DB42測2022-05-26發(fā)布湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 2 2 3 4 4本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》本文件DB42/T1864《家禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程》本部分為DB42/T1864的第2部分。DB42/T1864發(fā)布——第2部分：禽大腸桿菌致病群雙重探針法檢測——第4部分：禽白血病抗原ELISA檢測方法。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件起草單位：湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)本文件實(shí)施應(yīng)用的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱郵箱：wentingzhang87@hot禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程》系列標(biāo)準(zhǔn)，擬由4個(gè)——第二部分：禽大腸桿菌致病群雙重探針法檢測。目的在于檢測家禽泄殖腔拭子和糞便中的致——第三部分：雞沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌三重?zé)晒釶CR檢測方法。目的在于檢測雞肉及相關(guān)產(chǎn)品、雞泄殖腔拭子和糞便中的沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌，指導(dǎo)雞1家禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程第2部分：禽大腸桿菌致病群雙重探針法檢測本文件適用于檢測家禽泄殖腔拭子和糞便中的致病群大GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)NY/T555動(dòng)物產(chǎn)品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測方法大腸桿菌致病群escherichiacoliphylogenetic根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分類，將大腸桿菌分為B2、D、B1和A群，其中B2群和D群大腸桿菌稱為致病群大腸桿一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后4縮略語BHQ1：黑洞淬滅劑-l（BlackHoleQuencher-1）Ct值：循環(huán)閾值（CyclethreFAM：熒光素酰胺（FluoresceinAmidHEX：六氯熒光素（Hexachloro-Fluorescei2大腸桿菌毒力島基因chuA和yiaA，設(shè)計(jì)特異的引物和熒光探針，建立了一種禽大腸桿菌致病群篩選的Taqman雙重探針檢測方法，根據(jù)對應(yīng)的熒光曲線反應(yīng)和Ct值來判斷禽大腸桿菌的致病群。yiaA++/D+-/-/+A-/-注：“+”表示該基因檢測為陽性，“-”表示該基因檢測為陽性，“/”表示不檢測該基因。7.6臺(tái)式冷凍小型離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥120005’-TGCCGCCAGTACCAAAG-3’，探針：5’-35,-GGTGGAGTTGCAGAACAAGA-3,，探針：5,-HEX-CCAGCGCCTGTTAATCGCCAATTT-BHQ1-3,。8.2.6陽性對照1：chuA基因的陽性克隆分子8.2.7陽性對照2：yjaA基因的陽性克隆分子DNA或陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。9.1樣品的采集與前處理9.1.1泄殖腔拭子樣品用無菌的棉拭子插入雞泄殖腔內(nèi)2cm至3cm處并輕輕旋轉(zhuǎn)，將有可見糞便的棉拭子放入含有1mL~2mL運(yùn)送培養(yǎng)基中，冷藏箱保存，樣品保存時(shí)間不9.1.2糞便樣品9.2大腸桿菌的分離鑒定9.4.1反應(yīng)體系9.4.2反應(yīng)條件熒光PCR反應(yīng)在多通道熒光定量PCR儀上進(jìn)行，選擇熒光信號(hào)FAM和HEX（分別檢測chuA-FAM，延伸結(jié)束時(shí)開始進(jìn)行雙重?zé)晒庑盘?hào)檢測。閾值設(shè)置為閾值線超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高9.4.3對照4≤30，擴(kuò)增曲線明顯呈對數(shù)增長；如果陰性對照或者陽性對照有Ct值＜37且有擴(kuò)增曲線的報(bào)告為chuA基因熒光PCR檢測陽性，其余報(bào)告為yjaA基因熒光PCR檢測陽性檢測樣品低于檢測限或沒有，報(bào)告為yjaA基因熒光PCR檢測Ct值＜37且有擴(kuò)增曲線的報(bào)告為yjaA基因熒光PCR檢測陽性，其余則報(bào)告為yjaAchuA基因熒光PCR檢測陽性、yja