主講教師：王貴霞基因操作技術(shù)芽孢桿菌表達系統(tǒng)芽孢桿菌——屬革蘭氏陽性菌，細胞壁不含內(nèi)毒素，能將表達蛋白分泌到細胞外。目前常用作基因表達系統(tǒng)的有枯草桿菌和短小芽孢桿菌等。1、利用芽孢桿菌作為表達外源基因的受體菌的優(yōu)點：許多芽孢桿菌是非致病性微生物，培養(yǎng)條件簡單，生長迅速；表達產(chǎn)物能分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達產(chǎn)物具有天然構(gòu)相和生物學(xué)活性；某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，便于進行遺傳操作；利用芽孢桿菌進行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。2、宿主菌常用的宿主菌枯草芽孢桿菌短小芽孢桿菌地衣芽孢桿菌3、外源基因在芽孢桿菌中的分泌表達芽孢桿菌的細胞膜不同與大腸桿菌，通常只有一層細胞膜，當(dāng)分泌型蛋白質(zhì)跨膜后就進入到培養(yǎng)基中，因此，外源蛋白的表達量可以達到很高的水平，其表達量可達30g/L。4、在芽孢桿菌中高效表達外源基因的策略提高表達質(zhì)粒在細胞中的穩(wěn)定性滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶酵母表達系統(tǒng)酵母（yeast）——是一類以芽殖或裂殖進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌綱，是外源基因最理想的真核生物基因表達系統(tǒng)。酵母菌的特點：基因表達調(diào)控的機制比較清楚，遺傳操作相對簡便，并于1996年完成了對釀酒酵母基因組全序列的測定；具有原核生物所不具備的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾系統(tǒng)；可將外源基因表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；對人體和環(huán)境安全，不含毒素和特異性病毒；可進行大規(guī)模的發(fā)酵，工藝簡單而成熟，成本低廉。①基因表達調(diào)控機制比較清楚，遺傳操作簡單

1996年完成了釀酒酵母全基因組測序②具備蛋白翻譯后的加工和修飾系統(tǒng)③可將外源基因表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中④安全性好，對人與環(huán)境無害⑤可進行大規(guī)模發(fā)酵，工藝較簡單酵母表達外源基因的優(yōu)勢載體一般包含的元件①DNA復(fù)制起始區(qū)酵母自主復(fù)制序列來源于天然2μ質(zhì)粒YEp

來源于酵母自主復(fù)制序列(ARS)YRp

②選擇標記營養(yǎng)缺陷型選擇標記顯性選擇標記1、酵母表達載體③有絲分裂穩(wěn)定區(qū)(CEN)YCp④表達盒(expressioncassette)

啟動子、分泌信號序列、終止子啟動子上游含有各種調(diào)控元件如:上游激活序列(UAS)

上游阻遏序列(URS)

組成型啟動子序列1、酵母基因表達載體酵母克隆和表達載體是由：酵母野生型質(zhì)粒、原核生物質(zhì)粒載體上的功能基因（如抗性基因、復(fù)制子等）、宿主染色體DNA上自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起構(gòu)建而成。酵母基因表達系統(tǒng)的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進行復(fù)制。①DNA復(fù)制起始區(qū)酵母表達載體包含兩類復(fù)制起始序列：在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起始序列在酵母菌中引導(dǎo)進行自主復(fù)制的序列②選擇標記營養(yǎng)缺陷型選擇標記：它與宿主的基因型有關(guān)。顯性選擇標記：可用于各種類型的宿主細胞，并提供直觀的選擇標記。G418：氨基糖苷類抗生素Cycloheximide：蛋白合成抑制劑③有絲分裂穩(wěn)定區(qū)酵母菌表達載體在細胞內(nèi)拷貝數(shù)少，分子質(zhì)量較大，相當(dāng)于微型染色體。表達載體上的有絲分裂穩(wěn)定區(qū)，決定載體在宿主細胞分裂時，能平均分配到子細胞中去，它來源于酵母菌染色體著絲粒片段。④表達盒表達盒由啟動子、分泌信號序列和終止子等組成，是酵母表達載體的重要元件。分泌信號序列是前體蛋白N端一段長為17～30個氨基酸殘基的分泌信號肽編碼區(qū)，主要功能是引導(dǎo)分泌蛋白從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞外，并對蛋白質(zhì)翻譯后的加工起重要作用。2、酵母基因表達載體的種類（1）自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeastreplicatingplasmid，YRP）該載體含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標記和基因克隆位點等元件，能夠在酵母細胞中進行自我復(fù)制。優(yōu)點：在酵母細胞中的轉(zhuǎn)化效率較高，每個細胞中的拷貝數(shù)可達200個。缺點：經(jīng)過多代培養(yǎng)后，子細胞中的拷貝數(shù)會迅速減少。（2）整合型質(zhì)粒載體（yeastintegrationplasmid，YIP）整合型質(zhì)粒載體不含酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母中進行自主復(fù)制，但含有整合介導(dǎo)區(qū)，可通過DNA的同源重組將外源基因整合到酵母染色體上，并隨染色體一起進行復(fù)制。質(zhì)粒與染色體DNA的同源重組主要有單交換（插入）整合和雙交換（或替換）整合兩種方式。（3）著絲粒型質(zhì)粒載體（yeastcentromericplasmid，YCP）該型質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型的基礎(chǔ)上，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件。在細胞分裂時，質(zhì)粒載體能平均分配到子細胞中，穩(wěn)定性較高，但拷貝數(shù)很低，通常只有1～2個拷貝。該載體在酵母細胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個細胞內(nèi)只有單拷貝。在細胞分裂和遺傳過程中，能將染色體載體均勻分配到子細胞中，并保持相對獨立和穩(wěn)定。酵母菌選擇標記基因赭石突變抑制基因

SUP4表達時菌落呈白色，不表達時呈紅色。外源基因的插入可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組轉(zhuǎn)化子。YAC載體可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達研究。（4）酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）2、常用的酵母表達宿主菌釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、非洲酒裂殖酵母、多態(tài)漢遜酵母。①釀酒酵母應(yīng)用與研究最早乙醇積累影響酵母生長與基因表達蛋白過度糖基化分泌能力不強②巴斯德畢赤酵母甲醇營養(yǎng)菌甲醇可誘導(dǎo)與甲醇代謝相關(guān)酶高效表達利用甲醇誘導(dǎo)的乙醇氧化酶基因AOX1啟動子高效表達外源基因3、酵母基因表達系統(tǒng)宿主菌主要包括釀酒酵母*巴斯德畢赤酵母乳酸克努維酵母多型漢森酵母4、在酵母中高效表達外源基因的策略選擇合適的受體細胞系統(tǒng)提高表達載體在細胞中的拷貝數(shù)提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)哺乳動物細胞是最高等的真核生物細胞，其結(jié)構(gòu)、功能和基因表達調(diào)控更加復(fù)雜。要表達具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)和具有特異性催化功能的酶，需要在高等真核生物細胞中進行。外源基因在哺乳動物細胞中的表達包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)加工等過程。哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)的優(yōu)勢更好的蛋白輔助折疊系統(tǒng)蛋白糖基化、磷酸化、寡聚體、二硫鍵形成等蛋白加工系統(tǒng)可直接表達具有完全生物功能的活性蛋白哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)應(yīng)用哺乳動物表達載體載體一般包含的元件①哺乳動物細胞中進行基因轉(zhuǎn)錄的元件

啟動子、增強子、終止子、poly(A)信號、內(nèi)含子剪切信號②基因表達調(diào)控元件③細菌中進行復(fù)制和篩選的元件④篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記常用篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記哺乳動物常用表達載體：人腺病毒、猴空泡病毒SV40、人乳多瘤病毒BKV、人牛痘病毒哺乳動物常用受體細胞:中國倉鼠卵巢細胞CHO1、哺乳動物基因表達載體的組成特征哺乳動物基因表達載體質(zhì)粒載體病毒載體哺乳動物基因表達質(zhì)粒載體是一類穿梭質(zhì)粒，能夠在細菌（大腸桿菌）和哺乳動物細胞中進行擴增。哺乳動物基因表達載體組成元件一般包括：基因的轉(zhuǎn)錄元件：即轉(zhuǎn)錄的啟動子、增強子、終止子、poly(A)信號和內(nèi)含子剪接信號等；用于篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記；在細菌中進行復(fù)制和篩選的元件；基因表達的調(diào)控元件。3、哺乳動物基因表達宿主細胞哺乳動物基因表達宿主細胞選擇的基本原則：來源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達效果好。在哺乳動物基因表達過程中，與正常細胞生理特性盡可能接近的腫瘤細胞常被選擇為基因轉(zhuǎn)移的受體細胞。目前用作哺乳動物基因表達系統(tǒng)的受體細胞主要有：CHO-K1細胞、COS細胞、鼠骨髓瘤細胞等。CHO-K1細胞CHO-K1細胞——中國倉鼠卵巢的上皮細胞。目前被用于基因表達的受體細胞是一株缺乏二氫葉酸還原酶（dhfr－）的突變株，它可在氨甲蝶呤選擇壓力下，使外源基因拷貝數(shù)擴增并得到較高水平的表達，表達量可達10μg/ml以上。二氫葉酸還原酶可降解氨甲蝶呤氨甲蝶呤可抑制DNA和RNA的合成。①外源基因在沒有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；②適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達和胞內(nèi)表達；③對培養(yǎng)基的要求較低，可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；④細胞可進行貼壁培養(yǎng)，也可進行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。該細胞株是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物基因表達受體細胞之一，已有多種外源基因如人組織型纖溶酶原激活劑（tPA）、干擾素β、干擾素γ、凝血因子Ⅷ等在CHO細胞中得到表達。CHO-K1細胞特點COS細胞它來源于非洲綠猴腎細胞系（CV-1），能組成性表達SV40的大T抗原。COS細胞的特點：①細胞來源豐富；②細胞易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染；③能使轉(zhuǎn)染到該細胞中的帶有SV40復(fù)制子的轉(zhuǎn)錄載體快速擴增；④能瞬時大量表達外源基因的產(chǎn)物。由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在COS細胞中無節(jié)制復(fù)制，最終將導(dǎo)致細胞無法忍受而死亡。利用COS細胞作為外源基因瞬時表達的受體細胞可廣泛用于哺乳動物基因的表達與調(diào)控、蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析等研究。鼠骨髓瘤細胞鼠骨髓瘤細胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被