一、項目背景、來源及目的

1、項目背景

豬病毒性腹瀉是指由病毒引起的急性消化道傳染病，其主要病原有豬

流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）、豬傳染性胃腸

炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus,TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine

rotavirus,PRoV）、豬德爾塔冠狀病毒（Porcinedeltacoronavirus，PDCoV）

等，以厭食、嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，發(fā)病率和死亡率可高達100%，

給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。起草團隊重點針對4種豬主要病毒性腹瀉

病原（PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV）所致的腹瀉性疫病，集成創(chuàng)新和

推廣應用各種關鍵防控技術，制定成防控技術規(guī)范，作為廣西地方標準加

以推薦實施，以有效防控豬主要病毒性腹瀉的發(fā)生、傳播及流行，促進廣

西養(yǎng)豬業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

豬場良好的環(huán)境控制和管理制度以及嚴格的生物安全措施是防控好豬

主要病毒性腹瀉的前提條件。引種檢疫是養(yǎng)豬生產(chǎn)中一項重要的保障措施。

養(yǎng)豬場積極配合并執(zhí)行嚴格規(guī)范的引種及隔離檢疫，可從源頭杜絕疫病的

引入及傳播?？茖W合理的免疫接種是預防和控制豬主要病毒性腹瀉的關鍵

技術。搞好疫病監(jiān)測是做好疫病免疫和防病措施的保障。疫病監(jiān)測包括臨

床癥狀觀察、血清學監(jiān)測和病原學檢測。進行日常臨床癥狀觀察，可及時

發(fā)現(xiàn)豬群異常情況，盡早采取相應防控措施。進行血清學定期監(jiān)測（一般

每季度應進行一次），可掌握豬群的免疫狀況及疫病發(fā)生風險，及時調(diào)整

和確定最佳免疫計劃，為淘汰和消除亞臨床感染或隱性感染豬提供依據(jù)。

病原學檢測可為快速確診、明確病因和及時采取針對性防控措施提供技術

支持。根據(jù)不同疫病的免疫及定期監(jiān)測結(jié)果，按照國家及廣西相關法律法

規(guī)進行相應處置，以杜絕或消除疫病的發(fā)生與傳播，對保障豬群健康、提

高豬場經(jīng)濟效益具有重要意義。

2、項目來源

1

根據(jù)《廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關于下達2018年第二批廣西地

方標準制定項目的通知》（桂市監(jiān)函[2018]253號），自治區(qū)市場監(jiān)督管

理局將廣西地方標準《豬主要病毒性腹瀉防控技術規(guī)范》的制定下達給廣

西動物疫病預防控制中心，項目編號2018-0270，由施開創(chuàng)研究員主持。

3、項目目的

經(jīng)資料檢索，目前未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外有集成制定針對PEDV、TGEV、PRoV、

PDCoV等主要病毒所致腹瀉的綜合防控技術的國家標準、行業(yè)標準或地方

標準。

本標準根據(jù)課題組前期調(diào)研及相關研究積累，結(jié)合廣西豬病防控實際，

針對當前應重點防控的4種豬主要病毒性腹瀉，集成制定防控技術規(guī)范作

為廣西地方標準，使其更具針對性、適用性、可操作性和先進性。

二、工作概況

施開創(chuàng)研究員從2015年1月起主持開展廣西水產(chǎn)畜牧科技項目《豬流

行性腹瀉病毒Nsp1蛋白調(diào)控天然免疫信號通路的機制與推廣應用》（桂漁

牧科201528017），從2017年9月起主持開展廣西科技重大專項《畜禽重

大病害生態(tài)綜合防控技術創(chuàng)新示范》（桂科AA17204057）子課題。課題

組在豬主要病毒性腹瀉的診斷、檢測和防控措施等方面開展了大量研究和

臨床推廣應用。同時，開展了相關資料的收集整理工作，確定標準編寫目

標和依據(jù)，同時起草制訂廣西地方標準項目建議書，積極開展標準的申報。

2018年12月接到自治區(qū)市場監(jiān)督管理局下達的地方標準制定（修訂）項

目計劃的通知后，迅速成立標準編制課題組，確定標準起草編寫方案及時

間進度表，并積極組織實施。2019年8月31日已完成標準初稿的編寫。

本標準編制課題組人員包括：施開創(chuàng)、馮淑萍、粟艷瓊、陳芳芳、尹

彥文、屈素潔、陸文俊、莫勝蘭、李軍。各成員均具備多年專業(yè)知識，并

且有豐富的實驗室檢測、臨床診治工作經(jīng)驗和地方標準編寫經(jīng)驗，能保障

制定本標準起草任務。具體分工如下：

施開創(chuàng)：組長。負責標準的提出、起草、審定。

2

馮淑萍：負責標準的起草、校正、外聯(lián)。

粟艷瓊：負責標準起草。

陳芳芳：負責標準起草。

尹彥文：負責標準驗證。

屈素潔：負責標準驗證。

陸文?。贺撠煴葘υ囼?。

莫勝蘭：負責比對試驗。

李軍：負責標準稿審核。

三、標準編制原則

1、政策性原則：本標準編寫過程遵循國家相關法律、法規(guī)和國家標準。

2、先進性原則：以國內(nèi)外相關文獻資料為參考，力求反映最新的科技

成果；以國內(nèi)同類標準的編寫方法為基礎，對本標準進行規(guī)范、充實和創(chuàng)

新，使之具有先進性。

3、經(jīng)濟性原則：本標準編制過程，從獲取信息、起草、實驗室試驗、

臨床驗證到形成征求意見稿的每一個環(huán)節(jié)，在確保質(zhì)量的前提下均力行節(jié)

約，利用有限的經(jīng)費圓滿完成各階段編寫任務。

4、適用性原則：本標準借鑒國內(nèi)外豬豬主要病毒性腹瀉診斷、防控的

成功經(jīng)驗，并經(jīng)本項目組的實驗室和臨床驗證，完全按照要求編寫，內(nèi)容

全面，形式規(guī)范，可操作性和實用性強。

5、協(xié)調(diào)統(tǒng)一性原則：本標準參照國內(nèi)相關標準的編寫形式和表達方法，

力求與國內(nèi)相關標準協(xié)調(diào)統(tǒng)一。本標準通過持續(xù)查新，確保內(nèi)容不與已有

的國家、農(nóng)業(yè)行業(yè)和地方標準相重復或矛盾。

6、規(guī)范化原則：本標準是嚴格按照GB/T1.1-2009的要求來編寫的。

四、標準主要內(nèi)容及依據(jù)

本標準是動物疫病防控推薦性地方標準，編寫重點是疫病的診斷與防

控技術。標準的主要依據(jù)是借鑒國內(nèi)先進標準和技術內(nèi)容，參考國內(nèi)外有

關文獻資料，結(jié)合我國國情，進行實踐研究，并通過實驗室試驗和臨床驗

3

證后提出。

標準編寫主要內(nèi)容包括診斷技術、結(jié)果判定、防控、管理制度、生物

安全和監(jiān)測結(jié)果處置，適合于廣西境內(nèi)規(guī)模豬場豬主要病毒性腹瀉的綜合

防控。

標準的建立主要涉及以下兩個試驗：

（一）PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR檢測方法的建立

1、材料與方法

1.1主要試劑

E.coliDH5α感受態(tài)細胞、MiniPlasmidKit質(zhì)粒提取試劑盒購自天根

生化科技（北京）有限公司。MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit

Ver.4.0膠回收試劑盒、pMD18-T載體、EcoRⅠ內(nèi)切酶、HindШ內(nèi)切酶、

MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0核酸抽提試劑盒、

PrimeScriptTMⅡ1ststrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物

工程（大連）有限公司。

1.2引物設計

根據(jù)GenBank上發(fā)表的PEDV（AF353511）、TGEV（DQ811789）、

PDCoV（JQ065042）、PRoV（FJ617209）參考毒株基因序列，設計特異

性引物（見表1），用于擴增PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVN基

因、PRoVVP6基因。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV擴增引物

引物序列（5`→3`）目的基因產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃

F:GCATTTCTACTACCTCGGAA

PEDV-NPEDVN75058.6

R:GCGATCTGAGCATAGCCTGA

F:GCGTCTGATTGTGAGTCATG

TGEV-MTGEVM54458.6

R:AATAGTCCTGCTGGGTAATG

F:GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATG

PDCoV-NPDCoVN18358.6

R:CTGGGCCATCTCCGGTTGGGAATC

F:CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTC

PRoV-VP6PRoVVP632958.6

R:CATTTCGTTGCGATTCTCTAG

1.3重組質(zhì)粒標準品的制備

4

取PEDVCV777株、TGEVH株、PDCoVGX1701株、PRoVNX株病

毒液，根據(jù)MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0試劑盒使用說

明書提取總RNA，應用PrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit反

轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以此為模板，應用設計的4對引物進

行PCR擴增?；厥?、純化PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化DH5α

感受態(tài)細胞，涂板，篩選陽性克隆并增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR、酶

切及測序鑒定。

1.4多重RT-PCR反應條件的優(yōu)化

以構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒標準品為模板，用設計的4對特異性引物在同

一反應體系中進行PCR擴增。建立總體積為25μL的四重PCR反應體系：

2×TaqPCRMasterMix12.5μL，4對特異性上、下游引物各0.5μL，4種重

組質(zhì)粒標準品等比例混合物2.5μL，滅菌雙蒸水補足至25μL。對PCR的

退火溫度（分別為54.0℃、55.2℃、56.3℃、57.5℃、58.6℃、59.6℃）、

上下游引物的濃度（終濃度分別為0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75

pmol/μL）、循環(huán)數(shù)（分別為25、30、35、40、45個循環(huán)）等反應條件進

行優(yōu)化。

1.5多重RT-PCR的特異性、敏感性、重復性試驗

首先，以重組質(zhì)粒標準品pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和

pPRoV-VP6，以及PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、FMDV、PRRSV和

CSFV的cDNA，PRV、PCV2和PPV的DNA作為模板，雙蒸水作為陰性

對照，對所建立的多重RT-PCR進行特異性試驗。其次，將上述4種重組

質(zhì)粒標準品等比例混合后，10倍系列稀釋成濃度為1.57×109~1.57×100拷

貝/μL，對所建立的多重RT-PCR進行敏感性試驗。再次，隨機選取同一個

濃度的4種重組質(zhì)粒標準品等比例混合成1.57×107拷貝/μL，對所建立的

多重RT-PCR進行重復性試驗。

1.6多重RT-PCR方法的臨床應用

在廣西各地發(fā)生腹瀉的豬場中，采集病豬的糞便拭子、死亡仔豬的腸

5

道組織，共270份。應用所建立的多重RT-PCR方法檢測PEDV、TGEV、

PDCoV、PRoV。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA

后作為模板，應用特異性引物進行PCR擴增，獲得PEDVN基因750bp、

TGEVM基因544bp、PDCoVN基因183bp、PRoVVP6基因329bp等目

的片段?；厥?、純化PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α

感受態(tài)細胞，陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測

序鑒定正確后，分別命名為pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N、pPRoV-VP6。

鑒定結(jié)果見圖1。

圖1重組質(zhì)粒pPEDV-N(A)、pTGEV-M(B)、pPDCoV-N(C)、pPRoV-VP6(D)鑒定

M：DNA分子質(zhì)量標準；1：HindⅢ+EcoRⅠ酶切產(chǎn)物；2：PCR產(chǎn)物

6

2.2退火溫度的優(yōu)化

建立25μL多重PCR反應體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，4對

特異性上、下游引物（25pmol/μL）均為0.5μL，4種重組質(zhì)粒標準品等比

例混合物2.5μL，雙蒸水補足至25μL。反應程序：94℃預變性2min；94℃

變性10s，退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。其中，

退火溫度分別設置為54.0、55.2、56.3、57.5、58.6和59.6℃。結(jié)果如圖2

所示，各個退火溫度均可獲得較為清晰的擴增條帶，最后選取58.6℃作為

最適退火溫度。

圖2多重RT-PCR退火溫度的優(yōu)化

M：DNA分子質(zhì)量標準；1：54.0℃；2：55.2℃；3：56.3℃；4：57.5℃；5：58.6℃；6：59.6℃；

7：陰性對照

2.3引物濃度的優(yōu)化

在25μL多重PCR反應體系中，固定退火溫度為58.6℃，將4對特異

性上、下游引物終濃度以0.125、0.25、0.375、0.50、0.625和0.75pmol/μL

為6組不同的引物濃度，進行排列組合，其它條件固定不變，進行多重PCR，

以選出最佳引物濃度。經(jīng)過優(yōu)化，PEDV-N和PDCoV-N引物對的最佳終濃

度為0.50pmol/μL，TGEV-M和PRoV-VP6引物對的最佳終濃度為0.625

pmol/μL。部分結(jié)果見圖3。

7

圖3多重RT-PCR引物濃度的優(yōu)化

M：DNA分子質(zhì)量標準；1~6：PEDV、TGEV、PRoV引物終濃度分別固定為0.50、0.625、0.625pmol/μL，

PDCoV引物終濃度分別為0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75pmol/μL；7：陰性對照

2.4循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

建立25μL多重PCR反應體系，固定最佳退火溫度和最佳引物濃度，

保持其它條件不變，將循環(huán)數(shù)分別設置為25、30、35、40和45個循環(huán)，

進行多重PCR。結(jié)果見圖4，當循環(huán)數(shù)為35個時，擴增條帶最清晰明亮，

確定為最佳循環(huán)數(shù)。

圖4多重RT-PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

M：DNA分子質(zhì)量標準；1~5：循環(huán)數(shù)分別為25、30、35、40、45個；6：陰性對照

2.5多重RT-PCR反應條件的確定

經(jīng)過優(yōu)化反應條件，確定多重RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄體系和PCR擴增體系。

8

20μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScriptⅡBuffer4μL，dNTPMixture（10

mmol/μL）1μL，隨機引物6聚體（50μmol/μL）1μL、總RNA模板8μL，

RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5μL，PrimeScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，

滅菌雙蒸水4.5μL。反轉(zhuǎn)錄程序：30℃10min，48℃60min，95℃5min。

25μLPCR反應體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，PEDV-N和PDCoV-N

上、下游引物（25pmol/μL）0.5μL（終濃度均為0.50pmol/μL），TGEV-M

和PRoV-VP6上、下游引物（25pmol/μL）0.625μL（終濃度均為0.625

pmol/μL），cDNA2.5μL，滅菌雙蒸水5.5μL。PCR擴增程序：94℃預變

性2min；94℃變性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃

再延伸10min。

2.6多重RT-PCR特異性試驗

分別以重組質(zhì)粒pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6，

以及PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、FMDV、PRRSV和CSFV的cDNA，

PRV、PCV2和PPV的DNA作為模板，滅菌雙蒸水作為陰性對照，進行多

重RT-PCR反應。結(jié)果，只有PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV擴增出與

相應目的片段大小符合的條帶，而FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、

PPV均未出現(xiàn)擴增條帶（見圖5），表明多重RT-PCR沒有交叉反應。

圖5多重RT-PCR特異性試驗

M：DNA分子質(zhì)量標準；1：四種重組質(zhì)?；旌衔?；2：PEDV；3：TGEV；4：PDCoV；5：PRoV；

6：FMDV；7：PRRSV；8：CSFV；9：PRV；10：PCV2；11：PPV；12：陰性對照

2.7多重RT-PCR敏感性試驗

9

分別將pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6重組質(zhì)粒10

倍系列稀釋成終濃度為1.57×109拷貝/μL~1.57×100拷貝/μL，進行單重PCR。

結(jié)果，pPEDV-N、pPDCoV-N、pPRoV-VP6的檢出下限均為1.57×101拷貝

/μL，p-TGEV-M的檢出下限為1.57×103拷貝/μL（見圖6）。

圖6單重RT-PCR敏感性試驗

M：DNA分子質(zhì)量標準；1~10：重組質(zhì)粒濃度分別為1.57×109~1.57×100拷貝/μL；11：陰性對照

將pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N和pPRoV-VP6重組質(zhì)粒等比例

混合后，10倍系列稀釋，使4種重組質(zhì)粒的終濃度均為1.57×109拷貝

/μL~1.57×100拷貝/μL，進行多重PCR。結(jié)果，pPEDV-N、pPDCoV-N、

pPRoV-VP6的檢出下限均為1.57×102拷貝/μL，pTGEV-M的檢出下限為

1.57×103拷貝/μL（見圖7）。

圖7多重RT-PCR敏感性試驗

M：DNA分子質(zhì)量標準；1~10：重組質(zhì)粒濃度分別為1.57×109~1.57×100拷貝/μL；11：陰性對照

10

2.8多重RT-PCR重復性試驗

選取終濃度均為1.57×107拷貝/μL的4種重組質(zhì)?；旌衔镒鳛槟０澹?/p>

固定其它條件不變，進行多重RT-PCR。結(jié)果，5次重復試驗均能擴增出均

勻一致的目的條帶，具有良好的重復性。

圖8多重RT-PCR重復性試驗

M：DNA分子質(zhì)量標準；1~5：相同條件下的5次重復試驗；6：陰性對照

2.9多重RT-PCR方法的臨床應用

應用所建立的多重RT-PCR方法，對2017-2018年從廣西各地采集的

270份腹瀉病料進行檢測。結(jié)果，PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV陽性分

別為42份（15.56%）、31份（11.48%）、29份（10.74%）、5份（1.85%），

其中PEDV陽性39份（14.45%），TGEV陽性28份（10.37%），PDCoV

陽性25份（9.26%），PRoV陽性3份（1.11%），PEDV和TGEV、PEDV

和PDCoV、PEDV和PRoV混合陽性各1份（0.37%），PDCoV和TGEV

混合陽性2份（0.74%），PDCoV和TGEV混合陽性1份（0.37%）（見

表2）。部分陽性病料的檢測結(jié)果見圖9。同時，按照國家標準《豬流行性

腹瀉病毒RT-PCR檢測方法》（GB/T34757-2017）、農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《豬傳

染性胃腸炎病毒RT-nPCR檢測方法》（NY/T2841-2015）、國家標準《豬

輪狀病毒病RT-PCR檢測方法》（GB/T34756-2017）、張帆帆報道的PDCoV

RT-PCR方法[15]，分別檢測相應病料中的PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV，

結(jié)果上述單重RT-PCR方法與本研究所建立的多重RT-PCR方法檢測結(jié)果

11

的符合率為100%。隨機選取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV陽性樣品各

3份，回收PCR產(chǎn)物，克隆、測序、比對，證實為相應病毒的基因片段。

表2臨床病料檢測結(jié)果

病原檢測樣品數(shù)（份）陽性樣品數(shù)（份）陽性率（%）

PEDV2703914.45

TGEV2702810.37

PDCoV270259.26

PRoV27031.11

PEDV+TGEV27010.37

PEDV+PDCoV27010.37

PEDV+PRoV27010.37

PDCoV+TGEV27020.74

PDCoV+PRoV27010.37

合計Total27010137.41

圖9部分臨床樣品檢測結(jié)果

M：DNA分子質(zhì)量標準；1：陰性對照；2：陽性對照；3~14：臨床樣品

（二）PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR

檢測方法

1.1主要試劑和設備

MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0、TaKaRaRNAPCR

12

Kit(AMV)Ver.3.0（包含了RT-PCR擴增所需全部成份）、PremixEx

TaqTM(PerfectRealTime)（包含了熒光定量PCR反應所需的各種成分）為

寶生物工程（大連）有限公司。Q6型熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。

1.2引物和探針序列

表3PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV引物及探針序列

引物序列（5′→3′）目的基因產(chǎn)物大小/bp

PEDV-N-F5′-CTGGAATGAGCAAATTCGCTG-3′

PEDV-N-R5′-CTGAGGGTGTTTTCTGGGTTG-3′PEDV-N140

PEDV-N-PJOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1

TGEV-M-F5′-GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT-3′

TGEV-M-R5′-AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC-3′TGEV-M102

TGEV-M-PTexasRed-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2

PDCoV-M-F5′-ATCGACCACATGGCTCCAA-3′

PDCoV-M-R5′-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3′PDCoV-M72

PDCoV-M-P6-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1

PRoV-VP6-F5′-AATATGACACCAGCAGTTGCAAA-3′PRoV-VP6107

1.3樣品來源

采集自廣西各地發(fā)生腹瀉的豬場，243份臨床腹瀉樣品，包括腹瀉仔豬

的糞便拭子、病豬和死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物。

1.4待檢樣品的處理與提取

無菌采取腹瀉仔豬的糞便拭子、病豬和死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物等共

約1g，置于2.0mL離心管中，加入滅菌的1mol/LPBS（pH7.2）1mL，

用組織勻漿機充分研磨后，反復凍融3次；細胞培養(yǎng)物則直接反復凍融3

次。以10000×g離心5min，收集上清，用于總RNA抽提，或置-20℃

保存?zhèn)溆?。按照RNA/DNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為

cDNA。獲得的cDNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5重組質(zhì)粒標準品的制備

取PEDVCV777株、TGEVH株、PDCoVGX1701株、PRoVNX株

病毒液抽提總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應用設計的4對引物進行PCR擴

增。回收、純化PCR產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細

13

胞，涂板，篩選陽性克隆并增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR、酶切及測序

鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒作為標準品，分別命名為p-PEDV-N、

p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6。應用核酸蛋白分析儀測定濃度，

計算拷貝數(shù)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度×6.02×1023/（660×質(zhì)?？傞L度）。

1.6反應條件的優(yōu)化和標準曲線的制作

將4種重組質(zhì)粒標準品p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、

p-PRoV-VP6作為模板，應用4對特異性引物和TaqMan探針，在同一反應

體系中進行多重TaqMan熒光定量PCR擴增，優(yōu)化各種反應條件。擴增反

應中，當Ct值≤35循環(huán)時判為陽性反應。建立總體積為25μL的多重反應

體系，分別對退火溫度（52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃）、引物

濃度（終濃度為0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL）和

探針濃度（終濃度為0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL）

進行優(yōu)化，以獲得TaqMan熒光定量PCR的最佳反應條件。

將4種重組質(zhì)粒標準品10倍系列稀釋成2.06×109/μL~2.06×103拷貝

/μL，作為模板，按照優(yōu)化的TaqMan熒光定量RT-PCR反應條件進行擴增，

繪制擴增曲線及標準曲線。

1.7特異性試驗

取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV和FMDV病毒液，

按照RNA/DNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；取

PCV2、PPV和PRV病毒液，按照RNA/DNA抽提試劑盒說明書抽提總

DNA。以cDNA和DNA為模板，雙蒸水作為陰性對照，對所建立的多重

TaqMan熒光定量RT-PCR進行特異性試驗。

1.8敏感性試驗

將4種重組質(zhì)粒標準品p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、

p-PRoV-VP6進行10倍系列稀釋，選取終濃度為2.06×109~2.06×100拷貝/μL

的質(zhì)粒等比例混合物作為模板，進行TaqMan熒光定量PCR擴增，檢驗其

敏感性。

14

1.9重復性試驗

將4種重組質(zhì)粒p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6

分別10倍系列稀釋后等比例混合，取3個濃度梯度（終濃度分別為

2.06×108、2.06×106、2.06×104拷貝/μL）質(zhì)?；旌衔?，進行組內(nèi)和組間重

復性試驗。組間重復性試驗間隔1周進行。

1.10臨床樣品檢測

從廣西各地2018年發(fā)生腹瀉的豬場采集腹瀉病豬和死亡仔豬的腸道

組織以及病豬的糞便拭子共243份，應用上述的本實驗室之前建立的多重

RT-PCR方法以及本研究所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法進

行檢測，并比較兩者檢測PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV結(jié)果的符合率。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA

后作為模板，應用特異性引物進行PCR擴增，獲得PEDVN基因（140bp）、

TGEVM基因（102bp）、PDCoVM基因（72bp）、PRoVVP6基因（107

bp）片段，與各自目的片段大小一致。經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化，陽性克隆提

取質(zhì)粒，進行PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，成功構(gòu)建了4種重組質(zhì)粒，

分別命名為p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6，并將其

作為標準品。

2.2多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應條件的確定

經(jīng)過優(yōu)化，獲取多重TaqMan熒光定量RT-PCR的最佳反應條件。25μL

反應體系為：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)12.5μL，PEDV-N和

PRoV-VP6上、下游引物（25pmol/μL）及探針（25pmol/μL）各0.5μL（終

濃度均為0.50pmol/μL），TGEV-M和PDCoV-M上、下游引物（25pmol/μL）

及探針（25pmol/μL）各0.3μL（終濃度均為0.30pmol/μL），模板2μL，

滅菌雙蒸水5.7μL。擴增程序為：95℃20s；95℃1s，58℃45s，40個循

環(huán)，同時收集熒光信號。

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2.3多重TaqMan熒光定量RT-PCR標準曲線的繪制

將p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M和p-PRoV-VP6質(zhì)粒標準品

10倍系列稀釋成2.06×109~2.06×103拷貝/μL，等比例混合后作為模板進行

擴增，獲得多重TaqMan熒光定量RT-PCR的擴增曲線和標準曲線（圖10）。

結(jié)果顯示，4種標準曲線的相關系數(shù)（R2）均在0.998以上，表明各種標準

品的起始模板數(shù)和Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關系。

A:B:

PEDVTGEV

C:D:

PDCoVPRoV

1

2

3

4

E

(A-D)1-7:2.06×109-2.06×103copies/μL

(E)1:PEDV:y=-3.094x+34.314,R2=0.998;2:TGEV:y=-3.554x+38.423,R2=0.998;3:PDCoV:

y=-3.216x+35.024,R2=0.999;4:PRoV:y=-3.108x+35.395,R2=0.998

圖10多重TaqMan熒光定量RT-PCR的擴增曲線（A、B、C、D）及標準曲線（E）

16

2.4特異性分析

以PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV的cDNA

和PCV2、PPV和PRV的DNA為模板，以滅菌雙蒸水為陰性對照，對所

建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR進行特異性驗證。結(jié)果顯示，只有

作為陽性對照的p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M、p-PRoV-VP6質(zhì)粒

標準品以及以PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的cDNA為模板的反應出

現(xiàn)特異性擴增曲線，而且Ct值均小于35個循環(huán)，其余病毒的cDNA或DNA

為模板以及陰性對照均無擴增曲線（圖11）。表明，所建立的多重TaqMan

熒光定量RT-PCR方法與其它病毒沒有交叉反應，具有較強的特異性。

1

5678910

21′

4′3′

32′

4

1:p-TGEV-M;2:p-PEDV-N;3:p-PDCoV-M;4:p-PRoV-VP6;1′:TGEV;2′:PEDV;3′:PDCoV;4′:

PRoV;5:PRRSV;6:CSFV;7:FMDV;8:PCV2;9:PPV;10:PRV

圖11多重TaqMan熒光定量RT-PCR特異性試驗的擴增曲線

2.5敏感性分析

將p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M和p-PRoV-VP6質(zhì)粒標準品

10倍系列稀釋成2.06×109~2.06×100拷貝/μL，等比例混合后作為模板，進

行多重TaqMan熒光定量PCR的敏感性試驗。擴增反應中，當Ct值≤35

循環(huán)時判為陽性反應。結(jié)果顯示，p-PDCoV-M檢出下限為2.06×101拷貝

/μL，p-PEDV-N、p-TGEV-M檢出下限為2.06×102拷貝/μL，p-PRoV-VP6

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檢出下限為2.06×103拷貝/μL（圖12）。表明，該方法具有良好的敏感性。

A:PEDVB:TGEV

C:PDCoVD:PRoV

1-10:2.06×109-2.06×100copies/μL

圖12多重TaqMan熒光定量RT-PCR敏感性試驗的擴增曲線

2.6重復性分析

將4種質(zhì)粒標準品p-PEDV-N、p-TGEV-M、p-PDCoV-M和p-PRoV-VP6

系列稀釋后等比例混合，選取3個濃度梯度（終濃度分別為2.06×108、

2.06×106、2.06×104拷貝/μL)，對所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR

進行重復性測定。結(jié)果顯示，組內(nèi)及組間重復性試驗Ct值的變異系數(shù)均小

于1.1%，表明該方法具有良好的重復性（表4）。

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表4多重TaqMan熒光定量RT-PCR的重復性分析

濃度組內(nèi)重復試驗Ct值組間重復試驗Ct值

質(zhì)粒標準品

平均值標準差變異系數(shù)平均值標準差變異系數(shù)

MeanSDCV%MeanSDCV%

1.0×10429.270.030.1029.420.100.35

p-PEDV-N1.0×10622.600.100.4422.250.150.66

1.0×10816.290.030.1816.200.060.39

1.0×10431.050.100.3231.170.160.50

p-TGEV-M1.0×10624.800.271.0924.390.261.06

1.0×10818.090.040.2218.040.100.56

1.0×10429.500.180.6129.480.160.50

p-PDCoV-M1.0×10622.890.100.4422.670.170.76

1.0×10816.300.080.4916.370.100.59

1.0×10429.830.060.2030.520.100.37

p-PRoV-VP61.0×10624.420.160.6623.690.200.86

1.0×10817.190.120.7017.210.110.64

2.7臨床樣品的檢測結(jié)果

應用所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法，對2018年采集自

廣西各地的243份臨床腹瀉病料進行檢測。結(jié)果顯示，能夠檢出PEDV、

TGEV、PDCoV、PRoV一種或多種病原的陽性樣品96份（42.