第二章酶工程教學(xué)重點、難點、學(xué)時一、概述(一）酶的定義（二）分類及命名（三）酶工程的研究內(nèi)容（四）催化特性二、酶作用原理三、酶的生產(chǎn)及分離純化四、酶分子修飾五、酶的固定化六、酶反應(yīng)器七、酶的應(yīng)用及發(fā)展展望1、要點酶的定義、酶工程的研究內(nèi)容、酶的催化特性、酶的作用原理、分離純化、化學(xué)修飾、固定化、在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用及展望2、重點作用原理、分離純化、固定化3、學(xué)時7學(xué)時教學(xué)要點、重點、學(xué)時（一）酶的定義生物體內(nèi)產(chǎn)生的具有催化功能的特殊蛋白質(zhì)和RNA。（二）分類及命名1、分類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶或合成酶2、命名：(1)習(xí)慣命名法:

根據(jù)其催化底物來命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；結(jié)合上述兩個原則來命名；有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點。一、概述(2)國際系統(tǒng)命名法國際酶學(xué)－－四位數(shù)字編號系統(tǒng)第一位：表大類；第二位：表亞類；第三位：表亞亞類；第四位：表在亞亞類的序號系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶字。例如：習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶系統(tǒng)名稱:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶催化的反應(yīng):

谷氨酸+丙酮酸

-酮戊二酸+丙氨酸一、概述（三）酶工程的研究內(nèi)容酶工程：是利用酶的催化作用進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化的技術(shù)，是將酶學(xué)理論與化工技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。其主要任務(wù)是：通過預(yù)先設(shè)計，經(jīng)過人工操作控制而獲得大量所需的酶，并通過各種方法使酶發(fā)揮出最大的催化功能；目的是為我們提供產(chǎn)品或以特定的功能為我們服務(wù)。1、生產(chǎn)2、分離純化3、酶分子修飾4、酶的固定化5、酶反應(yīng)動力學(xué)6、酶反應(yīng)器7、酶的應(yīng)用一、概述（四）酶的催化特性

1、催化效率高2、專一性強

3、催化條件溫和

4、酶活性可調(diào)

5、對環(huán)境條件敏感一、概述（一）酶是生物催化劑活化能（J/mol)：在一定溫度下一摩爾底物全部進入活化狀態(tài)所需要的自由能。酶能大大降低活化能，增加活化分子。（二）酶催化反應(yīng)動力學(xué)中間產(chǎn)物學(xué)說二、酶作用原理在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶－底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化后，中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。

E+S====E-S

P+E

許多實驗事實證明了E－S復(fù)合物的存在。E－S復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。二、酶作用原理二、酶作用原理酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的方式（理論）(1)鎖鑰假說(lockandkeyhypothesis)：認為整個酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對一把鎖一樣(2)誘導(dǎo)契合假說（induced–fithypothesis):

該學(xué)說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補形狀.1、米－門方程的提出（底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響）二、酶作用原理二、酶作用原理米氏方程1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對酶促反映的動力學(xué)進行研究，推導(dǎo)出了表示整個反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。Km—米氏常數(shù)Vmax

—最大反應(yīng)速度米氏方程的推導(dǎo)：二、酶作用原理假設(shè)：1）忽略ｐ的逆反應(yīng)，也即在初速度期間；2）底物濃度遠遠大于酶的濃度；3）反應(yīng)處于穩(wěn)態(tài)，即中間產(chǎn)物生成和分解的速度相等。2、關(guān)于米－門方程的討論1）酶初速度和底物濃度的關(guān)系為一雙曲線；2）[E]<<[S]<<Km時，可用[So]表示[S]；3)當(dāng)V=Vmax,V與[S]無關(guān)，與[Eo]成正比；4）k3<<k2時，Km=Ks,可表示酶與底物結(jié)合緊密程度；5）k3－－酶的每個活性部位在單位時間內(nèi)，催化底物起反應(yīng)的分子數(shù)，又叫轉(zhuǎn)換系數(shù)，簡稱T.N.。二、酶作用原理3、Km與Vmax的意義1）米氏常數(shù)是酶反應(yīng)處于動態(tài)平衡，即穩(wěn)態(tài)時的平衡常數(shù)。是V=1/2Vmax時的底物濃度，故又稱半速度常數(shù)。（1）Km值是酶的特征常數(shù)之一，只與酶性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。不同的酶，Km值不同。（2）如果一個酶有幾種底物，則對每一種底物，各有一個特定的Km值。（3）同一種酶的幾種底物中，Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。2）最大酶反應(yīng)速率rp,max=k3CEｔ。它表示了當(dāng)全部的酶都成復(fù)合物狀態(tài)時的反應(yīng)速率。二、酶作用原理

二、酶作用原理

4、Km與Vmax的測定測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km二、酶作用原理（二）酶促反應(yīng)的影響因素

1、pH；

2、溫度；

3、酶濃度；

4、抑制劑的影響不可逆抑制與可逆抑制的區(qū)分

1）競爭性抑制；2）非競爭性抑制作用

3）反競爭抑制；4）底物抑制

5、底物的濃度二、酶作用原理（一）酶的生產(chǎn)

1.對酶源的要求

2.微生物作為酶的優(yōu)勢

3.對酶生產(chǎn)菌的要求（二）酶的分離純化

1.酶提取

2.酶分離純化的沉淀技術(shù)

3.酶分離純化的層析技術(shù)

4.酶分離純化的電泳技術(shù)三、酶的生產(chǎn)及分離純化（一）酶的生產(chǎn)1.對酶源的要求

1）酶含量豐富

2）提取、純化方便三、酶的生產(chǎn)及分離純化2.微生物作為酶的優(yōu)勢

1）易得到所需的酶類

2）易獲得高產(chǎn)菌株

3）生產(chǎn)成本低

4）微生物生長周期短

5）生產(chǎn)易管理

6）提高微生物產(chǎn)酶能力的途徑較多

7）可提高酶產(chǎn)量或改造酶（一）酶的生產(chǎn)三、酶的生產(chǎn)及分離純化3.對酶生產(chǎn)菌的要求

1）不是致病菌，也不產(chǎn)毒素

2）不易變異退化，不易感染噬菌體

3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶

4）原料廉價，周期短，易培養(yǎng)三、酶的生產(chǎn)及分離純化（一）酶的生產(chǎn)（二）酶的分離純化酶的分離提純可分為四個要點：酶源選材勻漿方法分離步驟結(jié)晶方法酶的分離提純涉及的理論與技術(shù)：酶主要是蛋白質(zhì)酶具有催化功能三、酶的生產(chǎn)及分離純化酶分離提純步驟如下：三、酶的生產(chǎn)及分離純化半勻漿選材提取液粗酶制品精制細胞器純酶酶結(jié)晶抽取或分散親和分離法少量酶分離方法結(jié)晶法1.酶提取定義：是將酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，以供進一步從中分離純化出所需的酶。1）組織及細胞的破碎（1）物理法（包括機械法）（2）化學(xué)法（3）酶解法

2）酶的提取原理———相似相溶常用方法：（1）酸、堿、鹽溶液提取（2）有機溶液提取三、酶的生產(chǎn)及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術(shù)1）鹽析———溶解度的差異鹽溶－低濃度的中性鹽可增加電解質(zhì)類物質(zhì)的溶解度；鹽析－當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)的溶解度反而降低而析出。（1）基本原理

a.減弱了蛋白質(zhì)的水合程度b.中和了蛋白質(zhì)電荷，使靜電荷減少蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中的離子強度遵守Cohn方程：

三、酶的生產(chǎn)及分離純化（2）影響因素

a.蛋白質(zhì)的濃度b.介質(zhì)的pHc.溫度d.鹽類型三、酶的生產(chǎn)及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術(shù)2．酶分離純化的沉淀技術(shù)2）PEG沉淀法———溶解度的差異（1）基本原理空間排阻學(xué)說：PEG分子在溶液中形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與溶液中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生空間排擠作用，從而使蛋白質(zhì)分子凝聚而沉淀下來。

PEG沉淀蛋白質(zhì)的過程遵循下列方程：三、酶的生產(chǎn)及分離純化（2）影響因素a.蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量——大，沉降好b.蛋白質(zhì)濃度c.pH值d.離子強度e.溫度f.PEG聚合度三、酶的生產(chǎn)及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術(shù)3)有機溶劑沉淀法——溶解度的差異（1）基本原理

a.介質(zhì)的介電常數(shù)下降，增強靜電作用力b.降低水合程度（2）常用方式

a.分級沉淀有用的蛋白質(zhì)b.雜蛋白質(zhì)變性（3）缺點——易使酶變性，低溫操作三、酶的生產(chǎn)及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術(shù)4）等電點沉淀法——溶解度的差異蛋白質(zhì)在等電點（ｐI）處，凈電荷為0，易于沉淀。5）熱變性沉淀法——熱穩(wěn)定性的差異

可用其他輔助因子、底物等方法，使目的酶的熱變性溫度提高。三、酶的生產(chǎn)及分離純化2．酶分離純化的沉淀技術(shù)3.酶分離純化的層析技術(shù)層析分離——是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)｛分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)｝的不同，使各組分的分布程度不同而達到分離。三、酶的生產(chǎn)及分離純化1）凝膠過濾層析——分子大小和形狀的差異（1）基本原理如圖2－32所示，酶液中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，從而實現(xiàn)分離純化。（2）優(yōu)點條件溫和，操作簡便，分離范圍廣，回收率高，層析柱可反復(fù)使用，無需再生處理,可分段分離。（3）常用的凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠3.酶分離純化的層析技術(shù)三、酶的生產(chǎn)及分離純化2）離子交換層析——電荷性質(zhì)的差異它利用離子交換劑上可解離基團對各種離子的親和力不同而進行分離。（1）基本原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，不同蛋白質(zhì)由于其pI不同，在同一種pH值介質(zhì)中電離狀況不同，分子所帶電荷種類和數(shù)量就不同，與離子交換劑的靜電吸附能力也不同。通過吸附和改變離子強度或pH值解吸洗脫，可使蛋白質(zhì)依據(jù)其靜電吸附能力由弱到強的順序而分離開來。三、酶的生產(chǎn)及分離純化3.酶分離純化的層析技術(shù)（2）洗脫方法

a.梯度洗脫

b.階段洗脫3.酶分離純化的層析技術(shù)三、酶的生產(chǎn)及分離純化3.酶分離純化的層析技術(shù)3）親和層析——親和力的差異（1）基本原理利用配基與酶結(jié)合能力而將目的酶分離出來。三、酶的生產(chǎn)及分離純化（2）載體a.應(yīng)具有均一、堅實、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)b.親水c.具有可活化和改變的化學(xué)基團d.具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性交聯(lián)瓊脂糖凝膠三、酶的生產(chǎn)及分離純化3.酶分離純化的層析技術(shù)(3)配基a.配基與酶的親和力b.配基與載體的結(jié)合方式引入手臂可避免配基在載體上密度太大而造成的空間障礙。W-氨烷基化合物三、酶的生產(chǎn)及分離純化3.酶分離純化的層析技術(shù)4）高效液相色譜（1）基本原理用檢測器檢出，由收集器收集同一色譜的目的酶。HPLC的優(yōu)點：分辨率高；快速，整個分離過程僅幾十分鐘；靈敏度高；一根術(shù)可分析多個樣品，而無需重新填裝柱。三、酶的生產(chǎn)及分離純化3.酶分離純化的層析技術(shù)4.酶分離純化的電泳技術(shù)三、酶的生產(chǎn)及分離純化電泳—帶電物質(zhì)在直流電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。區(qū)帶電泳——樣品溶液在一惰性支持物上進行電泳的過程。電泳后，不同的蛋白質(zhì)組成被分離形成帶狀區(qū)間。區(qū)帶的位置可用專一蛋白質(zhì)染料染色顯示，有些也可利用伴有顏色變化的酶催化反應(yīng)來顯示。1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（1）基本原理

a.蛋白質(zhì)的靜電荷b.蛋白質(zhì)的分子大?。?）分類三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)a連續(xù)凝膠電泳b不連續(xù)凝膠電泳c濃度梯度凝膠電泳dSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳a.連續(xù)凝膠電泳采用相同濃度的單體和交聯(lián)劑，用相同pH值和相同濃度的緩沖溶液制備成連續(xù)均勻的凝膠，然后在同一條件下進行電泳。按分子大小和凈電荷的不同而具有不同的遷移率，從而彼此分開。三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)b.不連續(xù)凝膠電泳是指凝膠孔徑大小、緩沖液成分及pH均為不連續(xù)的，并在電場中形成不連續(xù)的電位梯度，從而使樣品濃縮成一個極窄的起始區(qū)帶。可提高分辨率的三個物理效應(yīng)：濃縮效應(yīng)；分子篩效應(yīng)；電荷效應(yīng)組成：由上至下分別為：樣品凝膠；濃縮凝膠；分離凝膠三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)c.濃度梯度凝膠電泳聚丙烯酰胺濃度由上至下形成由低到高的連續(xù)梯度，其內(nèi)部孔徑也逐漸減小。適用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)d.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

加入1%~2%的SDS制備而成。

SDS－PAGE主要用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。基本原理：

SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物中SDS含有大量陰離子，從而掩蓋了蛋白質(zhì)之間原來的電荷的差異；而且蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變變成橢圓形，短軸為18埃左右，長軸與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量成正比－－－SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物的遷移率不再受其原在電荷和分子形狀的影響，而只決定于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)2）等電聚焦（1）基本原理帶有電荷的蛋白質(zhì)分子可在電場中泳動，其電泳遷移率隨其所帶電荷不同而彼此不同。等電聚焦是在電解槽中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，便形成一個由陽極到陰極逐步增加的ｐH梯度，而蛋白質(zhì)則移動并聚焦于pI處。三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)（2）目的a.分離純化酶b.測定pI（3）載體兩性電解質(zhì)

——是具在ｐH梯度的物質(zhì)，是由多種氨基與羧基比例不同的多氨基多羧酸的混合物構(gòu)成的。三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)理想載體兩性電解質(zhì)具有的條件：a.在pI處必須有足夠的緩沖能力，以使pH梯度穩(wěn)定；b.在pI處必須有足夠的電導(dǎo)；c.分子質(zhì)量要小；d.化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)；e.應(yīng)不與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。三、酶的生產(chǎn)及分離純化4.酶分離純化的電泳技術(shù)（一）問題的提出

1、定義

2、修飾目的

3、修飾方法

4、現(xiàn)在進行的工作（二）酶分子的化學(xué)修飾（三）生物酶工程四、酶分子修飾（一）問題的提出1、定義

———通過各種方法使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程。利用的是“結(jié)構(gòu)決定功能”。2、修飾目的

1）提高酶活力；2）增強穩(wěn)定性；

3）環(huán)境可改變；4）改變最適pH或T；

5）改變酶的特異性；6）改變催化類型；

7）提高反應(yīng)效率。四、酶分子修飾3.修飾方法

1）金屬離子置換修飾；

2）大分子結(jié)合修飾；

3）肽鏈有限水解修飾；

4）酶蛋白側(cè)鏈基團修飾；

5）氨基酸置換修飾；

6）物理修飾。四、酶分子修飾（一）問題的提出4.現(xiàn)在進行的工作

1）設(shè)法使酶的活性結(jié)構(gòu)加固；

2）通過化學(xué)修飾或酶法修飾改變酶的活性；

3）設(shè)法消除免疫性或抗原性以利于醫(yī)療應(yīng)用。四、酶分子修飾（一）問題的提出1.定義化學(xué)修飾——通過化學(xué)手段將某些化學(xué)物質(zhì)或基團結(jié)合到酶分子上，以改變酶的物理化學(xué)性質(zhì)，達到改變酶的催化性質(zhì)的目的。——是指通過主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對酶分子進行改造，其目的在于改變酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造出天然酶不具備的某些優(yōu)良性狀，擴大酶的應(yīng)用以達到較高的經(jīng)濟效益。它主要是利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團的特性，直接或經(jīng)一定活化步驟與酶分子的某種氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶的結(jié)構(gòu)和功能。四、酶分子修飾（二）酶分子的化學(xué)修飾2.修飾常用的方法1）部分水解酶的非活性主鏈；2）對活性部位或非活性部位以外的側(cè)鏈基團進行共價修飾；3）輔酶因子的置換。3.常用的修飾劑1）酰化試劑；2）烷化劑；3）形成酯和酰胺的試劑；4）氧化還原試劑；5）親電子試劑四、酶分子修飾（二）酶分子的化學(xué)修飾4.修飾時的注意事項1）對修飾劑的要求——分子質(zhì)量大、生物相容性和水溶性好、反應(yīng)基團多、半衰期長；2）對酶性質(zhì)的了解——活性部位、最適條件、側(cè)鏈基團的化學(xué)性質(zhì)以及反應(yīng)活性；3）反應(yīng)條件的選擇——酶穩(wěn)定的條件5.修飾后酶催化活性的改變?nèi)绫?－13四、酶分子修飾（二）酶分子的化學(xué)修飾1.性質(zhì)

——分子水平上的生物修飾2.概念

重組DNA技術(shù)——是在分子水平上，把某種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物細胞之中，并在新細胞中擴增和表達。生物酶工程——又稱高級酶工程，它是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。它是最理想的酶改造方法。四、酶分子修飾（三）生物酶工程3.生物酶工程的主要內(nèi)容（如圖2－48）1）克隆酶；2）突變酶；3）新酶。4、生物酶工程的發(fā)展分支——酶的蛋白質(zhì)工程1）定義——是通過結(jié)構(gòu)基因的改造達到修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，從而改變該蛋白質(zhì)的性能甚至創(chuàng)造出自然界中尚未發(fā)現(xiàn)的新蛋白質(zhì)的目的。2）與基因工程的區(qū)別和聯(lián)系聯(lián)系——蛋白質(zhì)工程在基因工程上發(fā)展起來的；區(qū)別——基因工程：解決的是酶大量生產(chǎn)的問題；蛋白質(zhì)工程：完全符合要求的酶四、酶分子修飾（三）生物酶工程（一）概述1.Idea的提出2.基本概念（二）固定化方法1.吸附法；2.包埋法；3.結(jié)合法；（三）固定化法對酶的影響五、固定化（一）概述1.Idea的提出1）酶的穩(wěn)定性差；2）難回收；3）難分離純化（產(chǎn)物與酶）。2.基本概念

酶的固定化——將酶與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化酶的過程。

固定化酶——固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。固定化酶的原料——純酶、結(jié)合在死細胞或細胞碎片的酶或酶系（固定化菌體）五、固定化1.吸附法

——利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定化的方法

常用吸附劑——活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石。特點——操作簡單、條件溫和、不會使酶失活；結(jié)合力弱、易脫落。五、固定化（二）固定化方法吸附法包埋法結(jié)合法分類2、包埋法——將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定。載體——瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉等。五、固定化（二）固定化方法凝膠包埋法半透膜包埋法分類根據(jù)載體材料和方法1）凝膠包埋法

——將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化菌體，大多數(shù)為球狀或片狀。常用凝膠——天然凝膠（瓊脂凝膠、角叉菜膠、明膠等）和合成凝膠（聚丙烯酰膠凝膠、光交聯(lián)樹脂）2）半透膜包埋法——是指將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。常用半透膜——聚酰胺膜、火棉膠膜等。微膠囊——半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直徑一般只有幾微米至幾百微米。特點——僅適用于底物和產(chǎn)物為小分子物質(zhì)的酶的固定化。（二）固定化方法五、固定化3.結(jié)合法——選擇適宜的載體，使之與通過共價鍵和離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。分類（結(jié)合鍵不同）：離子鍵結(jié)合法、共價鍵結(jié)合法1）離子鍵結(jié)合——通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體——不溶于水的離子交換劑特點——制備操作簡單，活力損失較少，但使用時一定要嚴格控制好pH值、離子強度和溫度。五、固定化（二）固定化方法2）共價鍵結(jié)合——通過共價鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法載體——纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物。載體活化——借助于某種方法，在載體上引進某一活潑基團。其方法有：重氮法、疊氮法、溴化氰法、烷化法等。能形成共價鍵的基團（酶分子）——氨基、羧基、巰基、酚基和咪唑基等。（二）固定化方法五、固定化各種固定化方法的比較：見表2－14固定化的注意事項：固定化前——對酶性質(zhì)的了解、方法的選擇、條件的控制。固定化后——測定酶的活力、研究反應(yīng)最適條件、考察酶穩(wěn)定性五、固定化（二）固定化方法1）酶活力回收率變化

——是指固定化酶所保留下來的酶的活力與游離酶在固定化之前的酶活力之比。多數(shù)下降2）底物專一性變化——對分子質(zhì)量大的活性下降3）反應(yīng)的最適pH值變化——不同程度