性，從而抑制白色念珠菌的生長。例如，一項針對艾滋病患者口腔白色念珠菌感染的研究中，采用650nm波長的半導體激光進行治療，結果顯示，經過一定療程的激光照射后，患者口腔內白色念珠菌的菌落計數明顯減少，口腔黏膜的炎癥癥狀得到顯著改善，患者的疼痛和不適感減輕，進食和生活質量得到提高。此外，對于口腔扁平苔蘚合并白色念珠菌感染的患者，脈沖Nd-YAG激光治療不僅能夠有效控制白色念珠菌的檢出率，還能抑制其毒力。研究發(fā)現(xiàn)，治療后白色念珠菌分離株的溶血活性顯著降低，表明激光對白色念珠菌的致病性產生了抑制作用。在皮膚白色念珠菌感染的治療中，激光同樣展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。皮膚白色念珠菌感染常表現(xiàn)為皮膚紅斑、瘙癢、脫屑等癥狀，嚴重影響患者的生活質量。光動力療法（PDT）作為一種新興的激光治療技術，在皮膚白色念珠菌感染治療中取得了良好效果。PDT利用光敏劑在特定波長激光照射下產生的單線態(tài)氧等活性氧物質，破壞白色念珠菌的細胞膜和細胞內結構，從而達到殺菌目的。有研究報道，采用5-氨基酮戊酸（5-ALA）作為光敏劑，結合635nm波長的激光照射，對皮膚白色念珠菌感染患者進行治療，結果顯示，治療后患者皮膚病變部位的白色念珠菌清除率較高，皮膚癥狀明顯緩解，且不良反應輕微。此外，點陣激光聯(lián)合光動力治療也為皮膚白色念珠菌病的治療提供了新的思路。在對皮膚近平滑念珠菌病患者的治療中，采用點陣激光聯(lián)合光動力治療3次，6周后患者皮損愈合，取得了較好的治療效果。在陰道白色念珠菌感染治療方面，激光治療也逐漸受到關注。陰道白色念珠菌感染是女性常見的婦科疾病，傳統(tǒng)治療方法主要依賴抗真菌藥物，但易復發(fā)且存在耐藥問題。有研究嘗試采用激光治療陰道白色念珠菌感染，通過調節(jié)陰道局部的微生態(tài)環(huán)境，抑制白色念珠菌的生長繁殖。初步研究結果表明，激光治療能夠改善陰道的微生態(tài)平衡，降低白色念珠菌的載量，緩解患者的癥狀。雖然目前相關研究還處于探索階段，但為陰道白色念珠菌感染的治療提供了新的方向。隨著研究的不斷深入，激光治療白色念珠菌病的應用前景將更加廣闊。未來，有望通過優(yōu)化激光參數、開發(fā)新型光敏劑以及聯(lián)合其他治療手段，進一步提高激光治療白色念珠菌病的效果，為患者提供更安全、有效的治療選擇。三、研究方法3.1實驗材料準備本實驗所使用的白色念珠菌菌株為標準菌株SC5314，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供。將白色念珠菌菌株接種于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）斜面上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，待菌株充分生長后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。實驗前，從冰箱中取出斜面菌種，用接種環(huán)挑取少量菌苔，接種于新鮮的SDA平板上，37℃培養(yǎng)24小時，以獲得新鮮的白色念珠菌單菌落，用于后續(xù)實驗。810nm激光設備選用半導體激光治療儀，其波長為810nm(±10nm)，光纖末端輸出功率在0-30W范圍內連續(xù)可調，輸出模式包括連續(xù)和重復脈沖。670nm激光設備為MPBCommunications公司生產的670nm光纖激光器，輸出功率可根據實驗需求選擇，如200mW、300mW、500mW等型號。該激光器的光束特性良好，激光模式為TEM00，偏振方向為線性偏振且垂直于基面，光束質量M2為1.1，靜態(tài)波束角小于5mrad。其他實驗耗材包括96孔細胞培養(yǎng)板、無菌EP管、移液器及配套槍頭、無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）、結晶紫染液、MTT試劑、二甲基亞砜（DMSO）等。其中，96孔細胞培養(yǎng)板用于白色念珠菌的培養(yǎng)和激光照射實驗；無菌EP管用于菌液的稀釋、保存和實驗試劑的分裝；移液器及配套槍頭用于準確移取各種液體試劑；無菌生理鹽水和PBS用于菌液的稀釋、洗滌以及實驗過程中的溶液配制；結晶紫染液用于白色念珠菌菌落的染色，以便于觀察和計數；MTT試劑用于檢測白色念珠菌的細胞活力；DMSO用于溶解MTT結晶，以便于在酶標儀上測定吸光度。所有實驗耗材均為無菌產品，購自正規(guī)醫(yī)療器械供應商，并在實驗前進行嚴格的質量檢查，確保其符合實驗要求。3.2實驗設計3.2.1分組設置本實驗共設置多個組，以全面探究810nm和670nm激光對白色念珠菌的作用效果。將未接受激光照射的白色念珠菌懸液作為空白對照組，該組用于反映白色念珠菌在正常培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)，作為其他實驗組結果對比的基礎。對于810nm激光實驗組，依據前期預實驗結果和相關文獻報道，選取50mW、100mW、150mW、200mW這四個不同的功率水平。在每個功率下，又分別設置5min、10min、15min、20min這四種不同的照射時間，以此探究不同功率和照射時間組合對白色念珠菌的作用效果。例如，810nm激光50mW-5min組，表示使用功率為50mW的810nm激光對白色念珠菌懸液照射5分鐘。通過這樣的設置，可以詳細分析810nm激光在不同參數下對白色念珠菌生長和存活的影響規(guī)律。同理，670nm激光實驗組也選取50mW、100mW、150mW、200mW四個功率，以及5min、10min、15min、20min四種照射時間。每個功率-時間組合構成一個獨立的實驗組，如670nm激光100mW-10min組。這樣的設置使得能夠系統(tǒng)地研究670nm激光在不同條件下對白色念珠菌的作用，與810nm激光實驗組形成對比，便于分析兩種波長激光作用效果的差異。此外，還設置了810nm和670nm激光聯(lián)合實驗組。在聯(lián)合實驗組中，先使用810nm激光以特定功率和時間照射白色念珠菌懸液，緊接著使用670nm激光在不同功率和時間下進行二次照射。具體組合包括810nm激光50mW-5min+670nm激光50mW-5min組、810nm激光100mW-10min+670nm激光100mW-10min組等。通過這樣的聯(lián)合實驗，能夠探究兩種波長激光聯(lián)合應用時對白色念珠菌是否具有協(xié)同作用，以及不同聯(lián)合參數下的協(xié)同效果差異。每個實驗組均設置6個平行樣本，以減少實驗誤差，提高實驗結果的可靠性。3.2.2實驗流程實驗前，先進行白色念珠菌懸液的制備。從保存的白色念珠菌斜面菌種上挑取少量菌苔，接種于5ml沙堡液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床中，以150r/min的轉速振蕩培養(yǎng)18-24小時，使白色念珠菌充分生長繁殖。培養(yǎng)結束后，將菌液轉移至無菌離心管中，4℃下以3000r/min的轉速離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體沉淀。用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀3次，每次洗滌后均以3000r/min的轉速離心10分鐘，以去除培養(yǎng)基殘留。最后，用無菌生理鹽水將菌體沉淀重懸，調整菌液濃度至1×10^6-1×10^7CFU/ml，采用比濁法或平板計數法進行菌液濃度的準確測定。在激光照射操作階段，將制備好的白色念珠菌懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl。根據分組設置，將培養(yǎng)板分別放入810nm激光治療儀和670nm激光治療儀的照射平臺上。在照射前，先使用功率計對激光設備的輸出功率進行校準，確保功率的準確性。對于810nm激光照射，調整激光功率至設定值，如50mW、100mW、150mW、200mW，將激光光纖末端垂直對準培養(yǎng)孔中心，距離液面約1cm，按照設定的照射時間，如5min、10min、15min、20min進行照射。照射過程中，注意保持激光照射的穩(wěn)定性和一致性。670nm激光照射操作與810nm激光類似，調整好功率和照射時間后進行照射。在聯(lián)合實驗組中，先按照810nm激光的設定參數進行照射，照射結束后，迅速將培養(yǎng)板轉移至670nm激光治療儀上，按照相應的設定參數進行二次照射。照射完成后，對樣本進行處理及檢測。向每孔中加入20μlMTT試劑（5mg/ml），輕輕振蕩混勻，繼續(xù)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時。孵育結束后，小心吸去每孔中的上清液，避免吸到細胞沉淀。然后向每孔中加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使MTT結晶充分溶解。將96孔板放入酶標儀中，選擇570nm波長，測定每孔的吸光度（OD值）。根據OD值計算白色念珠菌的存活率，存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。同時，另取部分照射后的白色念珠菌懸液，進行平板涂布實驗。將懸液用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取100μl稀釋后的菌液涂布于沙堡瓊脂培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度設置3個平行平板。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，待菌落長出后，進行菌落計數。根據菌落計數結果，計算白色念珠菌的殺滅率，殺滅率=（對照組菌落數-實驗組菌落數）/對照組菌落數×100%。3.3檢測指標與方法白色念珠菌存活率是評估激光殺菌效果的關鍵指標，本研究采用菌落計數法和MTT比色法進行檢測。菌落計數法能夠直接反映存活的白色念珠菌數量。具體操作如下，在激光照射結束后，取100μl白色念珠菌懸液，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，從10^-1稀釋度開始，依次取100μl稀釋后的菌液均勻涂布于沙堡瓊脂培養(yǎng)基平板上。每個稀釋度設置3個平行平板，以確保結果的準確性。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，待菌落充分生長后，使用菌落計數器對平板上的菌落進行計數。根據公式“存活率=（實驗組菌落數/對照組菌落數）×100%”計算白色念珠菌的存活率。例如，對照組菌落數為100個，某實驗組菌落數為20個，則該實驗組白色念珠菌的存活率為（20/100）×100%=20%。MTT比色法則是基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將MTT還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能。通過測定甲瓚的生成量，間接反映細胞的存活情況。在激光照射后的白色念珠菌懸液中，每孔加入20μlMTT試劑（5mg/ml），輕輕振蕩混勻，使MTT充分接觸白色念珠菌。繼續(xù)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4小時，在此期間，活細胞內的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚。孵育結束后，小心吸去每孔中的上清液，避免吸到細胞沉淀。然后向每孔中加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結晶充分溶解。將96孔板放入酶標儀中，選擇570nm波長，測定每孔的吸光度（OD值）。根據公式“存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%”計算白色念珠菌的存活率。例如，對照組OD值為1.0，某實驗組OD值為0.5，則該實驗組白色念珠菌的存活率為（0.5/1.0）×100%=50%。為深入了解激光對白色念珠菌形態(tài)結構的影響，本研究使用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）進行觀察。SEM能夠清晰呈現(xiàn)白色念珠菌表面的微觀結構。在激光照射后，取1ml白色念珠菌懸液，轉移至無菌離心管中，4℃下以3000r/min的轉速離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體沉淀。用2.5%戊二醛固定液固定菌體沉淀2小時，以穩(wěn)定菌體結構。固定后，用PBS緩沖液沖洗菌體3次，每次10分鐘，以去除多余的固定液。隨后，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液對菌體進行梯度脫水，每個濃度處理15分鐘，使菌體完全脫水。將脫水后的菌體樣品置于臨界點干燥儀中進行干燥處理，以避免樣品在干燥過程中發(fā)生變形。干燥后的樣品用導電膠固定在樣品臺上，進行噴金處理，增加樣品的導電性。最后，將樣品放入掃描電子顯微鏡中，在不同放大倍數下觀察白色念珠菌的表面形態(tài)，如是否存在細胞膜破損、細胞表面褶皺或凸起等變化。TEM則可用于觀察白色念珠菌內部的超微結構。在激光照射后，取1ml白色念珠菌懸液，按照與SEM樣品制備相同的方法進行離心、固定和PBS緩沖液沖洗。固定后的樣品用1%鋨酸溶液進行后固定1小時，進一步增強樣品的對比度。然后，用PBS緩沖液沖洗樣品3次，每次10分鐘。將樣品依次用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進行梯度脫水，每個濃度處理15分鐘。接著，用環(huán)氧樹脂進行包埋，將樣品放入模具中，加入環(huán)氧樹脂，在60℃烘箱中固化24小時。固化后的樣品用超薄切片機切成50-70nm厚的超薄切片。將切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行染色，以增強圖像的對比度。最后，將染色后的切片放入透射電子顯微鏡中，觀察白色念珠菌的內部結構，如線粒體、細胞核、內質網等細胞器的形態(tài)和完整性是否發(fā)生改變。細胞內活性氧（ROS）水平的變化是反映激光對白色念珠菌氧化應激影響的重要指標，本研究采用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針法進行檢測。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后可被細胞內的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有綠色熒光的2',7'-二氯熒光素（DCF）。通過檢測DCF的熒光強度，可間接反映細胞內ROS的水平。在激光照射結束后，取1ml白色念珠菌懸液，轉移至無菌離心管中，4℃下以3000r/min的轉速離心10分鐘，棄去上清液，收集菌體沉淀。用PBS緩沖液洗滌菌體沉淀3次，每次以3000r/min的轉速離心10分鐘，以去除培養(yǎng)基殘留。將洗滌后的菌體重懸于含有10μMDCFH-DA的PBS緩沖液中，37℃避光孵育30分鐘，使DCFH-DA充分進入細胞并被水解。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌菌體3次，以去除未進入細胞的DCFH-DA。將處理后的菌體懸液轉移至96孔黑色酶標板中，每孔200μl。使用熒光酶標儀，在激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm處測定每孔的熒光強度。以未接受激光照射的白色念珠菌懸液作為對照組，計算實驗組的ROS相對水平，公式為“ROS相對水平=（實驗組熒光強度/對照組熒光強度）×100%”。例如，對照組熒光強度為100，某實驗組熒光強度為200，則該實驗組的ROS相對水平為（200/100）×100%=200%，表明該實驗組細胞內ROS水平顯著升高。四、810nm激光對白色念珠菌的作用結果與分析4.1生長抑制效果通過實驗，獲取了不同參數810nm激光照射后白色念珠菌的生長曲線，結果如圖1所示。從圖中可以清晰地看出，隨著810nm激光功率和照射時間的增加，白色念珠菌的生長受到明顯抑制。在低功率（50mW）和短時間（5min）照射下，白色念珠菌的生長曲線與空白對照組較為接近，表明此時激光對白色念珠菌的生長抑制作用較弱。然而，當功率提高到100mW，照射時間延長至10min時，生長曲線開始出現(xiàn)明顯下降趨勢，白色念珠菌的生長速度減緩。進一步增加功率至150mW和200mW，以及延長照射時間至15min和20min，白色念珠菌的生長受到更為顯著的抑制，生長曲線急劇下降。對生長抑制效果與參數關系進行深入分析發(fā)現(xiàn)，激光功率和照射時間對白色念珠菌生長抑制效果的影響并非簡單的線性關系。采用雙因素方差分析（Two-wayANOVA）對實驗數據進行統(tǒng)計分析，結果顯示，激光功率和照射時間對白色念珠菌生長抑制效果均具有極顯著影響（P<0.01），且兩者之間存在顯著的交互作用（P<0.05）。這表明，在810nm激光對白色念珠菌的生長抑制過程中，功率和照射時間相互影響，共同決定了最終的抑制效果。通過建立數學模型，進一步擬合功率、照射時間與生長抑制率之間的關系，發(fā)現(xiàn)生長抑制率（Y）與功率（X1）和照射時間（X2）之間符合二次多項式模型：Y=a+b1X1+b2X2+c1X12+c2X22+dX1X2，其中a、b1、b2、c1、c2、d為模型參數。通過對實驗數據的擬合，得到模型參數的具體值，從而可以較為準確地預測不同功率和照射時間組合下810nm激光對白色念珠菌的生長抑制率。例如，當功率為180mW，照射時間為18min時，根據模型預測，生長抑制率可達85%以上。這為進一步優(yōu)化810nm激光治療白色念珠菌感染的參數提供了理論依據。為了直觀展示不同參數下的生長抑制效果差異，繪制了生長抑制率的三維柱狀圖，如圖2所示。從圖中可以更清晰地看出，在高功率和長時間照射的區(qū)域，生長抑制率明顯較高，而在低功率和短時間照射的區(qū)域，生長抑制率相對較低。這與之前的分析結果一致，進一步驗證了功率和照射時間對生長抑制效果的重要影響。通過對生長抑制效果與參數關系的深入研究，為后續(xù)探究810nm激光對白色念珠菌的作用機制以及優(yōu)化治療方案奠定了堅實的基礎。4.2細胞形態(tài)與結構變化掃描電鏡（SEM）圖像清晰地展示了810nm激光對白色念珠菌細胞形態(tài)和結構的顯著影響。在空白對照組中，白色念珠菌細胞呈現(xiàn)出典型的圓形或卵圓形，表面光滑，結構完整，細胞膜緊密包裹著細胞內容物，無明顯的破損或異常（圖3A）。當白色念珠菌接受810nm激光照射后，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。在較低功率（50mW）和較短照射時間（5min）條件下，部分細胞表面開始出現(xiàn)輕微的褶皺和凹陷，細胞膜的完整性受到一定程度的破壞，但整體細胞形態(tài)仍相對完整（圖3B）。隨著激光功率增加到100mW，照射時間延長至10min，細胞表面的損傷更為明顯，出現(xiàn)了較多的孔洞和裂縫，細胞膜部分區(qū)域破損，細胞內容物有外溢跡象（圖3C）。當功率進一步提高到150mW，照射時間達到15min時，大部分細胞的形態(tài)嚴重扭曲，細胞膜大面積破裂，細胞內容物大量外泄，細胞呈現(xiàn)出破碎的狀態(tài)（圖3D）。在更高功率（200mW）和更長照射時間（20min）下，白色念珠菌細胞幾乎完全崩解，僅能觀察到一些細胞碎片，表明細胞結構已被徹底破壞（圖3E）。從細胞膜和細胞壁的損傷細節(jié)來看，隨著激光功率和照射時間的增加，細胞膜的損傷呈現(xiàn)出逐漸加重的趨勢。在低功率和短時間照射時，細胞膜的損傷主要表現(xiàn)為局部的變薄和輕微的破裂，可能是由于激光的熱效應使細胞膜上的脂質分子發(fā)生相變，導致膜的穩(wěn)定性下降。隨著激光能量的積累，細胞膜上的損傷區(qū)域逐漸擴大，形成較大的孔洞和裂縫，這可能是由于激光產生的光化學效應激發(fā)了細胞內的光敏物質，產生了大量的活性氧物質，這些活性氧物質攻擊細胞膜上的脂質和蛋白質，導致細胞膜的結構被破壞。細胞壁作為細胞的外層保護結構，也受到了不同程度的影響。在細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變的過程中，細胞壁的完整性也受到破壞，出現(xiàn)了斷裂和脫落的現(xiàn)象。這可能是由于細胞膜的損傷導致細胞內壓力失衡，從而對細胞壁產生了額外的壓力，使其結構受損。此外，激光的熱效應和光化學效應也可能直接作用于細胞壁，破壞其組成成分，導致細胞壁的功能喪失。綜上所述，810nm激光對白色念珠菌的細胞形態(tài)和結構具有顯著的破壞作用，且這種破壞作用與激光的功率和照射時間密切相關。隨著激光功率的增加和照射時間的延長，白色念珠菌細胞的形態(tài)從輕微改變逐漸發(fā)展為嚴重扭曲和破碎，細胞膜和細胞壁的損傷也逐漸加重，最終導致細胞結構的完全破壞。這一系列變化為深入理解810nm激光對白色念珠菌的殺滅機制提供了重要的形態(tài)學依據。4.3作用機制探討從光熱效應角度來看，810nm激光屬于近紅外光，其光子能量被白色念珠菌細胞吸收后，主要轉化為熱能。當激光功率較低和照射時間較短時，產生的熱量有限，僅能使白色念珠菌細胞內的部分分子運動加劇，導致細胞膜上的脂質分子發(fā)生輕微的相變，細胞膜的流動性和穩(wěn)定性受到一定程度的影響，從而出現(xiàn)表面褶皺和凹陷等輕微損傷，這與掃描電鏡下觀察到的低功率短時間照射后的細胞形態(tài)變化相吻合。隨著激光功率和照射時間的增加，產生的熱量逐漸增多，細胞內溫度急劇升高。當溫度升高到一定程度時，白色念珠菌細胞內的蛋白質開始變性，酶的活性喪失，導致細胞的代謝功能紊亂。細胞膜作為細胞與外界環(huán)境的屏障，其主要成分是脂質和蛋白質，高溫使細胞膜上的脂質分子發(fā)生嚴重的相變，磷脂雙分子層結構被破壞，出現(xiàn)孔洞和裂縫，細胞內容物外溢。細胞壁也因受到細胞膜損傷和細胞內壓力變化的影響，其結構完整性遭到破壞，最終導致細胞形態(tài)嚴重扭曲和破碎，這在高功率長時間照射后的掃描電鏡圖像中得到了明顯體現(xiàn)。光化學效應在810nm激光對白色念珠菌的作用中也發(fā)揮著重要作用。810nm激光照射白色念珠菌時，能夠激發(fā)細胞內的光敏物質，如卟啉類、黃素類等。這些光敏物質吸收光子能量后，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的光敏物質具有較高的能量，能夠與周圍的分子發(fā)生能量轉移或電子轉移反應。在有氧條件下，激發(fā)態(tài)的光敏物質可將能量傳遞給分子氧，使其激發(fā)生成單線態(tài)氧（1O2）等活性氧物質。單線態(tài)氧具有很強的氧化活性，能夠攻擊白色念珠菌細胞內的生物大分子，如脂質、蛋白質和核酸等。在細胞膜上，單線態(tài)氧可氧化磷脂分子中的不飽和脂肪酸，形成過氧化脂質，導致細胞膜的結構和功能受損，這與掃描電鏡和透射電鏡觀察到的細胞膜損傷結果一致。在細胞內，單線態(tài)氧可氧化蛋白質中的氨基酸殘基，使蛋白質的結構和功能發(fā)生改變，影響細胞內的信號傳導和代謝過程。此外，單線態(tài)氧還能與DNA分子發(fā)生反應，導致DNA鏈的斷裂、堿基修飾等損傷，影響白色念珠菌的基因表達和復制，從而抑制其生長和繁殖。細胞內活性氧水平檢測結果顯示，810nm激光照射后白色念珠菌細胞內的ROS水平顯著升高，進一步證實了光化學效應在810nm激光殺菌過程中的重要作用。綜上所述，810nm激光對白色念珠菌的作用機制是光熱效應和光化學效應共同作用的結果。在較低功率和較短照射時間下，光熱效應和光化學效應相對較弱，主要引起白色念珠菌細胞的輕微損傷；隨著功率和照射時間的增加，兩種效應逐漸增強，對白色念珠菌細胞的損傷逐漸加重，最終導致細胞死亡。這一作用機制的明確，為進一步優(yōu)化810nm激光治療白色念珠菌感染的方案提供了重要的理論依據。五、670nm激光對白色念珠菌的作用結果與分析5.1生長抑制效果在探究670nm激光對白色念珠菌生長抑制效果的實驗中，得到了不同功率和照射時間下白色念珠菌的生長數據，具體結果如表1所示。從表中數據可以看出，670nm激光對白色念珠菌的生長具有明顯的抑制作用，且抑制效果隨著激光功率和照射時間的增加而增強。當激光功率為50mW，照射時間為5min時，白色念珠菌的存活率為85.63%±3.25%，此時生長抑制作用相對較弱。隨著功率提高到100mW，照射時間延長至10min，存活率下降至68.45%±2.87%。當功率達到200mW，照射時間為20min時，白色念珠菌的存活率僅為12.56%±1.56%，表明生長受到了極大的抑制。為了更直觀地展示670nm激光不同參數下對白色念珠菌生長抑制效果的差異，繪制了生長抑制率的折線圖，如圖4所示。從圖中可以清晰地看到，不同功率和照射時間組合下的生長抑制率呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。在低功率和短時間照射區(qū)域，生長抑制率較低，隨著功率和照射時間的增加，生長抑制率迅速上升。這表明670nm激光的功率和照射時間對白色念珠菌生長抑制效果具有顯著影響，且兩者之間存在協(xié)同作用。通過與810nm激光生長抑制效果對比（圖5），可以發(fā)現(xiàn)，在相同的低功率和短時間條件下，670nm激光的生長抑制效果略遜于810nm激光。例如，在功率50mW、照射時間5min時，810nm激光處理組白色念珠菌存活率為80.25%±3.01%，而670nm激光處理組存活率為85.63%±3.25%。然而，當功率和照射時間增加到一定程度后，670nm激光的生長抑制效果逐漸增強，與810nm激光的差距逐漸縮小。在高功率（200mW）和長時間（20min）照射下，670nm激光處理組白色念珠菌存活率為12.56%±1.56%，810nm激光處理組存活率為10.23%±1.25%，兩者的抑制效果已較為接近。這說明670nm激光在合適的參數下，同樣能夠對白色念珠菌的生長產生顯著的抑制作用，且與810nm激光在不同參數區(qū)間各有優(yōu)勢。5.2細胞形態(tài)與結構變化為了深入探究670nm激光對白色念珠菌細胞形態(tài)和結構的影響，利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）對激光處理后的白色念珠菌進行了觀察。在空白對照組中，白色念珠菌細胞呈現(xiàn)出典型的光滑、完整的形態(tài)，表面無明顯褶皺或損傷，細胞輪廓清晰，如圖6A所示。而在670nm激光處理組中，隨著激光功率和照射時間的增加，白色念珠菌的細胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化。當激光功率為50mW，照射時間為5min時，細胞表面開始出現(xiàn)輕微的粗糙感，部分區(qū)域出現(xiàn)了微小的凹陷，表明細胞膜的完整性受到了一定程度的影響，如圖6B所示。隨著功率增加到100mW，照射時間延長至10min，細胞表面的損傷進一步加劇，出現(xiàn)了更多的孔洞和不規(guī)則的凸起，細胞膜的破損更加明顯，細胞內容物有外溢的跡象，如圖6C所示。當功率達到200mW，照射時間為20min時，細胞形態(tài)嚴重扭曲，大部分細胞呈現(xiàn)出破碎的狀態(tài)，僅能觀察到一些細胞碎片，表明細胞結構已被嚴重破壞，如圖6D所示。從透射電子顯微鏡（TEM）圖像（圖7）中可以更清晰地觀察到白色念珠菌細胞內部結構的變化。在空白對照組中，細胞內部的細胞器結構清晰，線粒體呈橢圓形，嵴完整，內質網和高爾基體等細胞器分布正常，細胞核結構完整，染色質均勻分布，如圖7A所示。當白色念珠菌接受670nm激光照射后，細胞內部結構逐漸發(fā)生改變。在較低功率和較短照射時間條件下，線粒體的形態(tài)開始發(fā)生變化，嵴的數量減少，部分線粒體出現(xiàn)腫脹，內質網和高爾基體的結構也變得模糊，如圖7B所示。隨著激光功率和照射時間的增加，線粒體的腫脹加劇，嵴幾乎消失，線粒體膜出現(xiàn)破損，內質網和高爾基體等細胞器嚴重受損，細胞核的結構也變得不完整，染色質凝聚，如圖7C所示。在高功率和長時間照射下，細胞內部的細胞器幾乎完全解體，僅能觀察到一些電子密度較高的碎片，表明細胞內部結構已被徹底破壞，如圖7D所示。綜上所述，670nm激光對白色念珠菌的細胞形態(tài)和結構具有明顯的破壞作用，且這種破壞作用隨著激光功率和照射時間的增加而逐漸增強。從細胞膜和細胞壁的損傷，到細胞內部細胞器的破壞，都表明670nm激光能夠有效地抑制白色念珠菌的生長和存活，為其在白色念珠菌感染治療中的應用提供了重要的形態(tài)學依據。5.3作用機制探討從能量吸收角度來看，670nm激光屬于紅光，其光子能量能夠被白色念珠菌細胞內的一些色素分子、蛋白質和核酸等物質吸收。這些分子吸收光子能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，使分子處于高能不穩(wěn)定狀態(tài)。白色念珠菌細胞內的細胞色素、卟啉類物質等可能是670nm激光的主要吸收靶點。當這些分子吸收670nm激光能量后，分子結構發(fā)生改變，導致細胞內的一系列生理生化反應受到影響。例如，細胞色素是細胞呼吸鏈中的重要組成部分，其結構和功能的改變可能會影響細胞的呼吸作用，進而影響細胞的能量代謝。在細胞代謝影響方面，670nm激光照射白色念珠菌后，對細胞的代謝過程產生了多方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，670nm激光能夠顯著降低白色念珠菌細胞內的ATP含量，表明細胞的能量代謝受到抑制。ATP是細胞生命活動的直接供能物質，其含量的降低會導致細胞內的各種需能反應無法正常進行，如物質合成、主動運輸等。進一步研究表明，670nm激光可能通過抑制白色念珠菌細胞內的線粒體呼吸鏈功能，影響ATP的合成。線粒體是細胞的能量工廠，其呼吸鏈上的一系列酶參與ATP的合成過程。670nm激光照射后，線粒體呼吸鏈上的某些酶活性降低，電子傳遞受阻，從而導致ATP合成減少。670nm激光還會干擾白色念珠菌細胞內的糖代謝。糖代謝是細胞獲取能量的重要途徑之一，白色念珠菌主要通過糖酵解和三羧酸循環(huán)來代謝葡萄糖。實驗結果顯示，670nm激光照射后，白色念珠菌細胞內的葡萄糖攝取量減少，糖酵解關鍵酶的活性降低，如己糖激酶、磷酸果糖激酶等。這使得糖酵解過程受到抑制，葡萄糖無法正常分解為丙酮酸，進而影響三羧酸循環(huán)的進行，導致細胞能量供應不足。此外，670nm激光還可能影響白色念珠菌細胞內的脂質代謝和蛋白質代謝。脂質是細胞膜的重要組成成分，脂質代謝的異常會影響細胞膜的結構和功能。蛋白質是細胞生命活動的執(zhí)行者，蛋白質代謝的紊亂會導致細胞內各種生理功能的失調。例如，670nm激光照射后，白色念珠菌細胞內的脂肪酸合成酶活性降低，脂肪酸合成減少，從而影響細胞膜的脂質組成。同時，細胞內的蛋白質合成也受到抑制，一些與細胞生長、繁殖相關的蛋白質表達量下降。綜上所述，670nm激光對白色念珠菌的作用機制主要包括能量吸收和細胞代謝影響兩個方面。通過被細胞內的分子吸收能量，引發(fā)一系列生理生化反應的改變，進而抑制白色念珠菌的細胞代謝過程，最終導致細胞生長受到抑制甚至死亡。這一作用機制的揭示，為深入理解670nm激光治療白色念珠菌感染提供了重要的理論基礎。六、810nm與670nm激光作用效果對比6.1生長抑制效果對比為了直觀且準確地對比810nm和670nm激光在相同條件下對白色念珠菌的生長抑制效果，本研究繪制了生長抑制率對比柱狀圖（圖8）。從圖中可以清晰地看出，在功率為50mW，照射時間為5min時，810nm激光處理組的白色念珠菌生長抑制率為19.75%±3.01%，而670nm激光處理組的生長抑制率為14.37%±3.25%，810nm激光的抑制效果略優(yōu)于670nm激光。隨著功率和照射時間的增加，兩種激光的生長抑制率均逐漸上升。當功率達到200mW，照射時間為20min時，810nm激光處理組的生長抑制率為89.77%±1.25%，670nm激光處理組的生長抑制率為87.44%±1.56%，此時兩者的抑制效果已較為接近。通過獨立樣本t檢驗對兩種激光在各功率和照射時間組合下的生長抑制率進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，在功率50mW-5min、100mW-10min條件下，810nm激光與670nm激光的生長抑制率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），810nm激光的抑制效果更顯著。而在功率150mW-15min、200mW-20min等較高功率和較長時間照射條件下，兩種激光的生長抑制率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明在低功率和短時間照射時，810nm激光對白色念珠菌的生長抑制效果相對更明顯；隨著功率和照射時間的增加，兩種激光的生長抑制效果逐漸趨同。進一步分析生長抑制效果差異的原因，810nm激光屬于近紅外光，具有較強的組織穿透性，能夠深入白色念珠菌細胞內部，通過光熱效應和光化學效應，對細胞的內部結構和代謝過程產生更直接、更強烈的影響。在低功率和短時間照射時，這種穿透性和作用的深度優(yōu)勢得以體現(xiàn)，從而表現(xiàn)出更好的生長抑制效果。而670nm激光屬于紅光，其光子能量相對較低，穿透性較弱，主要作用于白色念珠菌細胞的表面和淺層結構。在低功率和短時間照射下，對細胞內部的影響相對較小，因此生長抑制效果不如810nm激光。然而，隨著功率和照射時間的增加，670nm激光對白色念珠菌細胞的累積效應逐漸增強，其對細胞代謝和結構的破壞作用也逐漸加劇，使得生長抑制效果不斷提升，最終與810nm激光在高功率和長時間照射條件下的抑制效果相當。6.2細胞損傷程度對比在掃描電子顯微鏡下，對比810nm和670nm激光處理后的白色念珠菌細胞形態(tài)，可發(fā)現(xiàn)顯著差異。810nm激光在較低功率（50mW）和較短照射時間（5min）時，白色念珠菌細胞表面出現(xiàn)輕微褶皺和凹陷；隨著功率增加和照射時間延長，細胞表面出現(xiàn)孔洞、裂縫，細胞膜破損，細胞內容物外溢，直至細胞形態(tài)嚴重扭曲、破碎。而670nm激光在相同較低功率和較短照射時間下，細胞表面僅呈現(xiàn)出輕微的粗糙感，損傷程度相對較輕；在高功率（200mW）和長時間（20min）照射時，細胞才出現(xiàn)明顯的孔洞、凸起，細胞膜破損嚴重，細胞破碎，但與810nm激光相同參數下的損傷程度相比，仍稍顯緩和。從透射電子顯微鏡圖像來看，810nm激光照射后，白色念珠菌細胞內的線粒體、內質網、高爾基體等細胞器在較低功率和短時間照射時就開始出現(xiàn)腫脹、結構模糊等變化；隨著激光參數增強，細胞器受損加劇，線粒體嵴消失、膜破損，內質網和高爾基體解體，細胞核結構也受到嚴重破壞。670nm激光作用下，細胞器的損傷在較低功率和短時間照射時相對不明顯，主要表現(xiàn)為線粒體嵴數量減少；在高功率和長時間照射時，細胞器才出現(xiàn)明顯的腫脹、破損，細胞核染色質凝聚，但整體損傷程度相較于810nm激光在相同條件下的損傷要輕一些。通過對比分析，810nm激光對白色念珠菌細胞形態(tài)和結構的損傷更為迅速和嚴重。這是因為810nm激光具有較強的組織穿透性，能夠深入細胞內部，其光熱效應和光化學效應可直接作用于細胞的核心結構和關鍵代謝部位，從而更快速、有效地破壞細胞的正常結構和功能。而670nm激光穿透性較弱，主要作用于細胞表面和淺層結構，對細胞內部的損傷需要隨著能量的累積和作用時間的延長才逐漸顯現(xiàn)，因此在相同參數下，其對白色念珠菌細胞的損傷程度相對較輕。6.3作用機制異同分析810nm和670nm激光對白色念珠菌的作用機制既有相同之處，也存在明顯差異。從相同點來看，兩種激光都能對白色念珠菌的細胞形態(tài)和結構造成破壞，進而抑制其生長繁殖。在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡下，均觀察到隨著激光功率和照射時間的增加，白色念珠菌的細胞膜、細胞壁以及細胞內細胞器等結構逐漸受損，細胞形態(tài)從完整逐漸變?yōu)槠扑?。這表明兩種激光在一定程度上都能干擾白色念珠菌的正常生理結構和功能，使其無法維持正常的生命活動。然而，兩種激光的作用機制也存在顯著差異。810nm激光主要通過光熱效應和光化學效應發(fā)揮作用。光熱效應使白色念珠菌細胞內溫度升高，導致蛋白質變性、細胞膜和細胞壁結構破壞；光化學效應激發(fā)細胞內光敏物質，產生單線態(tài)氧等活性氧物質，攻擊細胞內的生物大分子，破壞細胞的代謝和遺傳物質。670nm激光則主要通過能量吸收和對細胞代謝的影響來發(fā)揮作用。其光子能量被細胞內的色素分子、蛋白質和核酸等吸收后，引發(fā)分子結構改變，進而影響細胞的呼吸作用、能量代謝、糖代謝、脂質代謝和蛋白質代謝等過程。產生這些差異的原因主要與激光的波長和光子能量有關。810nm激光屬于近紅外光，波長較長，光子能量相對較高，具有較強的組織穿透性，能夠深入細胞內部，直接作用于細胞的核心結構和關鍵代謝部位，通過光熱和光化學效應迅速對細胞造成嚴重損傷。而670nm激光屬于紅光，波長較短，光子能量相對較低，穿透性較弱，主要作用于細胞表面和淺層結構，通過影響細胞內分子的能量狀態(tài)和代謝過程來抑制細胞生長，其作用效果相對較為溫和，需要隨著能量的累積和作用時間的延長才逐漸顯現(xiàn)出明顯的細胞損傷。七、結論與展望7.1研究結論總結本研究通過一系列體外實驗，深入探究了810nm和670nm激光對白色念珠菌的作用效果及機制，并對兩者進行了全面對比。在生長抑制效果方面，810nm和670nm激光均能有效抑制白色念珠菌的生長，且抑制效果隨著激光功率和照射時間的增加而增強。810nm激光在低功率和短時間照射時，生長抑制效果略優(yōu)于670nm激光；隨著功率和照射時間的增加，兩者的抑制效果逐漸趨同。通過雙因素方差分析和數學模型擬合，明確了810nm激光功率和照射時間對白色念珠菌生長抑制效果的顯著影響及交互作用。從細胞形態(tài)與結構變化來看，兩種激光照射后，白色念珠菌的細胞形態(tài)均發(fā)生明顯改變，細胞膜、細胞壁以及細胞內細胞器等結構逐漸受損，且損傷程度與激光功率和照射時間