ICS13.020.01

CCSZ06

!7,



DB32/T4677—2024

周叢生物綜合調查與分析

測試技術規(guī)程

Technicalcodeofpracticeforsurvey，analysisanddetermination

ofperiphyton

2024-02-05發(fā)布2024-03-05實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

中國標準出版社出版

DB32/T4677—2024

目次

前言……………………………Ⅲ

1范圍…………………………1

2規(guī)范性引用文件……………1

3術語和定義…………………1

4采樣點位布設………………2

4.1布點原則………………2

4.2布點前期準備…………………………2

4.3布點要求………………3

5樣品采集與保存……………4

5.1材料和器具……………4

5.2樣品采集………………4

5.3樣品的處理與儲存……………………5

6物理指標分析測試…………………………5

6.1覆蓋度測定……………5

6.2厚度測定………………6

6.3二維形態(tài)表征…………………………7

6.4三維結構表征…………………………7

7化學指標分析測試…………………………8

7.1總有機碳、總無機碳和總碳含量………………………8

7.2總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量…………………9

7.3磷含量…………………9

7.4鉀含量…………………10

7.5鈉含量…………………10

7.6鈣、鎂含量……………11

7.7硫含量…………………11

7.8鐵含量…………………11

7.9錳含量…………………12

7.10銅含量………………12

7.11鋅含量………………13

7.12鉬含量………………13

7.13硅含量………………13

7.14氯含量………………14

Ⅰ

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7.15硼含量………………14

8生物指標分析測試…………………………15

8.1微生物組成和多樣性…………………15

8.2磷脂脂肪酸群落結構…………………15

8.3胞外聚合物……………17

8.4生物量…………………18

8.5葉綠素含量……………18

附錄A（資料性）周叢生物采樣點位信息記錄表…………19

附錄B（資料性）周叢生物原位采樣器……………………20

附錄C（資料性）周叢生物野外采樣記錄…………………21

Ⅱ

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由全國土壤質量標準化技術委員會提出并歸口。

本文件起草單位：中國科學院南京土壤研究所、中國環(huán)境科學研究院、中國科學院水生生物研究所、

河海大學、南京林業(yè)大學、中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所、江蘇省農業(yè)科學院。

本文件主要起草人：吳永紅、孫朋飛、徐瀅、周蕾、劉俊琢、陸海鷹、李丹、王思楚、陳志浩、王凱、

周晴晴、陶靜、李庭芳、劉凌佳、韓燕云、吳麗蓉、金澤凡、相棣、李志福、羅華溢、劉蘇賢、孫宇婷、盧少勇、

吳辰熙、李九玉、夏永秋、佘冬立、沈健林、張松賀、馮彥房。

Ⅲ

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周叢生物綜合調查與分析

測試技術規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了周叢生物調查點位布設、樣品采集與保存以及物理、化學和生物指標分析測試的要求。

本文件適用于稻田、溝渠、河流、水庫、湖泊等濕地或淺水水體中周叢生物采樣點的布設、采集、保存

以及物理、化學和生物性質的定量表征或測試分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法

GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程

GB/T33834微束分析掃描電子顯微術生物試樣掃描電子顯微鏡分析方法

GB/T35871糧油檢驗谷物及其制品中鈣、鉀、鎂、鈉、鐵、磷、鋅、銅、錳、硼、鋇、鉬、鈷、鉻、鋰、鍶、

鎳、硫、釩、硒、銣含量的測定電感耦合等離子體發(fā)射光譜法

DZ/T0279.27區(qū)域地球化學樣品分析方法第27部分：有機碳量測定重鉻酸鉀容量法

HJ634土壤氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的測定氯化鉀溶液提取?分光光度法

HJ897水質葉綠素a的測定分光光度法

HJ/T345水質鐵的測定鄰菲啰啉分光光度法

JY/T0586激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法通則

LY/T1246森林土壤交換性鉀和鈉的測定

LY/T1250森林土壤碳酸鈣的測定

LY/T1270森林植物與森林枯枝落葉層全硅、鐵、鋁、鈣、鎂、鉀、鈉、磷、硫、錳、銅、鋅的測定

NY/T88土壤全磷測定法

NY/T149土壤有效硼測定方法

NY/T1378土壤氯離子含量的測定

NY/T2017植物中氮、磷、鉀的測定

NY/T3030棉花中水溶性總糖含量的測定蒽酮比色法

SN/T3926出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質含量的測定考馬斯亮藍法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

周叢生物periphyton

淹水環(huán)境下附著生長于固體基質表面的藻類、細菌、原生動物和后生動物等微生物及其代謝產物和

1

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有機碎屑交織在一起形成的聚合體。

3.2

周叢生物覆蓋度periphytoncoverage

單位面積內附著生長在基質表面的周叢生物面積占總面積之比。

注：一般用百分數(shù)表示。

3.3

周叢生物粗糙度periphytonroughness

周叢生物表面孔隙和空隙占整個體積的比例。

3.4

周叢生物多樣性biodiversityofperiphyton

周叢生物內顯著不同的種群之間以及同一種群內的遺傳變異，涉及周叢生物中多種多樣活的有機體

（藻類、細菌、原生動物和后生動物）的種類、數(shù)量及其在周叢生物中的分布信息。

3.5

周叢生物胞外聚合物extracellularpolymericsubstances（EPS)ofperiphyton

在一定環(huán)境條件下由周叢生物內細菌、微藻等微生物分泌于細胞外的主要由多糖、蛋白質和核酸等

組成的大分子聚合物。

3.6

周叢生物生物量biomassofperiphyton

某一時間段內單位面積或單位體積內周叢生物實存生活的有機物質（干重）總量。

注：通常用g/cm2或g/cm3表示。

4采樣點位布設

4.1布點原則

4.1.1科學性原則

采樣點位應具有典型性和代表性，能充分滿足調查評估工作的目標要求，能真實反映水域生態(tài)系統(tǒng)

中周叢生物真實分布情況。

4.1.2系統(tǒng)性原則

布設點位宜涵蓋調查區(qū)域范圍內周叢生物可能分布的類型，采樣點數(shù)量宜滿足統(tǒng)計學要求。

4.1.3重點性原則

宜把調查區(qū)域內水域生態(tài)系統(tǒng)及稻田作為調查重點區(qū)域。周叢生物生物量、性質、水動力和生境差

異較大時，宜提高點位布設密度。

4.1.4持續(xù)性原則

布設點位確定后宜長期保持固定。

4.2布點前期準備

4.2.1背景調查

了解調查區(qū)域稻田、溝渠、池塘、河流和水庫等水系分布信息及土壤、地形、灌溉、施肥、水文、氣候等

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背景信息，采樣點位信息表詳見附錄A。

4.2.2人員組織

組織具有相關專業(yè)背景的人員，明確任務分工，對人員做好觀測方法和野外操作規(guī)范的工作培訓。

加強野外調查安全培訓工作，提高相關人員安全意識。

4.3布點要求

4.3.1農田生態(tài)系統(tǒng)布點

4.3.1.1稻田布點

對于同一調查區(qū)域的稻田點位布設，應包含集約農業(yè)區(qū)、傳統(tǒng)自耕區(qū)、重要水體上下游及附近的稻

田，每類稻田至少布設3個采樣點。若調查區(qū)域的稻田不存在差異化分布，布設點位的稻田應涵蓋調查

區(qū)域的流域范圍，東南西北主要方位均有設點。盡量選擇具有一定規(guī)模的連片稻田，避免將點位布設在

6667m（210畝）以下孤立的小塊稻田。稻田面積小于66667m（2100畝）的設3~5個點位，66667m2~

666667m（2100畝~1000畝）的設4~6個點位，666667m（21000畝）以上的設6~10個點位。稻田點位

避免距離田壟較近的受人為擾動頻繁的區(qū)域，盡量靠近稻田中心位置等相對穩(wěn)定的地段。對于多個點位

同時布設在同一稻田的情況，主要依據(jù)均勻隨機布點的原則，根據(jù)周叢生物生長情況等進行實地調整，點

位相互間距離應大于5m。

4.3.1.2溝渠布點

溝渠點位應與稻田點位相對應，在每條溝渠中段布設1~2個點位，或布設不超過對應稻田樣點數(shù)的

點位。

4.3.2淺水生態(tài)系統(tǒng)布點

4.3.2.1河流布點

在河流上、中、下游，干、支流，以及干支流匯合點處均應設置點位。同一干/支流上任意兩個相鄰點

位間的地理距離應大于5km，若河流較短，則采樣點位應至少設置3個，覆蓋河流的上、中、下游，宜包括

不同生境（如淺灘、深潭、激流區(qū)、湍流區(qū)、緩流區(qū)、回水區(qū)、過渡區(qū)等）。

4.3.2.2池塘布點

將點位布設在池塘的水陸交錯帶附近，水域面積小于6667m（210畝）設1~2個點位，6667m2~

20000m（210畝~30畝）設2~3個點位，大于20000m（230畝）設3~6個點位。點位可圍繞池塘均勻布

設，但應覆蓋進水區(qū)、出水區(qū)和池塘灣區(qū)。

4.3.2.3水庫布點

將點位布設在水庫的水陸交錯帶附近，水域面積小于10km2設3~5個點位，10km2~50km2設4~6

個點位，大于50km2設5~8個點位，超過100km2設10~20個點位。點位可圍繞水庫均勻布設，但應覆

蓋進水區(qū)、出水區(qū)和水庫中段。

4.3.2.4湖泊布點

根據(jù)湖泊水體形態(tài)特點、水文狀況和周叢生物的分布特征以及水體受干擾狀況等因素，將湖泊區(qū)域

劃分成相對均質的敞水區(qū)、湖濱帶，污染區(qū)或相對清潔區(qū)等，每個小區(qū)內設置1~3個有代表性的點位，主

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要分布在湖濱帶。對于均質化程度較高的湖泊，可按照水庫布點方法均勻設置點位。

4.3.2.5濕地布點

對于非均一地面的濕地，每類設置1~3個點位。對于均一地面的濕地，點位布設應在區(qū)域內進行簡

單隨機抽樣代替整體分布，面積小于1km2設3~5個點位，面積1km2~10km2設5~8個點位，面積大于

10km2可按照水庫布點方法均勻設置點位。

5樣品采集與保存

5.1材料和器具

5.1.1主要材料

蒸餾水或同等純度的水、冰袋和液氮等。

5.1.2主要器具

金屬刮刀、鑷子、短尺、樣品袋或樣品瓶、聚乙烯樣品袋或螺紋蓋玻璃瓶、一次性無菌手套、GPS定位

儀、溫度計和便攜pH計等。

5.2樣品采集

5.2.1采樣計劃制定要點

5.2.1.1確定采樣基質

根據(jù)生境類型或溝渠、河流底質，確定周叢生物附著的基質。池塘、水庫、湖泊以近水岸的無機基質

（如石頭等）和有機基質（如水生植物等）作為周叢生物附著基質，稻田以表層土壤作為周叢生物附著基

質。不同基質上的樣品分開收集保存。

5.2.1.2確定樣品數(shù)

每份樣品保證取至少3個平行樣品。

5.2.2采樣時間和采樣頻率

5.2.2.1農田生態(tài)系統(tǒng)采樣時間和頻率

水稻移栽后每月采集樣品一次，移栽后第一個月可半月采集一次。農田溝渠周叢生物采樣時間和頻

率與稻田采樣相對應。

5.2.2.2淺水生態(tài)系統(tǒng)采樣時間和頻率

河流、池塘、湖泊、水庫、濕地等生境的周叢生物宜按季節(jié)或豐、平、枯水期開展采樣。采樣時間間隔

宜相同，選擇一天中的同一時段。

5.2.3樣品采集方法

5.2.3.1確定采樣容積

每個樣點采集的周叢生物容積應保持一致?；旌喜蓸討鶕?jù)混合點數(shù)量確定每點采集量。

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5.2.3.2采樣順序

需采集周叢生物上覆水或下層土壤樣品時，應先采集水樣后再采集周叢生物和土壤樣品。

5.2.3.3樣品刮取

使用鑷子或刮刀等工具從水下浸沒的介質，包括稻田土壤、水生植物、石塊表面剝離周叢生物，并移

至聚乙烯采樣袋內。

5.2.3.4原位厚度檢測

利用原位采樣器對周叢生物進行原位厚度檢測和固定，原位采樣器可參考附錄B。

5.2.3.5器具清洗

應及時清洗所有接觸過樣品的采樣器具，使用前使用0.1mol/L鹽酸溶液消毒。

5.2.4樣品標識和記錄

5.2.4.1樣品標識

在樣品袋或樣品瓶外側標注樣品編號、采樣日期、水體名稱、采樣點位、采樣人姓名。

5.2.4.2樣品記錄

采樣現(xiàn)場應記錄樣品經緯度、生境情況等信息，記錄表格可參考附錄C。

5.3樣品的處理與儲存

5.3.1樣品儲存容器

5.3.1.1常規(guī)樣品保存

周叢生物一般常用聚乙烯袋存儲。

5.3.1.2特殊樣品保存

有機物污染的周叢生物宜采用帶有螺紋蓋的玻璃瓶。

5.3.2樣品運輸和儲存

5.3.2.1從田間采樣到進行分析之前宜儲存在0℃~4℃的保溫箱中。

5.3.2.2運輸中應仔細存放樣品，以確保樣品無破損、樣品之間無污染。避免強光照射及強烈震動。

5.3.2.3周叢生物樣品運至實驗室后，分析物理指標的樣品應風干或儲存于4℃，分析化學指標的樣品

應進行液氮處理并儲存于-20℃，分析生物指標的樣品應進行液氮處理并儲存于-80℃。

6物理指標分析測試

6.1覆蓋度測定

6.1.1被測點選定

在擬開展調查的生境內，隨機選定觀測點，點與點之間間距為15m~30m。觀測點數(shù)參照第4章

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執(zhí)行。

6.1.2針刺法測定覆蓋度

覆蓋度應在采樣現(xiàn)場測定。將1m2的被測點方框以間隔網格線方式劃分為10cm×10cm，15cm×

15cm，20cm×20cm三種不同格網密度，并重復該過程5次~10次，取均值作為該被測點的最終結果。

6.1.3覆蓋度計算

測量每個隨機被測點的覆蓋面積，求取平均值，然后乘以總的稻田面積得到所測稻田的周叢生物面

積。覆蓋度為周叢生物面積占稻田總面積之比，一般用百分數(shù)表示。覆蓋度（PBC）計算見公式（1）：

S×S

PBC=AveragecoverageTotalarea×100…………（1）

STotalarea

式中：

——1m2m2

SAveragecoverage被測點（）內覆蓋面積的平均值，單位為平方米（）；

——m2

STotalarea所研究稻田區(qū)域的總面積，單位為平方米（）。

6.2厚度測定

6.2.1材料與設備

6.2.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、二甲基亞砜溶液、綠色熒光核酸染料、0.9%氯化鈉溶液（生

理鹽水）和抗熒光淬滅封片劑等。

6.2.1.2主要材料：載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、吸水紙、離心管和錫箔紙等。

6.2.1.3主要設備：激光掃描共聚焦顯微鏡等。

6.2.2測定步驟

6.2.2.1樣品制備

6.2.2.1.1用鑷子取小塊新鮮的周叢生物于潔凈載玻片，并放置于潔凈的培養(yǎng)皿中，用0.9%氯化鈉溶液

（生理鹽水）輕柔洗去表面殘余培養(yǎng)液和雜質。

6.2.2.1.2染料的配制：取潔凈離心管，用錫箔紙包緊，向其中加1mL二甲基亞砜溶液，取1.5μL綠色熒

光核酸染料加入二甲基亞砜溶液中，振蕩混勻，待用。

6.2.2.1.3加200μL染料于載玻片上，確保整個片子被染料液覆蓋，用錫箔紙包起放有載玻片的培養(yǎng)皿，

染色20min~30min后，取出載玻片，并將其邊緣液體吸干，加10μL抗熒光淬滅封片劑到潔凈的蓋玻片

上，將蓋玻片放置于周叢生物上壓緊，并排除氣泡，確保視野清晰不流動。將制備好的片子用錫箔紙包

好，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

6.2.2.2激光掃描共聚焦顯微鏡成像

激光共聚焦掃描顯微鏡對染色周叢生物進行顯微觀察和圖像采集，用激光作掃描光源，逐點、逐行、

逐面快速掃描成像，掃描限制在周叢生物樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，可以獲得周叢生物不

同深度層次的圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法應按照JY/T0586要求分析。

6.2.2.3最大厚度測定

對周叢生物樣本由內（周叢生物與玻片相貼面）向外（周叢生物游離面）沿三維坐標系Z軸逐層水平

掃描，步距14μm，當出現(xiàn)2個連續(xù)的水平層面，Z軸距離較小的水平層面上能夠觀察到周叢生物結構，Z

軸距離較大的水平層面上不能夠觀察到周叢生物結構，則后一水平層面的Z軸距離為周叢生物最大厚

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度（單位為μm）。

6.3二維形態(tài)表征

6.3.1材料與設備

6.3.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、2.5%戊二醛溶液、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）和

1%鋨酸固定液等。

6.3.1.2主要材料：蓋玻片、濾膜、吸水紙和離心管等。

6.3.1.3主要設備：冷凍干燥機和掃描電子顯微鏡等。

6.3.2測定步驟

6.3.2.1樣品制備

6.3.2.1.1取適量周叢生物展片于蓋玻片或濾膜上，用2.5%戊二醛溶液固定2h，0.1mol/L磷酸鹽緩沖

液（pH=7.4）漂洗三次，每次10min，再用1%鋨酸固定液固定1h~2h，固定結束再重復磷酸鹽緩沖液

漂洗過程。

6.3.2.1.2將固定好的周叢生物樣品冷凍干燥處理，以接近于物質的自然狀態(tài)直接放到掃描電鏡中進行

觀察。

6.3.2.1.3若觀察割裂面結構，應根據(jù)需求從不同角度切割周叢生物樣品。

6.3.2.1.4若試樣導電性弱時，一般選擇鍍膜處理。通常情況選擇鍍金（Au）膜，如果對分辨率有較高的

要求，可以選擇鍍鉑（Pt）、鉻（Cr）、銥（Ir）。如果要對樣品進行嚴格的化學定量分析，則不能鍍金屬膜，因

為金屬膜對X射線有較強的吸收，對定量有較大影響，可選用蒸鍍碳膜。

6.3.2.2掃描電子顯微鏡成像

應按照GB/T33834要求進行掃描電子顯微鏡成像。

6.4三維結構表征

6.4.1材料與設備

6.4.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）等。

6.4.1.2主要材料：載玻片、濾膜和吸水紙等。

6.4.1.3主要設備：激光掃描共聚焦顯微鏡。

6.4.2測定步驟

6.4.2.1樣品制備

取小片新鮮周叢生物或直接剪切至所需大小置于潔凈載玻片上，用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=

7.4）漂洗三次，每次10min，以除去雜質。

6.4.2.2三維結構成像

激光掃描共聚焦顯微鏡觀察周叢生物樣品并采集不同層面圖像，構建三維圖像。激光掃描共聚焦顯

微鏡分析方法參照JY/T0586。

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6.4.3注意事項

6.4.3.1掃描過程耗時較長，而且只能掃描不動的微生物，許多活動的大型微生物，例如周叢生物中原生

動物等，因運動比較劇烈而會對成像造成一定的影響。

6.4.3.2某些環(huán)境雜質可能會對某些活體細胞的活性造成一定的負面影響。在樣品制備中盡可能清洗

干凈，同時適當?shù)卣{整激光的光強，用最弱的光對樣品進行照射掃描。

7化學指標分析測試

7.1總有機碳、總無機碳和總碳含量

7.1.1測定方法

7.1.1.1應按照DZ/T0279.27要求測定總有機碳含量。

7.1.1.2應按照LY/T1250中的氣量法要求測定總無機碳含量。

7.1.1.3總碳的含量為總有機碳和總無機碳的含量之和。

7.1.2樣品預處理

7.1.2.1總有機碳：新鮮周叢生物樣品采集后，用去離子水洗凈，再用普通濾紙濾干水后，60℃條件下，烘

干8h，得到周叢生物干樣。再將周叢生物干樣經研磨后，經過60目（0.25mm）篩孔篩分后，精確稱取

0.5g（精準到0.1mg），用長條硫酸紙將樣品置于干燥的硬質玻璃試管內，并加入0.1g粉末狀硫酸銀。

用移液管加入5mL重鉻酸鉀標準溶液，然后用移液管注入5.0mL濃硫酸，搖勻，待測。

7.1.2.2總無機碳：稱取通過60目（0.25mm）篩孔的周叢生物干樣0.5g~10g于250mL錐形瓶中。用

蒸餾水潤濕樣品、瓶口和瓶壁，并向彎曲小試管中注入約10mL3mol/L的鹽酸溶液，再將其放入錐形瓶

中，塞緊。

7.1.3注意事項

7.1.3.1總有機碳

7.1.3.1.1測定周叢生物有機質應采用風干樣品，若未風干樣品含有較多的Fe2+、Mn2+及其他還原性物

質消耗重鉻酸鉀，可使結果偏高。試驗前將樣品磨細鋪開，在室內通風處風干約10d。

AgSO0.1g

7.1.3.1.2本方法不適用于含氯較高的樣品，若樣品含有少量的氯則可以加少量2（4約），使氯

離子沉淀以去除其測試干擾。

7.1.3.1.3加熱時產生的二氧化碳氣泡不是真正的沸騰，待溶液表面沸騰開始計時煮沸5min。

7.1.3.1.4轉移試管溶液時，應用少量蒸餾水進行沖洗，勿損失溶液。

7.1.3.1.5滴定亞硫酸鐵消耗量若小于空白試驗的1/3時，有未完全氧化的可能，應舍去重做。

7.1.3.2總無機碳

7.1.3.2.1周叢生物中的碳酸鹽主要以碳酸鈣為主，但也有的碳酸鹽以碳酸鈣-碳酸鎂和碳酸氫鹽等存

CaCOCaCO?COgkg-1

在，不過都表示為3或者3（2·）。

7.1.3.2.2為防止誤差較大，試驗前應檢測氣密性。

7.1.3.2.3可用蒸餾水濕潤樣品和錐形瓶瓶壁，以緩解碳酸鹽和鹽酸反應產熱的影響，也有助于瓶內的水

氣壓平衡。

7.1.3.2.4操作過程中避免用手直接觸碰反應器，防止因手的熱量使氣體膨脹，產生誤差。

8

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7.1.3.2.5測量過程中要隨時調整量氣管的液面與水準器的液面相平，勿相差太大。

7.2總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量

7.2.1測定方法

7.2.1.1按照NY/T2017中的凱氏消煮法要求測定總氮含量。

7.2.1.2按照HJ634中的氯化鉀溶液提取?分光光度法要求測定氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。

7.2.2樣品預處理

7.2.2.1樣品采集

無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運輸保存，并

在3d內完成分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱中保存。新鮮樣品清洗后，用吸水紙吸干表面

水分，留存?zhèn)錅y。

7.2.2.2樣品消解

稱取周叢生物干樣品0.100g~0.500g（精確到0.001g）于100mL消煮管中，加入3mL濃硫酸，再

加入1.1g催化劑，加蓋回流漏斗，置于消煮爐加熱，待沒有泡沫時，適當提高溫度，微微煮沸，使得固體完

全消失成為溶液，最終消煮液澄清透亮，呈現(xiàn)灰白色。消煮液冷卻后待用。

7.2.2.3樣品破碎

稱取新鮮周叢生物干樣品0.100g~0.500g（精確到0.001g）于100mL消化管，加入3mL氯化鉀溶

液，然后在冰浴中進行超聲破碎處理，超聲強度200W，超聲時間3s，間隔10s，重復30次。破碎后，將

其轉入50mL聚乙烯離心管中，在3000r/min條件下，離心10min，將上清液保存至比色管中，待測。

7.2.3注意事項

7.2.3.1在重復性條件下獲得的三次獨立測試結果的絕對誤差不應超過算術平均值的7%。

7.2.3.2每批樣品應測定10%的加標樣品。氨氮加標回收率應在80%~120%之間；亞硝酸鹽氮加標

回收率應在70%~120%之間；硝酸鹽氮加標回收率應在80%~120%之間。

7.2.3.3還原柱中的鎘粉在使用前需要檢驗其還原性。

7.3磷含量

7.3.1測定方法

應按照NY/T88中的氫氧化鈉熔融—鉬銻抗比色法要求測定總磷含量。

7.3.2樣品預處理

精準稱取0.2500g通過60目（0.25mm）篩的烘干（一般為60℃左右）的周叢生物干樣，輕輕放置于

鎳或銀坩堝底部，避免將樣品沾在坩堝壁上，加入幾滴無水乙醇稍微濕潤樣品，加2.0g（為樣品的8倍）

固體氫氧化鈉在樣品表面鋪平整，放置在干燥器中，以防吸濕潮解。將坩堝放入高溫電爐中，由室溫升到

300℃，保溫30min，再升溫至750℃，保溫15min，后冷卻坩堝，在坩堝中加10mL蒸餾水，放在電爐上

加熱至80℃左右，熔塊溶解后再煮沸5min，然后將坩堝內的溶液轉入50mL容量瓶中，用熱蒸餾水及

2mL硫酸多次洗滌坩堝并倒入容量瓶內，盡量不要使總體積超過40mL。然后往容量瓶中加5滴1∶1

鹽酸溶液及5mL硫酸溶液，輕輕振蕩，靜置冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50mL，搖勻后靜置至澄清或

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用無磷濾紙過濾，濾液貯于50mL三角瓶中，待測。同時做至少兩個空白試驗。

7.3.3注意事項

7.3.3.1在用氫氧化鈉熔融樣品時，為防止濺跳現(xiàn)象，一般從低溫開始，逐漸脫水后，再高溫加熱。

7.3.3.2若使用銀坩堝進行試驗，需注意控制溫度，銀坩堝在960℃時會融化。

7.3.3.3熔融完全的熔塊冷卻后會凝結，并呈現(xiàn)出淡藍色或藍綠色，如熔塊呈棕黑色則表示還沒有熔融

完全，應再按熔融的步驟再熔一次。

1/2HSO=0.55molL-11/2HSO)=

7.3.3.4鉬銻抗法要求顯色液中硫酸濃度為c（24）·。如果酸度小于c（24

0.45molL-11/2HSO)=0.65molL-1

·，顯色時間縮短，但穩(wěn)定時間變得較短；如果酸度大于c（24·，顯色時

間延長。如果不確定待測液中的原有酸度，要先中和處置。

7.3.3.5鉬銻抗法顯色溫度在15℃~60℃，如室溫未達到15℃，可放置在30℃~40℃烘箱中保溫

30min，冷卻后比色。

7.4鉀含量

7.4.1方法原理、主要儀器、試劑、測試步驟

應按照NY/T2017中的電感耦合等離子體質譜法要求測定鉀含量。

7.4.2樣品預處理

用無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運輸保存，

并在3d內完成測試分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱保存。將待測的周叢生物樣品干燥后研

磨，過60目（0.25mm）篩，稱取均勻干樣0.1g~0.5g（精確到0.0001g）于100mL試管內待測。

7.4.3注意事項

7.4.3.1本方法的檢出限為70μg·kg-1。

7.4.3.2在重復性條件下，獲得的兩次獨立測定結果的絕對值不應超過算術平均值的15%。

7.5鈉含量

7.5.1測定方法

按照LY/T1246中的火焰原子吸收光譜法要求測定鈉含量。

7.5.2樣品預處理

首先，將鋁盒60℃下烘干至恒重，稱重。然后準確稱取2g~3g新鮮周叢生物，用普通濾紙濾干后，

置于坩堝中，100℃下烘干（8h）。冷卻至室溫，稱重，計算周叢生物含水率。取適量干周叢生物樣品碾碎

混勻，并過60目（0.25mm）篩后放入封口袋中，備用。

7.5.3注意事項

7.5.3.1儀器校準：在進行火焰光度測定前，需要對光度計進行校準，以確保測定結果的準確性。通常，

會使用標準溶液進行校準。

7.5.3.2激發(fā)條件：火焰溫度要適當，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴重，影響測量的線

性關系。

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7.6鈣、鎂含量

7.6.1測定方法

按照GB/T35871要求測定鈣、鎂含量。

7.6.2樣品預處理

準確稱取通過60目（0.25mm）孔徑篩的周叢生物干樣0.2g，加入10mL濃硫酸，并在通風櫥中加

熱消煮，等瓶內硫酸開始冒白煙后，繼續(xù)加熱5min，然后靜置冷卻。等管內溫度冷卻至70℃左右，再逐

滴滴加10滴過氧化氫溶液，滴加時應緩慢滴加，避免容器氣壓過高。利用強酸的氧化性與酸性，使周叢

生物中的有機物質完全分解、氧化，呈氣態(tài)逸出，分析物質及共存離子轉化為無機物狀態(tài)，以穩(wěn)定的化學

形式存在于澄清溶液中。

7.6.3注意事項

7.6.3.1單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產生危險，因此在日常工作中多將兩種

或兩種以上的強酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機物質能快速而又平穩(wěn)地消解。

7.6.3.2元素含量小于0.1μg·g-1時，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算

術平均值的20%。

7.6.3.3元素含量在0.1μg·g-1~1μg·g-1時，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應

超過算術平均值的15%。

7.6.3.4元素含量大于lμg·g-1時，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算術

平均值的10%。

7.7硫含量

7.7.1測定方法

按照LY/T1270要求測定硫含量。

7.7.2樣品預處理

用無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運輸保存，

并在3d內完成分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱保存。將待測的周叢生物樣品干燥后研磨，

稱取約0.2g~0.5g（精確到0.0001g），加入150mL高型錐形瓶中待測。

7.7.3注意事項

在重復性條件下，任意兩次獨立測定結果的絕對差值需小于或等于算術平均值的10%。

7.8鐵含量

7.8.1測定方法

應按照HJ/T345的要求測定總鐵和亞鐵（二價鐵離子）含量。

三價鐵離子的濃度為總鐵的濃度減去二價鐵離子的濃度。

7.8.2樣品預處理

7.8.2.1亞鐵（二價鐵離子）：準確稱取5.0g干重的周叢生物（提前測定含水量）于錐形瓶中，加入浸提劑

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100mL，搖勻振蕩（5min，120r/min），離心（5min，8000r/min）獲得上清液。

7.8.2.2總鐵：稱取干重為5g的新鮮周叢生物樣品，60℃烘干8h，將烘干的周叢生物樣品在瓷研缽中

碾磨過60目（0.25mm）篩，稱取適量過篩后周叢生物樣品置于石英坩堝中，在電爐上加熱使其碳化，再

移入高溫電爐，在500℃下繼續(xù)加熱2h~3h，灰化完成，待其冷卻后，加入5mL稀硝酸溶液（1∶1）溶解

灰分，將溶液全部轉移入50mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線，最后再用0.45μm濾紙過濾，得到

澄清濾液，進行下一步總鐵含量的測定。

7.8.3注意事項

新鮮周叢生物從培養(yǎng)基取出后，應盡快測量，沒有用完的樣品勿放回培養(yǎng)基，以免造成污染。

7.9錳含量

7.9.1測定方法

應按照GB/T35871要求測定錳含量。

7.9.2樣品預處理

5g150mL30mLHNO?HClO

準確稱取的周叢生物干樣，置于錐形瓶中，加入34酸混合溶液

HNOHClO51

（3與4的體積比為∶），不要晃動錐形瓶，可在錐形瓶上方放一個漏斗，在漏斗中放一顆稍大

于漏斗口徑的玻璃珠，以減少靜置過程中溶液的揮發(fā)以及消煮過程中溶液的蒸發(fā)，將加完酸的溶液靜置

于通風櫥中過夜。在通風櫥中，把靜置一夜后的錐形瓶置于調溫板或調溫爐上加熱消煮5h左右（溫度

應控制在能讓消煮液微沸），消煮過程中會產生棕色二氧化氮氣體（戴帶上護具，注意防護），當不再產生

棕色氣體時，逐漸升溫，將溶液加熱至幾乎被蒸干。冷卻過后，將溶液及不溶性顆粒物全部轉移至50mL

容量瓶中，用蒸餾水定容后，再用0.45μm濾紙過濾，得到澄清濾液，待測。

7.9.3注意事項

單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產生危險，因此，在日常工作中多將兩種或兩

種以上的強酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機物質能快速而又平穩(wěn)地消解。

7.10銅含量

7.10.1測定方法

應按照GB/T35871要求測定銅含量。

7.10.2樣品預處理

在錐形瓶中加入周叢生物干樣0.500g~1.000g（精確到0.0001g），然后加入30mL提前制備的混

合酸，蓋上表面皿，以減少沸騰過程中的蒸發(fā)。調節(jié)電熱板溫度以保持錐形瓶中的液體沸騰，錐形瓶中會

NONO

出現(xiàn)大量2棕色氣體。當不再釋放2氣體時升高溫度，至消化液澄清透明（無色或微黃色）。如果

消化液變成深棕色，滴入少量硝酸，此時消化液釋放白色煙，消化液的顏色進一步轉變?yōu)闊o色透明，抑或

是轉變成微黃色時，將消化液靜置至冷卻，待測。

7.10.3注意事項

7.10.3.1單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產生危險，因此，在日常工作中多將兩

種或兩種以上的強酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機物質能快速而又平穩(wěn)地消解。

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7.10.3.2在重復性條件下對周叢生物中的銅含量進行兩次獨立的測定，計算兩次測定的周叢生物中的

銅含量的絕對差值和算術平均值，絕對差值不能超過算術平均值的20%。

7.10.3.3此方法中所使用的試劑的純度均為優(yōu)級純（GR）。

7.10.3.4此方法中所用的水為去離子水或重蒸餾水。

7.11鋅含量

7.11.1測定方法

按照LY/T1270要求測定鋅含量。

7.11.2樣品預處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品1.000g于50mL三角瓶中，以少量水潤濕，加入

8mL濃硫酸，振蕩或放置過夜（優(yōu)選）后，滴加10滴高氯酸，搖勻，瓶口放一小漏斗，置于電爐上加熱消煮

至瓶內液體開始轉白后，繼續(xù)消煮20min，全部消煮時間為45min~60min，將冷卻后的消煮液用去離子

水洗入100mL容量瓶中，沖洗時用水應少量多次，輕輕搖動容量瓶，蒸餾水定容，用干燥漏斗和濾紙濾

入干燥的100mL三角瓶中。

7.12鉬含量

7.12.1方法原理、主要儀器、試劑、測試步驟

應按照GB/T35871要求測定鉬含量。

7.12.2樣品預處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品1.000g于塑料瓶中待用。

7.12.3注意事項

7.1.2.3.1鉬含量小于0.1mg/kg時，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算

術平均值的20%。

7.12.3.2鉬含量在0.1mg/kg~1mg/kg時，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應

超過算術平均值的15%。

7.12.3.3鉬含量大于1mg/kg時，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算術

平均值的10%。

7.13硅含量

7.13.1測定方法

應按照LY/T1270要求測定硅含量。

7.13.2樣品預處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品1.000g（精確至0.0001g）于50mL錐形瓶中待用。

7.13.3注意事項

7.13.3.1如周叢生物樣品含鐵較多，可先用100g·L-1鹽酸洗滌沉淀，以免濾液體積過大。

7.13.3.2整個二氧化硅分離過程要連續(xù)操作，不可加熱煮沸，要保持漏斗處于溫熱狀態(tài)，并防止濾紙

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穿孔。

7.13.3.3檢查Fe3+表示已洗凈：在白瓷比色板凹槽中，接一滴濾液，加一滴100g·L-1硫氰化鉀，溶液呈

紅色表示有Fe3+存在，無色表示已洗凈。

7.13.3.4高氯酸應稀釋到60%后再使用，過濃易引起爆炸。

7.13.3.5消化時高氯酸已分解完畢，但殘留物仍呈黑色或棕色時，說明由于硝酸不足或溫度過高，硝酸

分解過快，氧化不完全。發(fā)現(xiàn)這種情況應立即將樣品取下，冷卻后再加3mL~4mL硝酸和1mL高氯

酸，繼續(xù)消化直到消化液完全呈白色為止。若小漏斗上有黑色物質，應使用少量濃硝酸沖洗，再重新

消化。

7.13.3.6因為鉀可沉淀為高氯酸鉀，故應把過多的高氯酸排除，不至在消化液中形成高氯酸鉀沉淀，因

此，消化終了時，要求出現(xiàn)硫酸回流即可。

7.13.3.7為避免已脫水的二氧化硅再次水化溶解，當以鹽酸作溶劑時，同時要考慮鹽酸的濃度，以阻止

二氧化硅再度水化為宜。

7.14氯含量

7.14.1測定方法

應按照NY/T1378要求測定氯含量。

7.14.2樣品預處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品5.000g（精確至0.0001g）于250mL塑料瓶中，準

確加入50mL純水，用橡皮塞塞緊后超聲30min。

7.14.3注意事項

7.14.3.1所有玻璃器皿均需在使用前用5%的硝酸浸泡4h，然后用去離子水浸泡并反復沖洗3次~

5次，晾干備用。

7.14.3.2在重復性條件下獲得兩次獨立測定結果的絕對差值，氯離子含量小于100mg·kg-1時，不應超

過算術平均值的5%，氯離子含量大于或等于100mg·kg-1時，不應超過算術平均值的3%。

7.15硼含量

7.15.1測定方法

應按照NY/T149要求測定硼含量。

7.15.2樣品預處理

準確稱取0.5g過篩周叢生物干品（精確到0.0001g），加1mL~2mL飽和氫氧化鈣溶液混勻，低溫

蒸干，并加熱炭化至無煙。隨即將其移入馬弗爐中，升溫至400℃并保持30min，然后升溫至500℃并保

持1.5h進行灰化。冷卻取出后加入10mL硫酸溶液溶解灰分，靜置1h。將溶解液全部轉移至50mL

容量瓶中并定容至標度。用干濾紙過濾，濾液儲存于聚乙烯試劑瓶中供測硼用。

7.15.3注意事項

兩次測試結果的相對標準偏差不超過10%。

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8生物指標分析測試

8.1微生物組成和多樣性

8.1.1通則

8.1.1.116SrDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10個保守區(qū)域和9個高變

區(qū)域，宜用于測定周叢生物中原核微生物的組成與物種多樣性。

8.1.1.218SrDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，宜用于定量周叢生物中真核微

生物的組成與物種多樣性。

8.1.1.3ITS分為兩個區(qū)域ITS1h和ITS2，ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之間，ITS2位

于真核生物rDNA序列5.8S和28S之間。對ITS1或ITS2進行測序，用于測定周叢生物微生物中真菌

群落組成與多樣性。

8.1.2測定步驟

8.1.2.1DNA提取

應按照GB/T30988提取周叢生物DNA。

8.1.2.2引物選擇

8.1.2.2.116SrDNA引物為：

515F（5'?GTGCCAGCMGCCGCGGTAA?3'）/907R（5'?CCGTCAATTCMTTTRAGTTT?3'）

8.1.2.2.318SrDNA引物為：

528F（5'?GCGGTAATTCCAGCTCCAA?3')/706R（5'?AATCCRAGAATTTCACCTCT?3'）

8.1.3其他

其他測序步驟應按照GB/T30989要求。

8.2磷脂脂肪酸群落結構

8.2.1儀器與試劑

8.2.1.1主要儀器：振蕩器、離心機、氮吹儀、水浴鍋和氣相色譜儀。

8.2.1.2主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、磷酸鹽緩沖液、三氯甲烷、甲醇、丙酮、甲苯、氫氧化鉀、正己

烷和乙酸等。

8.2.1.3主要材料：錐形瓶、離心管和硅膠（6mL，500mg）層析柱等。

8.2.2操作步驟

稱取10mg新鮮的去雜質的周叢生物于錐形瓶中，依次加磷酸鹽緩沖液7.2mL、三氯甲烷8mL、甲

醇16mL，振蕩器振搖60min，靜置（避光）12h；再加入磷酸鹽緩沖液7.2mL、三氯甲烷8mL，振搖

30min，靜置過夜；離心3min（2500r/min)分離水相、三氯甲烷相及固體相三相，移出三氯甲烷相，并用

N6mL500mg

2將其吹干；三氯甲烷相過硅膠（，）層析柱，依次用三氯甲烷、丙酮、甲醇洗滌層析柱，收集甲

N1mL111mL0.2mol/L

醇洗滌液，用2吹干；用體積比為∶的甲醇和甲苯的混合溶液與的氫氧化鉀溶

液溶解樣品，并在30℃~35℃的水浴中保溫15min，冷卻至室溫，再加入2mL體積比為4∶1的正己烷、

三氯甲烷混合溶液，用乙酸將溶液調至中性，加2mL蒸餾水，振搖5min，去水相，取底部正己烷相進行

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氣相色譜測試，再利用計算機對PLFA圖譜分析測定其成分及含量。

8.2.3數(shù)據(jù)分析

8.2.3.1PLFA的結構分析

脂肪酸可分為直鏈飽和脂肪酸（SSFA）、支鏈飽和脂肪酸（BSFA）、單鍵不飽和脂肪酸（MUFA）、環(huán)

丙烷脂肪酸（CFA）、羥基脂肪酸（OHFA）和多鍵不飽和脂肪酸（PUFA），按照所得脂肪酸的結構分成上

述6種，并統(tǒng)計其相對含量及絕對含量。

8.2.3.2分布特性分析

將所獲得的數(shù)據(jù)先進行單因子方差分析，后構建矩陣，并將數(shù)據(jù)進行中心化，以歐式距離為聚類尺

度，用組間連接法進行系統(tǒng)聚類。

8.2.3.3PLFA多樣性分析

引入ShannonWiener多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻度（J）和Simpson優(yōu)勢度（D）進行分析。

8.2.3.4多樣性指數(shù)

ShannonWiener多樣性指數(shù)（H）按公式（2）計算.。