B型煙粉虱免疫蟲生真菌和雙生病毒機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究一、研究背景B型煙粉虱（Bemisiatabaci）作為一種全球性的農(nóng)業(yè)害蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的損失。其寄主范圍廣泛，涵蓋了蔬菜、花卉、棉花等多種重要經(jīng)濟(jì)作物。B型煙粉虱不僅通過(guò)直接吸食植物汁液導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受阻、葉片發(fā)黃、枯萎，還能傳播多種植物病毒，其中雙生病毒（Geminivirus）尤為嚴(yán)重，可引發(fā)植物嚴(yán)重的病害，進(jìn)一步降低作物產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)上，針對(duì)B型煙粉虱的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用帶來(lái)了諸多問(wèn)題，如環(huán)境污染、非靶標(biāo)生物的傷害、農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康的潛在威脅，以及煙粉虱抗藥性的不斷增強(qiáng)等。因此，開(kāi)發(fā)環(huán)境友好且可持續(xù)的防治策略迫在眉睫。蟲生真菌作為一類重要的生物防治因子，能夠通過(guò)感染昆蟲體壁，在昆蟲體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。部分蟲生真菌對(duì)B型煙粉虱具有一定的致病力，有望成為綠色防治煙粉虱的有效手段。而雙生病毒雖然是植物病原體，但在與煙粉虱的相互作用過(guò)程中，也影響著煙粉虱的生理狀態(tài)和免疫反應(yīng)。深入了解B型煙粉虱對(duì)蟲生真菌和雙生病毒的免疫機(jī)制，對(duì)于優(yōu)化生物防治策略、開(kāi)發(fā)新的防治靶點(diǎn)具有重要意義。二、研究目的本研究旨在運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，全面解析B型煙粉虱在面對(duì)蟲生真菌和雙生病毒侵染時(shí)的免疫應(yīng)答機(jī)制。具體目標(biāo)包括：鑒定在感染過(guò)程中差異表達(dá)的基因，分析這些基因的生物學(xué)功能，明確其參與的代謝通路和免疫相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；比較B型煙粉虱對(duì)蟲生真菌和雙生病毒免疫反應(yīng)的異同點(diǎn)，為揭示其免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，進(jìn)而為開(kāi)發(fā)針對(duì)B型煙粉虱的新型生物防治方法奠定基礎(chǔ)。三、研究方法3.1實(shí)驗(yàn)材料B型煙粉虱：在溫室中選取健康的B型煙粉虱種群，在適宜的溫度（25±2℃）、相對(duì)濕度（60±5%）和光照周期（16L:8D）條件下，以煙草或番茄為寄主植物進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。蟲生真菌：選用對(duì)B型煙粉虱具有較強(qiáng)致病力的球孢白僵菌（Beauveriabassiana）或玫煙色擬青霉（Paecilomycesfumosoroseus）作為蟲生真菌實(shí)驗(yàn)材料。將真菌菌株在適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行活化和擴(kuò)繁，制備成濃度為1×10^8孢子/mL的孢子懸浮液備用。雙生病毒：以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛流行且由B型煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）為研究對(duì)象。通過(guò)感染TYLCV的番茄植株飼養(yǎng)B型煙粉虱，使煙粉虱攜帶病毒，或采用人工接種的方式將純化的病毒粒子導(dǎo)入煙粉虱體內(nèi)。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)蟲生真菌感染實(shí)驗(yàn)：選取羽化后3-5天的健康B型煙粉虱成蟲，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組將煙粉虱成蟲置于含有球孢白僵菌或玫煙色擬青霉孢子懸浮液的接種裝置中，通過(guò)浸蟲法或噴霧法使煙粉虱體表均勻附著真菌孢子；對(duì)照組則用無(wú)菌水進(jìn)行相同處理。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如12h、24h、48h、72h），分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的煙粉虱樣本，迅速放入液氮中冷凍，隨后保存于-80℃冰箱備用。雙生病毒感染實(shí)驗(yàn)：設(shè)置帶毒煙粉虱組和無(wú)毒煙粉虱組。帶毒煙粉虱組通過(guò)在感染TYLCV的番茄植株上飼養(yǎng)獲取，無(wú)毒煙粉虱組則在健康番茄植株上飼養(yǎng)。在特定時(shí)間（如接種病毒后3天、5天、7天），分別采集兩組煙粉虱樣本，同樣經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱。3.3總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)使用RNA純化試劑盒（如TRIzol試劑）對(duì)上述收集的煙粉虱樣本進(jìn)行總RNA提取。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，通過(guò)多次離心、洗滌等步驟，去除蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)，獲得高質(zhì)量的總RNA。利用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間；同時(shí)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，確保28S和18SrRNA條帶清晰，且28S條帶亮度約為18S條帶的2倍。3.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)⑻崛〉玫降母哔|(zhì)量RNA樣本送往專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序。采用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。首先，對(duì)RNA進(jìn)行片段化處理，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾、連接測(cè)序接頭等一系列操作，最后通過(guò)PCR擴(kuò)增富集文庫(kù)片段。完成文庫(kù)構(gòu)建后，在Illumina測(cè)序儀上進(jìn)行雙端測(cè)序（Paired-endsequencing），獲得大量的原始測(cè)序數(shù)據(jù)（Rawreads）。3.5數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)預(yù)處理：使用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和過(guò)濾。去除含有接頭序列、低質(zhì)量堿基（質(zhì)量值Q≤20的堿基比例超過(guò)10%）以及N堿基比例過(guò)高（超過(guò)5%）的reads，得到高質(zhì)量的清潔數(shù)據(jù)（Cleanreads）。參考基因組比對(duì)：將Cleanreads與B型煙粉虱的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，使用比對(duì)軟件（如HISAT2）確定每個(gè)read在基因組上的位置，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到基因組上的reads數(shù)量及比例，評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和覆蓋度。差異表達(dá)基因篩選：通過(guò)定量分析，計(jì)算每個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)量，常用的方法是使用FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件（如DESeq2），以|log2(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出在蟲生真菌或雙生病毒感染組與對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因（DifferentiallyExpressedGenes，DEGs）。生物功能分析：GeneOntology（GO）分析：對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，將基因按照生物學(xué)過(guò)程（BiologicalProcess）、分子功能（MolecularFunction）和細(xì)胞組成（CellularComponent）三個(gè)類別進(jìn)行分類，分析差異表達(dá)基因在各個(gè)功能類別中的富集情況，明確其參與的主要生物學(xué)功能。KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）分析：利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行代謝通路分析，確定基因參與的主要代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，了解煙粉虱在應(yīng)對(duì)蟲生真菌和雙生病毒侵染時(shí)體內(nèi)代謝和信號(hào)通路的變化。蛋白-蛋白相互作用（Protein-ProteinInteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析：借助相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件（如STRING數(shù)據(jù)庫(kù)、Cytoscape軟件），構(gòu)建差異表達(dá)基因編碼蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，分析基因之間的協(xié)同作用關(guān)系，進(jìn)一步揭示免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3.6RT-qPCR驗(yàn)證為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取部分差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證。根據(jù)目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin或GAPDH等持家基因作為內(nèi)參基因。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件根據(jù)所使用的qPCR試劑盒進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，評(píng)估兩者的一致性。四、研究結(jié)果4.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)概況經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)預(yù)處理，在蟲生真菌感染實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別獲得了[X]萬(wàn)條和[Y]萬(wàn)條Cleanreads，平均GC含量為[Z]%，與參考基因組的比對(duì)率達(dá)到[W]%；在雙生病毒感染實(shí)驗(yàn)中，無(wú)毒煙粉虱組和帶毒煙粉虱組分別產(chǎn)生了[M]萬(wàn)條和[N]萬(wàn)條Cleanreads，GC含量為[P]%，基因組比對(duì)率為[Q]%。這些高質(zhì)量的數(shù)據(jù)為后續(xù)的分析提供了可靠的基礎(chǔ)。4.2差異表達(dá)基因篩選結(jié)果蟲生真菌感染：在球孢白僵菌或玫煙色擬青霉感染B型煙粉虱后，共篩選出[X1]個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因[X2]個(gè)，下調(diào)基因[X3]個(gè)。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，差異表達(dá)基因的數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在感染后48h差異表達(dá)基因數(shù)量最多。雙生病毒感染：TYLCV感染B型煙粉虱后，鑒定出[Y1]個(gè)差異表達(dá)基因，包括上調(diào)基因[Y2]個(gè)和下調(diào)基因[Y3]個(gè)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，差異表達(dá)基因的變化模式較為復(fù)雜，部分基因在早期迅速響應(yīng)，而部分基因的表達(dá)變化則出現(xiàn)在感染后期。4.3GO功能富集分析結(jié)果蟲生真菌感染：在生物學(xué)過(guò)程類別中，差異表達(dá)基因主要富集在免疫應(yīng)答、細(xì)胞代謝過(guò)程調(diào)節(jié)、氧化還原過(guò)程等方面；分子功能類別中，與氧化還原酶活性、抗菌肽活性、蛋白酶活性等相關(guān)的基因顯著富集；細(xì)胞組成類別中，主要涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因。雙生病毒感染：生物學(xué)過(guò)程方面，富集在病毒防御反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA代謝過(guò)程等；分子功能上，與RNA結(jié)合、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等相關(guān)的基因富集明顯；細(xì)胞組成中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核等細(xì)胞器相關(guān)的基因出現(xiàn)顯著差異表達(dá)。4.4KEGG通路分析結(jié)果蟲生真菌感染：差異表達(dá)基因顯著富集在Toll和Imd信號(hào)通路、吞噬體通路、氧化磷酸化通路等。Toll和Imd信號(hào)通路是昆蟲重要的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，表明B型煙粉虱在應(yīng)對(duì)蟲生真菌侵染時(shí)，通過(guò)激活這兩條通路來(lái)啟動(dòng)免疫反應(yīng)；吞噬體通路的激活可能參與了對(duì)入侵真菌的吞噬和清除過(guò)程；氧化磷酸化通路的變化則可能影響煙粉虱的能量代謝，以滿足免疫反應(yīng)對(duì)能量的需求。雙生病毒感染：主要富集在Jak-STAT信號(hào)通路、RNA干擾通路、MAPK信號(hào)通路等。Jak-STAT信號(hào)通路在抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，被激活后可調(diào)控一系列抗病毒基因的表達(dá)；RNA干擾是昆蟲抵御病毒入侵的重要免疫機(jī)制，相關(guān)通路的激活表明B型煙粉虱通過(guò)RNA干擾途徑來(lái)識(shí)別和降解病毒RNA；MAPK信號(hào)通路的參與可能調(diào)節(jié)煙粉虱細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程，以應(yīng)對(duì)病毒感染帶來(lái)的壓力。4.5PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果構(gòu)建的蟲生真菌感染相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)包含[X4]個(gè)節(jié)點(diǎn)和[X5]條邊，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因如[基因名稱1]、[基因名稱2]等在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的連接和調(diào)控作用，它們可能通過(guò)與多個(gè)其他基因相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)煙粉虱的免疫反應(yīng)。雙生病毒感染的PPI網(wǎng)絡(luò)有[Y4]個(gè)節(jié)點(diǎn)和[Y5]條邊，其中[基因名稱3]、[基因名稱4]等關(guān)鍵基因處于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，對(duì)維持病毒感染狀態(tài)下煙粉虱體內(nèi)的生理平衡和免疫調(diào)控起到重要作用。4.6RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果選取的10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，其中8個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性。另外2個(gè)基因雖然在表達(dá)倍數(shù)上存在一定差異，但總體表達(dá)趨勢(shì)相同，可能是由于實(shí)驗(yàn)操作誤差或不同檢測(cè)方法的靈敏度差異導(dǎo)致。五、研究結(jié)論本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，全面揭示了B型煙粉虱在免疫蟲生真菌和雙生病毒過(guò)程中的基因表達(dá)變化。鑒定出大量差異表達(dá)基因，并明確了其參與的主要生物學(xué)功能、代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為深入理解B型煙粉虱的免疫機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。在應(yīng)對(duì)蟲生真菌侵染時(shí)，B型煙粉虱主要通過(guò)激活Toll和Imd信號(hào)通路，調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝、細(xì)胞自噬等過(guò)程，增強(qiáng)自身的免疫防御能力。而在雙生病毒感染時(shí)，Jak-STAT信號(hào)通路、RNA干擾通路以及MAPK信號(hào)通路等發(fā)揮關(guān)鍵作用，煙粉虱通過(guò)這些通路識(shí)別病毒入侵、降解病毒RNA，并調(diào)節(jié)細(xì)胞生理狀態(tài)以適應(yīng)病毒感染。比較B型煙粉虱對(duì)蟲生真菌和雙生病毒的免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)兩者存在一定的共性和差異。共性在于都涉及到免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程；差異則體現(xiàn)在具體的信號(hào)通路激活和基因表達(dá)模式上。這些差異可能與