Racl與NF-κBp65表達(dá)：解鎖非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移與預(yù)后密碼一、引言1.1研究背景與意義1.1.1非小細(xì)胞肺癌現(xiàn)狀肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。其中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）占據(jù)了所有肺癌病例的大約85%，是最為常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，男性的非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率大概在十萬(wàn)分之五十左右，女性接近十萬(wàn)分之三十，在國(guó)內(nèi)肺癌的發(fā)病率居于首位，2018年的數(shù)據(jù)顯示，肺癌新發(fā)病率占所有腫瘤新發(fā)病例的18%。盡管當(dāng)前針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療手段，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等不斷發(fā)展，但患者的總體預(yù)后仍然不容樂(lè)觀(guān)，五年生存率仍然不足20%。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者死亡的關(guān)鍵因素之一，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的治療難度大幅增加，生存時(shí)間顯著縮短。例如，非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移屬于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)腫瘤已進(jìn)展到晚期，治療難度極大，患者中位生存期僅8-10個(gè)月，1年生存期為30%-35%，2年生存期只有10%-15%。不同分期的非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率差異明顯，Ⅰ期患者5年生存率約為70%，Ⅱ期約為50%，ⅢA期約為30%，而ⅢB期能手術(shù)切除者5年生存率大概在15-30%，不能手術(shù)切除者與Ⅳ期相同，僅有5-10%，Ⅳ期患者因已發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)法手術(shù)切除，單純放、化療的5年生存率更是不到10%。因此，深入研究非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善患者的生存狀況、提高生存率具有極其重要的緊迫性和現(xiàn)實(shí)意義。1.1.2Racl和NF-κBp65研究意義Racl屬于RhoGTP酶家族的重要成員，在細(xì)胞極性、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究表明，Racl在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高，并且與腫瘤的浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從原位“跳”到遠(yuǎn)處，促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲，被視為非小細(xì)胞肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移的重要促進(jìn)因素。NF-κBp65是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族的一個(gè)亞單位，可激活眾多與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平也顯著升高，與腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移緊密相連。它不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原位轉(zhuǎn)移，還能抵抗化療藥物的作用，同時(shí)促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，提高腫瘤細(xì)胞的存活能力，進(jìn)一步推動(dòng)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。鑒于Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用，對(duì)它們與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行深入研究，有望為非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的分子標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)它們的表達(dá)水平，或許能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后情況，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供有力依據(jù)，從而提高治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的臨床治療和患者生存具有重要的潛在價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌中的研究開(kāi)展較早且較為深入。早在2000年，就有學(xué)者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Racl在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)異常升高，并且干擾Racl的表達(dá)能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，首次揭示了Racl與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移之間的潛在關(guān)聯(lián)。隨后，一系列研究從分子機(jī)制層面進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)Racl可以通過(guò)激活下游的WASP-Arp23復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，從而改變細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供動(dòng)力。在NF-κBp65方面，國(guó)外研究人員利用基因敲除技術(shù)，在小鼠非小細(xì)胞肺癌模型中證實(shí)了NF-κBp65基因缺失后，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，同時(shí)腫瘤組織中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白如MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）等表達(dá)顯著降低，揭示了NF-κBp65在調(diào)控非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)中的關(guān)鍵作用。此外，還有研究通過(guò)對(duì)大量非小細(xì)胞肺癌患者的臨床樣本分析，發(fā)現(xiàn)NF-κBp65的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)組患者的五年生存率明顯低于低表達(dá)組。國(guó)內(nèi)對(duì)Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌中的研究也取得了諸多成果。有研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用免疫組織化學(xué)和Westernblot等技術(shù)，對(duì)不同分期的非小細(xì)胞肺癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平均隨著腫瘤分期的升高而顯著增加，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，抑制Racl的活性可以下調(diào)NF-κBp65的磷酸化水平，進(jìn)而抑制其核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，減少相關(guān)促轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)，提示Racl可能通過(guò)調(diào)控NF-κBp65信號(hào)通路來(lái)影響非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移。在臨床應(yīng)用探索方面，國(guó)內(nèi)有學(xué)者嘗試將Racl和NF-κBp65作為聯(lián)合診斷指標(biāo)，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的病情進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度均高于單獨(dú)檢測(cè)，為臨床早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供了新的思路。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在Racl和NF-κBp65與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系的研究上已取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前的研究多集中在細(xì)胞和動(dòng)物模型層面，臨床大樣本、多中心的研究相對(duì)較少，導(dǎo)致研究結(jié)果的普遍性和可靠性受到一定限制。此外，雖然已知Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但它們之間具體的相互作用機(jī)制以及與其他信號(hào)通路之間的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確。在預(yù)后評(píng)估方面，現(xiàn)有的研究多是將兩者分別與預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，缺乏對(duì)兩者聯(lián)合作為預(yù)后評(píng)估指標(biāo)的系統(tǒng)研究，難以全面、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況。本研究將在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，通過(guò)收集大量非小細(xì)胞肺癌患者的臨床標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡等多種技術(shù)，深入探討Racl和NF-κBp65的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步研究?jī)烧咧g的相互作用機(jī)制，以期為非小細(xì)胞肺癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供更為全面、準(zhǔn)確的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究旨在深入探討Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，明確它們與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間的具體關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移狀態(tài)和預(yù)后情況的非小細(xì)胞肺癌患者組織中Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異與腫瘤轉(zhuǎn)移、患者生存期等臨床指標(biāo)的相關(guān)性，從而為非小細(xì)胞肺癌的臨床診斷提供新的潛在分子標(biāo)志物，幫助醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷患者的病情和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，研究?jī)烧咴诜切〖?xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制，探索以Racl和NF-κBp65為靶點(diǎn)的治療策略，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的思路和方法，最終改善患者的預(yù)后，提高生存率。1.3.2研究方法本研究將通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段來(lái)深入探究Racl和NF-κBp65與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)方法上，首先進(jìn)行病例采集，選取某一時(shí)間段內(nèi)在特定醫(yī)院接受手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者的組織標(biāo)本，同時(shí)收集正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照。根據(jù)患者的腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，將非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組。接著運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法，對(duì)收集的組織標(biāo)本進(jìn)行處理，使用特異性抗體分別標(biāo)記Racl和NF-κBp65蛋白，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察并分析它們?cè)诓煌M織中的表達(dá)定位和表達(dá)強(qiáng)度。蛋白質(zhì)印跡分析也是重要的實(shí)驗(yàn)方法之一，提取組織中的總蛋白，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再將其轉(zhuǎn)移到固相膜上，用特異性抗體檢測(cè)Racl和NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平，以半定量的方式準(zhǔn)確評(píng)估它們?cè)诜伟┙M織和正常肺組織中的表達(dá)差異。在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方面，采用SPSS等專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對(duì)于兩組之間的比較，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組之間的比較則采用方差分析。分析Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床病理特征，如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析。運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，分析Racl和NF-κBp65的表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系，并通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析，篩選出影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，綜合評(píng)估Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的作用。二、非小細(xì)胞肺癌概述2.1非小細(xì)胞肺癌的定義與分類(lèi)非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最為常見(jiàn)的類(lèi)型，約占所有肺癌病例的85%。從定義上講，它是指除小細(xì)胞肺癌（SCLC）以外的所有肺癌類(lèi)型，其癌細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散速度相對(duì)較慢，對(duì)化療和放療的敏感性也低于小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌涵蓋多種病理類(lèi)型，主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等，不同類(lèi)型具有各自獨(dú)特的特點(diǎn)。腺癌是最常見(jiàn)的非小細(xì)胞肺癌亞型，在肺癌中的占比約為40%。女性腺癌患者相對(duì)多見(jiàn)，主要起源于支氣管黏液腺，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道。根據(jù)組織學(xué)特征，腺癌又可細(xì)分為5個(gè)亞型，其中附壁型（CT表現(xiàn)為磨玻璃結(jié)節(jié)）惡性程度相對(duì)較低，實(shí)體型和微乳頭型（CT表現(xiàn)為實(shí)性結(jié)節(jié)）惡性程度較高。在分子特征方面，腺癌患者常伴有一些特定的基因突變，如EGFR、ALK等，這些突變與靶向治療的選擇密切相關(guān)，醫(yī)生會(huì)根據(jù)腫瘤基因檢測(cè)結(jié)果，決定患者適合接受靶向藥物治療還是化療。鱗癌在非小細(xì)胞肺癌中也占有一定比例，常見(jiàn)于老年男性。它一般生長(zhǎng)較為緩慢，轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，這使得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)相對(duì)較多，5年生存率在非小細(xì)胞肺癌各亞型中相對(duì)較高。不過(guò)，鱗癌對(duì)化療和放療的敏感性不如小細(xì)胞肺癌。鱗癌主要起源于較大的支氣管，常表現(xiàn)為中央型肺癌，在顯微鏡下可見(jiàn)癌細(xì)胞具有角化珠和細(xì)胞間橋等特征。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，較為少見(jiàn)，在肺癌中的占比通常在10%以下。其在細(xì)胞學(xué)和組織結(jié)構(gòu)及免疫表型等方面缺乏小細(xì)胞癌、腺癌或鱗癌的典型特征。大細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，手術(shù)切除機(jī)會(huì)相對(duì)較大。大細(xì)胞癌的癌細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核大且形態(tài)多樣，細(xì)胞質(zhì)豐富，惡性程度較高。除了上述主要類(lèi)型外，非小細(xì)胞肺癌還包括腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、NUT癌、唾液腺型癌等其他少見(jiàn)類(lèi)型。這些少見(jiàn)類(lèi)型各自具有獨(dú)特的病理特征和臨床行為，在診斷和治療上也具有一定的特殊性。例如，腺鱗癌同時(shí)具有腺癌和鱗癌的成分，其治療方案需要綜合考慮兩種癌的特點(diǎn)；肉瘤樣癌具有肉瘤的形態(tài)學(xué)特征，惡性程度高，預(yù)后較差。2.2非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率與死亡率非小細(xì)胞肺癌在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。從全球數(shù)據(jù)來(lái)看，肺癌是發(fā)病率位居第二、死亡率位居第一的癌種，在所有癌癥病例中，肺癌約占11.4%的新發(fā)病例，而因癌癥死亡的病例中，肺癌占比高達(dá)18%。在這其中，非小細(xì)胞肺癌又占據(jù)了肺癌病例的80-85%，是肺癌的主要構(gòu)成部分。以2020年為例，全球新增肺癌病例約220萬(wàn)例，死亡病例約180萬(wàn)例，按照非小細(xì)胞肺癌的占比推算，當(dāng)年新增非小細(xì)胞肺癌病例約176-187萬(wàn)例，死亡病例約144-153萬(wàn)例，數(shù)量極為龐大。在我國(guó)，非小細(xì)胞肺癌的形勢(shì)同樣嚴(yán)峻。肺癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均高居首位，發(fā)病率約為17.9%，死亡率達(dá)到23.8%，且均高于全球平均水平。2022年我國(guó)新發(fā)肺癌病例數(shù)約106萬(wàn)，死亡人數(shù)高達(dá)74萬(wàn)。這意味著，我國(guó)每年新增的非小細(xì)胞肺癌病例可能在84.8-90.1萬(wàn)例左右，死亡病例約62.9-63.9萬(wàn)例。從變化趨勢(shì)來(lái)看，過(guò)去幾十年間，我國(guó)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率總體呈上升態(tài)勢(shì)，這與多種因素密切相關(guān)。隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加速，空氣污染日益嚴(yán)重，汽車(chē)尾氣、工業(yè)廢氣等污染物的排放增加，為肺癌的發(fā)生埋下隱患。例如，在一些重工業(yè)城市，空氣中的PM2.5、苯并芘等有害物質(zhì)含量較高，長(zhǎng)期暴露在這樣的環(huán)境中，會(huì)增加患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。吸煙也是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率上升的重要因素，我國(guó)吸煙人數(shù)眾多，煙民數(shù)量超過(guò)3億，吸煙產(chǎn)生的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)會(huì)對(duì)肺部造成持續(xù)性損傷，進(jìn)而引發(fā)肺癌。此外，人口老齡化程度的加深，使得患癌風(fēng)險(xiǎn)增加，也在一定程度上推動(dòng)了非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率的上升。在死亡率方面，盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在非小細(xì)胞肺癌的治療上取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的更新、靶向治療和免疫治療的出現(xiàn)等，但非小細(xì)胞肺癌患者的總體死亡率仍然居高不下。這主要是因?yàn)榇蟛糠只颊咴诖_診時(shí)已處于中晚期，腫瘤已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。例如，約70%的患者在確診時(shí)已處于Ⅲ期或Ⅳ期，此時(shí)腫瘤細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散到周?chē)M織或遠(yuǎn)處器官，治療難度大幅增加。中晚期患者的五年生存率較低，Ⅲ期患者的五年生存率約為30%，Ⅳ期患者更是不到10%。即使接受了綜合治療，患者的復(fù)發(fā)率也較高，這進(jìn)一步降低了患者的生存率。非小細(xì)胞肺癌對(duì)人類(lèi)健康的嚴(yán)重威脅不容忽視，深入研究其發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移規(guī)律以及有效的治療和預(yù)后評(píng)估方法迫在眉睫。二、非小細(xì)胞肺癌概述2.3非小細(xì)胞肺癌的治療現(xiàn)狀2.3.1傳統(tǒng)治療方法手術(shù)治療是早期非小細(xì)胞肺癌的重要治療手段，對(duì)于Ⅰ期和部分Ⅱ期患者，手術(shù)切除腫瘤是實(shí)現(xiàn)根治的主要途徑。手術(shù)方式包括肺葉切除、肺段切除和楔形切除等，醫(yī)生會(huì)根據(jù)腫瘤的位置、大小以及患者的身體狀況等因素選擇合適的手術(shù)方式。例如，對(duì)于位于肺周邊、直徑較小的腫瘤，楔形切除或肺段切除可能是較好的選擇，既能切除腫瘤，又能最大程度保留肺功能；而對(duì)于腫瘤較大或位置靠近中央的患者，可能需要進(jìn)行肺葉切除。手術(shù)治療能夠直接去除腫瘤組織，早期患者通過(guò)手術(shù)切除后，五年生存率相對(duì)較高，Ⅰ期患者的五年生存率可達(dá)70%左右。然而，手術(shù)治療也存在一定局限性，對(duì)于中晚期患者，由于腫瘤可能已經(jīng)侵犯周?chē)M織或發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除難度大，且術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高。部分患者由于身體狀況較差，如心肺功能不全等，無(wú)法耐受手術(shù)，也不能選擇手術(shù)治療。化療在非小細(xì)胞肺癌的治療中也占據(jù)重要地位，無(wú)論是早期患者術(shù)后的輔助化療，還是中晚期無(wú)法手術(shù)患者的主要治療手段，化療都能發(fā)揮作用。化療藥物通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞分裂等方式來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞。常用的化療藥物有鉑類(lèi)（如順鉑、卡鉑）、紫杉類(lèi)（如紫杉醇、多西他賽）、長(zhǎng)春瑞濱、吉西他濱等。對(duì)于早期患者，術(shù)后輔助化療可以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高生存率；對(duì)于晚期患者，化療可以控制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，緩解癥狀，延長(zhǎng)生存期。一項(xiàng)針對(duì)Ⅱ-Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌患者的研究顯示，術(shù)后接受輔助化療的患者，五年生存率比未接受化療的患者提高了約5%-10%。化療也伴隨著諸多副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，這些副作用會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，部分患者可能因無(wú)法耐受副作用而中斷治療。而且，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，隨著化療次數(shù)的增加，化療效果會(huì)逐漸下降，限制了化療的長(zhǎng)期療效。放療同樣是治療非小細(xì)胞肺癌的重要手段之一，它利用高能射線(xiàn)（如X射線(xiàn)、γ射線(xiàn)等）殺死腫瘤細(xì)胞。放療可分為根治性放療、姑息性放療和輔助放療。根治性放療適用于不能手術(shù)的早期患者或局部晚期患者，通過(guò)高劑量的射線(xiàn)照射，試圖達(dá)到根治腫瘤的目的；姑息性放療則主要用于緩解晚期患者的癥狀，如骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛、腦轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的顱內(nèi)壓增高等；輔助放療通常在手術(shù)前后進(jìn)行，術(shù)前放療可以縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率，術(shù)后放療可以降低局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于早期不能手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者，采用立體定向放療，局部控制率可達(dá)80%-90%，五年生存率約為30%-40%。放療也存在一定的不良反應(yīng)，如放射性肺炎、放射性食管炎等，會(huì)給患者帶來(lái)不適，影響治療效果和生活質(zhì)量。放療的適用范圍也受到腫瘤位置、大小以及患者身體狀況等因素的限制，對(duì)于一些腫瘤周?chē)兄匾鞴俚幕颊?，放療劑量和范圍的選擇需要謹(jǐn)慎，以免對(duì)正常組織造成過(guò)大損傷。2.3.2靶向治療與免疫治療靶向治療是近年來(lái)非小細(xì)胞肺癌治療領(lǐng)域的重大突破，它針對(duì)腫瘤細(xì)胞中特定的分子靶點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)治療。非小細(xì)胞肺癌常見(jiàn)的靶向突變基因有EGFR、ALK、ROS1等。以EGFR突變?yōu)槔?，在東亞人群中，EGFR突變率約為40%-50%。EGFR-TKI（酪氨酸激酶抑制劑）是針對(duì)EGFR突變的靶向藥物，第一代EGFR-TKI如吉非替尼、厄洛替尼，通過(guò)與EGFR激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制其磷酸化，從而阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。臨床研究表明，對(duì)于EGFR突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者，使用第一代EGFR-TKI治療的客觀(guān)緩解率可達(dá)70%左右，無(wú)進(jìn)展生存期約為10-12個(gè)月。然而，大多數(shù)患者在使用第一代EGFR-TKI治療9-12個(gè)月后會(huì)出現(xiàn)耐藥。為解決耐藥問(wèn)題，第二代不可逆性EGFR-TKI如阿法替尼、達(dá)克替尼問(wèn)世，它們與EGFR共價(jià)結(jié)合，親和力更強(qiáng)，對(duì)部分第一代藥物耐藥的患者仍有一定療效。針對(duì)T790M耐藥突變，第三代EGFR-TKI奧希替尼應(yīng)運(yùn)而生，它不僅對(duì)敏感突變有效，還能克服T790M耐藥突變，顯著延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期，中位無(wú)進(jìn)展生存期可達(dá)18.9個(gè)月。ALK融合基因也是非小細(xì)胞肺癌的重要驅(qū)動(dòng)基因之一，在非小細(xì)胞肺癌中的突變率約為3%-7%。ALK抑制劑如克唑替尼、阿來(lái)替尼、塞瑞替尼等，通過(guò)抑制ALK激酶活性，阻斷下游信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。克唑替尼是第一代ALK抑制劑，對(duì)ALK陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者具有較好的療效，客觀(guān)緩解率可達(dá)70%-80%，但容易出現(xiàn)耐藥，且對(duì)腦轉(zhuǎn)移的控制效果不佳。第二代ALK抑制劑阿來(lái)替尼和塞瑞替尼在療效和安全性上有了進(jìn)一步提升，阿來(lái)替尼的中位無(wú)進(jìn)展生存期長(zhǎng)達(dá)34.8個(gè)月，且對(duì)腦轉(zhuǎn)移患者也有較好的療效，能夠顯著降低腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。第三代ALK抑制劑勞拉替尼對(duì)一、二代ALK抑制劑耐藥的患者仍有較高的活性，并且具有更強(qiáng)的血腦屏障穿透能力，對(duì)腦轉(zhuǎn)移患者的治療效果顯著。免疫治療是另一種新型的非小細(xì)胞肺癌治療方法，它通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞。目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的是免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑帕博利珠單抗、納武利尤單抗，以及程序性死亡受體配體1（PD-L1）抑制劑阿替利珠單抗、度伐利尤單抗等。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的作用機(jī)制是阻斷腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制，使T細(xì)胞能夠重新識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，免疫治療單藥或聯(lián)合化療都取得了顯著的療效。在KEYNOTE-024研究中，對(duì)于PD-L1表達(dá)≥50%的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，帕博利珠單抗單藥治療的中位無(wú)進(jìn)展生存期為10.3個(gè)月，中位總生存期為30個(gè)月，而化療組的中位無(wú)進(jìn)展生存期為6個(gè)月，中位總生存期為14.2個(gè)月。免疫治療聯(lián)合化療也顯示出更好的療效，在IMpower150研究中，阿替利珠單抗聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者，中位無(wú)進(jìn)展生存期為8.3個(gè)月，中位總生存期為19.2個(gè)月，顯著優(yōu)于單純化療組。然而，靶向治療和免疫治療也面臨一些挑戰(zhàn)。靶向治療的局限性在于，只有存在特定基因突變的患者才能從治療中獲益，對(duì)于沒(méi)有相應(yīng)靶點(diǎn)的患者，靶向治療無(wú)效。而且，腫瘤細(xì)胞容易對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥，耐藥機(jī)制復(fù)雜，一旦出現(xiàn)耐藥，治療難度增大。免疫治療雖然在部分患者中取得了顯著療效，但并非所有患者都能從中受益，有效率大約在20%-40%左右。免疫治療還可能引發(fā)一系列免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性甲狀腺炎等，嚴(yán)重時(shí)可能危及生命。此外，免疫治療的費(fèi)用較高，給患者和社會(huì)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2.4非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移與預(yù)后的關(guān)系轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，它極大地增加了治療難度，顯著降低了患者的生存率和生活質(zhì)量。一旦非小細(xì)胞肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的五年生存率會(huì)急劇下降。以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為例，當(dāng)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到身體其他部位，如腦、骨、肝等遠(yuǎn)處器官時(shí)，患者的五年生存率往往不足10%。這是因?yàn)檫h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移使得腫瘤細(xì)胞難以通過(guò)手術(shù)完全切除，且轉(zhuǎn)移部位的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療等傳統(tǒng)治療手段的敏感性降低，導(dǎo)致治療效果不佳。例如，非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的中位生存期僅8-10個(gè)月，1年生存期為30%-35%，2年生存期只有10%-15%。這是由于腦部血腦屏障的存在，使得許多化療藥物難以有效進(jìn)入腦部，對(duì)腦轉(zhuǎn)移瘤的治療效果有限，同時(shí)腦轉(zhuǎn)移瘤會(huì)引起顱內(nèi)壓升高、神經(jīng)功能障礙等嚴(yán)重并發(fā)癥，進(jìn)一步危及患者生命。不同的轉(zhuǎn)移部位對(duì)患者生存期和生活質(zhì)量有著不同程度的影響。骨轉(zhuǎn)移在非小細(xì)胞肺癌中較為常見(jiàn)，約30%-40%的晚期患者會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。雖然骨轉(zhuǎn)移本身并不直接威脅生命，但會(huì)引發(fā)一系列并發(fā)癥，如骨折后的長(zhǎng)期臥床可能導(dǎo)致肺部感染、深靜脈血栓等，從而間接縮短患者的生存期。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者中位生存期一般為6-12個(gè)月，5年生存率低于10%。肝轉(zhuǎn)移也是非小細(xì)胞肺癌常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一，一旦發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，患者的肝功能會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害，出現(xiàn)黃疸、腹水、肝功能衰竭等癥狀。肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，中位生存期通常在3-6個(gè)月左右，這是因?yàn)楦闻K是人體重要的代謝和解毒器官，腫瘤轉(zhuǎn)移到肝臟后，會(huì)迅速破壞肝臟的正常功能，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，且肝臟的血供豐富，腫瘤細(xì)胞容易在肝臟內(nèi)快速生長(zhǎng)和擴(kuò)散。轉(zhuǎn)移程度同樣對(duì)患者的預(yù)后有著顯著影響。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期系統(tǒng)，T代表原發(fā)腫瘤的大小和侵犯范圍，N代表區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，M代表遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。隨著T、N、M分期的升高，患者的轉(zhuǎn)移程度逐漸加重，預(yù)后也越來(lái)越差。例如，Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者，腫瘤局限于肺部，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，五年生存率可達(dá)70%左右；而Ⅳ期患者，腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，五年生存率不到10%。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，N0表示無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N1表示同側(cè)支氣管旁或肺門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N2表示同側(cè)縱隔和隆突下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N3表示對(duì)側(cè)縱隔、對(duì)側(cè)肺門(mén)、同側(cè)或?qū)?cè)斜角肌或鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度從N0到N3逐漸加重，患者的五年生存率顯著降低，N0患者五年生存率相對(duì)較高，而N3患者五年生存率極低。這是因?yàn)榱馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移程度的增加，意味著腫瘤細(xì)胞已經(jīng)通過(guò)淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到更多區(qū)域，手術(shù)難以徹底清除，且腫瘤細(xì)胞更容易通過(guò)淋巴系統(tǒng)進(jìn)一步擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官，導(dǎo)致全身轉(zhuǎn)移，增加治療難度，降低患者的生存機(jī)會(huì)。三、Racl和NF-κBp65的生物學(xué)特性3.1Racl的結(jié)構(gòu)與功能3.1.1Racl的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Racl全稱(chēng)Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Ras-relatedC3botulinumtoxinsubstrate1），是RhoGTP酶家族的重要成員，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重組等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從分子結(jié)構(gòu)來(lái)看，Racl基因定位于人類(lèi)第7號(hào)染色體上，全長(zhǎng)約29kb，包含7個(gè)外顯子。其編碼的蛋白質(zhì)由約192個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為21kDa。Racl具有典型的RhoGTP酶結(jié)構(gòu)特征，包含一個(gè)高度保守的G結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是其與GTP或GDP結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。G結(jié)構(gòu)域由5個(gè)α螺旋、6個(gè)β折疊以及若干環(huán)區(qū)組成，形成了一個(gè)緊密的三維結(jié)構(gòu)。在G結(jié)構(gòu)域中，存在一些關(guān)鍵的氨基酸殘基，如位于P環(huán)（phosphate-bindingloop）上的G1box（GXXXXGK[S/T]），它對(duì)于Racl與GTP的磷酸基團(tuán)結(jié)合至關(guān)重要；SwitchI和SwitchII區(qū)域則在Racl結(jié)合GTP或GDP時(shí)發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，從而介導(dǎo)Racl與下游效應(yīng)分子的相互作用。例如，當(dāng)Racl結(jié)合GTP時(shí)，SwitchI和SwitchII區(qū)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，暴露出與下游效應(yīng)分子結(jié)合的位點(diǎn)，使得Racl能夠激活下游信號(hào)通路。除了G結(jié)構(gòu)域，Racl還含有一個(gè)C末端的多堿性區(qū)域，該區(qū)域?qū)τ赗acl在細(xì)胞膜上的定位和功能發(fā)揮具有重要作用。多堿性區(qū)域富含帶正電荷的氨基酸殘基，能夠與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂分子相互作用，從而使Racl定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，便于接收來(lái)自細(xì)胞膜表面受體的信號(hào)并傳遞到細(xì)胞內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，缺失C末端多堿性區(qū)域的Racl突變體無(wú)法正常定位于細(xì)胞膜，其功能也受到顯著影響。Racl獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使其能夠在細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)地發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控作用，為其參與多種生物學(xué)過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。3.1.2Racl在細(xì)胞中的正常功能在正常細(xì)胞中，Racl參與眾多重要的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能起著不可或缺的作用。細(xì)胞極性的建立是細(xì)胞正常生理功能的重要基礎(chǔ)，Racl在其中扮演著關(guān)鍵角色。以上皮細(xì)胞為例，上皮細(xì)胞具有明顯的極性，分為頂端和基底側(cè)，不同部位執(zhí)行不同的功能。Racl通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器在不同區(qū)域的特異性分布，從而建立和維持上皮細(xì)胞的極性。研究表明，在極化的上皮細(xì)胞中，Racl主要分布于細(xì)胞的頂端區(qū)域，它能夠激活下游的效應(yīng)分子，如PAK（p21-activatedkinase）等，PAK進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的組裝和排列，使得細(xì)胞頂端的微絨毛等結(jié)構(gòu)得以正常形成和維持，保證上皮細(xì)胞能夠有效地進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是細(xì)胞實(shí)現(xiàn)多種生理功能的重要方式，Racl在這一過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，Racl通過(guò)與多種信號(hào)分子和細(xì)胞骨架成分相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)方向。當(dāng)細(xì)胞受到趨化因子等外界信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的受體被激活，進(jìn)而激活Racl?；罨腞acl促進(jìn)細(xì)胞前端的肌動(dòng)蛋白聚合，形成片狀偽足和絲狀偽足，這些偽足向前伸展并與周?chē)h(huán)境相互作用，為細(xì)胞的遷移提供動(dòng)力。同時(shí)，Racl還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞后端的黏附解除，使得細(xì)胞能夠順利地向前移動(dòng)。在免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞的吞噬作用中，Racl同樣發(fā)揮著重要作用。巨噬細(xì)胞通過(guò)識(shí)別和吞噬病原體來(lái)清除入侵的微生物，Racl參與調(diào)控吞噬體的形成和成熟過(guò)程。當(dāng)巨噬細(xì)胞識(shí)別到病原體后，Racl被激活，它促使細(xì)胞膜局部?jī)?nèi)陷，形成吞噬泡，將病原體包裹其中。隨后，Racl繼續(xù)參與調(diào)節(jié)吞噬泡與溶酶體的融合，使吞噬體內(nèi)的病原體被降解和清除。Racl在細(xì)胞周期調(diào)控中也具有重要作用。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖和分化的基礎(chǔ)，Racl通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞周期的G1期，Racl的活性對(duì)于細(xì)胞能否順利進(jìn)入S期至關(guān)重要。Racl可以通過(guò)激活下游的PI3K（phosphoinositide3-kinase）-Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換。如果Racl的功能受到抑制，細(xì)胞周期可能會(huì)停滯在G1期，影響細(xì)胞的增殖。Racl在正常細(xì)胞中的這些功能相互協(xié)調(diào)，共同維持著細(xì)胞的正常生理狀態(tài)和生命活動(dòng)。3.2NF-κBp65的結(jié)構(gòu)與功能3.2.1NF-κBp65的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)NF-κBp65，也被稱(chēng)為RelA，是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族中的關(guān)鍵成員。在哺乳動(dòng)物中，NF-κB家族共有5個(gè)成員，分別是RelA（p65）、c-Rel、RelB、NF-κB1（p105/p50）和NF-κB2（p100/p52），它們?cè)诩?xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。NF-κBp65的分子結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的特征，其N(xiāo)端擁有高度保守的Rel同源區(qū)（Relhomologyregion，RHR），該區(qū)域由N端結(jié)構(gòu)域（N-terminaldomain，NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（C-terminaldomain，CTD）相互連接構(gòu)成。在CTD上存在一個(gè)核定位區(qū)域（nuclear-localizationsequence，NLS），這個(gè)區(qū)域?qū)τ贜F-κBp65與DNA的特異性結(jié)合、自身的二聚化以及向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移過(guò)程起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NF-κBp65需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能時(shí)，NLS會(huì)與細(xì)胞核內(nèi)的輸入蛋白相互作用，從而引導(dǎo)NF-κBp65順利進(jìn)入細(xì)胞核。RelA（p65）、c-Rel和RelB的C端還存在反式激活結(jié)構(gòu)域（transactivationdomain，TD），這一結(jié)構(gòu)域能夠有效地激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。以NF-κBp65與p50形成的異二聚體為例，在受到細(xì)胞外刺激后，NF-κBp65的TD會(huì)招募轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，如CBP/p300等，這些輔助激活因子能夠與RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用，從而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。p50和p52與NF-κBp65有所不同，它們僅含有RHR，缺乏TD，因此，p50和p52的同源二聚體并不具備激活基因轉(zhuǎn)錄的能力，而是常常作為一種抑制分子存在于細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞中，p50和p52通常各自以前體p105和p100的形式存在，在特定的信號(hào)刺激下，p105和p100會(huì)被蛋白酶體裂解，從而產(chǎn)生具有活性的p50和p52。在受到TNF-α刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路會(huì)被激活，導(dǎo)致IκB激酶（IKK）復(fù)合體活化，IKK進(jìn)而磷酸化IκB蛋白，使IκB降解，釋放出NF-κB二聚體。此時(shí)，p105也會(huì)在蛋白酶體的作用下被裂解，產(chǎn)生p50，p50可以與RelA（p65）等形成異二聚體，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在未接受刺激時(shí)，NF-κBp65通常與IκB抑制因子結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。IκB通過(guò)其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeat–containingdomain，ARD）與NF-κB緊密結(jié)合，并覆蓋NF-κB的NLS，從而阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。當(dāng)細(xì)胞受到如細(xì)胞因子、脂多糖等刺激時(shí)，IκB激酶被激活，使IκB蛋白磷酸化，隨后IκB被泛素化修飾并被蛋白酶體降解，NF-κBp65得以釋放，并暴露其N(xiāo)LS，迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA上的特異序列相結(jié)合，啟動(dòng)或增強(qiáng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在TNF-α刺激細(xì)胞時(shí)，TNF-α與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，使IKK復(fù)合體磷酸化IκBα，IκBα被泛素化修飾后被蛋白酶體降解，釋放出NF-κBp65/p50異二聚體，該異二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。3.2.2NF-κBp65在細(xì)胞中的正常功能在正常細(xì)胞中，NF-κBp65對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，參與眾多生物學(xué)過(guò)程，是維持細(xì)胞正常生理功能的關(guān)鍵因子。在炎癥反應(yīng)中，當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵或組織損傷等刺激時(shí)，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等會(huì)被激活，釋放出多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎癥因子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，使NF-κBp65進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)一系列與炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κBp65可以促進(jìn)IL-6、IL-8等細(xì)胞因子基因的表達(dá)，這些細(xì)胞因子能夠招募更多的免疫細(xì)胞到炎癥部位，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，從而幫助機(jī)體清除病原體和修復(fù)受損組織。研究表明，在小鼠炎癥模型中，抑制NF-κBp65的活性，會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)明顯減弱，炎癥部位的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病原體清除能力下降。NF-κBp65在免疫應(yīng)答過(guò)程中也扮演著核心角色。在固有免疫中，NF-κBp65能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化為M1表型，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力。它還能促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和中性粒細(xì)胞的募集，提高機(jī)體的固有免疫防御能力。在適應(yīng)性免疫方面，NF-κBp65可以增強(qiáng)B細(xì)胞的激活、增殖、成熟和選擇，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。在T細(xì)胞中，NF-κBp65參與T細(xì)胞的活化和分化，調(diào)節(jié)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如在Th1細(xì)胞分化過(guò)程中，NF-κBp65通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。在病毒感染時(shí)，機(jī)體的免疫細(xì)胞會(huì)識(shí)別病毒抗原，激活NF-κB信號(hào)通路，NF-κBp65進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子，如抗體、細(xì)胞因子等，以清除病毒感染。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡至關(guān)重要。NF-κBp65在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中具有雙重作用。在某些情況下，NF-κBp65可以激活抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、IAPs等，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。在受到低劑量的紫外線(xiàn)照射時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的NF-κBp65被激活，它會(huì)結(jié)合到Bcl-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2可以抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素c，從而阻止凋亡小體的形成，抑制細(xì)胞凋亡。然而，在另一些情況下，NF-κBp65也可以促進(jìn)促凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，過(guò)度激活的NF-κBp65有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，以清除異常增殖的細(xì)胞。這表明NF-κBp65在細(xì)胞凋亡中的作用取決于細(xì)胞的類(lèi)型、刺激的性質(zhì)和強(qiáng)度等多種因素。3.3Racl和NF-κBp65在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制3.3.1Racl促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制Racl在非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，其主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞間黏附等機(jī)制，有力地促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在細(xì)胞骨架重組方面，Racl能夠激活下游的WASP-Arp2/3復(fù)合物。當(dāng)Racl處于活化狀態(tài)，即與GTP結(jié)合時(shí)，它會(huì)與WASP（Wiskott-Aldrichsyndromeprotein）相互作用，改變WASP的構(gòu)象，使其能夠與Arp2/3復(fù)合物結(jié)合。Arp2/3復(fù)合物是肌動(dòng)蛋白聚合的關(guān)鍵啟動(dòng)子，在WASP-Arp2/3復(fù)合物的作用下，肌動(dòng)蛋白單體迅速聚合，形成分支狀的肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)。這些肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞遷移的前端，也就是偽足部位大量聚集，推動(dòng)細(xì)胞膜向前突出，形成片狀偽足和絲狀偽足。片狀偽足是一種扁平的、富含肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，它能夠在細(xì)胞遷移時(shí)與周?chē)h(huán)境接觸，感知并探索遷移路徑；絲狀偽足則是細(xì)長(zhǎng)的、指狀的突起，能夠更深入地探測(cè)周?chē)h(huán)境，為細(xì)胞遷移提供方向指引。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移過(guò)程中，Racl的激活使得細(xì)胞前端不斷形成片狀偽足和絲狀偽足，這些偽足與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，產(chǎn)生牽引力，從而推動(dòng)細(xì)胞向前遷移。研究表明，使用Racl抑制劑處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)WASP-Arp2/3復(fù)合物的活性受到抑制，肌動(dòng)蛋白絲的聚合減少，片狀偽足和絲狀偽足的形成受阻，細(xì)胞的遷移能力顯著下降。Racl還可以通過(guò)調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化來(lái)影響細(xì)胞骨架的收縮性。Racl激活下游的PAK（p21-activatedkinase），PAK能夠磷酸化MLC激酶（MLCK），使其活化。活化的MLCK進(jìn)一步磷酸化MLC，增加肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白之間的相互作用，從而增強(qiáng)細(xì)胞骨架的收縮力。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，細(xì)胞后端的收縮力對(duì)于細(xì)胞脫離原來(lái)的位置并向前移動(dòng)至關(guān)重要。Racl通過(guò)調(diào)節(jié)MLC的磷酸化，增強(qiáng)細(xì)胞后端的收縮力，使得細(xì)胞能夠順利地向前遷移。在體外實(shí)驗(yàn)中，抑制Racl-PAK-MLCK通路，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞后端的收縮力減弱，細(xì)胞遷移速度明顯減慢。在細(xì)胞間黏附方面，Racl對(duì)E-cadherin等細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和功能有著重要影響。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，它能夠介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附，維持上皮組織的完整性和極性。在非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞需要降低細(xì)胞間的黏附力，以便脫離原發(fā)灶并遷移到其他部位。研究發(fā)現(xiàn)，Racl可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，抑制E-cadherin的表達(dá)。Racl活化后，激活下游的信號(hào)分子，最終導(dǎo)致NF-κB的活化，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低E-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)。E-cadherin表達(dá)的降低使得腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。此外，Racl還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞黏附分子如β-catenin等的定位和功能，進(jìn)一步影響細(xì)胞間的黏附。β-catenin與E-cadherin形成復(fù)合物，共同維持細(xì)胞間的黏附。Racl的活化可以導(dǎo)致β-catenin從細(xì)胞膜上解離，進(jìn)入細(xì)胞核，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而破壞細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Racl會(huì)導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下降，β-catenin核轉(zhuǎn)位增加，細(xì)胞間黏附力減弱，細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)。3.3.2NF-κBp65促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和抵抗治療的機(jī)制NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和抵抗治療過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它主要通過(guò)激活與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)對(duì)化療藥物抵抗的作用機(jī)制也較為復(fù)雜。在基因激活方面，NF-κBp65作為轉(zhuǎn)錄因子，在受到細(xì)胞外刺激后，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等，會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，NF-κBp65與特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)緊密結(jié)合，啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。其中，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因如MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）、VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）等，都受到NF-κBp65的調(diào)控。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、明膠等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。當(dāng)NF-κBp65激活MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄后，細(xì)胞內(nèi)MMP-9的表達(dá)水平升高，MMP-9被分泌到細(xì)胞外，降解細(xì)胞外基質(zhì)，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周?chē)M織，并進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在非小細(xì)胞肺癌組織中，NF-κBp65的高表達(dá)往往伴隨著MMP-9的高表達(dá)，且兩者的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新血管的生成。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于充足的血液供應(yīng)，NF-κBp65激活VEGF基因的表達(dá)后，腫瘤組織中VEGF的含量增加，VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。這些新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了通道，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究表明，抑制NF-κBp65的活性，可以降低VEGF的表達(dá)，減少腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。NF-κBp65還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。它可以激活一系列抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、IAPs（凋亡抑制蛋白）等。Bcl-2能夠抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素c，從而阻止凋亡小體的形成，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。IAPs則可以直接抑制caspase家族蛋白酶的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，NF-κBp65的持續(xù)激活使得Bcl-2和IAPs等抗凋亡基因高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞對(duì)各種凋亡刺激的敏感性降低，從而得以存活和增殖。NF-κBp65還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。它能夠上調(diào)CyclinD1等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞能夠快速增殖。在對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κBp65的活性，會(huì)導(dǎo)致Bcl-2和CyclinD1等基因的表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡增加，增殖受到抑制。在化療藥物抵抗方面，NF-κBp65通過(guò)多種機(jī)制賦予腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗性。NF-κBp65可以激活藥物外排泵相關(guān)基因的表達(dá)，如P-gp（P-糖蛋白）等。P-gp是一種跨膜蛋白，它能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性。當(dāng)NF-κBp65激活P-gp基因的轉(zhuǎn)錄后，腫瘤細(xì)胞表面P-gp的表達(dá)增加，化療藥物被不斷泵出細(xì)胞，導(dǎo)致化療效果降低。研究表明，在對(duì)化療藥物耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，NF-κBp65的活性較高，P-gp的表達(dá)也顯著升高，通過(guò)抑制NF-κBp65的活性，可以降低P-gp的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。NF-κBp65還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)和DNA損傷修復(fù)機(jī)制，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力?；熕幬锿鶗?huì)引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和DNA損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NF-κBp65可以激活抗氧化基因的表達(dá)，如SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）等，這些抗氧化酶能夠清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷，使腫瘤細(xì)胞能夠在化療藥物的作用下存活。NF-κBp65還可以促進(jìn)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，如ATM（共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白）、ATR（ATM和Rad3相關(guān)蛋白）等，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物引起的DNA損傷的修復(fù)能力，從而降低化療藥物的殺傷作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，抑制NF-κBp65的活性，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，DNA損傷修復(fù)能力下降，對(duì)化療藥物的敏感性顯著提高。四、研究設(shè)計(jì)與方法4.1病例采集本研究選取[具體醫(yī)院名稱(chēng)]在[具體時(shí)間段，如2018年1月至2022年12月]期間收治的非小細(xì)胞肺癌患者的組織標(biāo)本作為研究對(duì)象。共收集到[X]例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本，所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)檢查確診為非小細(xì)胞肺癌，診斷依據(jù)嚴(yán)格遵循世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的肺癌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。在病例選擇過(guò)程中，嚴(yán)格設(shè)定了入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)如下：患者年齡在18-75歲之間；患者均接受了手術(shù)治療，且手術(shù)切除標(biāo)本質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求；患者簽署了知情同意書(shū)，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤病史的患者；患有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙，無(wú)法耐受手術(shù)或影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷的患者；術(shù)前接受過(guò)放療、化療、靶向治療或免疫治療的患者，以免這些治療手段對(duì)Racl和NF-κBp65的表達(dá)產(chǎn)生干擾。根據(jù)患者的腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，將非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組。轉(zhuǎn)移組患者經(jīng)影像學(xué)檢查（如胸部增強(qiáng)CT、頭部增強(qiáng)MRI、全身骨掃描、18F-FDGPET/CT等）及術(shù)后病理檢查證實(shí)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。例如，對(duì)于懷疑腦轉(zhuǎn)移的患者，通過(guò)頭部增強(qiáng)MRI檢查發(fā)現(xiàn)腦部有異常占位，且經(jīng)病理活檢證實(shí)為肺癌腦轉(zhuǎn)移；對(duì)于懷疑骨轉(zhuǎn)移的患者，全身骨掃描顯示有放射性濃聚灶，結(jié)合臨床癥狀和其他檢查進(jìn)一步確診。非轉(zhuǎn)移組患者則在術(shù)前影像學(xué)檢查及術(shù)后病理檢查中均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移跡象。轉(zhuǎn)移組共納入[X1]例患者，非轉(zhuǎn)移組納入[X2]例患者。同時(shí)，為了對(duì)比分析，還采集了[X3]例正常肺組織標(biāo)本。這些正常肺組織標(biāo)本來(lái)源于因肺部良性疾病（如肺錯(cuò)構(gòu)瘤、肺囊腫等）接受手術(shù)切除的患者，且距離腫瘤邊緣至少5cm以上，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常肺組織。正常肺組織標(biāo)本的采集有助于明確Racl和NF-κBp65在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異，為研究它們?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供更有力的對(duì)照依據(jù)。所有組織標(biāo)本在手術(shù)切除后，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)使用。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色是一種利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原的定位、定性及定量的研究方法。本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)情況。在實(shí)驗(yàn)前，需確保所有實(shí)驗(yàn)所需的試劑、器材和設(shè)備都已準(zhǔn)備齊全。主要試劑包括特異性一抗（兔抗人Racl多克隆抗體和兔抗人NF-κBp65多克隆抗體）、二抗（山羊抗兔IgG抗體，標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶）、抗原修復(fù)液（檸檬酸緩沖液或EDTA緩沖液）、封閉液（5%牛血清白蛋白的PBS溶液）、DAB顯色液等。器材涵蓋顯微鏡、離心機(jī)、微量移液器、培養(yǎng)箱等，設(shè)備需進(jìn)行適當(dāng)?shù)那鍧嵑拖荆跃S持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。組織樣本的準(zhǔn)備是關(guān)鍵步驟。選擇合適的組織樣本后，使用10%中性緩沖福爾馬林固定液進(jìn)行固定，固定時(shí)間一般為24小時(shí)，隨后將組織轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中保存。固定后的組織樣本需歷經(jīng)脫水、透明化和浸蠟等步驟，然后進(jìn)行切片，切片厚度通常設(shè)定為4-6微米，將切片放置于玻片上，以便進(jìn)行后續(xù)處理。切片的脫蠟和再水化是必不可少的環(huán)節(jié)。將切片置于60℃烤箱中烘烤1小時(shí)，以增強(qiáng)切片與玻片的黏附性。接著依次用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡10分鐘進(jìn)行脫蠟，隨后通過(guò)梯度酒精（100%、95%、80%、70%，各2分鐘）進(jìn)行再水化，最后用蒸餾水洗5分鐘，共2次，以徹底去除切片上的石蠟和酒精?？乖迯?fù)是提高抗體特異性的重要步驟。選擇適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液（如檸檬酸緩沖液或EDTA緩沖液），將其加熱至沸騰并保持10-20分鐘，以去除固定過(guò)程中可能產(chǎn)生的抗原遮蔽效應(yīng)。之后將切片轉(zhuǎn)移至冷卻緩沖液中，待其冷卻至室溫。封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)可有效減少背景染色。用封閉液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）處理切片，在室溫下孵育30分鐘。加入一抗是檢測(cè)目標(biāo)蛋白的關(guān)鍵步驟。將一抗稀釋至適當(dāng)濃度（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)ǔacl抗體稀釋比例為1:100-1:200，NF-κBp65抗體稀釋比例為1:150-1:300），滴加在切片上。覆蓋切片后，置于濕箱中在4°C下孵育過(guò)夜，以保證抗體與抗原充分結(jié)合。洗滌切片以去除未結(jié)合的一抗。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。加入二抗時(shí)，將二抗稀釋至適當(dāng)濃度（常用稀釋比例為1:200-1:500），滴加在切片上。二抗應(yīng)選擇針對(duì)一抗的相應(yīng)標(biāo)記抗體，本研究使用的是標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗兔IgG抗體。孵育時(shí)間為30分鐘，孵育條件為室溫，同時(shí)要避免光照。再次洗滌切片以去除未結(jié)合的二抗，洗滌操作與加入一抗后的洗滌步驟相同。顯色反應(yīng)是使目標(biāo)蛋白可視化的重要過(guò)程。使用HRP標(biāo)記的二抗時(shí)，需加入DAB顯色液，并在顯微鏡下密切觀(guān)察反應(yīng)情況。顯色時(shí)間應(yīng)根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般為3-10分鐘，要避免過(guò)度顯色。當(dāng)觀(guān)察到切片上出現(xiàn)清晰的棕色反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，立即用自來(lái)水沖洗以結(jié)束顯色反應(yīng)。封片是為了保護(hù)切片和便于觀(guān)察。將封片劑均勻涂布在切片上，蓋上蓋玻片。封片劑應(yīng)選擇適合長(zhǎng)期保存切片的試劑，如DPX膠。封片后，將切片置于室溫下干燥。最后，使用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察染色結(jié)果。根據(jù)顯色反應(yīng)的強(qiáng)弱、位置及形態(tài)特征分析組織中的抗原分布情況。記錄觀(guān)察結(jié)果，并進(jìn)行圖像拍攝和數(shù)據(jù)分析。在分析結(jié)果時(shí)，要觀(guān)察抗原與抗體的結(jié)合是否具有特異性，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的染色情況，檢查實(shí)驗(yàn)組是否顯示了預(yù)期的抗原定位和表達(dá)。同時(shí)，分析組織切片上的染色強(qiáng)度是否符合預(yù)期，染色過(guò)強(qiáng)可能表明背景信號(hào)較高，染色不足可能表明抗體濃度不足或其他實(shí)驗(yàn)條件不佳，需調(diào)整抗體濃度和顯色時(shí)間，優(yōu)化染色條件以獲得最佳結(jié)果。還要仔細(xì)觀(guān)察染色信號(hào)的定位是否與預(yù)期的抗原位置一致，信號(hào)應(yīng)與組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類(lèi)型和抗原的已知分布模式相符，若信號(hào)分布不均或出現(xiàn)非特異性背景，則需檢查抗體處理過(guò)程中的潛在問(wèn)題。此外，要檢查背景染色的程度，背景染色可能由于非特異性結(jié)合、染色液過(guò)多或封閉不完全等原因引起，適當(dāng)優(yōu)化封閉步驟和洗滌條件，可減少背景染色的影響。為確保結(jié)果的穩(wěn)定性，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)染色方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。它能夠在組織原位檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，直觀(guān)地顯示蛋白在細(xì)胞和組織中的分布情況，為研究Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌中的作用提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。通過(guò)該方法，可以清晰地觀(guān)察到Racl和NF-κBp65在肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)差異，以及它們?cè)诓煌?xì)胞類(lèi)型和組織結(jié)構(gòu)中的定位，有助于深入了解它們?cè)诜切〖?xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。4.2.2蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)印跡分析，也被稱(chēng)為免疫印跡法，是一種能夠檢測(cè)固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法，在本研究中用于檢測(cè)Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平。該方法利用了蛋白質(zhì)的電泳分離、電轉(zhuǎn)移以及抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，需要準(zhǔn)備好SDS/PAGE實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料，包括不同濃度的丙烯酰胺、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris-HCl緩沖液、過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）等，用于制備聚丙烯酰胺凝膠。還需要電轉(zhuǎn)移裝置、供電設(shè)備、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）、Whatman3MM紙，以及鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤(pán)等工具。實(shí)驗(yàn)試劑方面，除了上述用于凝膠制備的試劑外，還需要10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（由30.3gTrizmabase和144g甘氨酸加蒸餾水至1L配制而成，pH約為8.3）、1x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（在1.4L蒸餾水中加入400ml甲醇及200ml10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液配制）、TBS緩沖溶液（將1.22gTris和8.78gNaCl加入到1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.5）、TTBSbuffer（在1LTBS緩沖溶液中加入0.5mlTween20）、一抗（兔抗人Racl多克隆抗體和兔抗人NF-κBp65多克隆抗體）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體）、3%封阻緩沖溶液（牛血清白蛋白15mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過(guò)濾后在4°C保存）、0.5%封阻緩沖溶液（牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過(guò)濾后在4°C保存）、顯影試劑（由1ml氯萘溶液、10ml甲醇、TBS緩沖溶液及30ul30%H2O2配制而成）。首先進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。取適量的非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織樣本，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，在冰上充分勻漿，然后在4°C下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進(jìn)行分離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用SDS/PAGE技術(shù)。按照配方配制分離膠和濃縮膠，將處理好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，加熱變性后上樣到凝膠孔中。同時(shí)，加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，用于判斷目的蛋白的分子量大小。在電泳過(guò)程中，先在低電壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶，然后升高電壓進(jìn)行分離膠電泳，使不同分子量的蛋白質(zhì)在分離膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。分離實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個(gè)小口以便定位，小心放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。準(zhǔn)備PVDF膜。根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，使其活化，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。制作膠膜夾心。在一淺盤(pán)中打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒，將一個(gè)預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過(guò)的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時(shí)注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過(guò)的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過(guò)的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白色端，填滿(mǎn)轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時(shí)防止出現(xiàn)氣泡。電轉(zhuǎn)移。連接電源，在4°C條件下維持恒壓100v，轉(zhuǎn)移1小時(shí)。通過(guò)電流的作用，凝膠中的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。免疫檢測(cè)。斷開(kāi)電源，將轉(zhuǎn)移盒從轉(zhuǎn)移槽中移出，將轉(zhuǎn)移盒的各個(gè)部分分開(kāi)。用鑷子將PVDF膜小心放入一個(gè)干凈的容器中，用TBS緩沖溶液進(jìn)行短暫清洗。從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個(gè)干凈的容器中，將這條膜在染色液中浸泡1分鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘，確定蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。對(duì)于沒(méi)有進(jìn)行染色的膜，首先倒出TBS緩沖溶液，加入3%封閉緩沖溶液，輕輕搖動(dòng)至少1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。倒掉3%封閉緩沖溶液，并用TBS緩沖溶液清洗3次，每次5分鐘。倒掉TBS緩沖溶液，加入10ml0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定一抗的稀釋比例和用量，通常Racl抗體稀釋比例為1:500-1:1000，NF-κBp65抗體稀釋比例為1:800-1:1500），輕輕搖動(dòng)1小時(shí)以上，使一抗與目的蛋白充分結(jié)合。用TTBSbuffer洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入適量的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體，稀釋比例一般為1:1000-1:2000），在室溫下孵育1小時(shí)。再次用TTBSbuffer洗滌膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。顯色。將顯影試劑按照配方配制好，加入到含有PVDF膜的容器中，在暗室中反應(yīng)數(shù)分鐘，當(dāng)觀(guān)察到膜上出現(xiàn)清晰的條帶時(shí)，用蒸餾水沖洗膜以終止反應(yīng)。使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行掃描，獲取圖像。分析條帶。通過(guò)分析條帶的灰度值，與內(nèi)參蛋白（常用的內(nèi)參蛋白有β-actin、GAPDH等）的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算出Racl和NF-κBp65蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白表達(dá)水平的半定量分析。蛋白質(zhì)印跡分析方法能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，通過(guò)與內(nèi)參蛋白的比較，可以排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差，實(shí)現(xiàn)對(duì)Racl和NF-κBp65表達(dá)的半定量分析，為研究它們?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中的表達(dá)變化提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。該方法具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，有助于深入研究Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。4.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)于Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)水平數(shù)據(jù)，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，分析肺癌組織與正常肺組織中兩者表達(dá)水平的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)涉及多組比較時(shí)，如不同TNM分期的肺癌組織中Racl和NF-κBp65表達(dá)水平的比較，采用方差分析（One-WayANOVA），若方差分析結(jié)果顯示存在組間差異，則進(jìn)一步進(jìn)行LSD（最小顯著差異法）或Dunnett'sT3等多重比較方法，以明確具體哪些組之間存在顯著差異。在分析Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性時(shí)，若數(shù)據(jù)為連續(xù)性變量且呈正態(tài)分布，采用Pearson相關(guān)分析；若數(shù)據(jù)不滿(mǎn)足正態(tài)分布或?yàn)榈燃?jí)資料，如分化程度分為高、中、低分化，TNM分期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期等，則采用Spearman秩相關(guān)分析。通過(guò)相關(guān)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r或rs，判斷兩者之間是否存在線(xiàn)性相關(guān)或等級(jí)相關(guān)關(guān)系，并確定相關(guān)性的強(qiáng)弱和方向。運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，分析Racl和NF-κBp65的表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系。將患者按照Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分別計(jì)算兩組患者的生存率，并繪制生存曲線(xiàn)。通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)對(duì)兩組生存曲線(xiàn)進(jìn)行比較，判斷兩組生存率之間是否存在顯著差異，若P<0.05，則認(rèn)為兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即Racl和NF-κBp65的表達(dá)與患者生存時(shí)間相關(guān)。使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析，將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（如Racl和NF-κBp65的表達(dá)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）納入模型，篩選出影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。通過(guò)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%置信區(qū)間（CI），評(píng)估每個(gè)因素對(duì)患者預(yù)后的影響程度。若某因素的HR>1且95%CI不包含1，則表明該因素是危險(xiǎn)因素，即其表達(dá)水平升高會(huì)增加患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)；若HR<1且95%CI不包含1，則表明該因素是保護(hù)因素，其表達(dá)水平升高會(huì)降低患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)。在所有統(tǒng)計(jì)分析中，均以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。五、研究結(jié)果5.1Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中Racl和NF-κBp65的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Racl在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），而在正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率僅為[Y]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。在肺癌組織中，Racl主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，陽(yáng)性染色強(qiáng)度較高，且在腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域表達(dá)更為明顯。正常肺組織中，Racl的表達(dá)較弱，僅在少數(shù)肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)微弱的陽(yáng)性染色。NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為[Z]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），在正常肺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為[W]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。在肺癌組織中，NF-κBp65主要定位于細(xì)胞核，也有部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核陽(yáng)性染色表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色，細(xì)胞質(zhì)染色相對(duì)較淺。在正常肺組織中，NF-κBp65的陽(yáng)性表達(dá)主要見(jiàn)于支氣管上皮細(xì)胞和少量肺泡巨噬細(xì)胞，表達(dá)強(qiáng)度明顯低于肺癌組織。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測(cè)。結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中Racl蛋白的相對(duì)表達(dá)量（以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示）為[Racl相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，顯著高于正常肺組織中的[Racl相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。NF-κBp65蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[NF-κBp65相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，同樣顯著高于正常肺組織中的[NF-κBp65相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果均顯示，Racl和NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，提示它們可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。5.2Racl和NF-κBp65表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系為了深入探究Racl和NF-κBp65表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)，本研究對(duì)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組患者腫瘤組織中Racl和NF-κBp65的表達(dá)進(jìn)行了詳細(xì)分析。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移組中Racl的陽(yáng)性表達(dá)率為[X1]%（[轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性例數(shù)]/[轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），顯著高于非轉(zhuǎn)移組的[X2]%（[非轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性例數(shù)]/[非轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]）。在蛋白質(zhì)印跡分析中，轉(zhuǎn)移組Racl蛋白的相對(duì)表達(dá)量為[Racl轉(zhuǎn)移組相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，同樣顯著高于非轉(zhuǎn)移組的[Racl非轉(zhuǎn)移組相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。這表明Racl在發(fā)生轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)明顯升高，提示其可能在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。從細(xì)胞層面來(lái)看，Racl的高表達(dá)能夠激活下游的WASP-Arp2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，使得腫瘤細(xì)胞能夠形成更多的片狀偽足和絲狀偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)Racl表達(dá)升高時(shí)，腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入周?chē)M織，進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在NF-κBp65的表達(dá)分析中，免疫組織化學(xué)染色顯示，轉(zhuǎn)移組中NF-κBp65的陽(yáng)性表達(dá)率為[Y1]%（[轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性例數(shù)]/[轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），明顯高于非轉(zhuǎn)移組的[Y2]%（[非轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性例數(shù)]/[非轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]）。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)移組NF-κBp65蛋白的相對(duì)表達(dá)量為[NF-κBp65轉(zhuǎn)移組相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，顯著高于非轉(zhuǎn)移組的[NF-κBp65非轉(zhuǎn)移組相對(duì)表達(dá)量均值]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.05）。NF-κBp65作為轉(zhuǎn)錄因子，其高表達(dá)會(huì)激活一系列與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。它能夠上調(diào)MMP-9的表達(dá)，MMP-9可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、明膠等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。NF-κBp65還能促進(jìn)VEGF的表達(dá)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新血管的生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了通道。通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析，進(jìn)一步探究Racl和NF-κBp65表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理特征（如TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）的相關(guān)性。結(jié)果顯示，Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平均與TNM分期呈顯著正相關(guān)（Racl與TNM分期的rs=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05；NF-κBp65與TNM分期的rs=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）。隨著TNM分期的升高，Racl和NF-κBp65的表達(dá)水平逐漸增加，這表明在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，Racl和NF-κBp65的高表達(dá)與腫瘤