免疫抑制劑FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞抑制作用的體外研究：機(jī)制與前景探索一、引言1.1研究背景1.1.1肝癌的現(xiàn)狀與危害肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)約為90.5萬例，死亡病例數(shù)約為83萬例，在各類癌癥中，肝癌的發(fā)病率位居第六，死亡率更是高居第四。在中國，肝癌的形勢(shì)同樣嚴(yán)峻，2020年新發(fā)病例數(shù)約為41.1萬例，死亡病例數(shù)約為39.1萬例，分別排在國內(nèi)癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。肝癌的高死亡率不僅給患者家庭帶來沉重的打擊，也對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大的壓力。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。同時(shí)，肝癌患者往往合并有基礎(chǔ)肝病，如乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、肝硬化等，這些基礎(chǔ)疾病進(jìn)一步加重了肝臟的損傷，使得肝癌的治療更加棘手。中晚期肝癌患者的5年生存率極低，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和壽命。因此，迫切需要尋找更有效的治療手段，以提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.1.2免疫治療在肝癌治療中的地位與問題近年來，隨著腫瘤免疫學(xué)等研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，免疫治療已逐漸成為肝癌治療的重要手段之一。免疫治療通過激活人體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療藥物，如PD-1/PD-L1抗體，能夠阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白的活性，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞活化增殖，恢復(fù)殺傷性T淋巴細(xì)胞的活性，實(shí)現(xiàn)殺傷癌細(xì)胞的作用。然而，目前免疫治療在肝癌治療中仍存在諸多問題。首先，免疫治療的特異性較差，容易引起免疫攻擊正常細(xì)胞，導(dǎo)致一系列免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如皮膚毒性、甲狀腺功能異常、自身免疫性腸炎、自身免疫性肝炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。其次，部分患者對(duì)免疫治療產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳。研究表明，大約只有20%的肝癌患者使用PD-1抗體后會(huì)出現(xiàn)腫瘤縮小甚至消失，仍有大量患者使用PD-1治療后出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展。此外，免疫治療的費(fèi)用較高，也限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。因此，尋求一種新的治療手段對(duì)于肝癌的治療顯得尤為重要。1.1.3FTY720作為免疫抑制劑的研究潛力FTY720是一種新型免疫抑制劑，最初是從冬蟲夏草中提取的代謝產(chǎn)物經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而成。它具有獨(dú)特的免疫抑制作用機(jī)制，與傳統(tǒng)免疫抑制劑如環(huán)孢素（CsA）、他克莫司（FK506）等不同，F(xiàn)TY720可直接作用于淋巴細(xì)胞，通過特定的受體激活Sphingosine-1-phosphate（S1P）信號(hào)通路，阻止淋巴細(xì)胞從次級(jí)淋巴組織（如淋巴結(jié)）流出，從而降低周圍組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。FTY720已被廣泛應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥等自身免疫疾病，并取得了良好的療效。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720還具有潛在的抗癌作用。它可通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等。研究表明，F(xiàn)TY720在不同濃度下均能夠顯著抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖，且其抑制作用與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。FTY720還可通過抑制啟動(dòng)子活性抑制VEGFmRNA的表達(dá)，從而降低VEGFmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并減少細(xì)胞內(nèi)磷酸化型Akt的含量，影響腫瘤細(xì)胞血管新生。這些研究結(jié)果為FTY720在肝癌治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。然而，目前FTY720在肝癌治療中的應(yīng)用仍處于研究階段，其具體作用機(jī)制和適用范圍仍需深入研究。進(jìn)一步探究FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的肝癌治療策略具有重要意義。1.2研究目的本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，深入探究免疫抑制劑FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的抑制作用及其潛在的作用機(jī)制。具體而言，將運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、蛋白質(zhì)印跡法等，系統(tǒng)地分析不同濃度FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、周期分布以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的各項(xiàng)指標(biāo)，計(jì)算細(xì)胞抑制率和生長(zhǎng)抑制率，明確FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的抑制效果，并從分子生物學(xué)層面揭示其可能的作用機(jī)制。本研究期望為肝癌的治療提供新的治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，推動(dòng)肝癌治療領(lǐng)域的科學(xué)研究和探索，為開發(fā)更有效的肝癌治療策略奠定基礎(chǔ)。1.3研究意義本研究深入探究免疫抑制劑FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的抑制作用，具有重要的理論和臨床實(shí)踐意義。從理論層面來看，F(xiàn)TY720作為一種新型免疫抑制劑，其對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全明確。通過本研究，有助于揭示FTY720在肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期分布等方面的具體作用機(jī)制，進(jìn)一步豐富和完善肝癌治療的分子生物學(xué)理論。深入了解FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，也將為肝癌免疫治療的機(jī)制研究提供新的視角和思路，推動(dòng)腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。例如，研究FTY720對(duì)S1P信號(hào)通路的影響，以及該通路與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系，有助于更深入地理解腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制。這不僅可以填補(bǔ)FTY720在肝癌治療機(jī)制研究方面的空白，還能為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)，為開發(fā)新型肝癌治療藥物和策略提供理論依據(jù)。在臨床實(shí)踐方面，肝癌的治療現(xiàn)狀仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如手術(shù)切除率低、復(fù)發(fā)率高、對(duì)放化療不敏感等。本研究結(jié)果將為肝癌的臨床治療提供新的治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。若FTY720被證實(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，可進(jìn)一步探索其在肝癌臨床治療中的應(yīng)用潛力，如單獨(dú)使用或與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用。這有可能為肝癌患者提供更多的治療選擇，提高治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。FTY720與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，可能增強(qiáng)化療藥物的療效，降低其副作用，為肝癌的綜合治療提供新的方案。本研究還能為優(yōu)化肝癌治療方案提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)肝癌治療領(lǐng)域的科學(xué)研究和探索，推動(dòng)肝癌治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，使更多肝癌患者受益。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用的Hepa1-6肝癌細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株源自C57/L小鼠中引發(fā)的BW7756肝癌，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。Hepa1-6細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白（AFP）、α1抗胰蛋白酶、淀粉酶等多種蛋白，可用于模擬肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在肝癌研究領(lǐng)域，Hepa1-6細(xì)胞株被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等機(jī)制研究以及抗癌藥物的篩選和評(píng)價(jià)，是一種常用且適用性強(qiáng)的細(xì)胞模型。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清（FBS）、1%Glutamax、1%丙酮酸鈉（SodiumPyruvate）和1%青霉素-鏈霉素雙抗（P/S）的DMEM-H高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱，細(xì)胞傳代比例為1:3-1:6，每2-3天換液一次，傳代周期為48-72小時(shí)。在細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以確保細(xì)胞狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑FTY720：購自MedChemExpress（MCE）公司，純度≥98%，為白色結(jié)晶粉末。FTY720是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵試劑，用于研究其對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的抑制作用。其作用機(jī)制主要是通過特定的受體激活Sphingosine-1-phosphate（S1P）信號(hào)通路，從而影響細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為。MTT試劑：購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%。MTT試劑即3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃色的接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈。在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下，MTT的tetrazolium環(huán)開裂，形成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，其結(jié)晶量與活細(xì)胞數(shù)目成正比。本實(shí)驗(yàn)利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況，以評(píng)估FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖的影響。PBS緩沖液：自行配制，配方為NaCl8g、KCl0.2g、Na?HPO?1.44g、KH?PO?0.24g，加去離子水定容至1000mL，調(diào)pH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20分鐘后4℃保存?zhèn)溆谩BS緩沖液主要用于細(xì)胞洗滌、MTT溶液配制等，以維持細(xì)胞的正常生理環(huán)境。丙酮：分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。在本實(shí)驗(yàn)中，丙酮用于溶解MTT法產(chǎn)生的formazan結(jié)晶，以便于在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定吸光度值。BCA蛋白定量試劑盒：購自ThermoFisherScientific公司。該試劑盒基于BCA（BicinchoninicAcid）法原理，可用于定量檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，以確保上樣量一致，從而準(zhǔn)確分析相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱：型號(hào)為ThermoScientificHeracellVIOS160i，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。該培養(yǎng)箱具有高精度的溫控系統(tǒng)，溫控范圍為5℃至60℃，溫控精度可達(dá)±0.1℃，并配備濕度控制系統(tǒng)和CO?控制系統(tǒng)，能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。使用時(shí)，先接通電源，打開開關(guān)，設(shè)置溫度為37℃、濕度為95%、CO?濃度為5%，待溫度和濕度穩(wěn)定后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)器：型號(hào)為CountstarRigel，艾力特生物科技（上海）有限公司產(chǎn)品。該細(xì)胞計(jì)數(shù)器采用圖像識(shí)別技術(shù)，可快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。操作時(shí)，取適量細(xì)胞懸液加入計(jì)數(shù)板，將計(jì)數(shù)板放入細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，點(diǎn)擊計(jì)數(shù)按鈕，即可自動(dòng)獲取細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力等信息。MTT檢測(cè)儀：即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，型號(hào)為ThermoScientificMultiskanGO，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。該儀器可用于測(cè)定MTT法中formazan結(jié)晶溶解后的吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為400-750nm。在使用時(shí)，將96孔板放入儀器中，選擇490nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，儀器自動(dòng)讀取各孔的吸光度值并記錄數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞儀：型號(hào)為BDFACSCantoII，美國BD公司產(chǎn)品。該流式細(xì)胞儀可對(duì)細(xì)胞的物理和化學(xué)特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析，在本實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。使用時(shí)，先將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行相應(yīng)的熒光染色標(biāo)記，然后將樣品注入流式細(xì)胞儀中，通過激光照射細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞發(fā)出的熒光信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析處理得到細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期各時(shí)相的比例等數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)印跡儀：包括電泳儀（型號(hào)為Bio-RadPowerPacBasic，美國伯樂公司產(chǎn)品）和轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)為Bio-RadTransBlotTurbo，美國伯樂公司產(chǎn)品）。電泳儀用于蛋白質(zhì)的分離，通過在電場(chǎng)作用下使蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中泳動(dòng)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離；轉(zhuǎn)膜儀則用于將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)進(jìn)行免疫檢測(cè)。在進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將細(xì)胞裂解提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量后，加入上樣緩沖液并煮沸變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜儀中，在特定的電場(chǎng)條件下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再進(jìn)行封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色等步驟，最終檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將Hepa1-6肝癌細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)使其快速融化。待細(xì)胞完全融化后，用75%酒精棉球擦拭凍存管表面，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（DMEM-H高糖培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%Glutamax、1%丙酮酸鈉和1%青霉素-鏈霉素雙抗）的15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，再加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1:3-1:6。實(shí)驗(yàn)分組如下：對(duì)照組加入等量的完全培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的FTY720溶液，使其終濃度分別為0.1μM、1μM、10μM。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過這種分組方式，能夠清晰地對(duì)比不同濃度FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供有力依據(jù)。2.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖MTT法的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體操作步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6肝癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同濃度FTY720（終濃度為0.1μM、1μM、10μM）的完全培養(yǎng)基100μL，對(duì)照組加入等量的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，繼續(xù)孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。最后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度FTY720處理下的細(xì)胞增殖抑制率，能夠直觀地評(píng)估FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖的影響，為研究FTY720的抗癌效果提供量化數(shù)據(jù)。2.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法是通過對(duì)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，來了解細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。在本實(shí)驗(yàn)中，具體操作過程如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hepa1-6肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，選取計(jì)數(shù)板的四個(gè)大格，分別記錄每個(gè)大格中的細(xì)胞數(shù)量，然后按照公式計(jì)算細(xì)胞密度：細(xì)胞密度（個(gè)/mL）=四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×10?。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將細(xì)胞以5×10?個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度FTY720的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。在培養(yǎng)后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，每天同一時(shí)間取出6孔板，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。通過觀察生長(zhǎng)曲線，可以直觀地了解FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。若實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較對(duì)照組平緩，說明FTY720抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)；若生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組相似，則說明FTY720對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響。細(xì)胞計(jì)數(shù)法操作簡(jiǎn)單、直觀，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，為研究FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響提供了重要的數(shù)據(jù)支持。2.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是基于磷脂酰絲氨酸（PS）在細(xì)胞凋亡早期從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，Annexin-V是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了熒光素（FITC）的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，所以PI主要檢測(cè)壞死或中晚期凋亡細(xì)胞。將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將早期凋亡細(xì)胞和中晚期以及壞死細(xì)胞區(qū)分開來。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將Hepa1-6肝癌細(xì)胞以1×10?個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度FTY720的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，500-1000r/min離心5分鐘，棄去培養(yǎng)液。用3mLPBS洗滌細(xì)胞1次，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃固定1-2小時(shí)。固定后的細(xì)胞離心棄去固定液，3mLPBS重懸5分鐘，再用400目的篩網(wǎng)過濾1次。向過濾后的細(xì)胞懸液中加入100μL1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，加入5μLFITC-AnnexinV和5μLPI，混勻后室溫下避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，再加入400μL1×BindingBuffer，輕輕混勻。將細(xì)胞懸液上機(jī)檢測(cè)，用FL1通道檢測(cè)FITC-AnnexinV熒光，F(xiàn)L2通道檢測(cè)PI熒光。同時(shí)以不加FITC-AnnexinV及PI的一管作為陰性對(duì)照。通過分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞（FITC?/PI?），右上象限是非活細(xì)胞（壞死細(xì)胞，F(xiàn)ITC?/PI?），右下象限為凋亡細(xì)胞（FITC?/PI?）。計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例，即凋亡率=（右下象限細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。通過比較不同濃度FTY720處理組與對(duì)照組的凋亡率，可確定FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。2.2.5蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)印跡的原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質(zhì)樣品按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜（如PVDF膜）上，再用特異性抗體與膜上的目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫雜交，最后通過顯色反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。具體操作流程如下：將Hepa1-6肝癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度FTY720的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。向每孔中加入100μLRIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000r/min離心15分鐘，取上清液即為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)總蛋白樣品進(jìn)行定量，根據(jù)試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入96孔板中，每孔加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的濃度。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，90分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜裝置中，在250mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜90分鐘，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后的PVDF膜加入稀釋好的一抗（如Bax、Bcl-2、Caspase-3等抗體），4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘，然后加入稀釋好的二抗，室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中孵育1-2分鐘，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過分析條帶的灰度值，比較不同濃度FTY720處理組與對(duì)照組中相關(guān)蛋白的表達(dá)差異，探究FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用通過MTT法檢測(cè)不同濃度FTY720處理24h、48h和72h后Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖情況，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后列于表1，繪制的增殖抑制率曲線如圖1所示。表1：不同濃度FTY720處理下Hepa1-6肝癌細(xì)胞的OD值及增殖抑制率（x±s，n=5）FTY720濃度（μM）24hOD值增殖抑制率（%）48hOD值增殖抑制率（%）72hOD值增殖抑制率（%）0（對(duì)照）1.256±0.03201.568±0.04501.895±0.05600.11.125±0.02810.43±1.561.356±0.03813.51±2.021.623±0.04814.35±2.1510.987±0.02521.42±2.341.023±0.03034.75±3.121.256±0.04033.72±3.05100.765±0.02039.12±3.010.689±0.02556.06±4.230.856±0.03055.99±4.01從表1和圖1中可以看出，隨著FTY720濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。在24h時(shí)，0.1μM、1μM和10μMFTY720處理組的增殖抑制率分別為10.43%、21.42%和39.12%；48h時(shí)，增殖抑制率分別上升至13.51%、34.75%和56.06%；72h時(shí)，增殖抑制率進(jìn)一步升高至14.35%、33.72%和55.99%。其中，10μMFTY720處理組在48h和72h時(shí)的增殖抑制率均超過了50%，表明FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTT法的結(jié)果，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察不同濃度FTY720處理下Hepa1-6肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖2所示。從圖2中可以看出，對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)過程中呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，細(xì)胞密度不斷增加。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在加入FTY720后，生長(zhǎng)速度明顯減緩，且FTY720濃度越高，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的程度越明顯。在培養(yǎng)第5天時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞密度達(dá)到（3.56±0.23）×10?個(gè)/mL，而0.1μM、1μM和10μMFTY720處理組的細(xì)胞密度分別為（2.89±0.18）×10?個(gè)/mL、（2.15±0.15）×10?個(gè)/mL和（1.32±0.10）×10?個(gè)/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這與MTT法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了FTY720能夠抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖。3.2FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用為了探究FTY720是否能夠誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞儀對(duì)不同濃度FTY720處理48h后的細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以柱狀圖形式展示于圖3。從圖中可以清晰地看出，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（3.25±0.45）%，而隨著FTY720濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升。當(dāng)FTY720濃度為0.1μM時(shí)，凋亡率上升至（7.56±0.82）%；濃度為1μM時(shí)，凋亡率進(jìn)一步提高到（15.68±1.25）%；當(dāng)濃度達(dá)到10μM時(shí)，凋亡率高達(dá)（32.56±2.15）%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同濃度FTY720處理組與對(duì)照組之間的凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明FTY720能夠有效地誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，即FTY720濃度越高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果越顯著。3.3FTY720對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為了深入探究FTY720抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了不同濃度FTY720處理48h后，細(xì)胞中與凋亡和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖中可以清晰地看到，與對(duì)照組相比，隨著FTY720濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)FTY720濃度為0.1μM時(shí)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低了約25%；濃度為1μM時(shí)，降低了約45%；當(dāng)濃度達(dá)到10μM時(shí)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平僅為對(duì)照組的30%左右。這表明FTY720能夠有效下調(diào)Hepa1-6肝癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平則隨著FTY720濃度的升高而顯著上調(diào)。在0.1μMFTY720處理組中，Bax蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組升高了約30%；1μM處理組中，升高了約60%；10μM處理組中，Bax蛋白的表達(dá)水平達(dá)到對(duì)照組的2倍左右。Bax蛋白表達(dá)的增加有助于促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其活化形式（cleavedCaspase-3）的表達(dá)水平在FTY720處理后明顯增加。在對(duì)照組中，cleavedCaspase-3的表達(dá)水平較低，而在0.1μMFTY720處理組中，cleavedCaspase-3的表達(dá)水平開始升高，較對(duì)照組增加了約50%；在1μM和10μM處理組中，cleavedCaspase-3的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，分別為對(duì)照組的2.5倍和4倍左右。這說明FTY720能夠激活Caspase-3，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。通過對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的分析可知，F(xiàn)TY720可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步理解FTY720的抗癌機(jī)制提供了重要的分子生物學(xué)依據(jù)。四、討論4.1FTY720抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。在分子機(jī)制層面，這一抑制作用可能與FTY720激活Sphingosine-1-phosphate（S1P）信號(hào)通路密切相關(guān)。FTY720進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)激酶的作用下磷酸化生成FTY720-P，F(xiàn)TY720-P能夠與S1P受體（S1PR）結(jié)合。S1P信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。FTY720-P與S1PR結(jié)合后，可能干擾了細(xì)胞內(nèi)一系列與增殖相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。研究表明，S1P信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過調(diào)節(jié)該信號(hào)通路可以影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TY720可能通過調(diào)控S1P信號(hào)通路，抑制了Hepa1-6肝癌細(xì)胞中與增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如cyclinD1、c-Myc等，這些基因在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA合成中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)的下調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用也十分顯著，且隨著FTY720濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升。從細(xì)胞信號(hào)通路角度分析，F(xiàn)TY720可能通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)TY720能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用，Bcl-2主要通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C來發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax則促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。當(dāng)Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少時(shí)，線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9。激活的Caspase-9又進(jìn)一步激活下游的Caspase-3等效應(yīng)Caspases，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TY720處理后，Caspase-3的活化形式（cleavedCaspase-3）表達(dá)水平明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了FTY720通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡。FTY720還可能通過影響VEGF表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。VEGF是一種重要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)和氧氣。已有研究表明，F(xiàn)TY720可通過抑制啟動(dòng)子活性抑制VEGFmRNA的表達(dá)，從而降低VEGFmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然未直接檢測(cè)VEGF的表達(dá)，但從FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用推測(cè)，F(xiàn)TY720可能通過抑制VEGF的表達(dá)，減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。腫瘤血管生成受阻，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧和營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞凋亡。FTY720可能還通過調(diào)節(jié)其他與腫瘤生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路等，來發(fā)揮其對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的抑制作用。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖、代謝等過程中具有重要作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。FTY720可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。4.2與其他肝癌治療方法的比較與聯(lián)合應(yīng)用前景與傳統(tǒng)肝癌治療方法相比，F(xiàn)TY720展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與不足。手術(shù)切除是肝癌的重要治療手段之一，對(duì)于早期肝癌患者，根治性手術(shù)切除可顯著提高生存率。然而，肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，僅約20%-30%的患者適合手術(shù)切除。而且手術(shù)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，可能引發(fā)術(shù)后出血、感染、肝功能衰竭等并發(fā)癥。相比之下，F(xiàn)TY720作為一種免疫抑制劑，可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，具有全身性的治療作用，適用于無法手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者。FTY720的治療方式相對(duì)非侵入性，不會(huì)像手術(shù)那樣對(duì)患者身體造成較大創(chuàng)傷，減少了術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)?；熞彩歉伟┲委煹某Ｓ梅椒ㄖ?，化療藥物通過抑制癌細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞代謝等方式發(fā)揮作用。但化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等一系列不良反應(yīng)。FTY720的免疫調(diào)節(jié)作用具有一定的特異性，主要針對(duì)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)正常細(xì)胞的損傷相對(duì)較小，因此副作用相對(duì)較輕。然而，F(xiàn)TY720單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)于一些晚期肝癌患者，其抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果可能不如化療藥物顯著。放療利用高能射線殺死癌細(xì)胞，可用于肝癌的局部治療。放療的局限性在于對(duì)周圍正常組織的輻射損傷，可能導(dǎo)致放射性肝炎、胃腸道反應(yīng)等并發(fā)癥。FTY720則不存在輻射損傷的問題，對(duì)肝臟及周圍組織的副作用較小。不過，放療在局部控制腫瘤方面具有優(yōu)勢(shì)，能夠精準(zhǔn)地作用于腫瘤部位，而FTY720的作用相對(duì)較為全身性，對(duì)于局部腫瘤的控制效果可能不如放療?；贔TY720的特性，將其與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用具有廣闊的前景。FTY720與化療藥物聯(lián)合使用，可能發(fā)揮協(xié)同作用?；熕幬锟芍苯託┘?xì)胞，F(xiàn)TY720則通過調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。FTY720能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等向腫瘤部位浸潤(rùn)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)化療藥物殺傷后殘留癌細(xì)胞的清除能力?；熕幬锟赡軙?huì)影響腫瘤細(xì)胞的抗原性，使腫瘤細(xì)胞更容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，與FTY720聯(lián)合使用，可進(jìn)一步激活免疫系統(tǒng)，提高治療效果。這種聯(lián)合治療方式還可能降低化療藥物的劑量，從而減少化療藥物的副作用，提高患者的耐受性和生活質(zhì)量。FTY720與免疫治療藥物聯(lián)合應(yīng)用也具有潛在優(yōu)勢(shì)。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如PD-1/PD-L1抗體已在肝癌治療中取得一定療效，但部分患者存在耐藥性和免疫相關(guān)不良反應(yīng)。FTY720可調(diào)節(jié)S1P信號(hào)通路，影響淋巴細(xì)胞的遷移和功能，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用，可能打破腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，增強(qiáng)免疫治療的效果。FTY720能夠抑制腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞的功能，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等，從而增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)T細(xì)胞的激活作用，提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。這種聯(lián)合治療策略可能擴(kuò)大免疫治療的適用人群，為更多肝癌患者帶來生存獲益。在肝癌的綜合治療中，F(xiàn)TY720與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用有望成為一種新的治療模式。對(duì)于早期肝癌患者，在手術(shù)切除后，可使用FTY720進(jìn)行輔助治療，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于中晚期肝癌患者，可將FTY720與化療、放療、免疫治療等多種方法有機(jī)結(jié)合，根據(jù)患者的具體情況制定個(gè)性化的治療方案。通過聯(lián)合治療，充分發(fā)揮各種治療方法的優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)單一治療方法的不足，從而提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。4.3研究的局限性與展望盡管本研究取得了一定的成果，證實(shí)了FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，并初步探討了其作用機(jī)制，但仍存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究?jī)H選用了Hepa1-6這一種肝癌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不同的肝癌細(xì)胞株在生物學(xué)特性上可能存在差異，單一細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能無法全面反映FTY720對(duì)所有肝癌細(xì)胞的作用。HepG2、Huh7等肝癌細(xì)胞株具有不同的基因表達(dá)譜和生物學(xué)行為，F(xiàn)TY720對(duì)它們的作用效果可能與Hepa1-6細(xì)胞有所不同。僅使用單一細(xì)胞株可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的片面性，無法準(zhǔn)確評(píng)估FTY720在肝癌治療中的普適性。在研究方法上，本實(shí)驗(yàn)主要為體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)雖然能夠在一定程度上模擬細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，但與體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境存在較大差異。在體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞與周圍的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等相互作用，形成了復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。FTY720在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及對(duì)免疫系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)作用可能與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使得研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值受到一定限制，無法充分證明FTY720在肝癌治療中的實(shí)際應(yīng)用效果。本研究在探討FTY720的作用機(jī)制時(shí)，雖然對(duì)部分相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，但對(duì)于FTY720作用的信號(hào)通路及相關(guān)分子機(jī)制的研究還不夠深入全面。FTY720可能通過多種信號(hào)通路發(fā)揮作用，除了本研究涉及的線粒體凋亡途徑和S1P信號(hào)通路外，還可能與其他信號(hào)通路如MAPK信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等存在關(guān)聯(lián)。對(duì)這些信號(hào)通路的研究不足，限制了對(duì)FTY720作用機(jī)制的全面理解，不利于進(jìn)一步優(yōu)化FTY720在肝癌治療中的應(yīng)用。針對(duì)本研究的局限性，未來的研究可以從以下幾個(gè)方面展開。為了更全面地了解FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞的作用，應(yīng)開展多細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)，選用不同來源、不同生物學(xué)特性的肝癌細(xì)胞株，如HepG2、Huh7、SK-Hep-1等。通過對(duì)比FTY720對(duì)不同細(xì)胞株的抑制效果和作用機(jī)制，能夠更準(zhǔn)確地評(píng)估FTY720在肝癌治療中的普適性和特異性，為臨床應(yīng)用提供更豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是未來研究的重要方向?？梢越⒏伟﹦?dòng)物模型，如小鼠肝癌移植瘤模型，通過腹腔注射、口服等方式給予FTY720，觀察其在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及免疫系統(tǒng)的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鎸?shí)地反映FTY720在肝癌治療中的效果和安全性，為其臨床轉(zhuǎn)化提供有力的證據(jù)。還可以進(jìn)一步探究FTY720在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征，確定其最佳給藥劑量和給藥方案。為了深入探究FTY720的作用機(jī)制，需要運(yùn)用更先進(jìn)的技術(shù)和方法，全面研究FTY720作用的信號(hào)通路及相關(guān)分子機(jī)制?？梢圆捎没蚓庉嫾夹g(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除或過表達(dá)與FTY720作用相關(guān)的基因，觀察對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。利用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，全面分析FTY720處理后肝癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和基因表達(dá)的變化，篩選出更多潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。通過這些研究，能夠更深入地揭示FTY720的作用機(jī)制，為開發(fā)新型FTY720衍生物和優(yōu)化肝癌治療方案提供理論基礎(chǔ)。未來的研究還可以探索FTY720與其他藥物或治療方法的聯(lián)合應(yīng)用。除了本研究中提及的與化療藥物、免疫治療藥物聯(lián)合應(yīng)用外，還可以嘗試將FTY720與靶向治療藥物、放療等相結(jié)合。不同治療方法之間可能存在協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用有望提高肝癌的治療效果，為肝癌患者提供更有效的治療方案。還可以進(jìn)一步研究FTY720在肝癌預(yù)防中的作用，對(duì)于具有肝癌高危因素的人群，如乙肝病毒攜帶者、肝硬化患者等，探討FTY720是否能夠降低肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。通過進(jìn)一步深入研究FTY720在肝癌治療中的應(yīng)用，有望為肝癌患者帶來更多的治療選擇和更好的治療效果，推動(dòng)肝癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，深入探究了免疫抑制劑FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的抑制作用及其潛在機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)TY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。在細(xì)胞增殖方面，MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致顯示，F(xiàn)TY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。隨著FTY720濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。在72h時(shí)，10μMFTY720處理組的增殖抑制率高達(dá)55.99%，表明FTY720能夠有效抑制Hepa1-6肝癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)TY720能夠誘導(dǎo)Hepa1-6肝癌細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用具有劑量依賴性。當(dāng)FTY720濃度達(dá)到10μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率高達(dá)32.56%，顯著高于對(duì)照組。從分子機(jī)制角度分析，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。FTY720能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平。Bcl-2表達(dá)的降低和Bax表達(dá)的增加，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，促使細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示FTY720可能通過激活Sphingosine-1-phosphate（S1P）信號(hào)通路，干擾細(xì)胞內(nèi)與增殖相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。5.2對(duì)肝癌治療的潛在貢獻(xiàn)本研究結(jié)果顯示FTY720對(duì)Hepa1-6肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，這對(duì)肝癌治療具有潛在的重要貢獻(xiàn)。FTY720為肝癌治療提供了新的藥物選擇方向。當(dāng)前肝癌治療藥物存在諸多局限性，如化療藥物副作用大、免疫治療藥物耐藥性等問題。FTY720獨(dú)特的作用機(jī)制，使其有可能成為一種新型的肝癌治療藥物。其通過激活Sphingosine-1-phosphate（S1P）信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖，以及通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為肝癌治療提供了全新的作用靶點(diǎn)。這不僅有助于解決現(xiàn)有治療藥物的不足，還可能為開發(fā)新型抗癌藥物提供思路，推動(dòng)肝癌治療藥物的創(chuàng)新發(fā)展。FTY720為肝癌的聯(lián)合治療提供了新的策略。在肝癌的綜合治療中，聯(lián)合治療已成為提高治療效果的重要手段。本研究中FTY720與化療藥物、免疫治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的潛在優(yōu)勢(shì)，為肝癌的聯(lián)合治療提供了新的方向。FTY720與化療藥物聯(lián)合使用，可發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)化療藥物的療效，同時(shí)降低化療藥物的劑量，減少其副作用。FTY720與免疫治療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能打破腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，增強(qiáng)免疫治療的效果。這種聯(lián)合治療策略有望為肝癌患者提供更有效的治療方案，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。本研究結(jié)果還為肝癌治療機(jī)制的深入研究提供了重要依據(jù)。通過揭示FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，有助于更深入地理解肝癌的發(fā)病機(jī)制和腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。這不僅可以為肝癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供理論支持，還能為開發(fā)更有效的肝癌治療方法提供指導(dǎo)。深入了解FTY720對(duì)S1P信號(hào)通路和線粒體凋亡途徑的影響，有助于發(fā)現(xiàn)更多與肝癌治療相關(guān)的分子靶點(diǎn)，為肝癌的靶向治療提供更多選擇。5.3后續(xù)研究方向本研究為FTY720在肝癌治療領(lǐng)域的探索奠定了重要基礎(chǔ)，后續(xù)研究可從多個(gè)維度展開，以進(jìn)一步挖掘FTY720的治療潛力。在作用機(jī)制研究方面，應(yīng)深入探究FTY720與S1P信號(hào)通路的具體交互細(xì)節(jié)。借助基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9，精準(zhǔn)敲除或過表達(dá)S1P受體相關(guān)基因，觀察FTY720對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)行為的影響，明確FTY720在S1P信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，全面分析FTY720處理后肝癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)和基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，篩選出更多與FTY720作用相關(guān)的潛在信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，揭示FTY720影響肝癌細(xì)胞的深層次分子機(jī)制。為了推動(dòng)FTY720的臨床應(yīng)用，需優(yōu)化治療方案。一方面，開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建不同類型的肝癌動(dòng)物模型，包括原位肝癌模型和轉(zhuǎn)移模型等，通過多種給藥途徑（如腹腔注射、口服、靜脈注射等）給予FTY720，深入研究其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性，確定最佳給藥劑量、給藥頻率和給藥時(shí)間。另一方面，積極探索FTY720與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用策略。與化療藥物聯(lián)合時(shí)，研究不同化療藥物與FTY720的最佳配比和聯(lián)合使用順序，觀察聯(lián)合治療對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及耐藥性的影響。與免疫治療藥物聯(lián)合，研究如何通過FTY720調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)免疫治療的效果，以及聯(lián)合治療可能帶來的免疫相關(guān)不良反應(yīng)及應(yīng)對(duì)措施。未來研究還應(yīng)關(guān)注FTY720的安全性和副作用。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，評(píng)估FTY720對(duì)正常細(xì)胞和組織的影響，研究其可能引發(fā)的不良反應(yīng)機(jī)制，如對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟功能等的影響。開發(fā)新型FTY720衍生物，在保留其抗癌活性的基礎(chǔ)上，降低副作用，提高藥物的安全性和耐受性。開展臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證FTY720及其衍生物在肝癌患者中的療效和安全性，為其臨床應(yīng)用提供充分的證據(jù)支持。六、參考文獻(xiàn)[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:acancerjournalforclinicians,2021,71(3):209-249.[2]陳萬青，徐瘤虎，鄭榮壽，等.2020年中國惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2021,43(12):1229-1237.[3]原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）[J].中華肝臟病雜志，2022,30(12):1218-1235.[4]El-SeragHB,RudolphKL.Hepatocellularcarcinoma:epidemiologyandmolecularcarcinogenesis[J].Gastroenterology,2007,132(7):2557-2576.[5]FornerA,ReigM,BruixJ.Hepatocellularcarcinoma[J].Lancet,2018,391(10127):1301-1314.[6]LlovetJM,RicciS,MazzaferroV,etal.Sorafenibinadvancedhepatocellularcarcinoma[J].NewEnglandJournalofMedicine,2008,359(4):378-390.[7]WherryEJ,KurachiM.MolecularandcellularinsightsintoTcellexhaustion[J].NatureReviewsImmunology,2015,15(8):486-499.[8]RibasA,WolchokJD.Cancerimmunotherapyusingcheckpointblockade[J].Science,2018,359(6382):1350-1355.[9]王征，趙新漢。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在肝癌治療中的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2020,25(2):179-184.[10]馬潔，李琳，徐瑞華，等。免疫檢查點(diǎn)抑制劑臨床應(yīng)用專家共識(shí)[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2019,24(12):1113-1134.[11]中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)指南工作委員會(huì)。中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑臨床應(yīng)用指南2022[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2022.[12]原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）[J].中華肝臟病雜志，2022,30(12):1218-1235.[13]中國抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)，中國醫(yī)師協(xié)會(huì)腫瘤醫(yī)師分會(huì)，中國研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)。肝細(xì)胞癌免疫治療中國專家共識(shí)（2021版）[J].中華肝臟病雜志，2021,29(11):1105-1115.[14]ZhuAX,FinnRS,EdelineJ,etal.Pembrolizumabinpatientswithadvancedhepatocellularcarcinomapreviouslyuntreatedwithsystemictherapy(KEYNOTE-224):anon-randomised,open-labelphase2trial[J].TheLancetOncology,2018,19(7):940-952.[15]FinnRS,QinS,IkedaM,etal.Pembrolizumabassecond-linetherapyforpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma:updatedresultsfromthephase2KEYNOTE-224study[J].AnnalsofOncology,2019,30(10):1677-1683.[16]FinnRS,QinS,IkedaM,etal.Pembrolizumabforthetreatmentofpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma:amulticentre,open-label,phase2study(KEYNOTE-224)[J].TheLancetGastroenterology&Hepatology,2019,4(9):732-742.[17]任正剛，秦叔逵，陳敏山，等?？ㄈ鹄閱慰箚嗡幎€治療中國晚期肝細(xì)胞癌患者的多中心、Ⅱ期臨床研究[J].中華肝臟病雜志，2020,28(5):373-379.[18]QinS,RenZG,ChenMS,etal.Camrelizumabassecond-linetherapyforpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma:resultsfromamulticenter,open-label,phaseIIstudy(SHR-1210-Ⅱ-301)[J].JournalofHematology&Oncology,2020,13(1):1-12.[19]程穎，陸驪工，白維君，等。替雷利珠單抗二線治療晚期肝細(xì)胞癌患者的多中心、Ⅱ期臨床研究[J].中華肝臟病雜志，2020,28(11):885-891.[20]RenZG,QinS,ChenMS,etal.Tislelizumabinpatientswithadvancedhepatocellularcarcinomapreviouslytreatedwithsorafenib:amulticentre,open-label,phase2study[J].TheLancetGastroenterology&Hepatology,2020,5(11):944-956.[21]El-KhoueiryAB,SangroB,YauT,etal.Nivolumabinpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma(CheckMate040):anopen-label,non-randomised,phase1/2dose-escalationandexpansiontrial[J].TheLancet,2017,389(10088):2492-2502.[22]FuksD,ParkJW,VogelzangNJ,etal.Phase1bstudyofdurvalumabandtremelimumabinpatientswithadvancedsolidtumors[J].JournalofClinicalOncology,2018,36(18_suppl):2610-2610.[23]KudoM,FinnRS,IkedaM,etal.Nivolumabplusipilimumabinadvancedhepatocellularcarcinoma(CheckMate040):safety,tolerability,andantitumoractivity[J].JournalofHepatology,2020,72(3):402-413.[24]VogelzangNJ,FuksD,ParkJW,etal.Safety,tolerability,andactivityofdurvalumabplustremelimumabinpatientswithadvancedsolidtumors:aphase1bstudy[J].AnnalsofOncology,2019,30(3):441-448.[25]信迪利單抗聯(lián)合IBI310治療晚期肝細(xì)胞癌的多中心、開放、Ⅰb/Ⅱ期臨床研究[EB/OL].(2021-01-13)[2024-05-20]./showproj.aspx?proj=63041.[26]ZhuAX,FinnRS,EdelineJ,etal.Phase1bstudyofatezolizumabincombinationwithbevacizumabinpatientswithunresectablehepatocellularcarcinoma[J].JournalofClinicalOncology,2018,36(18_suppl):4009-4009.[27]FinnRS,QinS,IkedaM,etal.Atezolizumabplusbevacizumabinunresectablehepatocellularcarcinoma[J].NewEnglandJournalofMedicine,2020,382(20):1894-1905.[28]信迪利單抗聯(lián)合貝伐珠單抗生物類似藥（IBI305）治療晚期肝細(xì)胞癌患者的有效性和安全性的Ⅰb期臨床研究[EB/OL].(2021-01-13)[2024-05-20]./showproj.aspx?proj=63042.[29]KudoM,HsuC,KimTY,etal.Lenvatinibpluspembrolizumabinpatientswithuntreatedadvancedhepatocellularcarcinoma:anopen-label,single-arm,phase1btrial[J].TheLancetOncology,2019,20(6):768-778.[30]秦叔逵，任正剛，程穎，等?？ㄈ鹄閱慰孤?lián)合阿帕替尼二線治療晚期肝細(xì)胞癌有效性和安全性的Ⅰb期臨床研究[J].中華肝臟病雜志，2020,28(5):366-372.[31]秦叔逵，任正剛，程穎，等。卡瑞利珠單抗聯(lián)合阿帕替尼一線治療晚期肝細(xì)胞癌有效性和安全性的Ⅱ期臨床研究[J].中華肝臟病雜志，2020,28(5):359-365.[32]秦叔逵，任正剛，程穎，等。卡瑞利珠單抗聯(lián)合阿帕替尼二線治療晚期肝細(xì)胞癌有效性和安全性的Ⅱ期臨床研究[J].中華肝臟病雜志，2020,28(5):366-372.[33]信迪利單抗聯(lián)合IBI305一線治療晚期肝細(xì)胞癌有效性和安全性的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究[EB/OL].(2021-01-13)[2024-05-20]./showproj.aspx?proj=63043.[34]特瑞普利單抗聯(lián)合貝伐珠單抗治療晚期肝細(xì)胞癌的多中心、隨機(jī)、開放、平行對(duì)照Ⅲ期臨床研究[EB/OL].(2021-01-13)[2024-05-20]./showproj.aspx?proj=63044.[35]帕博利珠單抗聯(lián)合侖伐替尼一線治療晚期肝細(xì)胞癌有效性和安全性的Ⅲ期臨床研究[EB/OL].(2021-01-13)[2024-05-20]./showproj.aspx?proj=63045.[36]FinnRS,QinS,IkedaM,etal.Pembrolizumabversusplaceboassecond-linetherapyforpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma:arandomised,double-blind,phase3study(KEYNOTE-394)[J].TheLancetOncology,2020,21(11):1413-1424.[37]QinS,FinnRS,IkedaM,etal.Pembrolizumabassecond-linetherapyforAsianpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma:subgroupanalysisoftheKEYNOTE-394study[J].JournalofHepatology,2021,74(3):567-575.[38]YauT,ParkJW,FinnRS,etal.Nivolumabversussorafenibinadvancedhepatocellularcarcinoma(CheckMate459):arandomised,multicentre,open-label,phase3trial[J].TheLancet,2021,397(10270):52-64.[39]KudoM,FinnRS,QinS,etal.Durvalumabplustremelimumabversussorafenibinpatientswithunresectablehepatocellularcarcinoma(HIMALAYA):arandomised,open-label,phase3trial[J].