體內(nèi)藥分考試題目和答案一、名詞解釋（每題3分，共15分）1.生物利用度：指藥物經(jīng)血管外途徑給藥后，到達體循環(huán)的相對量（AUC）和速度（達峰時間、峰濃度）。通常用試驗制劑與參比制劑的AUC比值表示絕對或相對生物利用度。2.基質(zhì)效應(yīng)：生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂類、代謝物等）對分析物檢測信號產(chǎn)生的增強或抑制作用，表現(xiàn)為相同濃度分析物在純?nèi)軇┡c生物基質(zhì)中響應(yīng)值的差異。3.LLOQ（最低定量限）：在生物樣品分析中，能被準(zhǔn)確定量的最低分析物濃度，需滿足精密度（RSD≤20%）和準(zhǔn)確度（RE≤±20%）要求，且至少有3個獨立樣品驗證。4.手性藥物對映體選擇性分析：針對具有手性中心的藥物，利用手性色譜柱、手性衍生化或手性流動相添加劑等方法，實現(xiàn)對映體的分離與定量檢測，因?qū)τ丑w可能存在藥效、毒性差異。5.代謝物輪廓分析：通過非靶向或靶向分析技術(shù)（如LCMS、NMR），全面檢測生物樣品中藥物代謝產(chǎn)物的種類、結(jié)構(gòu)及相對含量，用于闡明藥物代謝途徑和生物轉(zhuǎn)化規(guī)律。二、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述生物樣品（血漿/血清）預(yù)處理中蛋白沉淀法的常用試劑及作用原理。答：常用試劑包括有機溶劑（如乙腈、甲醇）、強酸（如高氯酸、三氯乙酸）、鹽類（如硫酸銨）。原理：有機溶劑通過降低溶液介電常數(shù)，破壞蛋白質(zhì)水化膜并與蛋白質(zhì)爭奪水分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集沉淀；強酸通過中和蛋白質(zhì)表面電荷（等電點沉淀）并破壞氫鍵，使蛋白質(zhì)變性；鹽類通過鹽析作用，降低蛋白質(zhì)溶解度。蛋白沉淀法操作簡單、耗時短，適用于大部分藥物，但可能損失部分與蛋白強結(jié)合的藥物。2.列舉HPLCMS/MS用于體內(nèi)藥物分析的3個主要優(yōu)勢，并說明原因。答：（1）高靈敏度：MS/MS通過母離子→子離子的選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式，顯著降低背景噪音，檢測限可達ng/mL甚至pg/mL級，適合低濃度藥物檢測。（2）高選擇性：SRM模式僅采集目標(biāo)離子對，可有效排除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物及同分異構(gòu)體的干擾，專屬性強。（3）多組分同時分析：通過MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）可同時監(jiān)測多個藥物/代謝物的離子對，提高分析效率，適用于藥代動力學(xué)研究或治療藥物監(jiān)測。3.簡述體內(nèi)藥物分析方法驗證中“專屬性”的考察內(nèi)容及常用驗證手段。答：考察內(nèi)容包括：①空白生物基質(zhì)（如空白血漿）中是否存在干擾分析物檢測的內(nèi)源性物質(zhì)；②代謝物、共存藥物或其代謝物是否對分析物產(chǎn)生干擾；③不同來源或批次的生物基質(zhì)（如不同個體血漿）是否存在基質(zhì)效應(yīng)差異。驗證手段：①進樣空白基質(zhì)樣品，觀察目標(biāo)色譜峰保留時間處是否有干擾峰（要求干擾峰面積≤LLOQ響應(yīng)值的20%）；②進樣含代謝物或共存藥物的樣品，確認無交叉干擾；③采用至少6批不同來源的空白基質(zhì)，考察分析物與內(nèi)標(biāo)峰的分離度（理論板數(shù)、拖尾因子符合要求）。4.說明內(nèi)標(biāo)法在體內(nèi)藥物分析中的作用及內(nèi)標(biāo)物的選擇原則。答：作用：校正生物樣品預(yù)處理過程（如提取回收率、進樣體積誤差）及儀器響應(yīng)的波動，提高定量準(zhǔn)確性。選擇原則：①化學(xué)結(jié)構(gòu)與分析物相似（如同系物、氘代同位素），確保與分析物在預(yù)處理和色譜分離中行為一致；②無內(nèi)源性干擾，在生物樣品中不存在或含量極低；③與分析物色譜保留時間接近（避免色譜條件波動影響）；④穩(wěn)定性好，不與分析物發(fā)生反應(yīng)；⑤同位素內(nèi)標(biāo)需注意同位素豐度（如D3標(biāo)記避免H/D交換）。5.比較尿液與血漿作為生物樣品的優(yōu)缺點（各列舉3點）。答：血漿優(yōu)點：①直接反映藥物在體循環(huán)中的濃度，與藥效/毒性相關(guān)性高；②樣品體積?。ㄍǔ?0200μL即可分析）；③干擾物質(zhì)（如代謝物）較少，預(yù)處理相對簡單。血漿缺點：①需侵入性采樣（靜脈采血），患者依從性差；②藥物濃度受蛋白結(jié)合率影響，游離藥物濃度需額外分離（如超濾）；③半衰期短的藥物可能因采樣時間窗窄導(dǎo)致漏檢。尿液優(yōu)點：①非侵入性采樣，易獲取大體積樣品；②藥物或代謝物濃度高（經(jīng)腎臟排泄?jié)饪s），適合低劑量或長期用藥監(jiān)測；③可反映藥物累積暴露量（通過24小時尿藥排泄量計算）。尿液缺點：①藥物濃度與時間、尿量相關(guān)（需用肌酐校正）；②代謝物復(fù)雜（可能需結(jié)合代謝物鑒定）；③易受pH、細菌污染影響（需冷凍保存）。三、論述題（每題10分，共30分）1.詳述LCMS/MS法測定人血漿中某弱堿性藥物（pKa=8.5，logP=3.2）的方法開發(fā)與驗證流程，需涵蓋色譜條件優(yōu)化、質(zhì)譜參數(shù)選擇及關(guān)鍵驗證參數(shù)。答：方法開發(fā)流程：（1）色譜條件優(yōu)化：①固定相選擇：藥物為弱堿性，logP=3.2（中等脂溶性），優(yōu)先選擇C18或C8色譜柱（保留中等極性化合物）。因pKa=8.5，在中性或弱酸性流動相中主要以離子形式存在，可通過調(diào)節(jié)流動相pH（如pH34，使用0.1%甲酸）抑制電離，增強反相保留；②流動相：有機相（乙腈或甲醇）比例初始設(shè)為10%20%，梯度洗脫至90%以縮短分析時間；③流速：0.30.5mL/min（兼顧柱效與質(zhì)譜離子化效率）；④柱溫：3040℃（提高分離重復(fù)性）。（2）質(zhì)譜參數(shù)選擇：①離子化模式：弱堿性藥物易質(zhì)子化，選擇電噴霧正離子模式（ESI+）；②母離子掃描：通過直接進樣（10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液）全掃描（Q1）確定準(zhǔn)分子離子[M+H]+（如分子量為m，則母離子m/z=m+1）；③子離子掃描：對母離子進行碰撞誘導(dǎo)解離（CID），選擇23個響應(yīng)最強的碎片離子作為定量離子（主離子）和定性離子（輔助離子）；④碰撞能量（CE）優(yōu)化：通過CE掃描（如535eV）確定主離子的最佳CE，使子離子響應(yīng)最大化；⑤掃描方式：采用SRM模式，監(jiān)測母離子→子離子對（如m/z328→154，CE=20eV）。關(guān)鍵驗證參數(shù)：（1）專屬性：取6批不同來源空白血漿，按預(yù)處理方法（如乙腈沉淀蛋白）處理后進樣，確認目標(biāo)峰保留時間處無干擾峰（干擾峰面積≤LLOQ響應(yīng)的20%）；同時考察高濃度代謝物（如O去甲基產(chǎn)物）是否干擾，確保分離度>1.5。（2）線性范圍：配制68個濃度點（覆蓋LLOQ至ULOQ），以分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積比（A/Ais）對濃度（C）進行加權(quán)（1/x2）線性回歸，要求r2≥0.99，殘差≤±15%（LLOQ≤±20%）。（3）精密度與準(zhǔn)確度：低（LLOQ×2）、中（中間濃度）、高（ULOQ×0.8）3個濃度，每天6份，連續(xù)3天，計算日內(nèi)/日間RSD（≤15%，LLOQ≤20%）及相對誤差（RE≤±15%，LLOQ≤±20%）。（4）提取回收率：比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值（A基質(zhì)/A溶劑×100%），3個濃度回收率應(yīng)一致（RSD≤15%），且內(nèi)標(biāo)回收率需與分析物匹配。（5）基質(zhì)效應(yīng)：比較空白基質(zhì)提取物加標(biāo)與純?nèi)軇┘訕?biāo)的響應(yīng)值（A基質(zhì)加標(biāo)/A溶劑加標(biāo)×100%），3個濃度基質(zhì)效應(yīng)因子（ME）應(yīng)在85%115%（RSD≤15%），避免強抑制（ME<85%）或增強（ME>115%）。2.某患者因癲癇長期服用苯妥英鈉（治療窗1020μg/mL），現(xiàn)需進行治療藥物監(jiān)測（TDM），請設(shè)計基于HPLCUV法的血漿樣品分析方案，包括樣品采集與保存、預(yù)處理方法、色譜條件及結(jié)果判讀注意事項。答：分析方案設(shè)計：（1）樣品采集與保存：①采樣時間：需在穩(wěn)態(tài)血藥濃度時采集（通常連續(xù)服藥5個半衰期后，苯妥英鈉半衰期約22小時，故至少服藥5天后）；采樣點為谷濃度（下次服藥前30分鐘）或峰濃度（服藥后24小時，根據(jù)劑型調(diào)整）；②采血管：使用肝素抗凝管（避免EDTA影響色譜柱），采集35mL全血，3000rpm離心10分鐘分離血漿，20℃冷凍保存（避免反復(fù)凍融）。（2）預(yù)處理方法：苯妥英鈉為弱酸性（pKa=8.3），血漿蛋白結(jié)合率高（約90%），需釋放結(jié)合型藥物。采用蛋白沉淀法：取100μL血漿，加入200μL乙腈（含內(nèi)標(biāo)地西泮，濃度10μg/mL），渦旋1分鐘，12000rpm離心10分鐘，取上清液氮氣吹干，用100μL流動相復(fù)溶，0.22μm濾膜過濾后進樣。（3）色譜條件：①色譜柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；②流動相：甲醇水（50:50，v/v），pH3.0（用磷酸調(diào)節(jié)，抑制苯妥英鈉解離，增強保留）；③檢測波長：苯妥英鈉紫外最大吸收波長204nm（或254nm，避免溶劑干擾）；④流速：1.0mL/min；⑤柱溫：30℃；⑥進樣量：20μL。（4）結(jié)果判讀注意事項：①校正蛋白結(jié)合率：因患者可能存在低蛋白血癥（如肝硬化），需同時檢測游離苯妥英鈉濃度（通過超濾法分離），游離濃度治療窗為12μg/mL；②藥物相互作用：苯妥英鈉為CYP2C9/2C19底物，若患者聯(lián)用奧美拉唑（抑制劑）或利福平（誘導(dǎo)劑），需調(diào)整劑量；③非線性藥代動力學(xué)：苯妥英鈉在治療濃度范圍內(nèi)可能出現(xiàn)飽和代謝（米氏動力學(xué)），小劑量增加可能導(dǎo)致血藥濃度顯著升高（如劑量增加10%，濃度可能增加50%），需警惕中毒；④樣品穩(wěn)定性：血漿中苯妥英鈉在20℃可穩(wěn)定3個月，但反復(fù)凍融（>3次）可能降解，需記錄凍融次數(shù)；⑤干擾排除：若患者同時服用卡馬西平（結(jié)構(gòu)相似），需確認色譜分離度（理論板數(shù)>5000，分離度>1.5），避免交叉干擾。3.論述毛發(fā)樣品在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用價值、預(yù)處理難點及解決策略。答：應(yīng)用價值：①長期暴露監(jiān)測：毛發(fā)以約0.30.5mm/天的速度生長，可通過分段分析（如每1cm代表1個月）追溯數(shù)月至數(shù)年的藥物暴露史，適用于毒品濫用（如甲基苯丙胺）、兒童被動吸煙（尼古?。┗蜷L期用藥依從性評估；②非侵入性采樣：無需采血，易獲取，患者依從性高；③抗篡改：毛發(fā)外部包裹角蛋白，藥物一旦進入毛干（通過血液或皮脂腺分泌）難以被外源性污染（除非刻意涂抹），證據(jù)效力強。預(yù)處理難點及解決策略：（1）外源性污染去除：毛發(fā)表面可能附著環(huán)境中的藥物（如二手煙中的尼古?。┗蛳礈鞖埩?，需通過清洗步驟去除。解決策略：采用中性洗滌劑（如十二烷基硫酸鈉）超聲清洗23次，再用去離子水沖洗，最后用甲醇/乙酸乙酯（1:1）洗脫表面污染物，氮氣吹干后剪碎。（2）藥物從毛干中釋放：毛干由角蛋白組成，藥物通過共價結(jié)合（如與半胱氨酸殘基的二硫鍵）或非共價結(jié)合（疏水作用）固定，需破壞角蛋白結(jié)構(gòu)。解決策略：①酸水解：用0.11MHCl在5080℃孵育24小時，斷裂二硫鍵；②酶解：用蛋白酶K（50mMTrisHCl，pH8.0）在37℃消化過夜，溫和釋放藥物；③有機溶劑萃?。航Y(jié)合研磨（液氮冷凍粉碎）增加表面積，用甲醇/乙腈（含1%甲酸）超聲萃取，提高提取效率。（3）基質(zhì)效應(yīng)復(fù)雜：毛發(fā)中含脂類、色素（如黑色素）等，可能干擾LCMS檢測。解決策略：①固相萃取（SPE）：使用C18或混合模式柱（如WCX），去除極性雜質(zhì)；②稀釋后進樣：將提取液用流動相稀釋510倍，降低基質(zhì)離子強度；③同位素內(nèi)標(biāo)校正：如使用氘代藥物（如苯丙胺d5），補償基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的信號波動。（4）定量準(zhǔn)確性：毛發(fā)中藥物濃度與血藥濃度的相關(guān)性受多種因素影響（如種族、毛發(fā)顏色、洗頭頻率），缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)曲線。解決策略：建立本地人群校正數(shù)據(jù)庫，記錄性別、年齡、毛發(fā)顏色等信息；采用配對研究（同一受試者毛發(fā)與血漿濃度對比），確定轉(zhuǎn)換系數(shù)；報告結(jié)果時注明“定性檢測”或“半定量”，避免絕對濃度誤判。四、計算題（每題12.5分，共25分）1.某藥物單次靜脈注射1000mg后，測得不同時間點血漿藥物濃度如下表（假設(shè)為單室模型）：|時間（h）|0.5|1.0|2.0|4.0|6.0|8.0||||||||||濃度（μg/mL）|80|65|45|20|9|4|（1）計算消除速率常數(shù)（k）、半衰期（t1/2）、表觀分布容積（Vd）；（2）若該藥物治療窗為1030μg/mL，計算有效作用時間（血藥濃度維持在治療窗內(nèi)的時長）。答：（1）單室模型靜脈注射后，血藥濃度時間方程為C=C0e^(kt)，取自然對數(shù)得lnC=lnC0kt。以lnC對t線性回歸：計算各時間點lnC：0.5h:ln80≈4.382；1.0h:ln65≈4.174；2.0h:ln45≈3.807；4.0h:ln20≈2.996；6.0h:ln9≈2.197；8.0h:ln4≈1.386。線性回歸參數(shù)：斜率b=(nΣtlnCΣtΣlnC)/(nΣt2(Σt)2)n=6，Σt=0.5+1+2+4+6+8=21.5；ΣlnC=4.382+4.174+3.807+2.996+2.197+1.386=18.942ΣtlnC=0.5×4.382+1×4.174+2×3.807+4×2.996+6×2.197+8×1.386=2.191+4.174+7.614+11.984+13.182+11.088=49.233Σt2=0.25+1+4+16+36+64=121.25b=(6×49.23321.5×18.942)/(6×121.2521.52)=(295.398407.253)/(727.5462.25)=(111.855)/265.25≈0.4217h?1（即k=0.4217h?1）截距a=lnC0=(ΣlnCbΣt)/n=(18.942(0.4217×21.5))/6=(18.942+9.067)/6≈28.009/6≈4.668，故C0=e^4.668≈106.7μg/mL半衰期t1/2=ln2/k≈0.693/0.4217≈1.64h表觀分布容積Vd=劑量/C0=1000mg/106.7μg/mL=1000×103μg/(106.7μg/mL)=9372mL≈9.37L（2）有效作用時間為血藥濃度≥10μg/mL且≤30μg/mL的時長。當(dāng)C=30μg/mL時，t1=(lnC0lnC)/k=(ln106.7ln30)/0.4217=(4.6683.401)/0.4217≈1.267/0.4217≈3.00h當(dāng)C=10μg/mL時，t2=(ln106.7ln10)/0.4217=(4.6682.303)/0.4217≈2.365/0.4217≈5.61h有效作用時間=t2t1=5.613.00≈2.61h（注：需驗證3.00h時濃度是否≤30μg/mL，代入方程C=106.7×e^(0.4217×3)=106.7×e^(1.265)=106.7×0.282≈30.1μg/mL，接近30μg/mL；5.61h時C=106.7×e^(0.4217×5.61)=106.7×e^(2.365)=106.7×0.094≈10.0μg/mL，符合要求）2.某藥物口服后經(jīng)HPLCMS/MS測定，得到以下數(shù)據(jù)：試驗制劑（T）：AUC0∞=3500ng·h/mL，劑量=100mg參比制劑（R）：AUC0∞=3000ng·h/mL，劑量=100mg（靜脈注射）試驗制劑達峰時間（Tmax）=1.5h，峰濃度（Cmax）=500ng/mL參比制劑（靜脈注射）的清除率（Cl）=20L/h（1）計算試驗制劑的絕對生物利用度（Fabs）；（2）若參比制劑為口服溶液（劑量100mg，AUC0∞=2800ng·h/mL），計算試驗制劑的相對生物利用度（Frel）；（3）計算試驗制劑的表觀分布容積（Vd）（假設(shè)為單室模型，且靜脈注射后符合單室模型）。答：（1）絕對生物利用度Fabs=(AUC_T×Dose_R)/(AUC_R×Dose_T)×100%。因參比制劑為靜脈注射（生物利用度100%），Dose_R=Dose_T=100mg，故Fabs=(3500×100)/(3000×100)×100%≈116.7%（注：可能因試驗誤差或制劑特性導(dǎo)致Fabs>100%，需確認是否存在首過效應(yīng)低或檢測誤差）。（2）相對生物利用度Frel=(AUC_T×Dose_R)/(AUC_R×Dose_T)×100%，此時參比制劑為口服溶液（非靜脈），Dose_R=Dose_T=100mg，故Frel=(3500×100)/(2800×100)×100%=125%。（3）靜脈注射參比制劑的清除率Cl=20L/h，根據(jù)單室模型Cl=kVd，而k=ln2/t1/2，但已知Cl=(Dose_R)/AUC_R（靜脈注射時AUC=Dose/(Cl×1000)，注意單位轉(zhuǎn)換：Dose=100mg=100×103μg=100×103ng×10?3mL/L=100×103ng×10?3/1000L=0.1ng·L？需統(tǒng)一單位。正確公式：AUC（ng·h/mL）=(Dose（ng）)/(Cl（mL/h）)，故Cl（mL/h）=Dose（ng）/AUC（ng·h/mL）。參比制劑靜脈注射劑量=100mg=100×10?ng，AUC_R=3000ng·h/mL，故Cl=100×10?ng/3000ng·h/mL≈33333.3mL/h≈33.33L/h（與題目中Cl=20L/h矛盾，可能題目中Cl單位為L/h，需按題目數(shù)據(jù)計算）。題目中參比制劑（靜脈）Cl=20L/h=20×103mL/h，AUC_R=3000ng·h/mL，根據(jù)AUC=Dose/(Cl×1000)（Dose單位為mg，Cl單位為L/h，AUC單位為μg·h/mL），但題目中AUC單位為ng·h/mL，需轉(zhuǎn)換：Dose（ng）=100mg×10?ng/mg=100×10?ngAUC=(Dose)/(Cl×1000)→Cl=Dose/(AUC×1000)=100×10?ng/(3000ng·h/mL×1000mL/L)=100×10?/(3×10?)≈33.33L/h（與題目中Cl=20L/h不符，可能題目假設(shè)Cl已知，直接使用）。單室模型中，靜脈注射后Vd=Dose/(C0)，而C0=AUC×k，k=Cl/Vd→C0=AUC×(Cl/Vd)→Vd=Dose/(AUC×k)。但更簡單的方法：Cl=kVd→Vd=Cl/k。而k=ln2/t1/2，但題目未給t1/2，需通過試驗制劑的AUC計算。試驗制劑口服后，若假設(shè)生物利用度F=1（靜脈），則AUC=Dose/(Cl)→Cl=Dose/AUC=100mg/3000ng·h/mL（單位轉(zhuǎn)換：100mg=100×103μg=100×10?ng，1mL=0.001L，故AUC=3000ng·h/mL=3000×103ng·h/L=3×10?ng·h/L=3μg·h/L），則Cl=100×10?ng/3×10?ng·h/L≈33.33L/h（與題目Cl=20L/h矛盾，可能題目中Cl為已知參數(shù)，直接使用）。題目要求計算試驗制劑的Vd（假設(shè)為單室模型，靜脈注射符合），則Vd=Cl/k。但k=ln2/t1/2，而t1/2可通過靜脈注射參比制劑的AUC和Cl計算：AUC=(Dose)/(Cl)（靜脈注射F=1），故Dose=Cl×AUC=20L/h×3000ng·h/mL=20×103mL/h×3000ng·h/mL=6×10?ng=60mg（與題目中靜脈注射劑量100mg矛盾，說明題目數(shù)據(jù)可能簡化，直接使用公式Vd=(Dose×F)/(AUC×k)不適用，可能題目意圖為Vd