ICS65.020．99

CCSB16

46

海南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB46/T644—2024

咖啡果小蠹分子鑒定技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeformolecularidentificationofcoffeeberryborer

2024-09-23發(fā)布2024-11-01實(shí)施

海南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

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目次

前言................................................................................III

引言.................................................................................IV

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3術(shù)語(yǔ)與定義..........................................................................1

4縮略語(yǔ)..............................................................................1

5咖啡果小蠹基本信息..................................................................1

6原理................................................................................1

7主要儀器設(shè)備和主要試劑..............................................................1

主要儀器設(shè)備....................................................................1

試劑............................................................................2

8分子鑒定操作步驟....................................................................2

樣品處理........................................................................2

DNA提取.........................................................................2

DNA純度和濃度測(cè)定...............................................................2

特異性引物使用..................................................................2

PCR擴(kuò)增反應(yīng).....................................................................2

電泳及測(cè)序......................................................................2

9結(jié)果判定............................................................................2

10樣品保存、復(fù)核與記錄...............................................................2

樣品保存.......................................................................2

復(fù)核...........................................................................2

記錄...........................................................................2

附錄A（資料性）咖啡果小蠹基本信息...................................................3

A.1生物學(xué)特性......................................................................3

A.2傳播途徑........................................................................3

A.3地理分布........................................................................3

A.4寄主............................................................................4

附錄B（規(guī)范性）DNA提取方法及PCR檢測(cè)方法...........................................5

B.1DNA提取方法.....................................................................5

B.2引物序列........................................................................5

B.3擴(kuò)增反應(yīng)體系....................................................................5

B.4擴(kuò)增反應(yīng)條件....................................................................5

I

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B.5PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果.............................................................5

B.6PCR擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果.............................................................6

B.7結(jié)果判定.........................................................................6

II

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的

規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由海南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。

本文件主要起草人：孟倩倩、王政、孫世偉、高圣風(fēng)、茍亞峰、劉世超、田甜、溫思為、薛超。

III

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引言

2019年5月，首次在海南省萬(wàn)寧市興隆地區(qū)咖啡種植園中發(fā)現(xiàn)咖啡果小蠹入侵，標(biāo)本經(jīng)鑒定確定

為咖啡果小蠹，于2019年6月上報(bào)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部。海南地區(qū)作為羅布斯塔咖啡主要產(chǎn)區(qū)，目前在海南

萬(wàn)寧、瓊中、瓊海等地均發(fā)現(xiàn)咖啡果小蠹為害。

依據(jù)外部形態(tài)學(xué)特征對(duì)咖啡果小蠹的鑒定，需要昆蟲(chóng)分類專業(yè)人員和顯微設(shè)備才能鑒別，特別是對(duì)

于卵、幼蟲(chóng)、蛹及特征脫落的殘?bào)w等樣本，存在鑒別難度大、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。

鑒于以上原因，特制定本文件，可顯著提高咖啡果小蠹檢測(cè)效率，為咖啡果小蠹的口岸檢疫、監(jiān)測(cè)

防控提供必要的技術(shù)支撐。

IV

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咖啡果小蠹分子鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了咖啡果小蠹的縮略語(yǔ)、基本信息、原理、儀器和試劑、分子鑒定操作步驟、結(jié)果判定、

樣品保存、復(fù)核與記錄。

本文件適用于植物及其產(chǎn)品中攜帶咖啡果小蠹的檢疫和鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)與定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

mtDNACOI：線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

ddH2O：雙蒸水（doubledistilledH2O）

5咖啡果小蠹基本信息

咖啡果小蠹基本信息見(jiàn)附錄A。

6原理

不同物種間mtDNACOI序列存在片段差異，可根據(jù)種間序列的差異性設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR

擴(kuò)增，獲得對(duì)應(yīng)特異性片段，用于區(qū)分不同物種。根據(jù)咖啡果小蠹mtDNACOI特征，采用所設(shè)計(jì)特異

性引物對(duì)疑似樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用分子手段對(duì)咖啡果小蠹進(jìn)行鑒定。

7主要儀器設(shè)備和主要試劑

主要儀器設(shè)備

研缽、水浴鍋、純水儀、漩渦振蕩器、離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、冷凍冰箱、PCR儀、凝膠成像儀、

微量移液器（0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）、電動(dòng)碾磨器、無(wú)菌濾紙、

無(wú)菌槍頭、離心管等。

1

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試劑

動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒、無(wú)水乙醇、ddH2O、蛋白酶K:ProteinnaseK，PCR反應(yīng)預(yù)混液：2×Taq

PCRMasterMixⅡ、瓊脂糖（電泳純）、TAE緩沖液。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。

8分子鑒定操作步驟

樣品處理

挑取疑似咖啡果小蠹蟲(chóng)體或部分殘?bào)w組織放置在2mL離心管內(nèi)，加入1.5mL無(wú)水乙醇浸泡。

DNA提取

DNA提取方法按照B.1的規(guī)定執(zhí)行。

DNA純度和濃度測(cè)定

用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定DNA的純度與濃度，分別讀取260nm和280nm處的吸收值（記為OD260和

OD280）。DNA的純度計(jì)算方法為OD260/OD280，范圍應(yīng)在1.7～1.9，DNA的濃度為50倍的OD260（μg/mL）。

DNA的濃度與純度應(yīng)符合PCR反應(yīng)的要求。

特異性引物使用

特異性引物序列按照B.2給出的序列。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)

按照B.3、B.4給出的方法執(zhí)行。

電泳及測(cè)序

PCR產(chǎn)物電泳及測(cè)序按照B.5、B.6給出的方法執(zhí)行。

9結(jié)果判定

按照B.7給出的方法執(zhí)行。

10樣品保存、復(fù)核與記錄

樣品保存

用無(wú)水乙醇將樣品浸泡后置于4℃冰箱妥善保存，樣品至少保存6個(gè)月。

復(fù)核

保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)記錄及PCR檢測(cè)結(jié)果等資料的完整性和真實(shí)性，必要時(shí)進(jìn)行復(fù)核實(shí)驗(yàn)。

記錄

記錄樣品的來(lái)源、種類、采樣時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間、地點(diǎn)、方法等，并保存PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果照片。

2

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A

A

附錄A

（資料性）

咖啡果小蠹基本信息

A.1生物學(xué)特性

咖啡果小蠹Hypothenemushampei（Ferrari），英文名coffeeberryborer，屬鞘翅目Coleoptera，

象甲科Curculionidae，小蠹亞科Scolytinae，咪小蠹屬HypothenemusWestwood。其生命周期需經(jīng)歷卵、

幼蟲(chóng)（1齡和2齡）、預(yù)蛹、蛹和成蟲(chóng)5個(gè)階段（見(jiàn)圖A.1）。整個(gè)發(fā)育歷期為25d～60d。

雌成蟲(chóng)在果實(shí)端部開(kāi)始鉆蛀，向內(nèi)啃食形成不規(guī)則的坑道到達(dá)胚乳并產(chǎn)卵，整個(gè)歷期不再飛出果實(shí)，

終生與后代相伴。幼蟲(chóng)孵出后取食果肉和種子胚乳，待其羽化為成蟲(chóng)后可以同胞之間近親交配生殖，隨

后雌成蟲(chóng)飛出坑道尋找新的果實(shí)鉆蛀產(chǎn)卵。雌成蟲(chóng)一天可產(chǎn)卵1～3粒，連續(xù)產(chǎn)20d以上，單雌產(chǎn)卵

量超過(guò)120粒，雌雄性比為10:1。雌成蟲(chóng)發(fā)育歷期為81d～282d，平均131d，雄蟲(chóng)歷期短于雌蟲(chóng)，

為40d～52d。

a）卵b）幼蟲(chóng)

c）蛹d）成蟲(chóng)

圖A.1咖啡果小蠹各發(fā)育歷期蟲(chóng)態(tài)圖

A.2傳播途徑

隨咖啡果、種子、豆及其包裝物遠(yuǎn)距離傳播。近距離傳播主要依靠雌成蟲(chóng)在尋找產(chǎn)卵場(chǎng)所過(guò)程中借

助氣流飛翔傳播，雌成蟲(chóng)飛行時(shí)間為22min～100min，飛行距離為200m～500m。

A.3地理分布

3

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咖啡果小蠹世界主要分布見(jiàn)表A.1。

表A.1咖啡果小蠹世界分布

所屬地域國(guó)別或地區(qū)

中華人民共和國(guó)、印度尼西亞、泰國(guó)、印度、越南、老撾、柬埔寨、馬來(lái)西亞、緬甸、菲律賓、也門、

亞洲

東帝汶、斯里蘭卡、沙特阿拉伯、馬里亞納群島

埃塞俄比亞、剛果民主共和國(guó)、剛果、安哥拉、津巴布韋、馬達(dá)加斯加、哥斯達(dá)黎加、科特迪瓦、布隆

迪、加蓬、加納、赤道幾內(nèi)亞、尼日利亞、盧旺達(dá)、馬拉維、贊比亞、喀麥隆、中非共和國(guó)、貝寧、幾內(nèi)

非洲

亞、肯尼亞、蘇丹、烏干達(dá)、乍得、坦桑尼亞、利比里亞、塞拉利昂、多哥、塞內(nèi)加爾、埃塞俄比亞、扎

伊爾、加納利群島、圣多美和普林西比、莫桑比克、費(fèi)爾南多波動(dòng)群島

大洋洲瓦努阿圖、巴布新幾內(nèi)亞、密克羅尼西亞、斐濟(jì)、新喀利多尼亞、加羅林群島、社會(huì)群島、伊里安島

美國(guó)、巴西、玻利維亞、巴拉圭、秘魯、墨西哥、多米尼亞共和國(guó)、巴拿馬、圭亞那、古巴、厄瓜多爾、

美洲海地、哥倫比亞、薩爾瓦多、危地馬拉、洪都拉斯共和國(guó)、牙買加、尼加拉瓜、特立尼達(dá)拉島和多巴哥、

委內(nèi)瑞拉、多米尼加、波多黎各、蘇里南

A.4寄主

主要寄主為茜草科（Rubiaceae）、豆科（Fabaceae）、禾本科（Poaceae）和薯蕷科（Dioscoreaceae）

等4科11種植物。主要寄主植物見(jiàn)表A.2。

其他寄主為大戟科（Euphorbiaceae）、西番蓮科（Passifloraceae）和棕櫚科（Arecaceae）的部

分植物，但僅作為咖啡果小蠹的食料，不能完成整個(gè)生命周期。

表A.2咖啡果小蠹主要寄主植物

拉丁名

物種名科

CoffeacanephoraPierreex.Fr?hner.

中粒種咖啡茜草科Rubiaceae

Ixorasp.

龍船花屬植物茜草科Rubiaceae

Oxyanthussp.

文殊梔屬植物茜草科Rubiaceae

Psychotriasp.

九節(jié)屬植物茜草科Rubiaceae

ZeamaysL.

玉米禾本科Poaceae

Dioscoreasp.

薯蕷屬植物薯蕷科Dioscoreaceae

Dialiumsp.

摘亞木豆科Fabaceae

Dialiumsp.

酸欖豆屬植物豆科Fabaceae

Gliricidiasepium(Jacq.)

格力豆豆科Fabaceae

Cajanuscajan(L.)Millsp

木豆豆科Fabaceae

Leucaenaleucocephala(Lam.)

銀合歡豆科Fabaceae

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

DNA提取方法及PCR檢測(cè)方法

B.1DNA提取方法

DNA提取方法參照相關(guān)試劑盒，具體步驟如下：

a）將樣品用無(wú)水乙醇清洗5s后，用ddH2O清洗5次，置于滅菌濾紙上晾干，放入1.5mL的離心

管中；

b）加入180μLBufferACL，充分研磨后加入20μLProteinnaseK溶液，震蕩混勻，56℃水浴1h

至細(xì)胞完全裂解；

c）加入200μLBufferCL、200μL無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻；

d）將吸附柱放入收集管中，將上述c）中的懸浮物轉(zhuǎn)入吸附柱中，靜置2min，10000rpm離心1min；

e）倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，加入500μLCW1Solution，10000rpm離心30s；

f）倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μLCW2Solution，10000rpm

離心30s；

g）倒掉收集管廢液后，將吸附柱重新放回收集管中，12000rpm離心2min；

h）將吸附柱蓋子打開(kāi)，室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；

i）取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入50μLCEBuffer靜置3min，12000rpm離心2

min，收集DNA溶液，―20℃保存。

B.2引物序列

引物序列如下：

a）正向引物F：5’—AAGGTGTTGATATAGGATTGGGTCC-3’；

b）反向引物R：5’—CCACTAATACTAGGCGCACCTG-3’。

B.3擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表B.1。陽(yáng)性對(duì)照模板含基因組DNA，陰性對(duì)照模板為雙蒸水ddH2O。

表B.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

組成成分使用量（μL）

疑似樣品基因組DNA模板1

正向引物F0.5

反向引物R0.5

2×TaqPCRMasterMixⅡ12.5

ddH2O5.5

B.4擴(kuò)增反應(yīng)條件

94℃預(yù)變性4min；然后94℃變性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃

延伸10min。

B.5PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果

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