CXCR7蛋白表達(dá)調(diào)控對(duì)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞命運(yùn)的影響：增殖與遷移的分子機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymalStemCells，MSC）作為一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。MSC廣泛存在于骨髓、脂肪、臍帶等多種組織中，其多向分化潛能使其能夠在特定誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，在骨損傷修復(fù)中，MSC可分化為成骨細(xì)胞促進(jìn)新骨形成；在軟骨損傷治療時(shí)，能分化為軟骨細(xì)胞修復(fù)受損軟骨組織。同時(shí)，MSC還具有免疫調(diào)節(jié)特性，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制T細(xì)胞過(guò)度活化、調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖和抗體分泌以及影響樹突狀細(xì)胞成熟等，在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療中發(fā)揮作用。此外，MSC的旁分泌作用也不可忽視，它能分泌多種生物活性因子，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和組織修復(fù)，調(diào)節(jié)局部微環(huán)境。MSC治療效果在很大程度上依賴于其增殖和遷移能力。足夠的細(xì)胞數(shù)量是發(fā)揮治療作用的基礎(chǔ)，較強(qiáng)的增殖能力可使MSC在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增，滿足治療需求。而遷移能力則決定了MSC能否準(zhǔn)確歸巢到受損組織部位，進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)和再生功能。在心肌梗死治療中，MSC需遷移至受損心肌部位，通過(guò)分化為心肌細(xì)胞或分泌生物活性因子促進(jìn)血管新生，改善心臟功能；在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中，MSC遷移到傷口處，促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖和遷移，加速傷口愈合。若MSC增殖和遷移能力受限，其治療效果將大打折扣。CXC趨化因子受體7（CXCchemokinereceptor7，CXCR7）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、3個(gè)細(xì)胞外環(huán)和3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)組成，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)，這些修飾對(duì)受體穩(wěn)定性、定位和功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。CXCR7的主要配體是CXC趨化因子12（CXCL12，也稱為SDF-1）和CXC趨化因子11（CXCL11），與其他趨化因子受體不同，它與配體結(jié)合具有高親和力，且能快速內(nèi)化和再循環(huán)，有效調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)趨化因子的反應(yīng)。在細(xì)胞生理和病理過(guò)程中，CXCR7發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育時(shí)，CXCR7參與引導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞、造血干細(xì)胞等多種細(xì)胞的遷移和歸巢，對(duì)器官形成和組織發(fā)育意義重大；在成年個(gè)體中，它參與淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的遷移，在炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和免疫監(jiān)視等過(guò)程中發(fā)揮作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞分泌的CXCL12等趨化因子可激活腫瘤微環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞上的CXCR7，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)支持，且CXCR7在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活、遷移和侵襲以及調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和免疫逃逸，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在炎癥性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病中，CXCR7及其配體CXCL12表達(dá)水平上調(diào)，參與炎癥細(xì)胞募集和組織損傷過(guò)程。目前，關(guān)于CXCR7對(duì)MSC增殖和遷移能力的影響研究尚處于初步階段。雖然已有研究表明趨化因子受體參與調(diào)節(jié)不同微環(huán)境中MSCs的增殖和遷移，CXCR7作為新發(fā)現(xiàn)的CXCL12受體，具有腫瘤遷移的器官特異性，但具體作用機(jī)制仍不明確。明確CXCR7對(duì)MSC增殖和遷移能力的影響及作用機(jī)制，有助于深入了解MSC的生物學(xué)特性，為提高M(jìn)SC治療效果提供理論依據(jù)和新的策略。通過(guò)調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)，有可能優(yōu)化MSC治療方案，增強(qiáng)MSC在受損組織部位的聚集和修復(fù)能力，從而為多種疾病的治療帶來(lái)新的突破。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，科研人員較早關(guān)注到趨化因子受體對(duì)干細(xì)胞行為的調(diào)控。有研究表明，在胚胎發(fā)育微環(huán)境中，CXCR7通過(guò)與CXCL12相互作用，引導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞、造血干細(xì)胞等遷移和歸巢，奠定了CXCR7在細(xì)胞遷移領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)CXCR7在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，如在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)激活下游信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，這為研究其在MSC遷移中的作用提供了思路。在MSC相關(guān)研究中，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)MSC表面表達(dá)多種趨化因子受體，這些受體參與調(diào)節(jié)MSC在不同微環(huán)境中的增殖和遷移。對(duì)于CXCR7，有實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了過(guò)表達(dá)和抑制CXCR7修飾的mMSCs系，結(jié)果表明CXCR7基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)mMSCs增殖和遷移，抑制CXCR7則產(chǎn)生相反效果，且過(guò)表達(dá)CXCR7增加了MSC分泌的CXCL12、VCAM-1、CD44和MMP2水平，促進(jìn)了mMSC增殖和遷移，揭示了CXCR7與MSC增殖和遷移之間的正向關(guān)聯(lián)及可能的作用途徑。國(guó)內(nèi)研究緊跟國(guó)際步伐，在間充質(zhì)干細(xì)胞和CXCR7研究方面取得諸多成果。在MSC特性和應(yīng)用研究上，深入探索了MSC在骨損傷修復(fù)、自身免疫性疾病治療等方面的機(jī)制，明確了MSC治療效果與增殖、遷移能力的緊密聯(lián)系。在CXCR7研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)其在炎癥性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病中表達(dá)上調(diào)，參與炎癥細(xì)胞募集和組織損傷過(guò)程，拓展了對(duì)CXCR7功能的認(rèn)知。針對(duì)CXCR7與MSC的關(guān)系，國(guó)內(nèi)有研究從臍帶中提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs），發(fā)現(xiàn)促進(jìn)CXCR7高表達(dá)可提高h(yuǎn)UC-MSCs遷移活性，如大豆甾醇B可通過(guò)促進(jìn)CXCR7表達(dá)顯著增強(qiáng)hUC-MSCs的遷移能力，為提高M(jìn)SC遷移能力提供了新的方法和物質(zhì)基礎(chǔ)。在信號(hào)通路研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者致力于探究CXCR7調(diào)節(jié)MSC增殖和遷移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)激活PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚未完全明確。盡管國(guó)內(nèi)外在CXCR7對(duì)MSC增殖和遷移能力影響方面取得一定進(jìn)展，但仍存在不足。目前研究多集中在體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)研究相對(duì)較少，對(duì)于CXCR7在體內(nèi)復(fù)雜生理病理環(huán)境下對(duì)MSC增殖和遷移的影響缺乏深入了解。研究多關(guān)注單一細(xì)胞類型或組織來(lái)源的MSC，不同組織來(lái)源MSC對(duì)CXCR7調(diào)控反應(yīng)的差異研究不足，難以全面揭示CXCR7作用的普遍性和特殊性。此外，CXCR7調(diào)節(jié)MSC增殖和遷移的信號(hào)通路及分子機(jī)制尚未完全明晰，在信號(hào)通路上下游分子的相互作用、關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子的調(diào)控等方面仍需深入研究。1.3研究目的和創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過(guò)調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)，深入探究其對(duì)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）增殖和遷移能力的影響，并進(jìn)一步闡明其潛在作用機(jī)制。具體而言，將構(gòu)建過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)CXCR7的小鼠MSC細(xì)胞模型，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，檢測(cè)MSC增殖和遷移能力的變化。同時(shí)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡、實(shí)時(shí)定量PCR等方法，分析相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)和活性變化，以揭示CXCR7調(diào)節(jié)MSC增殖和遷移的分子機(jī)制。在研究方法上，本研究創(chuàng)新性地綜合運(yùn)用多種前沿技術(shù)。采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CXCR7蛋白表達(dá)的穩(wěn)定調(diào)控，相較于傳統(tǒng)基因操作方法，慢病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高、可整合到宿主基因組等優(yōu)勢(shì)，能夠更有效地建立穩(wěn)定表達(dá)模型。在檢測(cè)MSC增殖和遷移能力時(shí)，除了常規(guī)的CCK-8法、Transwell小室實(shí)驗(yàn)外，還引入活細(xì)胞成像技術(shù)，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MSC在不同條件下的增殖和遷移過(guò)程，為研究提供更直觀、連續(xù)的數(shù)據(jù)。從研究視角來(lái)看，本研究突破以往局限，全面考慮CXCR7在不同微環(huán)境下對(duì)MSC增殖和遷移的影響。設(shè)置多種模擬生理病理微環(huán)境，如炎癥微環(huán)境、低氧微環(huán)境等，觀察CXCR7調(diào)控MSC行為的變化，有助于更深入了解MSC在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中的生物學(xué)特性，為臨床應(yīng)用提供更貼近實(shí)際的理論依據(jù)。本研究還關(guān)注不同組織來(lái)源MSC對(duì)CXCR7調(diào)控反應(yīng)的差異，選取骨髓、脂肪等多種組織來(lái)源的MSC進(jìn)行研究，有助于全面揭示CXCR7作用的普遍性和特殊性，為針對(duì)不同組織來(lái)源MSC的個(gè)性化治療策略提供理論基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）概述間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymalStemCells，MSC）作為成體干細(xì)胞家族中的重要成員，在再生醫(yī)學(xué)、組織工程及免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，吸引了眾多科研工作者的關(guān)注。MSC最早于1968年由Friedenstein等人在小鼠骨髓中發(fā)現(xiàn)，起初因其貼壁生長(zhǎng)且形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，被命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，MSC并非僅存在于骨髓，還廣泛分布于脂肪、臍帶、胎盤、牙髓等多種組織中。從來(lái)源上看，MSC起源于發(fā)育早期的中胚層，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，中胚層的部分細(xì)胞逐漸分化形成具有多向分化潛能的MSC，這些細(xì)胞隨著個(gè)體發(fā)育，遷移并定位于不同組織，為組織的生長(zhǎng)、修復(fù)和維持提供細(xì)胞儲(chǔ)備。MSC具有一系列獨(dú)特的生物學(xué)特性。其強(qiáng)大的自我更新能力是維持干細(xì)胞庫(kù)穩(wěn)定的關(guān)鍵，在體外培養(yǎng)條件下，MSC能夠不斷分裂增殖，同時(shí)保持未分化狀態(tài)，多次傳代后仍能維持干細(xì)胞特性。在適宜的誘導(dǎo)條件下，MSC展現(xiàn)出令人矚目的多向分化潛能，可分化為多種細(xì)胞類型，如在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下，MSC能夠分化為成骨細(xì)胞，參與骨組織的形成與修復(fù)，通過(guò)合成和分泌骨基質(zhì)蛋白，促進(jìn)鈣鹽沉積，構(gòu)建新的骨小梁結(jié)構(gòu)；在軟骨誘導(dǎo)環(huán)境中，MSC可轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，分泌軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖，用于修復(fù)受損的軟骨組織，改善關(guān)節(jié)功能；在脂肪誘導(dǎo)體系里，MSC能分化為脂肪細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)逐漸積累脂滴，形成成熟脂肪細(xì)胞的典型形態(tài)和功能。免疫調(diào)節(jié)功能是MSC的另一大顯著特性。MSC可通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸以及分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，MSC能夠抑制T細(xì)胞的過(guò)度活化，減少促炎細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌，降低免疫細(xì)胞對(duì)自身組織的攻擊；調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖和抗體分泌，維持體液免疫平衡，避免過(guò)度免疫應(yīng)答導(dǎo)致的組織損傷；影響樹突狀細(xì)胞的成熟和功能，削弱其抗原提呈能力，進(jìn)而抑制免疫反應(yīng)的啟動(dòng)。在組織修復(fù)和再生過(guò)程中，MSC發(fā)揮著不可或缺的作用。以心肌梗死為例，MSC移植到受損心肌部位后，一方面可分化為心肌樣細(xì)胞，補(bǔ)充受損心肌細(xì)胞，改善心肌收縮功能；另一方面通過(guò)旁分泌作用分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等生物活性因子，促進(jìn)血管新生，為心肌組織提供充足的血液供應(yīng)，減少梗死面積，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)。在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中，MSC遷移至傷口處，分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF），促進(jìn)皮膚細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口愈合，減少瘢痕形成。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如脊髓損傷的治療研究中，MSC可分化為神經(jīng)細(xì)胞，或通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF），促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化和軸突再生，改善神經(jīng)功能。此外，MSC還具有低免疫原性和免疫逃逸特性。MSC表面主要組織相容性復(fù)合物（MHC）I類分子表達(dá)水平較低，MHCII類分子通常不表達(dá)，這使得其在異體移植時(shí)不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊，降低了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生概率，為臨床異體移植治療提供了有利條件。2.2CXCR7蛋白的結(jié)構(gòu)與功能CXCR7蛋白，作為CXC趨化因子受體家族中的重要成員，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它多樣且關(guān)鍵的生物學(xué)功能。從結(jié)構(gòu)上看，CXCR7由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，這些跨膜結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜中呈α-螺旋狀穿插排列，形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的跨膜通道結(jié)構(gòu)，是受體與配體結(jié)合以及信號(hào)傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在跨膜結(jié)構(gòu)域之間，分布著3個(gè)細(xì)胞外環(huán)和3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)。細(xì)胞外環(huán)在維持受體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與配體結(jié)合的特異性方面發(fā)揮著重要作用，其氨基酸序列和空間構(gòu)象決定了CXCR7能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合其配體。而細(xì)胞內(nèi)環(huán)則主要參與與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子的相互作用，是將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵部位。CXCR7的N端位于細(xì)胞外，這一區(qū)域富含多種修飾位點(diǎn)，如糖基化位點(diǎn)。糖基化修飾能夠增加N端的親水性，保護(hù)N端免受蛋白酶的降解，維持受體的穩(wěn)定性，還可能影響受體與配體的結(jié)合親和力，調(diào)節(jié)受體的功能。C端位于細(xì)胞內(nèi)，同樣具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)在受體激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)CXCR7與配體結(jié)合后，C端的磷酸化位點(diǎn)會(huì)被相應(yīng)的蛋白激酶磷酸化，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)趨化因子信號(hào)的應(yīng)答。CXCR7的主要配體為CXC趨化因子12（CXCL12，又稱SDF-1）和CXC趨化因子11（CXCL11）。與其他趨化因子受體相比，CXCR7與配體的結(jié)合具有高親和力，這種高親和力使得CXCR7能夠在低濃度配體環(huán)境下有效捕捉配體，從而激活下游信號(hào)通路。CXCR7還具有快速內(nèi)化和再循環(huán)的特點(diǎn)，當(dāng)與配體結(jié)合形成復(fù)合物后，受體-配體復(fù)合物能夠迅速被細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行一系列的處理后，受體又能夠重新回到細(xì)胞膜表面，繼續(xù)參與信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，這種快速內(nèi)化和再循環(huán)機(jī)制保證了細(xì)胞對(duì)趨化因子信號(hào)的持續(xù)響應(yīng)和精確調(diào)控。在細(xì)胞遷移和歸巢過(guò)程中，CXCR7發(fā)揮著不可或缺的作用。在胚胎發(fā)育階段，CXCR7參與引導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞、造血干細(xì)胞等多種細(xì)胞的遷移和歸巢。以神經(jīng)嵴細(xì)胞為例，在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)嵴細(xì)胞需要從神經(jīng)管遷移到身體的各個(gè)部位，分化形成多種細(xì)胞類型，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞等。CXCR7與配體CXCL12相互作用，為神經(jīng)嵴細(xì)胞提供遷移方向和動(dòng)力，使其能夠準(zhǔn)確遷移到預(yù)定位置，完成正常的發(fā)育過(guò)程。若CXCR7功能缺失或異常，神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和歸巢將受到阻礙，可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形等嚴(yán)重后果。在成年個(gè)體中，CXCR7參與淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的遷移，在炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和免疫監(jiān)視等過(guò)程中發(fā)揮作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，炎癥部位會(huì)分泌大量的CXCL12，吸引表達(dá)CXCR7的淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞向炎癥部位遷移。淋巴細(xì)胞的遷移有助于增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能，清除病原體；內(nèi)皮細(xì)胞的遷移則參與血管生成和組織修復(fù)過(guò)程，促進(jìn)炎癥部位的愈合。在血管生成方面，CXCR7通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)血管生成。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)分泌CXCL12等趨化因子，激活腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞上的CXCR7，從而促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)支持。腫瘤細(xì)胞不斷生長(zhǎng)需要充足的血液供應(yīng)，腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的CXCL12與內(nèi)皮細(xì)胞表面的CXCR7結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，這些新生血管為腫瘤細(xì)胞提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了通道。在正常生理狀態(tài)下，CXCR7也參與調(diào)節(jié)血管生成，維持血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，確保組織器官獲得充足的血液供應(yīng)。2.3MSC增殖及遷移能力的相關(guān)理論MSC的增殖和遷移能力在多種生理病理過(guò)程中扮演著舉足輕重的角色，受到多種復(fù)雜因素的精密調(diào)控。在生理狀態(tài)下，MSC的增殖是維持組織穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞更新的關(guān)鍵機(jī)制。以骨髓組織為例，骨髓中的MSC通過(guò)不斷增殖，為造血微環(huán)境提供必要的支持細(xì)胞，維持造血干細(xì)胞的自我更新和分化，確保血細(xì)胞的正常生成。在皮膚組織中，MSC的增殖參與皮膚細(xì)胞的更新?lián)Q代，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)皮膚受到輕微損傷時(shí)，局部的MSC迅速增殖，補(bǔ)充受損的細(xì)胞，促進(jìn)傷口愈合。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，MSC的遷移對(duì)于器官形成和組織發(fā)育至關(guān)重要。例如，在心臟發(fā)育過(guò)程中，MSC從原始心血管系統(tǒng)遷移到特定位置，分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等，參與心臟結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，MSC遷移到神經(jīng)組織，為神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化提供支持，促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成。在病理狀態(tài)下，如組織損傷和疾病發(fā)生時(shí)，MSC的增殖和遷移能力被進(jìn)一步激活。當(dāng)機(jī)體遭受創(chuàng)傷、缺血性損傷或炎癥等病理刺激時(shí)，受損組織會(huì)釋放一系列趨化因子和生長(zhǎng)因子，如CXCL12、VEGF、PDGF等，這些因子能夠吸引MSC向損傷部位遷移。以心肌梗死為例，心肌缺血壞死區(qū)域會(huì)分泌大量的CXCL12，表達(dá)CXCR4、CXCR7等趨化因子受體的MSC在CXCL12的趨化作用下，從骨髓等組織遷移至受損心肌部位。到達(dá)損傷部位后，MSC在局部微環(huán)境的刺激下，迅速增殖并分化為心肌樣細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，參與心肌組織的修復(fù)和血管新生，改善心臟功能。在炎癥性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，炎癥關(guān)節(jié)部位產(chǎn)生的趨化因子吸引MSC遷移至關(guān)節(jié)腔，MSC通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)增殖分化為軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞，修復(fù)受損的關(guān)節(jié)組織。MSC的增殖和遷移能力受到多種調(diào)控機(jī)制和因素的影響。內(nèi)在調(diào)控機(jī)制方面，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白起著關(guān)鍵作用。如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）組成的復(fù)合物，通過(guò)磷酸化和去磷酸化作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，控制MSC的增殖。當(dāng)MSC受到生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，CyclinD與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，啟動(dòng)DNA合成和細(xì)胞增殖。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子如Oct4、Sox2和Nanog等，在維持MSC的自我更新和增殖能力中發(fā)揮重要作用，它們通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，維持MSC的干性和增殖潛能。外在調(diào)控因素主要包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等。ECM作為細(xì)胞生存的微環(huán)境，為MSC提供物理支撐和信號(hào)傳導(dǎo)平臺(tái)。ECM中的膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等成分，通過(guò)與MSC表面的整合素受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖。例如，纖連蛋白可以與MSC表面的整合素α5β1結(jié)合，激活FAK-Src信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖。細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)MSC增殖和遷移的重要外在信號(hào)分子。如前文所述的CXCL12，通過(guò)與MSC表面的CXCR4、CXCR7受體結(jié)合，激活PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)MSC的遷移。VEGF不僅能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，還能刺激MSC的增殖和遷移，在組織修復(fù)和血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）可以與MSC表面的PDGF受體結(jié)合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)MSC的增殖和遷移，參與組織修復(fù)和再生。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6小鼠，6-8周齡，體重20-25g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：[具體許可證號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。細(xì)胞株：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mBMSCs），由本實(shí)驗(yàn)室前期分離培養(yǎng)并保存。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone，美國(guó)）的α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液一次，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。主要試劑：慢病毒載體及包裝質(zhì)粒：過(guò)表達(dá)CXCR7的慢病毒載體（pHBLV-CMVIE-CXCR7-ZsGreen-T2A-puromycin）和抑制CXCR7表達(dá)的慢病毒載體（pHBLV-U6-shCXCR7-ZsGreen-T2A-puromycin）由[公司名稱]構(gòu)建并包裝；包裝質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G購(gòu)自Addgene（美國(guó)）。轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，美國(guó)）。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)）、青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone，美國(guó)）、胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，HyClone，美國(guó)）。檢測(cè)試劑：CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Dojindo，日本）、Transwell小室（Corning，美國(guó)，8.0μm孔徑）、Matrigel基質(zhì)膠（Corning，美國(guó)）、RIPA裂解液（碧云天，中國(guó)）、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，中國(guó)）、SDS凝膠制備試劑盒（碧云天，中國(guó)）、PVDF膜（Millipore，美國(guó)）、CXCR7抗體（Abcam，英國(guó)）、β-actin抗體（CellSignalingTechnology，美國(guó)）、HRP標(biāo)記的二抗（JacksonImmunoResearch，美國(guó)）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific，美國(guó)）、TRIzol試劑（Invitrogen，美國(guó)）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本）。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，美國(guó)）、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰，中國(guó)）、倒置顯微鏡（Olympus，日本）、低速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）。核酸及蛋白分析儀器：PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad，美國(guó)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）、電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國(guó)）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，中國(guó)）。其他儀器：酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific，美國(guó)）、移液器（Eppendorf，德國(guó)）、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、96孔板、24孔板、6孔板等。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控小鼠MSC中CXCR7蛋白表達(dá)。根據(jù)小鼠CXCR7基因序列（GenBank登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]），設(shè)計(jì)并合成過(guò)表達(dá)CXCR7的慢病毒載體（pHBLV-CMVIE-CXCR7-ZsGreen-T2A-puromycin）和抑制CXCR7表達(dá)的慢病毒載體（pHBLV-U6-shCXCR7-ZsGreen-T2A-puromycin），由專業(yè)公司進(jìn)行構(gòu)建和包裝。將構(gòu)建好的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G按照一定比例（如慢病毒載體：pSPAX2：pMD2G=4：3：1）混合，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將293FT細(xì)胞以[X]個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將混合好的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5分鐘后混合均勻，繼續(xù)室溫孵育20分鐘，然后將混合液加入到含有293FT細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為新鮮的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48小時(shí)和72小時(shí)后分別收集含有慢病毒的上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，使用超速離心機(jī)在[具體轉(zhuǎn)速和時(shí)間]條件下進(jìn)行濃縮，得到高滴度的慢病毒液。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠MSC以[X]個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%-40%時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI），向細(xì)胞中加入適量的過(guò)表達(dá)或抑制CXCR7的慢病毒液，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（polybrene），輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12-16小時(shí)后，更換為新鮮的含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（ZsGreen）的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，使用含有2μg/mL嘌呤霉素的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每2-3天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選1-2周，直至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部死亡，獲得穩(wěn)定表達(dá)或抑制CXCR7的小鼠MSC細(xì)胞株。采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）方法驗(yàn)證CXCR7在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。提取對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染慢病毒的小鼠MSC）、過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CXCR7慢病毒的小鼠MSC）和抑制組（轉(zhuǎn)染抑制CXCR7慢病毒的小鼠MSC）細(xì)胞的總RNA，使用TRIzol試劑按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。將提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本）在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）上進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列根據(jù)小鼠CXCR7基因設(shè)計(jì)，上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因β-actin的上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算CXCR7mRNA的相對(duì)表達(dá)量。提取對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和抑制組細(xì)胞的總蛋白，使用RIPA裂解液（碧云天，中國(guó)）在冰上裂解細(xì)胞30分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，中國(guó)）測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，100℃煮沸10分鐘使蛋白變性。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，將分離后的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore，美國(guó)）上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入兔抗小鼠CXCR7抗體（Abcam，英國(guó)，1:1000稀釋）和兔抗小鼠β-actin抗體（CellSignalingTechnology，美國(guó)，1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（JacksonImmunoResearch，美國(guó)，1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific，美國(guó)）進(jìn)行顯影，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，中國(guó)）上曝光成像，分析CXCR7蛋白的表達(dá)水平。3.2.2小鼠MSC增殖能力的檢測(cè)方法采用CCK-8法檢測(cè)小鼠MSC的增殖能力。將對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和抑制組的小鼠MSC以3000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑（Dojindo，日本），繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時(shí)，具體培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，以確保吸光度值在合適的檢測(cè)范圍內(nèi)。使用酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific，美國(guó)）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值（OD值），同時(shí)在650nm波長(zhǎng)處測(cè)量參考吸光度值，用于扣除背景。在培養(yǎng)后的第1天、第3天、第5天和第7天分別進(jìn)行檢測(cè)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，通過(guò)GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，分析不同組小鼠MSC的增殖情況。CCK-8法的原理基于細(xì)胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，WST-8被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)，間接反映細(xì)胞的增殖能力。采用EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證小鼠MSC的增殖能力。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中。將對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和抑制組的小鼠MSC以[X]個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔中加入終濃度為10μM的EdU溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，使EdU摻入到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞中。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未摻入的EdU。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.5%TritonX-100破膜10分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。按照EdU檢測(cè)試劑盒（RiboBio，中國(guó)）說(shuō)明書，加入含Apollo?染色液的反應(yīng)液，室溫避光孵育30分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入DAPI染液，室溫避光孵育10分鐘，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，PBS洗滌3次，每次5分鐘。在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，DAPI染色的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，即EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，以此評(píng)估不同組小鼠MSC的增殖能力。3.2.3小鼠MSC遷移能力的檢測(cè)方法采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠MSC的遷移能力。Transwell小室（Corning，美國(guó)，8.0μm孔徑）分為上下兩室，上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基。將Matrigel基質(zhì)膠（Corning，美國(guó)）用無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋后，取50μL加入到Transwell小室的上室，均勻鋪在小室底部，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠凝固，形成人工基底膜，用于模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力；若不鋪Matrigel基質(zhì)膠，則用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和抑制組的小鼠MSC用無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加入600μL含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基作為趨化因子來(lái)源。將Transwell小室置于24孔板中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室遷移到膜表面的細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.1%結(jié)晶紫染液染色15-20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)，分析不同組小鼠MSC的遷移能力。采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠MSC的遷移能力。將對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和抑制組的小鼠MSC以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%。用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕時(shí)保持力度均勻，確保劃痕寬度一致。用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入含有1%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后的0小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)分別在倒置顯微鏡下拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率，遷移率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%，通過(guò)比較不同組的遷移率，評(píng)估小鼠MSC的遷移能力。四、調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)對(duì)小鼠MSC增殖能力的影響4.1過(guò)表達(dá)CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖的促進(jìn)作用為探究過(guò)表達(dá)CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖能力的影響，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。將構(gòu)建成功的過(guò)表達(dá)CXCR7的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠MSC，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在不同時(shí)間點(diǎn)（第1天、第3天、第5天和第7天）檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值（OD值），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)第1天，過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組的OD值無(wú)顯著差異，表明此時(shí)兩組細(xì)胞增殖狀態(tài)基本一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，從第3天開始，過(guò)表達(dá)組的OD值明顯高于對(duì)照組，且在第5天和第7天差異更為顯著（P<0.05），說(shuō)明過(guò)表達(dá)CXCR7能夠促進(jìn)小鼠MSC的增殖，使其增殖速度明顯加快。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)。將過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的小鼠MSC培養(yǎng)后，加入EdU溶液，使正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞摻入EdU。通過(guò)熒光顯微鏡觀察，過(guò)表達(dá)組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組（P<0.05），直觀地表明過(guò)表達(dá)CXCR7促進(jìn)了小鼠MSC進(jìn)入DNA合成期（S期），從而增加了細(xì)胞的增殖能力。在相關(guān)信號(hào)通路和分子機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CXCR7后，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K和Akt的磷酸化水平，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），表明CXCR7過(guò)表達(dá)促進(jìn)了PI3K的活化，進(jìn)而激活A(yù)kt蛋白，使Akt發(fā)生磷酸化。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)下游一系列與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，如增加細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合，促進(jìn)Rb蛋白磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。過(guò)表達(dá)CXCR7還影響了MAPK信號(hào)通路。檢測(cè)p-ERK1/2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明CXCR7過(guò)表達(dá)激活了MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2激酶，使其發(fā)生磷酸化。激活的ERK1/2可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Fos、c-Jun等，這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。過(guò)表達(dá)CXCR7可能通過(guò)上調(diào)一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，間接促進(jìn)小鼠MSC的增殖。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這些生長(zhǎng)因子可以與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，如VEGF與VEGFR結(jié)合后，激活PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖；PDGF與PDGFR結(jié)合，激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。4.2抑制CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖的抑制作用在明確過(guò)表達(dá)CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖具有促進(jìn)作用后，本研究進(jìn)一步探究抑制CXCR7表達(dá)對(duì)小鼠MSC增殖能力的影響。將抑制CXCR7表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠MSC，設(shè)立未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在第1天、第3天、第5天和第7天測(cè)量細(xì)胞的OD值并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，第1天抑制組與對(duì)照組的OD值無(wú)明顯差異。但從第3天起，抑制組的OD值顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，第5天和第7天的差異更為顯著，表明抑制CXCR7表達(dá)會(huì)抑制小鼠MSC的增殖，使其增殖速度明顯減緩。EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。抑制組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P<0.05），直觀地表明抑制CXCR7表達(dá)阻礙了小鼠MSC進(jìn)入DNA合成期（S期），進(jìn)而降低了細(xì)胞的增殖能力。在信號(hào)通路變化方面，抑制CXCR7表達(dá)后，PI3K/Akt信號(hào)通路的活性受到抑制。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制組中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），表明CXCR7表達(dá)被抑制后，PI3K的活化受到抑制，Akt蛋白的磷酸化水平降低，使得PI3K/Akt信號(hào)通路無(wú)法有效激活，影響了下游與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程受阻，抑制了細(xì)胞增殖。抑制CXCR7表達(dá)還影響了MAPK信號(hào)通路。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑制組中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明CXCR7表達(dá)被抑制后，MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2激酶磷酸化水平降低，激活受到抑制。無(wú)法有效激活的ERK1/2難以進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，從而抑制了細(xì)胞增殖。抑制CXCR7表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，間接抑制小鼠MSC的增殖。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制組中VEGF、PDGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這些生長(zhǎng)因子表達(dá)的降低，使得細(xì)胞表面相應(yīng)受體無(wú)法有效激活，下游信號(hào)通路難以啟動(dòng)，無(wú)法為細(xì)胞增殖提供必要的信號(hào)刺激，進(jìn)而抑制了小鼠MSC的增殖。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與討論本研究通過(guò)CCK-8法和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)對(duì)小鼠MSC增殖能力的影響，所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)組在第3天、第5天和第7天的OD值與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖有顯著促進(jìn)作用；抑制組在第3天、第5天和第7天的OD值顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明抑制CXCR7表達(dá)可顯著抑制小鼠MSC增殖。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，過(guò)表達(dá)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組（P<0.05），抑制組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。本研究結(jié)果與前人相關(guān)研究具有一致性。Liu等人構(gòu)建過(guò)表達(dá)和抑制CXCR7修飾的mMSCs系，發(fā)現(xiàn)CXCR7基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)mMSCs增殖和遷移，抑制CXCR7則產(chǎn)生相反效果，與本研究中過(guò)表達(dá)CXCR7促進(jìn)小鼠MSC增殖、抑制CXCR7抑制小鼠MSC增殖的結(jié)果一致。另有研究利用慢病毒構(gòu)建過(guò)表達(dá)CXCR7的UCMSCs，證實(shí)CXCR7基因促進(jìn)UCMSCs的增殖和遷移，進(jìn)一步支持了本研究結(jié)論。本研究深入探討了CXCR7調(diào)控小鼠MSC增殖的生物學(xué)意義。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，MSC治療效果依賴于足夠的細(xì)胞數(shù)量，過(guò)表達(dá)CXCR7可促進(jìn)MSC增殖，能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，滿足治療需求。在組織損傷修復(fù)中，受損組織需要大量MSC增殖分化來(lái)修復(fù)，如心肌梗死時(shí)，促進(jìn)CXCR7表達(dá)使MSC大量增殖并遷移至受損心肌部位，分化為心肌樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)心肌修復(fù)和血管新生，改善心臟功能；在骨損傷修復(fù)中，增殖的MSC可分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)新骨形成。抑制CXCR7表達(dá)抑制MSC增殖，從反面證明CXCR7在維持MSC增殖能力方面的重要性，也為研究MSC增殖調(diào)控機(jī)制提供了反向研究思路。在信號(hào)通路方面，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CXCR7激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，抑制CXCR7則抑制這兩條信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、存活和代謝中起關(guān)鍵作用，Akt磷酸化激活后可調(diào)節(jié)下游多種與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)。本研究結(jié)果表明，CXCR7可能通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)小鼠MSC增殖；抑制CXCR7表達(dá)則抑制這兩條信號(hào)通路，阻礙細(xì)胞增殖相關(guān)調(diào)節(jié)，抑制小鼠MSC增殖。本研究也存在一定局限性。僅在體外細(xì)胞水平研究CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖的影響，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，未來(lái)需構(gòu)建動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究體內(nèi)環(huán)境下CXCR7對(duì)MSC增殖的調(diào)控作用及機(jī)制。本研究未深入探討CXCR7與其他信號(hào)通路或分子的相互作用，后續(xù)研究可關(guān)注此方面，以全面揭示CXCR7調(diào)控MSC增殖的分子機(jī)制。五、調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)對(duì)小鼠MSC遷移能力的影響5.1過(guò)表達(dá)CXCR7對(duì)小鼠MSC遷移的增強(qiáng)作用為深入探究過(guò)表達(dá)CXCR7對(duì)小鼠MSC遷移能力的影響，本研究采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，將過(guò)表達(dá)CXCR7的小鼠MSC（過(guò)表達(dá)組）和對(duì)照組小鼠MSC分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基作為趨化因子來(lái)源，培養(yǎng)24小時(shí)后，計(jì)數(shù)遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)CXCR7能夠明顯增強(qiáng)小鼠MSC的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。將過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的小鼠MSC培養(yǎng)至融合度達(dá)到80%-90%后進(jìn)行劃痕處理，分別在劃痕后的0小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)拍照并測(cè)量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率發(fā)現(xiàn)，在12小時(shí)和24小時(shí)，過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)CXCR7促進(jìn)了小鼠MSC在劃痕損傷區(qū)域的遷移，加快了劃痕愈合速度。在分子機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CXCR7后，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，這與細(xì)胞遷移密切相關(guān)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使招募并激活A(yù)kt蛋白，使其發(fā)生磷酸化。激活的Akt可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞遷移，例如調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促使絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）聚合形成偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力；抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，保證細(xì)胞在遷移過(guò)程中的存活。過(guò)表達(dá)CXCR7還激活了MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2激酶。檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)組中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。激活的ERK1/2可以磷酸化一系列下游底物，包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，ERK1/2通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子如c-Fos、c-Jun等的活性，促進(jìn)與細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞遷移開辟路徑，從而促進(jìn)小鼠MSC的遷移。過(guò)表達(dá)CXCR7可能通過(guò)上調(diào)一些與細(xì)胞遷移相關(guān)的因子表達(dá)，促進(jìn)小鼠MSC的遷移。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1，即CXCL12）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、CD44和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）等因子的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。SDF-1與其受體CXCR7結(jié)合后，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞遷移；VCAM-1和CD44參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或其他細(xì)胞的黏附過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移；MMP2能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白等成分，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造有利條件。5.2抑制CXCR7對(duì)小鼠MSC遷移的抑制作用為探究抑制CXCR7表達(dá)對(duì)小鼠MSC遷移能力的影響，本研究同樣采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，將抑制CXCR7表達(dá)的小鼠MSC（抑制組）和對(duì)照組小鼠MSC分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基作為趨化因子來(lái)源，培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)數(shù)遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，抑制組遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P<0.05），表明抑制CXCR7表達(dá)能夠明顯減弱小鼠MSC的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。將抑制組和對(duì)照組的小鼠MSC培養(yǎng)至融合度達(dá)到80%-90%后進(jìn)行劃痕處理，分別在劃痕后的0小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)拍照并測(cè)量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率發(fā)現(xiàn)，在12小時(shí)和24小時(shí)，抑制組的細(xì)胞遷移率顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明抑制CXCR7表達(dá)抑制了小鼠MSC在劃痕損傷區(qū)域的遷移，減緩了劃痕愈合速度。從分子機(jī)制角度分析，抑制CXCR7表達(dá)后，PI3K/Akt信號(hào)通路的活性受到顯著抑制。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制組中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。PI3K活性抑制導(dǎo)致PIP3生成減少，無(wú)法有效招募并激活A(yù)kt蛋白，使得Akt磷酸化水平降低。Akt活性降低后，無(wú)法正常調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，F(xiàn)-actin聚合受阻，偽足形成減少，細(xì)胞遷移能力隨之減弱；Akt對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的抑制作用也減弱，細(xì)胞在遷移過(guò)程中的凋亡風(fēng)險(xiǎn)增加，進(jìn)一步影響細(xì)胞遷移。抑制CXCR7表達(dá)還導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2激酶激活受到抑制。檢測(cè)結(jié)果表明，抑制組中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。ERK1/2激酶無(wú)法有效激活，使得其下游底物的磷酸化水平降低，轉(zhuǎn)錄因子如c-Fos、c-Jun等的活性受到抑制，與細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)減少，MMPs等酶的表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)降解能力減弱，阻礙了小鼠MSC的遷移。抑制CXCR7表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)一些與細(xì)胞遷移相關(guān)的因子表達(dá)，抑制小鼠MSC的遷移。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑制組中SDF-1、VCAM-1、CD44和MMP2等因子的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。SDF-1表達(dá)下調(diào)，減少了與CXCR7的結(jié)合，無(wú)法有效激活下游信號(hào)通路，抑制細(xì)胞遷移；VCAM-1和CD44表達(dá)降低，影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)或其他細(xì)胞的黏附，阻礙細(xì)胞遷移；MMP2表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解能力下降，細(xì)胞遷移的物理屏障無(wú)法有效清除，從而抑制小鼠MSC的遷移。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與討論本研究通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)調(diào)控CXCR7蛋白表達(dá)對(duì)小鼠MSC遷移能力的影響，所得數(shù)據(jù)同樣采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)組遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組（P<0.05），抑制組遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P<0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)中，在12小時(shí)和24小時(shí)，過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），抑制組的細(xì)胞遷移率顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這表明過(guò)表達(dá)CXCR7可增強(qiáng)小鼠MSC遷移能力，抑制CXCR7表達(dá)則減弱其遷移能力。本研究結(jié)果與Liu等人的研究結(jié)果一致，他們構(gòu)建過(guò)表達(dá)和抑制CXCR7修飾的mMSCs系，發(fā)現(xiàn)CXCR7基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)mMSCs遷移，抑制CXCR7產(chǎn)生相反效果。還有學(xué)者構(gòu)建過(guò)表達(dá)CXCR7的UCMSCs，證實(shí)CXCR7基因促進(jìn)UCMSCs遷移，進(jìn)一步支持本研究結(jié)論。從生物學(xué)意義角度來(lái)看，在再生醫(yī)學(xué)和組織修復(fù)領(lǐng)域，MSC的遷移能力至關(guān)重要。在心肌梗死治療中，MSC需要遷移到受損心肌部位，發(fā)揮修復(fù)作用。過(guò)表達(dá)CXCR7增強(qiáng)MSC遷移能力，有助于MSC更快速、有效地到達(dá)受損心肌，促進(jìn)心肌修復(fù)和血管新生，改善心臟功能。在神經(jīng)損傷修復(fù)中，增強(qiáng)MSC遷移能力，使其能更好地遷移到損傷神經(jīng)部位，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、分化和軸突再生，改善神經(jīng)功能。抑制CXCR7表達(dá)抑制MSC遷移，從反面證明CXCR7在維持MSC遷移能力方面的關(guān)鍵作用，也為研究MSC遷移調(diào)控機(jī)制提供反向研究思路。在信號(hào)通路方面，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CXCR7激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，抑制CXCR7則抑制這兩條信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路激活后，Akt磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）聚合形成偽足，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力；抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活性，保證細(xì)胞在遷移過(guò)程中的存活。MAPK信號(hào)通路中ERK1/2激活后，磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)與細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞遷移開辟路徑。本研究結(jié)果表明，CXCR7可能通過(guò)激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞凋亡以及相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)小鼠MSC遷移；抑制CXCR7表達(dá)則抑制這兩條信號(hào)通路，阻礙細(xì)胞遷移相關(guān)調(diào)節(jié)，抑制小鼠MSC遷移。本研究也存在局限性。體外實(shí)驗(yàn)雖能在一定程度上揭示CXCR7對(duì)小鼠MSC遷移的影響及機(jī)制，但與體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境存在差異。未來(lái)需構(gòu)建動(dòng)物模型，研究體內(nèi)環(huán)境下CXCR7對(duì)MSC遷移的調(diào)控作用及機(jī)制。本研究未深入探討CXCR7與其他趨化因子受體或信號(hào)通路的相互作用，后續(xù)研究可關(guān)注此方面，以全面揭示CXCR7調(diào)控MSC遷移的分子機(jī)制。六、CXCR7蛋白表達(dá)調(diào)控影響小鼠MSC增殖及遷移能力的機(jī)制探討6.1相關(guān)信號(hào)通路的研究CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖和遷移能力的調(diào)控涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路，其中PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、存活、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。當(dāng)CXCR7與配體CXCL12或CXCL11結(jié)合后，受體構(gòu)象發(fā)生改變，激活下游的PI3K。PI3K是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成的異源二聚體，激活后的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使招募并激活A(yù)kt蛋白，使其發(fā)生磷酸化。在小鼠MSC中，過(guò)表達(dá)CXCR7后，PI3K的活性增強(qiáng)，p-PI3K和p-Akt的表達(dá)量顯著增加，激活的Akt通過(guò)調(diào)節(jié)下游一系列與細(xì)胞周期和遷移相關(guān)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。Akt可以磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），抑制其活性，從而穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1），促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖；Akt還能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，促進(jìn)絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）聚合形成偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。抑制CXCR7表達(dá)則導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路活性降低，p-PI3K和p-Akt表達(dá)減少，細(xì)胞增殖和遷移受到抑制。MAPK信號(hào)通路也是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括ERK1/2、JNK和p38MAPK等多個(gè)亞家族，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在CXCR7調(diào)控小鼠MSC增殖和遷移的過(guò)程中，ERK1/2信號(hào)通路被激活。當(dāng)CXCR7被激活后，通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Ras蛋白，Ras進(jìn)一步激活Raf蛋白，Raf激活MEK1/2，MEK1/2再激活ERK1/2，使其發(fā)生磷酸化。在過(guò)表達(dá)CXCR7的小鼠MSC中，p-ERK1/2的表達(dá)量顯著升高，激活的ERK1/2可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Fos、c-Jun等，這些轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。c-Fos和c-Jun可以形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，結(jié)合到基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造條件；ERK1/2還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。抑制CXCR7表達(dá)后，ERK1/2信號(hào)通路的激活受到抑制，p-ERK1/2表達(dá)減少，細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖和遷移能力減弱。CXCR7還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路和分子，間接影響小鼠MSC的增殖和遷移能力。CXCR7與配體結(jié)合后，可能激活PLCγ信號(hào)通路，PLCγ水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG），IP3促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶等，DAG激活蛋白激酶C（PKC），這些信號(hào)通路的激活可能進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移。CXCR7還可能與其他趨化因子受體如CXCR4等相互作用，形成異源二聚體或多聚體，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)趨化因子的反應(yīng)，影響細(xì)胞的增殖和遷移能力。6.2相關(guān)因子的作用研究在CXCR7對(duì)小鼠MSC增殖和遷移能力的調(diào)控過(guò)程中，CXCL12、VCAM-1、CD44和MMP2等因子發(fā)揮著重要作用。CXCL12作為CXCR7的主要配體之一，在這一調(diào)控機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。當(dāng)CXCL12與CXCR7結(jié)合后，能夠激活一系列下游信號(hào)通路，從而影響小鼠MSC的增殖和遷移。在增殖方面，CXCL12-CXCR7軸激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究表明，在體外培養(yǎng)的小鼠MSC中，添加外源性CXCL12可顯著增加細(xì)胞增殖速率，而過(guò)表達(dá)CXCR7后，這種促進(jìn)作用更為明顯，表明CXCL12與CXCR7的結(jié)合能夠有效促進(jìn)小鼠MSC的增殖。在遷移過(guò)程中，CXCL12-CXCR7信號(hào)通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)細(xì)胞遷移。如在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，加入CXCL12后，過(guò)表達(dá)CXCR7的小鼠MSC遷移到膜下表面的細(xì)胞數(shù)顯著增加，說(shuō)明CXCL12與CXCR7結(jié)合能夠增強(qiáng)小鼠MSC的遷移能力。VCAM-1和CD44作為細(xì)胞黏附分子，在CXCR7調(diào)控小鼠MSC增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。VCAM-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，CD44則廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面，包括MSC。在CXCR7的作用下，小鼠MSC中VCAM-1和CD44的表達(dá)上調(diào)。VCAM-1通過(guò)與MSC表面的整合素α4β1結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)MSC穿越血管壁遷移到損傷組織部位。研究發(fā)現(xiàn)，抑制VCAM-1的表達(dá)后，過(guò)表達(dá)CXCR7的小鼠MSC遷移能力顯著下降，表明VCAM-1在CXCR7促進(jìn)MSC遷移過(guò)程中不可或缺。CD44與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸等成分結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和遷移。在小鼠MSC中，CXCR7過(guò)表達(dá)導(dǎo)致CD44表達(dá)增加，增強(qiáng)了MSC與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，為細(xì)胞遷移提供了穩(wěn)定的支撐點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞遷移。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，敲低CD44表達(dá)后，過(guò)表達(dá)CXCR7的小鼠MSC劃痕愈合速度明顯減慢，證明CD44在CXCR7調(diào)控MSC遷移中的重要作用。MMP2作為一種基質(zhì)金屬蛋白酶，在CXCR7影響小鼠MSC增殖和遷移中也發(fā)揮著重要作用。MMP2能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，為細(xì)胞遷移開辟路徑。在CXCR7過(guò)表達(dá)的小鼠MSC中，MMP2的表達(dá)水平顯著升高。研究表明，CXCR7通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，上調(diào)MMP2基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，加入MMP2抑制劑后，過(guò)表達(dá)CXCR7的小鼠MSC遷移能力明顯降低，說(shuō)明MMP2在CXCR7促進(jìn)MSC遷移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MMP2還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，影響細(xì)