動物繁殖理論與生物技術(shù)

、胚胎移植技術(shù)

?概念

動物胚胎移植（ET）：是將一頭優(yōu)秀母畜配種后的早期胚胎用手術(shù)或非手術(shù)的方法取出，在顯微鏡下檢出后，移植到另一頭同種并且生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個(gè)體的技術(shù)，也稱借腹懷胎。

提供胚胎的個(gè)體——供體接受胚胎的個(gè)體——受體第一節(jié)概述

1890年劍橋大學(xué)WalterHeape從一頭純種安哥拉母兔取出2個(gè)4細(xì)胞胚胎，移植到一頭純種比利時(shí)母兔輸卵管上端(用同種公兔交配后3h),結(jié)果生出了4只比利時(shí)種仔兔和2只純種安哥拉仔兔。這一結(jié)果說明早期發(fā)育的胚胎更換到另一個(gè)體的輸卵管(或子宮角)內(nèi)，如果胚胎的發(fā)育階段和所處的環(huán)境條件相適應(yīng)，它完全可以繼續(xù)正常發(fā)育，并成長為一個(gè)新個(gè)體。一、胚胎移植發(fā)展概況胚胎移植大事記

ET開始于60年代，主要發(fā)展開始于70年代后期，先后在兔、綿羊、牛、馬、山羊、豬等動物方面試驗(yàn)成功。

目前以牛的ET工作做得最多，主要是高產(chǎn)奶牛和優(yōu)良肉牛，特別是從國外進(jìn)口的優(yōu)良肉牛品種胚胎。

目前我國的波爾山羊的ET達(dá)國際先進(jìn)水平。我國的ET2005年3月29日，通過胚胎移植技術(shù)，山西本地山羊產(chǎn)下兩只純種南非產(chǎn)波爾小羊羔。這是羊“媽媽”帶著沒有一點(diǎn)血緣關(guān)系的羊“孩子”在曬太陽。波爾山羊具有體格大、生長快、屠宰率高等優(yōu)點(diǎn)。成年公羊：110kg成年母羊：60kg而我國本土普通成年公山羊:50-60kg，普通成年母山羊:40kg1、充分發(fā)揮優(yōu)良母牛的繁殖潛力2、縮短世代間隔，及早進(jìn)行后裔測定3、提高生產(chǎn)效率，誘發(fā)肉牛產(chǎn)雙胎。4、代替種畜引種5、保存品種的資源6、作為研究手段7、通過胚胎移植進(jìn)行奶牛品種改良8、利用胚胎移植進(jìn)行純種奶牛擴(kuò)繁二、胚胎移植的意義與原理(一）胚胎移植的意義(二）胚胎移植的原理

1、母畜發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育：母畜發(fā)情后數(shù)日甚至10余日內(nèi)，生殖系統(tǒng)的變化相同，即在相同的時(shí)期，生理狀態(tài)一致，子宮內(nèi)的環(huán)境相同。

2、早期胚胎的游離狀態(tài)：早期胚胎有透明帶的保護(hù)，可以機(jī)械性的移位而不受損害。

3、胚胎移植不存在免疫問題。由于胎盤屏障的保護(hù)和妊娠時(shí)母體免疫機(jī)能發(fā)生的變化，胚胎可以在受體母畜子宮內(nèi)存活，正常發(fā)育至分娩。

4、胚胎的遺傳特性不受受體母畜的影響。胚胎的遺傳特性和性別在母畜體內(nèi)受精時(shí)就已經(jīng)決定了，受體母畜只是給移入的胚胎提供了一個(gè)孕育的環(huán)境，胚胎的遺傳特性不受受體母畜的影響。三、胚胎移植的基本原則

1、胚胎移植前后所處環(huán)境的同一性：指胚胎移植后的生活環(huán)境和胚胎的發(fā)育階段相適應(yīng)：（1）供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性；（2）供體和受體生理上的一致性，即發(fā)情時(shí)間的同期性；（3）動物解剖部位上的一致性，即胚胎移植前后于生殖道內(nèi)的位置要相同。

2、胚胎發(fā)育期限。胚胎的采集和移植時(shí)間不能遲于周期黃體的壽命，更不能遲于開始附植時(shí)，一般在周期黃體開始退化前幾天，在供體發(fā)情配種后3~8d內(nèi)收集胚胎，受體也在相同時(shí)間接受ET。

3、胚胎的質(zhì)量。在胚胎收集和移植的全部操作過程中，胚胎不能受到任何不良因素（物理、化學(xué)、病原）的影響而危及生命力，經(jīng)鑒定確認(rèn)發(fā)育正常的胚胎才能移植。四、胚胎移植的技術(shù)程序1、供體母畜

不僅應(yīng)具備優(yōu)良的遺傳品質(zhì)，而且其生殖機(jī)能還需要處于較高的水平。牛、豬產(chǎn)后兩個(gè)月以上才能作為供體。2、受體母畜

雖不要求具有優(yōu)良的遺傳品質(zhì)，但應(yīng)該具有良好的繁殖性能和健康體態(tài)，體型中等以上。供體與受體的發(fā)情時(shí)間應(yīng)該相同，前后差異不超過1d。必要是時(shí)對供、受體進(jìn)行同期發(fā)情處理。（一）供、受體的選擇（二）供體的超數(shù)排卵1、根據(jù)母牛自然發(fā)情周期進(jìn)行超排所用激素：FSH、PG牛超排方法：時(shí)間第1天第5天第6天第7天第8天第9天第10天早上7時(shí)放栓雌二醇2mg孕酮100mgFSH4mlFSH3mlFSH4mlPG4mgFSH1ml發(fā)情人工授精晚上7時(shí)FSH4mlFSH3mlFSH2ml撤栓FSH1ml人工授精2、利用陰道栓人工控制卵泡波進(jìn)行超排（三）受體的同情發(fā)情1、前列腺素處理法PGF2a或氯前列烯醇時(shí)間：早于供體牛1d方法：間隔約12天，兩次注射。PGF2α有溶解黃體的作用，從而引起發(fā)情，所以只對卵巢上存在黃體的受體有效。在情期第9天以后，注射PGF2α，?？稍谧⑸浜?-3天內(nèi)發(fā)情(WHY?)。對于不能確定發(fā)情周期的受體，可采用間隔10-12天的兩次注射法。此方法方便可靠，但費(fèi)用較高。為何要進(jìn)行兩次注射？s母牛發(fā)情周期第7-17天，對前列腺素（PG）有反應(yīng)2、孕激素處理法方法：耳部埋植，9—12天取管。孕酮能夠抑制腺垂體釋放FSH，每日肌注或口服孕酮，或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮或其類似物，一般處理12-18天后，可以抑制卵泡發(fā)育。停止處理或撤除海綿栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡發(fā)育，通常在2-3天內(nèi)發(fā)情。為了提高排卵的效率，在孕激素處理結(jié)束的前一天，可以給予小劑量的FSH。此法費(fèi)用低，但處理時(shí)間長。（四）胚胎的采集1、采卵時(shí)間2、常規(guī)采卵法（1）牛的非手術(shù)收集胚胎可利用三路式導(dǎo)管沖卵器。外管前端連接以氣囊，當(dāng)將沖卵器插入子宮內(nèi)時(shí)，充氣使氣囊脹大，堵住子宮頸內(nèi)口以免沖洗液經(jīng)子宮頸流出。將沖洗液通過內(nèi)管注入子宮角內(nèi)，然后由另一導(dǎo)管導(dǎo)出沖洗液。（2）每側(cè)子宮角需沖洗100-150ml。沖洗液的導(dǎo)出應(yīng)順暢，并盡可能回收全部注入的容量。母牛非手術(shù)沖卵示意圖牛的非手術(shù)法回收胚胎a.沖卵液b.硬膜外麻醉c.插入子宮中的Foley管d.子宮頸3、子宮體沖卵法4、供體母牛采卵后的處理向子宮內(nèi)注射抗菌素或前列腺素沖卵管通過子宮頸后，充氣把部卵管拉緊，固定在宮體和子宮頸內(nèi)。子宮充滿液體后回收，按摩子宮角前端，兩角同時(shí)回收，反復(fù)5~6次。子宮角回收的液體較多，可以通過專用胚胎漏斗除去多余的沖卵液，在連續(xù)變倍解剖顯微鏡（實(shí)體顯微鏡）下進(jìn)行檢胚；胚胎的質(zhì)量評定：主要采用形態(tài)學(xué)方法，優(yōu)質(zhì)胚胎才能用于進(jìn)行胚胎冷凍或移植。（五）胚胎的鑒定與保存胚胎評定發(fā)育正常的胚胎未受精卵或異常胚胎2-cell4-cell8-cell16-cellMorulaBlastocyst正常胚胎的形態(tài)胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時(shí)間體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中胚胎的保存第二節(jié)胚胎移植重點(diǎn)應(yīng)檢查子宮和卵巢的異常情況以及子宮的緊張性，然后檢查卵巢上黃體的發(fā)育情況（位置、大?。?，只有黃體發(fā)育良好者才能正式列為待移植母牛，并記錄和在牛臀部標(biāo)出黃體位于左右哪一側(cè)。牛站立保定于六柱欄保定架內(nèi)，用2%鹽酸利多卡因或普魯卡因進(jìn)行薦尾椎硬膜外麻醉，用18號針頭，每只牛約5ml。1、受體母牛的準(zhǔn)備非手術(shù)移植1、胚胎裝管將胚胎裝入0.25ml的塑料細(xì)管內(nèi)；

1.1ml注射器2.裝管接頭3.細(xì)管A.棉塞B.氣泡Ⅰ、Ⅲ、保護(hù)液Ⅱ.含胚段裝管器械和裝管方法胚胎裝管圖