M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA：肝癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移抑制的新策略探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下，已然成為沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，肝癌的形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年新增肝癌病例數(shù)和死亡病例數(shù)均位居世界前列，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量與生命健康。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)。且肝癌具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，使得臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，肝癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、消融治療、放療、化療以及靶向治療等。手術(shù)切除和肝移植雖為根治性治療方法，但僅適用于早期肝癌患者，且肝移植面臨著供體短缺、免疫排斥等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。消融治療對(duì)于較大腫瘤或多發(fā)腫瘤效果欠佳。放療和化療因缺乏腫瘤靶向性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織和器官也會(huì)造成嚴(yán)重的毒副作用，患者往往難以耐受。靶向治療雖取得了一定進(jìn)展，但仍存在耐藥性等問(wèn)題，總體治療效果仍不盡人意。因此，迫切需要探索新的治療策略，以提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，基因治療作為一種新興的治療方法，為肝癌的治療帶來(lái)了新的希望?；蛑委熗ㄟ^(guò)將特定的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是基因治療領(lǐng)域的重要突破，它能夠特異性地降解靶基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的高效沉默，為肝癌的基因治療提供了有力工具。骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，OPN在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，且與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及不良預(yù)后密切相關(guān)。OPN通過(guò)多種信號(hào)通路，如PI3K-AKT、MAPK等，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），同時(shí)還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。因此，OPN成為肝癌基因治療的重要靶點(diǎn)之一。然而，RNAi技術(shù)在肝癌治療中的臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，其中關(guān)鍵問(wèn)題之一是如何將小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或短發(fā)夾狀RNA（shorthairpinRNA，shRNA）高效、安全地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。傳統(tǒng)的病毒載體雖具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性強(qiáng)、潛在致癌性、攜帶基因容量有限等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。非病毒載體如脂質(zhì)體、聚合物等，因其具有低免疫原性、制備簡(jiǎn)單、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）是一種具有較高陽(yáng)離子電荷密度的聚合物，能夠通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)核酸的有效遞送。PEI分子中的氨基在生理環(huán)境下能夠發(fā)生質(zhì)子化，形成“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，促進(jìn)復(fù)合物的內(nèi)吞和內(nèi)涵體逃逸，提高基因轉(zhuǎn)染效率。然而，PEI的細(xì)胞毒性限制了其在基因治療中的應(yīng)用，尤其是高相對(duì)分子質(zhì)量的PEI，其細(xì)胞毒性更為顯著。為了克服PEI的細(xì)胞毒性問(wèn)題，研究人員對(duì)其進(jìn)行了一系列修飾和改造，如合成低相對(duì)分子質(zhì)量PEI并進(jìn)行交聯(lián)、接枝等化學(xué)修飾。輻射制備的M-PEIs納米凝膠作為一種新型的非病毒基因載體，具有粒徑可控、細(xì)胞毒性低、基因轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，為解決基因遞送難題提供了新的途徑。M-PEIs納米凝膠能夠與shRNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù)shRNA免受核酸酶的降解，同時(shí)促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的有效沉默?；谝陨媳尘埃狙芯恐荚谔接慚-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用及其潛在機(jī)制，為肝癌的基因治療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)構(gòu)建M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物，研究其在體外對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步在體內(nèi)動(dòng)物模型中驗(yàn)證其治療效果，有望為肝癌的臨床治療開(kāi)辟新的道路，提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，從細(xì)胞和動(dòng)物水平全面剖析其潛在的作用機(jī)制，為肝癌的基因治療提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體而言，本研究具有以下重要目的和意義：目的：首先，成功構(gòu)建M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物，并對(duì)其理化性質(zhì)，如粒徑、電位、形態(tài)等進(jìn)行精確表征，確保復(fù)合物的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。其次，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)研究M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響，明確其抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的效果。然后，深入探討M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路和關(guān)鍵分子的表達(dá)變化，揭示其作用的內(nèi)在途徑。最后，在體內(nèi)動(dòng)物模型中驗(yàn)證M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物的治療效果，評(píng)估其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和動(dòng)物生存時(shí)間的影響，為臨床應(yīng)用提供前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。意義：在理論層面，本研究有助于深入揭示OPN在肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制，進(jìn)一步豐富對(duì)肝癌生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的視角和理論依據(jù)。同時(shí)，對(duì)M-PEIs作為非病毒基因載體的研究，將拓展基因遞送系統(tǒng)的知識(shí)體系，為開(kāi)發(fā)高效、安全的基因載體提供參考。在實(shí)踐意義方面，若M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠有效抑制肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，有望為肝癌的臨床治療開(kāi)辟新的途徑。這種基因治療策略可能克服傳統(tǒng)治療方法的局限性，提高肝癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量。此外，本研究的成果還可能為其他惡性腫瘤的基因治療提供借鑒和啟示，推動(dòng)整個(gè)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在M-PEIs載體的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均投入了大量精力。國(guó)外研究起步相對(duì)較早，在輻射制備M-PEIs納米凝膠的技術(shù)優(yōu)化和基礎(chǔ)性能研究上取得了顯著成果。如美國(guó)的科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控輻射劑量和反應(yīng)條件，成功制備出粒徑均一、穩(wěn)定性良好的M-PEIs納米凝膠，并深入探究了其與核酸相互作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)M-PEIs能夠通過(guò)靜電作用與核酸緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，有效保護(hù)核酸免受核酸酶的降解。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也緊跟國(guó)際步伐，不僅在M-PEIs的制備工藝上進(jìn)行了創(chuàng)新，降低了生產(chǎn)成本，還對(duì)其在不同細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。例如，國(guó)內(nèi)某研究小組通過(guò)對(duì)M-PEIs進(jìn)行表面修飾，引入特定的功能基團(tuán)，顯著提高了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒性，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。然而，目前M-PEIs載體在體內(nèi)的分布、代謝和長(zhǎng)期安全性等方面仍缺乏深入研究，限制了其進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化。關(guān)于OPN與肝癌關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)外均有眾多報(bào)道。國(guó)外研究通過(guò)大規(guī)模的臨床樣本分析和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，明確了OPN在肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵作用。研究表明，OPN高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，其能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，通過(guò)激活PI3K-AKT、MAPK等信號(hào)通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的生存能力和轉(zhuǎn)移潛能。同時(shí)，OPN還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。國(guó)內(nèi)研究則在OPN作用機(jī)制的研究上取得了特色成果，發(fā)現(xiàn)OPN與肝癌細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合后，可引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使肝癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。盡管對(duì)OPN與肝癌關(guān)系的研究已較為深入，但如何精準(zhǔn)地靶向OPN并抑制其功能，以實(shí)現(xiàn)有效的肝癌治療，仍需進(jìn)一步探索。在shRNA基因治療方面，國(guó)外在技術(shù)研發(fā)和臨床前研究上處于領(lǐng)先地位。一些國(guó)際知名科研機(jī)構(gòu)已成功設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)多種腫瘤相關(guān)基因的shRNA，并在動(dòng)物模型中驗(yàn)證了其治療效果。例如，針對(duì)乳腺癌相關(guān)基因的shRNA治療，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)了動(dòng)物的生存時(shí)間。同時(shí)，國(guó)外還在不斷探索新的shRNA遞送系統(tǒng)和聯(lián)合治療策略，以提高基因治療的療效。國(guó)內(nèi)在shRNA基因治療領(lǐng)域也取得了一定進(jìn)展，不僅開(kāi)展了針對(duì)肝癌等多種惡性腫瘤的研究，還在優(yōu)化shRNA設(shè)計(jì)、提高基因轉(zhuǎn)染效率等方面進(jìn)行了創(chuàng)新。但目前shRNA基因治療仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如shRNA的脫靶效應(yīng)、免疫原性以及遞送系統(tǒng)的安全性和有效性等問(wèn)題，亟待解決。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述肝癌，作為肝臟惡性腫瘤的統(tǒng)稱，主要涵蓋原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率在各類惡性腫瘤中位居前列，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝癌在2020年的新增病例數(shù)約為90.6萬(wàn)，死亡病例數(shù)約為83萬(wàn)，發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中分別排名第六位和第三位。在我國(guó)，肝癌同樣是高發(fā)且預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，由于乙肝病毒感染率較高、飲酒等不良生活習(xí)慣普遍以及環(huán)境污染等因素，我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平，嚴(yán)重影響著人民群眾的身體健康和生活質(zhì)量。肝癌的發(fā)病隱匿，早期通常無(wú)明顯癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度極大，預(yù)后不佳。肝癌的生物學(xué)特性復(fù)雜，具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，這使得肝癌的治療成為臨床面臨的重大挑戰(zhàn)之一。目前，肝癌的治療手段雖然多樣，但總體治療效果仍不盡人意，患者的5年生存率較低。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療策略、提高肝癌患者的生存率具有重要意義。2.1.1肝癌的發(fā)病機(jī)制肝癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及多種基因和信號(hào)通路的異常改變。目前研究認(rèn)為，肝癌的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，這些因素相互作用，共同導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生。病毒感染：乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染是誘發(fā)肝癌的主要病因之一。全球約50%-80%的肝癌病例與HBV感染相關(guān)，在我國(guó)，這一比例更高。HBV和HCV感染后，病毒可整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致基因的突變和異常表達(dá)。例如，HBV的X基因（HBx）可通過(guò)多種途徑干擾細(xì)胞的正常生理功能，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如PI3K-AKT、MAPK等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，從而增加肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，病毒感染還會(huì)引發(fā)持續(xù)的肝臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟組織的損傷和修復(fù)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行，在這一過(guò)程中，肝細(xì)胞不斷受到刺激，容易發(fā)生基因突變，進(jìn)而逐漸發(fā)展為肝癌?；蛲蛔儯焊伟┘?xì)胞中存在多種基因突變，這些突變可影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過(guò)程。常見(jiàn)的基因突變包括抑癌基因的失活和癌基因的激活。例如，p53基因是一種重要的抑癌基因，在肝癌中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致其功能喪失，無(wú)法正常抑制細(xì)胞的異常增殖，從而使細(xì)胞更容易發(fā)生癌變。而c-myc、K-ras等癌基因的激活，則可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，推動(dòng)肝癌的發(fā)生發(fā)展。此外，一些與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、代謝等相關(guān)的基因也會(huì)發(fā)生突變，這些基因突變相互作用，共同擾亂細(xì)胞的正常生理平衡，促使肝癌的形成。環(huán)境因素：環(huán)境因素在肝癌的發(fā)病中也起著重要作用。黃曲霉毒素是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，常見(jiàn)于霉變的糧食、堅(jiān)果等食物中。長(zhǎng)期攝入被黃曲霉毒素污染的食物，可增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。黃曲霉毒素的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素B1可與DNA結(jié)合，形成加合物，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，從而誘發(fā)肝癌。此外，長(zhǎng)期大量飲酒也是肝癌的重要危險(xiǎn)因素之一。酒精在肝臟代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙醛，乙醛具有細(xì)胞毒性，可損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝臟炎癥、纖維化，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，最終增加肝癌的發(fā)生幾率。同時(shí)，環(huán)境污染、化學(xué)物質(zhì)暴露等也可能與肝癌的發(fā)病相關(guān)。細(xì)胞增殖與凋亡失衡：正常情況下，細(xì)胞的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能。在肝癌發(fā)生過(guò)程中，這種平衡被打破，細(xì)胞增殖異?；钴S，而凋亡受到抑制。多種因素可導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡，如上述的病毒感染、基因突變、環(huán)境因素等。例如，癌基因的激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)；而抑癌基因的失活則無(wú)法正常發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用。此外，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等也可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等，它們可通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。2.1.2肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制肝癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞與周圍組織、細(xì)胞外基質(zhì)以及機(jī)體免疫系統(tǒng)之間的相互作用。肝癌轉(zhuǎn)移主要通過(guò)血行轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移三種途徑，其中血行轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移又是血行轉(zhuǎn)移中最常見(jiàn)的類型。肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶：肝癌細(xì)胞通過(guò)下調(diào)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，如E-鈣黏蛋白，減弱與周圍正常肝細(xì)胞的黏附力，從而使腫瘤細(xì)胞能夠脫離原發(fā)腫瘤組織。同時(shí)，肝癌細(xì)胞還可分泌一些蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移開(kāi)辟道路。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解Ⅳ型膠原蛋白，破壞基底膜的完整性，使腫瘤細(xì)胞更容易穿透基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)：脫離原發(fā)灶的肝癌細(xì)胞通過(guò)降解周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，進(jìn)入血管或淋巴管，從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在這一過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞需要克服血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用。研究表明，肝癌細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)一些黏附分子，如整合素，與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層，進(jìn)入血液循環(huán)。此外，腫瘤細(xì)胞還可誘導(dǎo)血管生成，為其進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)提供更多的通道。腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新的血管，這些新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)創(chuàng)造了條件。腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中的存活和運(yùn)輸：進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的肝癌細(xì)胞面臨著機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊和血流的剪切力等多種挑戰(zhàn)。為了在循環(huán)系統(tǒng)中存活，肝癌細(xì)胞可通過(guò)多種機(jī)制逃避免疫監(jiān)視，如表達(dá)免疫抑制分子，抑制免疫細(xì)胞的活性；偽裝成正常細(xì)胞，逃避免疫細(xì)胞的識(shí)別。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞還可聚集形成腫瘤細(xì)胞團(tuán)，減少血流剪切力的影響，提高在循環(huán)系統(tǒng)中的存活幾率。在運(yùn)輸過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞隨血流到達(dá)身體的各個(gè)部位，但只有少數(shù)腫瘤細(xì)胞能夠在遠(yuǎn)處組織中著床并生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞黏附并定植于遠(yuǎn)處組織：當(dāng)腫瘤細(xì)胞到達(dá)遠(yuǎn)處組織后，它們需要黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并穿透血管壁進(jìn)入周圍組織，形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)特定的黏附分子，如選擇素、整合素等，與遠(yuǎn)處組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的配體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)黏附。例如，肝癌細(xì)胞表面的CD44分子可與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的透明質(zhì)酸結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附。隨后，腫瘤細(xì)胞再次分泌蛋白酶，降解血管壁和周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)入組織實(shí)質(zhì)，并在適宜的微環(huán)境中定植、增殖，形成轉(zhuǎn)移瘤。腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶的增殖和生長(zhǎng)：腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶定植后，需要適應(yīng)新的微環(huán)境，獲取營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)信號(hào)，才能不斷增殖和生長(zhǎng)。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分等都可影響腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。例如，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；同時(shí)，腫瘤細(xì)胞還可與周圍的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等相互作用，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。此外，腫瘤細(xì)胞自身的基因表達(dá)和信號(hào)通路的改變也可使其適應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的微環(huán)境，促進(jìn)其增殖和生長(zhǎng)。2.2M-PEIs載體2.2.1M-PEIs的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)M-PEIs，即輻射制備的聚乙烯亞胺納米凝膠，是一種通過(guò)輻射技術(shù)制備的新型納米材料。其化學(xué)結(jié)構(gòu)基于聚乙烯亞胺（PEI），PEI是由乙烯亞胺單體聚合而成的聚合物，分子主鏈上富含大量的氨基，這些氨基在不同pH值條件下能夠發(fā)生質(zhì)子化和去質(zhì)子化反應(yīng)，賦予了PEI獨(dú)特的理化性質(zhì)。在M-PEIs的制備過(guò)程中，通過(guò)精確控制輻射劑量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)體系等條件，使PEI分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米凝膠。這種納米凝膠結(jié)構(gòu)使得M-PEIs具有粒徑可控的特性，通過(guò)調(diào)整輻射參數(shù)和反應(yīng)條件，可以制備出粒徑在幾十納米到幾百納米之間的M-PEIs納米凝膠，以滿足不同的應(yīng)用需求。M-PEIs納米凝膠具有良好的穩(wěn)定性，在水溶液中能夠均勻分散，不易聚集沉淀。這是由于其表面帶有一定的電荷，通過(guò)靜電排斥作用維持了納米凝膠的分散狀態(tài)。同時(shí)，M-PEIs納米凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠有效地包裹和保護(hù)其所負(fù)載的物質(zhì)，如核酸、藥物等，防止其被外界環(huán)境中的酶、化學(xué)物質(zhì)等降解或破壞。在生理?xiàng)l件下，M-PEIs納米凝膠能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和性能，確保所負(fù)載的基因能夠安全、有效地遞送至靶細(xì)胞。作為基因載體，M-PEIs具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，其高陽(yáng)離子電荷密度使其能夠與帶負(fù)電荷的核酸（如shRNA）通過(guò)靜電作用緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種復(fù)合物結(jié)構(gòu)不僅保護(hù)了核酸不被核酸酶降解，還為基因的遞送提供了載體。其次，M-PEIs的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)是其實(shí)現(xiàn)高效基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵機(jī)制之一。當(dāng)M-PEIs/核酸復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)涵體后，內(nèi)涵體中的酸性環(huán)境會(huì)使M-PEIs分子中的氨基發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致內(nèi)涵體中質(zhì)子濃度升高。為了維持電荷平衡，大量氯離子和水分子進(jìn)入內(nèi)涵體，使得內(nèi)涵體膨脹、破裂，從而使復(fù)合物釋放到細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸，提高基因轉(zhuǎn)染效率。此外，M-PEIs納米凝膠的粒徑和表面電荷等性質(zhì)可通過(guò)制備工藝進(jìn)行調(diào)控，這為其在不同細(xì)胞類型和組織中的應(yīng)用提供了靈活性，使其能夠更好地適應(yīng)復(fù)雜的生物體內(nèi)環(huán)境。2.2.2M-PEIs作為基因載體的優(yōu)勢(shì)M-PEIs在基因傳遞中展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為極具潛力的非病毒基因載體。在與基因的結(jié)合能力方面，M-PEIs憑借其分子結(jié)構(gòu)中豐富的氨基，能夠與帶負(fù)電荷的核酸形成強(qiáng)大的靜電相互作用。這種結(jié)合不僅迅速且穩(wěn)定，可有效保護(hù)核酸免受核酸酶的降解，確?；蛟谶f送過(guò)程中的完整性。研究表明，M-PEIs與shRNA形成的復(fù)合物在血清中能夠保持穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間不被降解，從而為基因的有效傳遞提供了保障。同時(shí)，M-PEIs與核酸的結(jié)合比例可通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行精確調(diào)控，以達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效果，這一特性使得其在不同基因治療方案中具有良好的適應(yīng)性。細(xì)胞攝取效率是衡量基因載體性能的重要指標(biāo)，M-PEIs在這方面表現(xiàn)出色。其納米級(jí)別的粒徑和表面電荷特性，使其易于被細(xì)胞識(shí)別和攝取。細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用將M-PEIs/基因復(fù)合物攝入細(xì)胞內(nèi)，M-PEIs的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)了復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃逸，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并最終進(jìn)入細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)基因的有效傳遞和表達(dá)。與傳統(tǒng)的基因載體相比，M-PEIs能夠顯著提高細(xì)胞對(duì)基因的攝取效率，例如在肝癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中，M-PEIs介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率比某些脂質(zhì)體載體高出數(shù)倍，為肝癌的基因治療提供了更高效的手段。細(xì)胞毒性是制約基因載體臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，而M-PEIs在降低細(xì)胞毒性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。相較于高相對(duì)分子質(zhì)量的PEI，M-PEIs納米凝膠由于其特殊的交聯(lián)結(jié)構(gòu)和粒徑控制，細(xì)胞毒性顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，M-PEIs對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用明顯低于未修飾的PEI，且對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和功能影響較小。這使得M-PEIs在保證基因轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，減少了對(duì)正常細(xì)胞的損傷，提高了基因治療的安全性，為其在體內(nèi)的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。此外，M-PEIs還具有制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。其輻射制備方法易于操作，不需要復(fù)雜的化學(xué)合成步驟，且反應(yīng)條件溫和，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)制備出大量高質(zhì)量的M-PEIs納米凝膠。這一優(yōu)勢(shì)使得M-PEIs在基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為臨床治療的常用基因載體。2.3OPN與肝癌的關(guān)系2.3.1OPN的生物學(xué)功能OPN作為一種多功能的分泌型糖蛋白，在細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它與多種細(xì)胞表面受體相互作用的能力，從而參與細(xì)胞黏附、遷移、信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理活動(dòng)。在細(xì)胞黏附方面，OPN通過(guò)其分子結(jié)構(gòu)中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列與細(xì)胞表面的整合素受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附。整合素是一類細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，通過(guò)與OPN的結(jié)合，可激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、遷移和增殖等行為。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，OPN與整合素的相互作用可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與周圍組織的黏附能力，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。例如，在肝癌細(xì)胞中，OPN與整合素αvβ3的結(jié)合可促進(jìn)肝癌細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，使其更容易穿透血管壁，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。OPN在細(xì)胞遷移過(guò)程中也扮演著關(guān)鍵角色。它能夠刺激細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的遷移。OPN通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如PI3K-AKT、MAPK等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)。這些信號(hào)通路的激活可促使細(xì)胞伸出偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，OPN對(duì)于細(xì)胞的遷移和組織器官的形成具有重要的調(diào)控作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，OPN的高表達(dá)可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，使其能夠突破腫瘤組織的邊界，向周圍組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)。在信號(hào)傳導(dǎo)方面，OPN作為一種細(xì)胞外信號(hào)分子，與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，激活一系列下游信號(hào)通路。除了上述的PI3K-AKT、MAPK信號(hào)通路外，OPN還可激活NF-κB信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。OPN激活NF-κB信號(hào)通路后，可促進(jìn)炎癥因子、細(xì)胞增殖相關(guān)基因和抗凋亡基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。此外，OPN還可通過(guò)與其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步影響細(xì)胞的生理功能。2.3.2OPN在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用OPN在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用，其異常高表達(dá)與肝癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞增殖方面，大量研究表明，OPN能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。OPN通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路，抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性，進(jìn)而穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖。同時(shí)，OPN還可通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-myc、PCNA等，進(jìn)一步推動(dòng)肝癌細(xì)胞的增殖。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，沉默OPN基因的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期阻滯在G1期；而外源性添加OPN則可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，表明OPN在肝癌細(xì)胞增殖過(guò)程中具有重要的促進(jìn)作用。OPN對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力也有顯著影響。OPN通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2、MMP-9等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，為肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，破壞細(xì)胞間的連接和組織結(jié)構(gòu)，使肝癌細(xì)胞更容易穿透基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管。此外，OPN還可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在EMT過(guò)程中，OPN通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug等，抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白等的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中OPN的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，OPN高表達(dá)的肝癌患者更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。OPN還參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。正常情況下，細(xì)胞的凋亡是維持機(jī)體正常生理平衡的重要機(jī)制之一。在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，OPN通過(guò)激活抗凋亡信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。OPN激活PI3K-AKT信號(hào)通路后，可使下游的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。此外，OPN還可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，如c-IAP1、c-IAP2等，進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。這種對(duì)凋亡的抑制作用使得肝癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)肝癌的發(fā)展。腫瘤微環(huán)境在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，OPN在其中也扮演著關(guān)鍵角色。OPN可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，OPN能夠抑制自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，使其對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力減弱。同時(shí)，OPN還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，M2型巨噬細(xì)胞具有免疫抑制功能，可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。此外，OPN還可促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。OPN通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和分泌，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新的血管。2.4shRNA干擾技術(shù)2.4.1shRNA的作用原理shRNA是一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子，其作用原理基于RNA干擾（RNAi）機(jī)制，這是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。當(dāng)shRNA被導(dǎo)入細(xì)胞后，首先會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶識(shí)別并切割，形成小干擾RNA（siRNA）。siRNA由約21-23個(gè)核苷酸組成，具有雙鏈結(jié)構(gòu)，其中一條鏈為引導(dǎo)鏈（guidestrand），另一條為過(guò)客鏈（passengerstrand）。形成的siRNA會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合，在結(jié)合過(guò)程中，過(guò)客鏈被逐漸降解，而引導(dǎo)鏈則引導(dǎo)RISC復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的靶mRNA序列上。一旦RISC復(fù)合物與靶mRNA結(jié)合，復(fù)合物中的核酸酶，主要是Argonaute2（Ago2）蛋白，會(huì)對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶mRNA的降解。這種特異性的切割作用使得靶mRNA無(wú)法正常翻譯為蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的沉默。例如，當(dāng)針對(duì)OPN基因設(shè)計(jì)的shRNA被導(dǎo)入肝癌細(xì)胞后，形成的siRNA會(huì)與OPNmRNA互補(bǔ)結(jié)合，RISC復(fù)合物中的核酸酶將OPNmRNA切割降解，使細(xì)胞無(wú)法合成OPN蛋白，進(jìn)而阻斷OPN在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。除了通過(guò)降解靶mRNA實(shí)現(xiàn)基因沉默外，shRNA還可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達(dá)，即轉(zhuǎn)錄基因沉默（TGS）。在TGS過(guò)程中，shRNA可以通過(guò)與DNA序列或DNA-RNA雜交體相互作用，招募一些染色質(zhì)修飾酶，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙酰化酶等，對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使基因啟動(dòng)子區(qū)域處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，從而阻止基因的轉(zhuǎn)錄。這種作用機(jī)制進(jìn)一步豐富了shRNA干擾技術(shù)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的方式，為深入研究基因功能和疾病治療提供了更多的可能性。2.4.2shRNA在基因治療中的應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)在基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，在多種疾病的治療研究中取得了顯著進(jìn)展。在腫瘤治療方面，針對(duì)多種腫瘤相關(guān)基因的shRNA研究為腫瘤的治療提供了新的策略。例如，在乳腺癌的治療研究中，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)乳腺癌相關(guān)基因HER2的shRNA，將其導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞中，可有效抑制HER2基因的表達(dá)，降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲性。臨床前研究表明，HER2shRNA治療能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間，為乳腺癌的治療提供了新的思路。在肺癌治療中，針對(duì)肺癌驅(qū)動(dòng)基因EGFR的shRNA也顯示出良好的治療效果。通過(guò)干擾EGFR基因的表達(dá)，可阻斷其下游信號(hào)通路的激活，抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥性。一些研究還嘗試將EGFRshRNA與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)化療藥物的敏感性，提高治療效果。在病毒感染性疾病的治療中，shRNA也發(fā)揮了重要作用。以艾滋病為例，HIV病毒感染人體后，會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組中，難以徹底清除。利用shRNA干擾技術(shù)，針對(duì)HIV病毒的關(guān)鍵基因，如gag、pol、env等設(shè)計(jì)shRNA，可有效抑制病毒基因的表達(dá)和病毒的復(fù)制。研究表明，將這些shRNA導(dǎo)入HIV感染的細(xì)胞中，能夠降低病毒載量，延緩疾病的進(jìn)展。在乙型肝炎的治療研究中，針對(duì)乙肝病毒（HBV）的表面抗原基因（HBsAg）、核心抗原基因（HBcAg）等設(shè)計(jì)的shRNA，可抑制HBV基因的表達(dá)和病毒的組裝、釋放，減少血清中HBVDNA的水平，為乙型肝炎的治療提供了新的方法。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，shRNA同樣具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。例如，在帕金森病的研究中，針對(duì)α-突觸核蛋白（α-synuclein）基因設(shè)計(jì)的shRNA，可降低α-synuclein在神經(jīng)元中的表達(dá)水平，減少其聚集和神經(jīng)毒性，從而緩解帕金森病的癥狀。在阿爾茨海默病的治療研究中，通過(guò)干擾淀粉樣前體蛋白（APP）基因的表達(dá)，可減少β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，有望延緩阿爾茨海默病的發(fā)展進(jìn)程。在肝癌治療中，shRNA針對(duì)關(guān)鍵基因的研究也取得了一定的成果。由于OPN在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，針對(duì)OPN基因的shRNA成為研究熱點(diǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA，可有效沉默OPN基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究表明，OPNshRNA能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞中OPN蛋白的表達(dá)水平，阻斷其下游信號(hào)通路的激活，如PI3K-AKT、MAPK等信號(hào)通路，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，OPNshRNA還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。三、M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA抑制肝癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備細(xì)胞系：選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7，這兩種細(xì)胞系在肝癌研究中廣泛應(yīng)用，具有典型的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性。HepG2細(xì)胞具有較高的增殖能力和侵襲性，常被用于研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制；Huh7細(xì)胞則對(duì)某些信號(hào)通路的變化較為敏感，有助于探究基因治療對(duì)肝癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠免疫缺陷，對(duì)人源腫瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)低，適合用于建立人肝癌異種移植模型。動(dòng)物飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）環(huán)境中，自由攝食和飲水，嚴(yán)格控制環(huán)境溫度（22±2）℃、濕度（50%±10%），12h光照/黑暗循環(huán)。M-PEIs：M-PEIs納米凝膠通過(guò)輻射制備方法合成，具體制備過(guò)程如下：將一定濃度的聚乙烯亞胺（PEI）溶液置于特定的輻射裝置中，在適宜的輻射劑量和反應(yīng)時(shí)間下，使PEI分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成M-PEIs納米凝膠。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)透析、超濾等方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和分離，去除未反應(yīng)的單體和雜質(zhì)，得到高純度的M-PEIs納米凝膠。采用動(dòng)態(tài)光散射（DynamicLightScattering，DLS）技術(shù)和透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscopy，TEM）對(duì)M-PEIs納米凝膠的粒徑、電位和形態(tài)進(jìn)行表征。DLS結(jié)果顯示，M-PEIs納米凝膠的平均粒徑在100-200nm之間，粒徑分布均勻；TEM圖像表明，M-PEIs納米凝膠呈球形，形態(tài)規(guī)則。OPNshRNA表達(dá)載體：根據(jù)人OPN基因序列，利用RNA干擾設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)OPN基因的shRNA序列，并將其克隆至pGPU6/GFP/Neo載體中，構(gòu)建OPNshRNA表達(dá)載體。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證載體中shRNA序列的正確性，確保其能夠有效靶向OPN基因。同時(shí)，構(gòu)建陰性對(duì)照shRNA表達(dá)載體，其序列與OPN基因無(wú)同源性，用于排除非特異性干擾。相關(guān)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自Gibco公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)染試劑，以評(píng)估M-PEIs的轉(zhuǎn)染效率；CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司，用于檢測(cè)細(xì)胞活力；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自Corning公司，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，用于檢測(cè)基因表達(dá)水平；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，保證實(shí)驗(yàn)操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行；倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司，用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BDBiosciences公司，用于分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自AppliedBiosystems公司，用于定量檢測(cè)基因表達(dá)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad公司，用于蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自Tanon公司，用于檢測(cè)蛋白印跡結(jié)果。3.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組體外實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組：僅培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，用于觀察細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)，作為基礎(chǔ)對(duì)照。陰性對(duì)照組：將陰性對(duì)照shRNA表達(dá)載體與M-PEIs按照一定比例混合，形成M-PEIs/陰性對(duì)照shRNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。陰性對(duì)照shRNA序列與OPN基因無(wú)同源性，用于排除M-PEIs和載體本身對(duì)細(xì)胞的非特異性影響。實(shí)驗(yàn)組：將OPNshRNA表達(dá)載體與M-PEIs按照一定比例混合，形成M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。該組用于研究M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用。Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組：將OPNshRNA表達(dá)載體與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照試劑說(shuō)明書(shū)的比例混合，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。Lipofectamine3000是一種常用的高效轉(zhuǎn)染試劑，作為陽(yáng)性對(duì)照，用于對(duì)比M-PEIs的轉(zhuǎn)染效率和對(duì)細(xì)胞的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組：將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。空白對(duì)照組：將1×10?個(gè)肝癌細(xì)胞（HepG2或Huh7）懸浮于100μLPBS中，接種于裸鼠右前肢腋下，建立肝癌異種移植模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，開(kāi)始給予裸鼠腹腔注射100μLPBS，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于觀察腫瘤的自然生長(zhǎng)情況。陰性對(duì)照組：按照上述方法建立肝癌異種移植模型，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將M-PEIs/陰性對(duì)照shRNA復(fù)合物（相當(dāng)于100μgshRNA）懸浮于100μLPBS中，給予裸鼠瘤內(nèi)注射，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于排除M-PEIs和陰性對(duì)照shRNA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的非特異性影響。實(shí)驗(yàn)組：建立肝癌異種移植模型，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物（相當(dāng)于100μgshRNA）懸浮于100μLPBS中，給予裸鼠瘤內(nèi)注射，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于研究M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌生長(zhǎng)的抑制作用。Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組：建立肝癌異種移植模型，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將Lipofectamine3000/OPNshRNA復(fù)合物（相當(dāng)于100μgshRNA）懸浮于100μLPBS中，給予裸鼠瘤內(nèi)注射，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于對(duì)比M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物在體內(nèi)的治療效果。3.1.3實(shí)驗(yàn)方法與步驟細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮中取出凍存的HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。M-PEIs與OPNshRNA復(fù)合物制備：將M-PEIs納米凝膠和OPNshRNA表達(dá)載體按照不同的N/P比（氮磷比，即M-PEIs中氮原子與shRNA中磷酸根的摩爾比）混合，具體N/P比設(shè)置為2、4、6、8、10。首先，將M-PEIs用無(wú)菌水稀釋至所需濃度，然后將OPNshRNA表達(dá)載體用無(wú)菌水稀釋至1μg/μL。按照設(shè)定的N/P比，將適量的M-PEIs溶液和OPNshRNA表達(dá)載體溶液加入到無(wú)菌EP管中，輕輕混勻，室溫孵育30min，使M-PEIs與OPNshRNA充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)復(fù)合物的形成情況，觀察條帶的遷移率變化，以確定最佳的N/P比。同時(shí)，利用DLS技術(shù)檢測(cè)復(fù)合物的粒徑和電位變化，評(píng)估復(fù)合物的穩(wěn)定性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基。將制備好的M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物（按照最佳N/P比）、M-PEIs/陰性對(duì)照shRNA復(fù)合物（按照最佳N/P比）、Lipofectamine3000/OPNshRNA復(fù)合物（按照試劑說(shuō)明書(shū)比例）分別加入到對(duì)應(yīng)的孔中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。GFP基因與shRNA表達(dá)載體共表達(dá)，通過(guò)觀察GFP的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例，可以直觀地了解轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞活力檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)比較不同組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力，分析M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。腫瘤體積測(cè)量：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，從接種腫瘤細(xì)胞后第7天開(kāi)始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，比較不同組腫瘤體積隨時(shí)間的變化情況，評(píng)估M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌生長(zhǎng)的抑制作用。同時(shí)，觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括體重變化、飲食、活動(dòng)等情況，記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中裸鼠的死亡情況，分析M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物對(duì)裸鼠生存狀況的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測(cè)通過(guò)熒光標(biāo)記的方法對(duì)M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA的效率進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組）和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組（Lipofectamine3000/OPNshRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組）均觀察到明顯的綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)熒光圖像進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的比例，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果如圖1所示，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率最高，陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到（85.6±3.2）%；實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染效率次之，陽(yáng)性細(xì)胞比例為（72.5±4.5）%；而陰性對(duì)照組（M-PEIs/陰性對(duì)照shRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組）和空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）幾乎未觀察到綠色熒光，陽(yáng)性細(xì)胞比例均低于5%。這表明M-PEIs能夠有效地將OPNshRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中，雖然其轉(zhuǎn)染效率略低于Lipofectamine3000，但仍具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化收集，用PBS洗滌后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例為（86.7±2.8）%，實(shí)驗(yàn)組為（73.4±3.9）%，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例均低于5%。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、客觀地反映了M-PEIs對(duì)OPNshRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，進(jìn)一步證實(shí)了M-PEIs作為基因載體的有效性。為了探究M-PEIs與OPNshRNA不同N/P比（氮磷比）對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響，分別制備了N/P比為2、4、6、8、10的M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物，并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染48h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果如圖2所示，隨著N/P比的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸提高，當(dāng)N/P比為8時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，陽(yáng)性細(xì)胞比例為（72.5±4.5）%；繼續(xù)增加N/P比至10，轉(zhuǎn)染效率略有下降。這表明在一定范圍內(nèi)，增加M-PEIs與OPNshRNA的N/P比有助于提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但過(guò)高的N/P比可能會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物的毒性增加或穩(wěn)定性下降，從而影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。綜合考慮轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細(xì)胞毒性等因素，選擇N/P比為8作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳比例?！敬颂幙刹迦雸D1：不同組轉(zhuǎn)染48h后綠色熒光蛋白表達(dá)情況（熒光顯微鏡圖），橫坐標(biāo)為不同組別（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組），縱坐標(biāo)為陽(yáng)性細(xì)胞比例?！俊敬颂幙刹迦雸D2：不同N/P比的M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率，橫坐標(biāo)為N/P比，縱坐標(biāo)為陽(yáng)性細(xì)胞比例?！?.2.2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況采用CCK-8法檢測(cè)M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h，分別檢測(cè)各孔細(xì)胞的吸光度值（OD值），并計(jì)算細(xì)胞活力。結(jié)果如圖3所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞活力逐漸升高，表明肝癌細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下能夠持續(xù)增殖。而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞活力在轉(zhuǎn)染后均受到明顯抑制，且抑制作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在轉(zhuǎn)染72h后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力為（45.6±5.2）%，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞活力為（38.9±4.8）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且抑制效果與陽(yáng)性對(duì)照試劑Lipofectamine3000相當(dāng)。進(jìn)一步通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞以低密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。結(jié)果如圖4所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組形成了大量的克隆，克隆數(shù)分別為（286±25）個(gè)和（278±22）個(gè)；而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的克隆形成數(shù)明顯減少，實(shí)驗(yàn)組的克隆數(shù)為（125±18）個(gè)，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的克隆數(shù)為（102±15）個(gè)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，減少細(xì)胞克隆的形成，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)?！敬颂幙刹迦雸D3：不同組肝癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力，橫坐標(biāo)為時(shí)間（24h、48h、72h），縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力（%），不同組別用不同顏色線條表示?！俊敬颂幙刹迦雸D4：不同組肝癌細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖（結(jié)晶紫染色圖），橫坐標(biāo)為不同組別（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組），縱坐標(biāo)為克隆數(shù)?！?.2.3腫瘤體積變化在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)量腫瘤體積來(lái)評(píng)估M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌生長(zhǎng)的抑制作用。從接種腫瘤細(xì)胞后第7天開(kāi)始，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖5所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的腫瘤體積隨時(shí)間迅速增大，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第28天），空白對(duì)照組的腫瘤體積達(dá)到（1568±186）mm3，陰性對(duì)照組的腫瘤體積為（1495±168）mm3。而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積為（654±98）mm3，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的腫瘤體積為（523±85）mm3，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠有效地抑制肝癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)，顯著減小腫瘤體積，其抑制效果與陽(yáng)性對(duì)照試劑Lipofectamine3000相當(dāng)，為肝癌的治療提供了潛在的有效策略?！敬颂幙刹迦雸D5：不同組裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間（天），縱坐標(biāo)為腫瘤體積（mm3），不同組別用不同顏色線條表示?！克?、M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA抑制肝癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1新增實(shí)驗(yàn)材料基質(zhì)膠：選用Matrigel基質(zhì)膠，購(gòu)自Corning公司。Matrigel基質(zhì)膠是一種從小鼠腫瘤中提取的細(xì)胞外基質(zhì)成分，富含膠原蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖等多種生物活性分子。其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，為細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)和遷移支持，常用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，以評(píng)估腫瘤細(xì)胞穿透基底膜的能力。使用前需將基質(zhì)膠儲(chǔ)存于-20℃冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)在冰上緩慢解凍，避免反復(fù)凍融影響其生物學(xué)活性。Transwell小室：采用CostarTranswell小室，其膜孔徑為8.0μm，適用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。Transwell小室由上下兩個(gè)室組成，上室為細(xì)胞接種室，下室添加含趨化因子的培養(yǎng)基，中間的多孔膜可允許細(xì)胞通過(guò)。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室的上室面，可模擬體內(nèi)基底膜，用于檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)前需對(duì)Transwell小室進(jìn)行無(wú)菌處理，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。其他材料：除上述材料外，還需準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)板（24孔板用于Transwell實(shí)驗(yàn)，6孔板用于細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）、無(wú)菌PBS緩沖液、胰蛋白酶-EDTA消化液、甲醇、結(jié)晶紫染液等常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料。甲醇用于固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染液用于染色，以便在顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)穿過(guò)Transwell小室膜或遷移到劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量。4.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整體外實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組：不進(jìn)行任何處理，僅培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，用于觀察細(xì)胞的正常遷移和侵襲能力，作為基礎(chǔ)對(duì)照。陰性對(duì)照組：將陰性對(duì)照shRNA表達(dá)載體與M-PEIs按照最佳N/P比（N/P比為8）混合，形成M-PEIs/陰性對(duì)照shRNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。用于排除M-PEIs和陰性對(duì)照shRNA對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的非特異性影響。實(shí)驗(yàn)組：將OPNshRNA表達(dá)載體與M-PEIs按照最佳N/P比（N/P比為8）混合，形成M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。用于研究M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組：將OPNshRNA表達(dá)載體與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照試劑說(shuō)明書(shū)的比例混合，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。作為陽(yáng)性對(duì)照，用于對(duì)比M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA的效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組：將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為4組，每組10只?？瞻讓?duì)照組：將1×10?個(gè)肝癌細(xì)胞（HepG2或Huh7）懸浮于100μLPBS中，接種于裸鼠右前肢腋下，建立肝癌異種移植模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，開(kāi)始給予裸鼠腹腔注射100μLPBS，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于觀察腫瘤的自然轉(zhuǎn)移情況。陰性對(duì)照組：按照上述方法建立肝癌異種移植模型，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將M-PEIs/陰性對(duì)照shRNA復(fù)合物（相當(dāng)于100μgshRNA）懸浮于100μLPBS中，給予裸鼠瘤內(nèi)注射，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于排除M-PEIs和陰性對(duì)照shRNA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的非特異性影響。實(shí)驗(yàn)組：建立肝癌異種移植模型，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物（相當(dāng)于100μgshRNA）懸浮于100μLPBS中，給予裸鼠瘤內(nèi)注射，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于研究M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的抑制作用。Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組：建立肝癌異種移植模型，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將Lipofectamine3000/OPNshRNA復(fù)合物（相當(dāng)于100μgshRNA）懸浮于100μLPBS中，給予裸鼠瘤內(nèi)注射，每周注射3次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用于對(duì)比M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物在體內(nèi)抑制肝癌轉(zhuǎn)移的效果。4.1.3轉(zhuǎn)移相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)）：在6孔板底面，用馬克筆沿直尺畫(huà)三條橫線作為標(biāo)記線。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至融合狀態(tài)。用直尺比著，200μL槍頭垂直于孔板和畫(huà)的標(biāo)記線劃兩條垂線，使劃痕與標(biāo)記線相交，形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞兩到三次，洗去劃下來(lái)的細(xì)胞。根據(jù)分組分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基，在劃痕、清洗、加液完成后，用顯微鏡拍不同倍數(shù)的照片，作為0h對(duì)照。然后將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2h、4h、6h、8h、12h、24h取出細(xì)胞，于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。使用ImageJ軟件分析照片，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移的距離或劃痕面積，以此評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell實(shí)驗(yàn)）：實(shí)驗(yàn)前一天，將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，置于冰上緩慢解凍。用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基將Matrigel基質(zhì)膠按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室面，均勻鋪展，4℃風(fēng)干過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50μL含10g/LBSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃孵育30min，水化基底膜。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，24孔板下室加入500μL含10%FBS的培養(yǎng)基。將Transwell小室放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞，用PBS沖洗小室兩次。將小室放入甲醇中固定15min，然后用結(jié)晶紫染液染色15min，用清水沖洗小室，去除多余染液。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算平均值，評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：采用裸鼠尾靜脈注射法建立肝癌肺轉(zhuǎn)移模型。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將1×10?個(gè)轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞懸浮于100μLPBS中，通過(guò)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。注射后定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括體重變化、飲食、活動(dòng)等情況。在實(shí)驗(yàn)第4周，將裸鼠處死，取出肺組織，用4%多聚甲醛固定，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。對(duì)肺組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小，評(píng)估肝癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1細(xì)胞遷移和侵襲能力變化通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，于劃痕后0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h分別拍照記錄劃痕寬度，結(jié)果如圖6所示。0h時(shí)，各組細(xì)胞劃痕寬度無(wú)明顯差異。隨著時(shí)間的推移，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞遷移速度較快，劃痕寬度逐漸減小，在24h時(shí)，劃痕幾乎完全愈合；而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞遷移明顯受到抑制，劃痕寬度減小緩慢，在24h時(shí)仍保留較大的劃痕寬度。通過(guò)ImageJ軟件分析劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移距離，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞遷移距離顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.01），表明M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力?！敬颂幙刹迦雸D6：不同組肝癌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)的照片及細(xì)胞遷移距離統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同時(shí)間點(diǎn)（0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h），縱坐標(biāo)為細(xì)胞遷移距離，不同組別用不同顏色線條或柱子表示?！吭赥ranswell遷移實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)48h后，取出Transwell小室，擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞，對(duì)穿過(guò)膜的細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖7所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量較多，分別為（256±28）個(gè)和（248±25）個(gè)；而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，實(shí)驗(yàn)組為（105±16）個(gè)，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組為（89±13）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力?！敬颂幙刹迦雸D7：不同組肝癌細(xì)胞Transwell遷移實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果圖及穿過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同組別（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組），縱坐標(biāo)為穿過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量?！吭赥ranswell侵襲實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室的上室面，模擬體內(nèi)基底膜，培養(yǎng)48h后，對(duì)穿過(guò)膜的細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖8所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量較多，分別為（186±22）個(gè)和（179±20）個(gè)；而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，實(shí)驗(yàn)組為（68±10）個(gè)，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組為（56±8）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力，使其穿透基底膜的能力明顯降低?！敬颂幙刹迦雸D8：不同組肝癌細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果圖及穿過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同組別（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組），縱坐標(biāo)為穿過(guò)膜細(xì)胞數(shù)量?！?.2.2體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)裸鼠尾靜脈注射法建立肝癌肺轉(zhuǎn)移模型，觀察M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的抑制效果。在實(shí)驗(yàn)第4周，將裸鼠處死，取出肺組織，進(jìn)行HE染色，觀察肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。結(jié)果如圖9所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的肺組織中可見(jiàn)大量的轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量分別為（18±3）個(gè)和（16±2）個(gè)，且轉(zhuǎn)移灶體積較大；而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組的肺組織中轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，實(shí)驗(yàn)組為（6±1）個(gè)，Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組為（4±1）個(gè)，且轉(zhuǎn)移灶體積較小。實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA能夠有效抑制肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，減少肺轉(zhuǎn)移灶的形成，降低肝癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。【此處可插入圖9：不同組裸鼠肺組織HE染色圖片及肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同組別（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組），縱坐標(biāo)為肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量?！课?、作用機(jī)制探討5.1對(duì)OPN基因及蛋白表達(dá)的影響5.1.1基因水平檢測(cè)為深入探究M-PEIs轉(zhuǎn)導(dǎo)OPNshRNA抑制肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制，首先在基因水平上對(duì)OPN基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。采用RT-qPCR技術(shù)，該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠精確地檢測(cè)出基因mRNA的表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)步驟如下：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，使用TRIzol試劑提取各組肝癌細(xì)胞的總RNA。TRIzol試劑能夠迅速裂解細(xì)胞，有效抑制RNA酶的活性，確保提取的RNA完整性良好。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保其符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。然后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，確保反應(yīng)條件的準(zhǔn)確性。最后，以cDNA為模板，使用針對(duì)OPN基因的特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。同時(shí)，選擇內(nèi)參基因GAPDH作為對(duì)照，以校正不同樣本之間的RNA上樣量差異。GAPDH是一種廣泛存在于各種細(xì)胞中的管家基因，其表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，常被用作內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化其他基因的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（M-PEIs/OPNshRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組）中OPN基因mRNA的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.01），與陽(yáng)性對(duì)照Lipofectamine3000/OPNshRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體數(shù)據(jù)如圖10所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中OPN基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.08和0.95±0.06，而實(shí)驗(yàn)組和Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組中OPN基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.25±0.03和0.22±0.02。這表明M-PEIs能夠有效地將OPNshRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中，特異性地降解OPN基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)OPN基因的沉默，從而降低OPN基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，為后續(xù)研究OPN基因沉默對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)?！敬颂幙刹迦雸D10：不同組肝癌細(xì)胞中OPN基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，橫坐標(biāo)為不同組別（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、Lipofectamine3000陽(yáng)性對(duì)照組），縱坐標(biāo)為OPN基因mRNA相對(duì)表達(dá)量?！?.1.2蛋白水平檢測(cè)在基因水平檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)Westernblot技術(shù)在蛋白水平上檢測(cè)OPN蛋白的表達(dá)量，以驗(yàn)證基因沉默對(duì)蛋白合成的影響。Westernblot技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，它能夠通過(guò)特異性抗體識(shí)別并檢測(cè)目標(biāo)蛋白，具有高度的特異性和準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)步驟如下：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集各組肝癌細(xì)胞，加入適量的蛋白裂解液，在冰上充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)。通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保上樣量的一致性。將定量后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。SDS-PAGE凝膠電泳能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上形成不同的條帶。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，能夠有效地固定蛋白質(zhì)。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，以防止非特異性結(jié)合。然后，將PVDF膜與OPN蛋白的特異性一抗孵育，一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合OPN蛋白。孵育過(guò)夜后，用TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜，去除未結(jié)合的一抗。接著，將PVDF膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，從而放大檢測(cè)信號(hào)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，去除未結(jié)合的二抗。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯影，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析OPN蛋白條帶的灰度值，以確定OPN蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組