Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的影響機制探究一、引言1.1研究背景傳染性支氣管炎病毒（InfectiousBronchitisVirus，IBV）是引起雞傳染性支氣管炎的病原體，屬于冠狀病毒科γ冠狀病毒屬。該病毒具有高度的變異性和廣泛的組織嗜性，可感染雞的呼吸道、消化道、泌尿生殖道等多個器官系統(tǒng)，給全球養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經濟損失。IBVM41株是IBV的經典毒株之一，自1931年在美國首次分離以來，在世界各地廣泛傳播，對雞群的健康構成了嚴重威脅。CEK細胞，即雞胚腎細胞（ChickenEmbryoKidneyCells），是研究IBV感染機制和病毒-宿主相互作用的常用細胞模型。CEK細胞來源于雞胚的腎臟組織，具有易于培養(yǎng)、生長迅速、對IBV敏感等優(yōu)點。在IBV研究中，CEK細胞被廣泛應用于病毒的增殖、毒力測定、疫苗研發(fā)以及抗病毒藥物的篩選等方面。通過在CEK細胞上進行IBV感染實驗，可以深入了解病毒的吸附、侵入、復制、裝配和釋放等過程，為揭示IBV的致病機制提供重要的實驗依據(jù)。Bestatin，又稱烏苯美司（Ubenimex），是一種從橄欖網狀鏈霉菌（Streptomycesolivoreticuli）培養(yǎng)液中分離得到的低分子二肽化合物。它是一種廣譜、競爭性的氨肽酶抑制劑，能夠抑制多種氨肽酶的活性，包括氨肽酶N（APN/CD13）等。在病毒感染研究領域，Bestatin的作用機制主要與病毒的吸附和侵入過程相關。已有研究表明，APN作為人冠狀病毒HCoV-229E和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）表面的受體，在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。Bestatin通過抑制APN的活性，可以阻斷這些病毒與宿主細胞表面受體的結合，從而抑制病毒的感染。此外，Bestatin還具有免疫調節(jié)作用，能夠增強機體的免疫力，間接發(fā)揮抗病毒作用。在腫瘤治療領域，Bestatin常作為抗癌化療、放療的輔助藥物，用于增強患者的免疫功能，提高治療效果。在病毒感染性疾病的研究中，Bestatin也逐漸受到關注，其對IBVM41株感染CEK細胞的影響值得深入探究。神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）是流感病毒等多種病毒表面的一種重要糖蛋白，在病毒感染過程中扮演著關鍵角色。NA的主要功能是催化宿主細胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液酸殘基水解，從而促進病毒粒子從感染細胞表面釋放，實現(xiàn)病毒的傳播和擴散。對于流感病毒而言，NA是現(xiàn)有抗流感藥物（如奧司他韋等）的主要作用靶點之一。這些藥物通過抑制NA的活性，阻止新產生的病毒顆粒從感染細胞中釋放，從而限制病毒的傳播和感染。在IBV感染研究中，雖然IBV與流感病毒屬于不同的病毒科，但NA在病毒感染過程中的作用機制具有一定的共性。研究NA對IBVM41株感染CEK細胞的影響，有助于深入了解IBV的感染和傳播機制，為開發(fā)新型抗IBV藥物提供理論基礎。此外，NA的活性變化還可能與IBV的毒力、致病性以及宿主的免疫應答等方面存在關聯(lián)，進一步探究其作用機制具有重要的科學意義和應用價值。肝素酶Ⅲ（HeparinaseIII）是一種能夠特異性降解硫酸乙酰肝素（HeparanSulfate，HS）的多糖裂解酶，主要來源于肝素黃桿菌（Flavobacteriumheparinum）等微生物。HS是一種廣泛存在于細胞表面和細胞外基質中的糖胺聚糖，它在細胞間相互作用、信號傳導、病毒感染等多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。在病毒感染方面，HS可以作為多種病毒的受體或輔助受體，介導病毒與宿主細胞的吸附和侵入。肝素酶Ⅲ通過降解HS，破壞病毒與宿主細胞表面HS的結合位點，從而抑制病毒的感染。例如，在單純皰疹病毒（HSV）、登革熱病毒等病毒感染研究中，肝素酶Ⅲ已被證實能夠有效抑制病毒的感染和復制。在IBV感染研究中，探究肝素酶Ⅲ對IBVM41株感染CEK細胞的影響，有助于揭示IBV與宿主細胞表面分子的相互作用機制，為開發(fā)針對IBV的抗病毒策略提供新的思路和方法。此外，肝素酶Ⅲ在腫瘤治療、心血管疾病等領域也具有潛在的應用價值，對其在病毒感染研究中的深入探索，將進一步拓展其應用范圍和研究領域。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的影響，揭示這三種物質在病毒感染過程中的具體作用機制，為防控雞傳染性支氣管炎提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。在病毒感染機制研究方面，盡管目前對IBV的感染過程有了一定的了解，但病毒與宿主細胞相互作用的分子機制仍存在許多未知之處。Bestatin作為氨肽酶抑制劑，其對IBV感染的影響尚未明確，研究其作用機制有助于揭示病毒吸附和侵入宿主細胞的分子途徑，以及氨肽酶在這一過程中的潛在作用。對于NA，雖然在流感病毒感染中研究較為深入，但在IBV感染中的作用機制研究相對較少。探究NA對IBVM41株感染CEK細胞的影響，能夠豐富我們對IBV感染和傳播機制的認識，為開發(fā)針對IBV的抗病毒藥物提供新的靶點和思路。肝素酶Ⅲ對硫酸乙酰肝素的降解作用，為研究IBV與宿主細胞表面分子的相互作用提供了新的視角。通過研究肝素酶Ⅲ對IBVM41株感染CEK細胞的影響，有望揭示HS在IBV感染過程中的具體作用機制，以及病毒利用宿主細胞表面分子進行感染的策略。在防控雞傳染性支氣管炎方面，雞傳染性支氣管炎給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經濟損失，目前的防控措施主要依賴于疫苗接種和生物安全措施，但由于IBV的高度變異性，現(xiàn)有疫苗的保護效果受到一定限制。本研究結果可能為開發(fā)新型抗IBV藥物或治療策略提供理論支持。如果能夠明確Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ對IBV感染的影響機制，就有可能基于這些機制開發(fā)出特異性的抗病毒藥物，通過抑制病毒的吸附、侵入或釋放等關鍵環(huán)節(jié)，阻斷病毒的感染和傳播，從而有效防控雞傳染性支氣管炎的發(fā)生和流行。此外，本研究還有助于優(yōu)化現(xiàn)有的防控策略。例如，通過了解這三種物質對IBV感染的影響，我們可以在疫苗研發(fā)過程中考慮引入相關的免疫靶點，提高疫苗的免疫效果；或者在養(yǎng)殖過程中，通過調節(jié)雞體內相關物質的水平，增強雞群對IBV的抵抗力，降低感染風險。綜上所述，研究Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的影響，不僅具有重要的理論意義，能夠深化我們對病毒感染機制的認識，還具有廣泛的應用價值，為雞傳染性支氣管炎的防控提供新的策略和方法，對保障養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞與病毒CEK細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該細胞來源于10日齡SPF雞胚的腎臟組織，經胰蛋白酶消化后，進行原代培養(yǎng)和傳代，從而建立了CEK細胞系。CEK細胞呈上皮樣形態(tài)，具有貼壁生長的特性，在適宜的培養(yǎng)條件下，生長迅速，可用于多種病毒感染實驗。細胞復蘇后，用含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次傳代，傳代比例為1:2至1:3，以維持細胞的良好生長狀態(tài)。當細胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)實驗。在本實驗中，使用處于第4-6代的CEK細胞，以確保細胞的生物學特性穩(wěn)定且對病毒感染敏感。IBVM41株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，該毒株是雞傳染性支氣管炎病毒的經典毒株之一，具有典型的冠狀病毒形態(tài)特征，呈球形或橢圓形，有囊膜，表面有纖突。IBVM41株具有較強的致病性，可引起雞的呼吸道、腎臟等組織病變，在雞群中傳播迅速，對養(yǎng)雞業(yè)危害較大。病毒保存于-80℃冰箱，使用前從冰箱取出，在冰浴中緩慢融化。將病毒接種于9-11日齡SPF雞胚的尿囊腔，37℃孵育48-72小時，收獲雞胚尿囊液，經多次凍融后，離心去除沉淀，取上清液作為病毒液，測定其半數(shù)雞胚感染量（EID??）。在本實驗中，使用EID??為10?.?/0.1mL的病毒液進行感染實驗，以保證病毒感染的有效性和實驗結果的可靠性。2.1.2主要試劑Bestatin（烏苯美司）購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，為白色結晶粉末，以無菌PBS溶解配制成100mmol/L的儲存液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱，使用時根據(jù)實驗需求進行稀釋。神經氨酸酶（NA）購自ProSpec公司，來源于流感病毒，活性≥5000U/mg，為凍干粉形式。使用無菌水溶解配制成1mg/mL的儲存液，分裝后保存于-80℃冰箱，避免反復凍融。實驗時，根據(jù)不同實驗設計，將其稀釋至所需濃度。肝素酶Ⅲ購自北京阿斯雷爾生物技術有限公司，來源于肝素黃桿菌，比活性＞200IU/mg，為溶液形態(tài)，主要成分是肝素酶I和磷酸緩沖溶液。儲存于-20℃冰箱，使用時直接取出，按實驗要求進行稀釋。胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，經過嚴格的質量檢測，無支原體、細菌、病毒等污染，內毒素含量低，可支持細胞的良好生長和增殖。高糖DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，含有豐富的營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖類等，可為細胞提供適宜的生長環(huán)境。胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）購自Solarbio公司，用于細胞的消化傳代。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Beyotime公司，青霉素終濃度為100U/mL，鏈霉素終濃度為100μg/mL，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。MTT試劑購自Sigma-Aldrich公司，為黃色粉末，用無菌PBS配制成5mg/mL的溶液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，避光保存于4℃冰箱，用于細胞活力檢測。DMSO（二甲基亞砜）購自國藥集團化學試劑有限公司，分析純，用于溶解MTT結晶和配制藥物稀釋液。TRIzol試劑購自Invitrogen公司，用于提取細胞中的總RNA。逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，可高效地將RNA逆轉錄為cDNA，并進行精確的實時熒光定量PCR檢測，以分析病毒基因的表達水平。2.1.3實驗儀器CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific），型號為3111，可精確控制溫度為37℃，CO?濃度為5%，濕度為95%，為細胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。超凈工作臺（蘇州凈化），型號為SW-CJ-2FD，采用垂直流送風方式，可有效過濾空氣中的塵埃和微生物，保證實驗操作的無菌環(huán)境。倒置顯微鏡（Olympus），型號為CKX41，配備有高分辨率的物鏡和目鏡，可對細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)進行實時觀察和記錄。低速離心機（Eppendorf），型號為5804R，最大轉速可達14000rpm，用于細胞懸液的離心沉淀和上清液的分離。酶標儀（Bio-Rad），型號為680，可在多種波長下檢測吸光度值，用于MTT法檢測細胞活力和ELISA實驗中檢測抗體水平。實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems），型號為7500，具有高靈敏度和準確性，可對病毒基因的表達進行精確的定量分析。核酸蛋白測定儀（ThermoScientific），型號為Nanodrop2000，可快速、準確地測定核酸和蛋白質的濃度及純度。純水儀（Millipore），型號為Milli-QIntegral10，可制備高純度的去離子水，用于實驗試劑的配制和儀器的清洗。2.2實驗方法2.2.1CEK細胞培養(yǎng)與IBVM41株感染模型建立將凍存的CEK細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速解凍。解凍后的細胞懸液轉移至含有5mL含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天，當細胞匯合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液潤洗細胞兩次，加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓并開始脫落時，加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞，使其均勻分散，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的CEK細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁生長。將IBVM41株病毒液從-80℃冰箱取出，冰浴融化后，用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度（根據(jù)預實驗確定的最佳感染復數(shù)，如MOI=0.1）。棄去96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100μL稀釋后的病毒液，設正常細胞對照組（只加入等量的含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基），置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中吸附1-2小時，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細胞充分接觸。吸附結束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞3次，去除未吸附的病毒，每孔加入200μL含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（如6、12、24、36、48小時等），通過倒置顯微鏡觀察細胞病變效應（CPE），記錄細胞變圓、脫落、融合等形態(tài)變化情況。同時，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用實時熒光定量PCR法檢測病毒核酸拷貝數(shù)，以確定病毒在細胞中的增殖情況。具體操作如下：使用TRIzol試劑提取細胞培養(yǎng)上清液中的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，使用IBVM41株特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH?O7μL。反應條件為：95℃預變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個循環(huán)。以正常細胞對照組為陰性對照，以已知濃度的病毒標準品為陽性對照，根據(jù)標準曲線計算樣品中的病毒核酸拷貝數(shù)。此外，還可通過免疫熒光染色法檢測細胞內的病毒抗原，進一步驗證感染模型的建立。具體步驟為：感染后的細胞用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘；加入0.1%TritonX-100通透液處理10-15分鐘，PBS緩沖液洗滌3次；加入5%BSA封閉液，37℃孵育30-60分鐘；棄去封閉液，加入IBVM41株特異性一抗（稀釋度根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜；PBS緩沖液洗滌3次，加入熒光素標記的二抗（稀釋度根據(jù)抗體說明書確定），37℃孵育30-60分鐘，避光操作；PBS緩沖液洗滌3次，用DAPI染核5-10分鐘，PBS緩沖液洗滌3次；在熒光顯微鏡下觀察，可見感染細胞內呈現(xiàn)特異性熒光信號，表明病毒抗原存在，成功建立了IBVM41株感染CEK細胞模型。2.2.2Bestatin對CEK細胞感染IBVM41株的影響實驗將Bestatin用無菌PBS溶解，配制成100mmol/L的儲存液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱。實驗時，用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基將Bestatin儲存液稀釋成不同濃度的工作液，如0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L。取處于對數(shù)生長期的CEK細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成細胞懸液，調整細胞密度為1×10?個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁生長。棄去96孔板中的培養(yǎng)基，將不同濃度的Bestatin工作液分別加入相應孔中，每孔100μL，設正常細胞對照組（只加入等量的含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基）和病毒感染對照組（只加入等量的病毒液，不加入Bestatin），每組設置6個復孔。將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時，使Bestatin與細胞充分作用。孵育結束后，棄去含Bestatin的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞3次。將IBVM41株病毒液用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至MOI=0.1，每孔加入100μL稀釋后的病毒液，正常細胞對照組加入等量的含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中吸附1-2小時，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細胞充分接觸。吸附結束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞3次，去除未吸附的病毒，每孔加入200μL含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（如6、12、24、36、48小時等），通過倒置顯微鏡觀察細胞病變效應（CPE），記錄細胞變圓、脫落、融合等形態(tài)變化情況，并按照病變程度進行評分，如0分表示無明顯病變，1分表示少數(shù)細胞變圓，2分表示部分細胞變圓、脫落，3分表示大部分細胞變圓、脫落，4分表示細胞全部脫落。同時，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用實時熒光定量PCR法檢測病毒核酸拷貝數(shù)，具體操作同2.2.1中所述。另外，使用MTT法檢測細胞活力，評估Bestatin對細胞的毒性作用。具體步驟為：在感染后的相應時間點，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時；棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使MTT結晶充分溶解；用酶標儀在570nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），細胞活力（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。2.2.3NA對CEK細胞感染IBVM41株的影響實驗將NA用無菌水溶解，配制成1mg/mL的儲存液，分裝后保存于-80℃冰箱，避免反復凍融。實驗時，用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基將NA儲存液稀釋成不同劑量的工作液，如5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。取處于對數(shù)生長期的CEK細胞，按照2.2.2中的方法接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時使細胞貼壁生長。棄去96孔板中的培養(yǎng)基，將不同劑量的NA工作液分別加入相應孔中，每孔100μL，設正常細胞對照組、病毒感染對照組，每組設置6個復孔。將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育不同時間，如1小時、2小時、4小時，以探究不同作用時間對實驗結果的影響。孵育結束后，棄去含NA的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞3次。將IBVM41株病毒液用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至MOI=0.1，每孔加入100μL稀釋后的病毒液，正常細胞對照組加入等量的含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，按照2.2.2中的方法進行病毒吸附和后續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（如6、12、24、36、48小時等），采用與2.2.2相同的方法觀察細胞病變效應（CPE）并進行評分，收集細胞培養(yǎng)上清液用實時熒光定量PCR法檢測病毒核酸拷貝數(shù)，使用MTT法檢測細胞活力。此外，還可通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中神經氨酸酶的活性變化。具體操作如下：根據(jù)ELISA試劑盒說明書，將細胞培養(yǎng)上清液、標準品和檢測抗體等加入相應的酶標板孔中，37℃孵育1-2小時；棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，每次3-5分鐘；加入底物溶液，37℃孵育15-30分鐘，避光操作；加入終止液，用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)標準曲線計算樣品中神經氨酸酶的活性。2.2.4肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的影響實驗肝素酶Ⅲ儲存于-20℃冰箱，使用時直接取出，用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，如0.05IU/mL、0.1IU/mL、0.2IU/mL、0.4IU/mL、0.8IU/mL。取處于對數(shù)生長期的CEK細胞，按前面所述方法接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時使細胞貼壁生長。棄去96孔板中的培養(yǎng)基，將不同濃度的肝素酶Ⅲ稀釋液分別加入相應孔中，每孔100μL，設正常細胞對照組、病毒感染對照組，每組設置6個復孔。將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。孵育結束后，棄去含肝素酶Ⅲ的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞3次。將IBVM41株病毒液用含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至MOI=0.1，每孔加入100μL稀釋后的病毒液，正常細胞對照組加入等量的含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，按照前面的方法進行病毒吸附和后續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時間點（如6、12、24、36、48小時等），通過倒置顯微鏡觀察細胞病變效應（CPE）并進行評分，收集細胞培養(yǎng)上清液用實時熒光定量PCR法檢測病毒核酸拷貝數(shù)，使用MTT法檢測細胞活力。為了探究肝素酶Ⅲ對病毒與細胞表面硫酸乙酰肝素結合的影響，可采用表面等離子共振（SPR）技術或免疫共沉淀技術等。以免疫共沉淀技術為例，在感染前用肝素酶Ⅲ處理細胞，然后感染IBVM41株，在適當時間點收集細胞，裂解細胞后加入抗IBV抗體和ProteinA/G磁珠進行免疫共沉淀；將沉淀復合物進行SDS-PAGE電泳和Westernblot分析，檢測與病毒結合的硫酸乙酰肝素的含量變化，從而判斷肝素酶Ⅲ對病毒與細胞表面硫酸乙酰肝素結合的影響。2.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法實驗數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進一步采用Tukey's檢驗進行兩兩比較；若方差不齊，采用Dunnett'sT3檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。通過統(tǒng)計分析，明確Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ不同處理組與對照組之間在病毒核酸拷貝數(shù)、細胞活力、細胞病變評分等指標上的差異，從而準確評估這三種物質對CEK細胞感染IBVM41株的影響。三、實驗結果3.1Bestatin對CEK細胞感染IBVM41株的影響結果在不同濃度Bestatin處理下，對CEK細胞感染IBVM41株的各項檢測指標進行分析，結果如下。細胞病變效應（CPE）觀察結果顯示，在病毒感染對照組中，隨著感染時間的延長，細胞病變逐漸加重。在感染12小時后，部分細胞開始變圓；24小時時，約50%的細胞出現(xiàn)變圓、脫落現(xiàn)象；48小時時，大部分細胞已脫落，細胞病變評分為3分。而在Bestatin處理組中，各濃度Bestatin均對細胞病變有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。當Bestatin濃度為0.1μmol/L時，在感染24小時后，細胞病變程度略低于病毒感染對照組，但差異不顯著；在48小時時，細胞病變評分為2分。當Bestatin濃度升高到10μmol/L時，在感染24小時后，細胞變圓、脫落的比例明顯減少，細胞病變評分為1分；48小時時，細胞病變評分為1.5分，仍有較多細胞保持貼壁狀態(tài)。當Bestatin濃度達到1000μmol/L時，在感染48小時后，細胞病變評分僅為0.5分，大部分細胞形態(tài)正常，僅有少數(shù)細胞出現(xiàn)輕微變圓。實時熒光定量PCR檢測病毒核酸拷貝數(shù)的結果表明，病毒感染對照組中，病毒核酸拷貝數(shù)在感染后6小時開始逐漸上升，24小時時顯著增加，48小時達到高峰，約為10?拷貝/mL。而在Bestatin處理組中，各濃度Bestatin均能抑制病毒核酸的復制。當Bestatin濃度為0.1μmol/L時，在感染24小時和48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)分別約為10?.?拷貝/mL和10?.?拷貝/mL，與病毒感染對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著Bestatin濃度的升高，抑制作用更加明顯。當Bestatin濃度為100μmol/L時，在感染24小時和48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)分別約為10?.?拷貝/mL和10?拷貝/mL，與病毒感染對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。當Bestatin濃度達到1000μmol/L時，在感染48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)僅約為10?.?拷貝/mL，顯著低于其他處理組和對照組（P<0.01）。相關數(shù)據(jù)繪制的折線圖如圖1所示，橫坐標為感染時間（小時），縱坐標為病毒核酸拷貝數(shù)（拷貝/mL），不同曲線代表不同濃度Bestatin處理組及病毒感染對照組。[此處插入病毒核酸拷貝數(shù)隨時間變化的折線圖，圖1]MTT法檢測細胞活力的結果顯示，正常細胞對照組的細胞活力在整個實驗過程中保持在95%以上。病毒感染對照組在感染后，細胞活力逐漸下降，在感染48小時后，細胞活力降至60%左右。在Bestatin處理組中，當Bestatin濃度低于100μmol/L時，在感染48小時后，細胞活力與病毒感染對照組相比，雖有一定提高，但差異不顯著。當Bestatin濃度為100μmol/L和1000μmol/L時，在感染48小時后，細胞活力分別約為70%和75%，與病毒感染對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明較高濃度的Bestatin在抑制病毒感染的同時，對細胞具有一定的保護作用，能維持細胞的活力。相關數(shù)據(jù)繪制的柱狀圖如圖2所示，橫坐標為不同處理組，縱坐標為細胞活力（%）。[此處插入細胞活力比較的柱狀圖，圖2]綜上所述，Bestatin能夠抑制CEK細胞感染IBVM41株后的病毒復制，減輕細胞病變程度，且在較高濃度時對細胞具有一定的保護作用，維持細胞活力，其抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。3.2NA對CEK細胞感染IBVM41株的影響結果不同劑量NA處理及不同作用時間下，對CEK細胞感染IBVM41株的各項指標檢測結果如下。細胞病變效應（CPE）觀察顯示，病毒感染對照組中，細胞病變隨時間逐漸加重。感染12小時后，細胞開始出現(xiàn)變圓現(xiàn)象；24小時時，約40%的細胞變圓、脫落；48小時時，大部分細胞脫落，細胞病變評分為3分。在NA處理組中，NA對細胞病變的抑制作用與劑量和作用時間相關。當NA劑量為5μg/mL，作用時間為1小時時，在感染24小時后，細胞病變程度與病毒感染對照組相比，無明顯差異；48小時時，細胞病變評分為2.5分。當NA劑量提高到20μg/mL，作用時間為2小時時，在感染24小時后，細胞變圓、脫落的比例明顯減少，細胞病變評分為1.5分；48小時時，細胞病變評分為2分。當NA劑量達到80μg/mL，作用時間為4小時時，在感染48小時后，細胞病變評分僅為1分，仍有較多細胞保持貼壁狀態(tài)。實時熒光定量PCR檢測病毒核酸拷貝數(shù)結果表明，病毒感染對照組中，病毒核酸拷貝數(shù)在感染后6小時開始上升，24小時顯著增加，48小時達到高峰，約為10?拷貝/mL。在NA處理組中，NA對病毒核酸復制有抑制作用，且抑制程度與劑量和作用時間有關。當NA劑量為5μg/mL，作用時間為1小時時，在感染24小時和48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)分別約為10?.?拷貝/mL和10?.?拷貝/mL，與病毒感染對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當NA劑量提高到40μg/mL，作用時間為2小時時，在感染24小時和48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)分別約為10?拷貝/mL和10?.3拷貝/mL，與病毒感染對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。當NA劑量達到80μg/mL，作用時間為4小時時，在感染48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)僅約為10?.?拷貝/mL，顯著低于其他處理組和對照組（P<0.01）。相關數(shù)據(jù)繪制的折線圖如圖3所示，橫坐標為感染時間（小時），縱坐標為病毒核酸拷貝數(shù)（拷貝/mL），不同曲線代表不同劑量NA處理組及病毒感染對照組。[此處插入病毒核酸拷貝數(shù)隨時間變化的折線圖，圖3]MTT法檢測細胞活力結果顯示，正常細胞對照組的細胞活力在整個實驗過程中維持在95%以上。病毒感染對照組在感染后，細胞活力逐漸下降，48小時后降至60%左右。在NA處理組中，當NA劑量低于20μg/mL，作用時間為1-2小時時，在感染48小時后，細胞活力與病毒感染對照組相比，雖有提高，但差異不顯著。當NA劑量為40μg/mL和80μg/mL，作用時間為2-4小時時，在感染48小時后，細胞活力分別約為70%和75%，與病毒感染對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明較高劑量且較長作用時間的NA在抑制病毒感染的同時，對細胞具有一定保護作用，可維持細胞活力。相關數(shù)據(jù)繪制的柱狀圖如圖4所示，橫坐標為不同處理組，縱坐標為細胞活力（%）。[此處插入細胞活力比較的柱狀圖，圖4]ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中神經氨酸酶活性變化結果顯示，病毒感染對照組中，神經氨酸酶活性在感染后逐漸升高，24小時時明顯上升，48小時達到較高水平。在NA處理組中，隨著NA劑量的增加和作用時間的延長，神經氨酸酶活性逐漸降低。當NA劑量為5μg/mL，作用時間為1小時時，神經氨酸酶活性與病毒感染對照組相比，略有降低，但差異不顯著。當NA劑量為20μg/mL，作用時間為2小時時，神經氨酸酶活性顯著低于病毒感染對照組（P<0.05）。當NA劑量達到80μg/mL，作用時間為4小時時，神經氨酸酶活性降至較低水平，僅為病毒感染對照組的40%左右。相關數(shù)據(jù)繪制的柱狀圖如圖5所示，橫坐標為不同處理組，縱坐標為神經氨酸酶活性（U/mL）。[此處插入神經氨酸酶活性比較的柱狀圖，圖5]綜上所述，NA能夠抑制CEK細胞感染IBVM41株后的病毒復制，減輕細胞病變程度，在較高劑量且較長作用時間時對細胞具有一定保護作用，同時可降低細胞培養(yǎng)上清液中神經氨酸酶的活性，其抑制作用與劑量和作用時間相關。3.3肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的影響結果在不同濃度肝素酶Ⅲ處理下，對CEK細胞感染IBVM41株的各項檢測指標分析結果如下。細胞病變效應（CPE）觀察結果顯示，病毒感染對照組中，細胞病變隨感染時間逐漸加重。感染12小時后，部分細胞開始變圓；24小時時，約45%的細胞出現(xiàn)變圓、脫落現(xiàn)象；48小時時，大部分細胞脫落，細胞病變評分為3分。在肝素酶Ⅲ處理組中，各濃度肝素酶Ⅲ對細胞病變均有抑制作用，且呈一定的劑量依賴性。當肝素酶Ⅲ濃度為0.05IU/mL時，在感染24小時后，細胞病變程度與病毒感染對照組相比，略有減輕，但差異不顯著；48小時時，細胞病變評分為2.5分。當肝素酶Ⅲ濃度升高到0.2IU/mL時，在感染24小時后，細胞變圓、脫落的比例明顯減少，細胞病變評分為1.5分；48小時時，細胞病變評分為2分。當肝素酶Ⅲ濃度達到0.8IU/mL時，在感染48小時后，細胞病變評分僅為1分，仍有較多細胞保持貼壁狀態(tài)。實時熒光定量PCR檢測病毒核酸拷貝數(shù)結果表明，病毒感染對照組中，病毒核酸拷貝數(shù)在感染后6小時開始上升，24小時顯著增加，48小時達到高峰，約為10?拷貝/mL。在肝素酶Ⅲ處理組中，各濃度肝素酶Ⅲ均能抑制病毒核酸的復制。當肝素酶Ⅲ濃度為0.05IU/mL時，在感染24小時和48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)分別約為10?.?拷貝/mL和10?.?拷貝/mL，與病毒感染對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著肝素酶Ⅲ濃度的升高，抑制作用增強。當肝素酶Ⅲ濃度為0.4IU/mL時，在感染24小時和48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)分別約為10?.?拷貝/mL和10?.2拷貝/mL，與病毒感染對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。當肝素酶Ⅲ濃度達到0.8IU/mL時，在感染48小時后，病毒核酸拷貝數(shù)僅約為10?拷貝/mL，顯著低于其他處理組和對照組（P<0.01）。相關數(shù)據(jù)繪制的折線圖如圖6所示，橫坐標為感染時間（小時），縱坐標為病毒核酸拷貝數(shù)（拷貝/mL），不同曲線代表不同濃度肝素酶Ⅲ處理組及病毒感染對照組。[此處插入病毒核酸拷貝數(shù)隨時間變化的折線圖，圖6]MTT法檢測細胞活力結果顯示，正常細胞對照組的細胞活力在整個實驗過程中保持在95%以上。病毒感染對照組在感染后，細胞活力逐漸下降，48小時后降至60%左右。在肝素酶Ⅲ處理組中，當肝素酶Ⅲ濃度低于0.2IU/mL時，在感染48小時后，細胞活力與病毒感染對照組相比，雖有提高，但差異不顯著。當肝素酶Ⅲ濃度為0.4IU/mL和0.8IU/mL時，在感染48小時后，細胞活力分別約為70%和75%，與病毒感染對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明較高濃度的肝素酶Ⅲ在抑制病毒感染的同時，對細胞具有一定保護作用，能維持細胞活力。相關數(shù)據(jù)繪制的柱狀圖如圖7所示，橫坐標為不同處理組，縱坐標為細胞活力（%）。[此處插入細胞活力比較的柱狀圖，圖7]免疫共沉淀技術檢測結果顯示，與病毒感染對照組相比，肝素酶Ⅲ處理組中與病毒結合的硫酸乙酰肝素含量顯著降低。當肝素酶Ⅲ濃度為0.2IU/mL時，與病毒結合的硫酸乙酰肝素含量約為病毒感染對照組的60%；當肝素酶Ⅲ濃度達到0.8IU/mL時，與病毒結合的硫酸乙酰肝素含量僅為病毒感染對照組的30%左右，表明肝素酶Ⅲ能夠有效降解細胞表面的硫酸乙酰肝素，減少病毒與細胞表面硫酸乙酰肝素的結合，從而抑制病毒的感染。相關數(shù)據(jù)繪制的柱狀圖如圖8所示，橫坐標為不同處理組，縱坐標為與病毒結合的硫酸乙酰肝素相對含量（以病毒感染對照組為100%）。[此處插入與病毒結合的硫酸乙酰肝素相對含量比較的柱狀圖，圖8]綜上所述，肝素酶Ⅲ能夠抑制CEK細胞感染IBVM41株后的病毒復制，減輕細胞病變程度，在較高濃度時對細胞具有一定保護作用，可降低病毒與細胞表面硫酸乙酰肝素的結合，其抑制作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。四、討論4.1Bestatin影響CEK細胞感染IBVM41株的機制探討本研究結果表明，Bestatin對CEK細胞感染IBVM41株具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。這一現(xiàn)象背后的機制可能涉及多個方面，以下從細胞免疫和代謝途徑等角度進行深入探討。在細胞免疫方面，Bestatin作為一種氨肽酶抑制劑，可能通過調節(jié)細胞表面的氨肽酶活性，影響病毒與細胞表面受體的結合過程。已有研究表明，氨肽酶N（APN/CD13）在一些冠狀病毒感染宿主細胞的過程中充當受體或輔助受體。Bestatin抑制APN的活性后，可能改變了細胞表面受體的結構或功能，使得IBVM41株難以與細胞表面的相應受體結合，從而阻斷了病毒的吸附和侵入環(huán)節(jié)，減少了病毒感染細胞的機會。此外，Bestatin還具有免疫調節(jié)作用。它可能通過激活細胞內的免疫信號通路，增強細胞的抗病毒免疫反應。例如，Bestatin可能促進細胞產生干擾素（IFN）等抗病毒細胞因子。IFN可以誘導細胞產生一系列抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2',5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）等，這些蛋白能夠抑制病毒的復制和轉錄過程。PKR可以磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），從而抑制病毒蛋白的翻譯起始；OAS可以激活核糖核酸酶L（RNaseL），降解病毒的RNA。Bestatin通過增強細胞的抗病毒免疫反應，限制了IBVM41株在CEK細胞內的復制和傳播，減輕了病毒感染對細胞的損傷。從代謝途徑角度分析，Bestatin可能干擾了病毒感染所依賴的細胞代謝途徑。病毒在感染細胞后，會利用細胞的代謝資源進行自身的復制和裝配。Bestatin可能通過抑制氨肽酶活性，影響了細胞內氨基酸的代謝和轉運。氨基酸是蛋白質合成的原料，病毒的復制和裝配需要大量的蛋白質合成。Bestatin對氨基酸代謝的干擾，可能導致細胞內氨基酸供應不足，從而影響了病毒蛋白的合成，進而抑制了病毒的復制。此外，Bestatin還可能影響細胞的能量代謝途徑。病毒感染細胞后，會改變細胞的能量代謝模式，以滿足自身的能量需求。Bestatin可能通過調節(jié)細胞內的能量代謝相關酶的活性，如己糖激酶、丙酮酸激酶等，影響細胞的糖酵解和線粒體呼吸作用，減少細胞的能量供應，使得病毒在細胞內的復制和裝配過程因缺乏能量而受到抑制。綜上所述，Bestatin對CEK細胞感染IBVM41株的抑制作用是通過多種機制協(xié)同實現(xiàn)的，包括對病毒吸附和侵入環(huán)節(jié)的阻斷、對細胞抗病毒免疫反應的增強以及對病毒感染所依賴的細胞代謝途徑的干擾。這些機制的深入研究，為進一步理解病毒與宿主細胞的相互作用提供了新的視角，也為開發(fā)針對IBV感染的新型治療策略提供了理論依據(jù)。4.2NA影響CEK細胞感染IBVM41株的機制探討NA對CEK細胞感染IBVM41株的抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性，這一現(xiàn)象背后的機制涉及病毒感染的多個關鍵環(huán)節(jié)。在病毒吸附和侵入階段，雖然IBV與流感病毒屬于不同病毒科，但細胞表面的唾液酸殘基在病毒感染過程中具有重要作用。流感病毒的NA通過水解宿主細胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液酸殘基，促進病毒粒子從感染細胞表面釋放。對于IBVM41株而言，細胞表面的唾液酸殘基可能也是其吸附和侵入細胞的重要識別位點。當加入外源性NA時，高劑量且較長時間作用下的NA可能搶先水解了CEK細胞表面的唾液酸殘基，使得IBVM41株無法有效識別和結合細胞表面的唾液酸，從而阻斷了病毒的吸附和侵入過程，減少了病毒進入細胞的數(shù)量，進而降低了病毒感染的幾率。在病毒釋放階段，NA的作用更為關鍵。病毒在細胞內完成復制和裝配后，需要從感染細胞表面釋放，以繼續(xù)感染其他細胞。IBVM41株感染CEK細胞后，細胞表面會表達大量帶有唾液酸殘基的糖蛋白和糖脂，這些唾液酸殘基就像“錨點”一樣，將新產生的病毒粒子錨定在細胞表面。而NA能夠催化這些唾液酸殘基水解，切斷病毒粒子與細胞表面的連接，促進病毒粒子的釋放。當使用外源性NA處理CEK細胞時，在高劑量且長時間作用下，NA抑制了病毒從感染細胞表面的釋放。新產生的病毒粒子無法正常脫離細胞，被困在細胞表面或細胞內，使得細胞培養(yǎng)上清液中的病毒數(shù)量減少，從而降低了病毒在細胞間的傳播和擴散能力，抑制了病毒的感染進程。此外，NA還可能通過影響細胞內的信號傳導通路來間接影響病毒感染。細胞表面的唾液酸殘基不僅是病毒的識別位點，還參與細胞內的多種信號傳導過程。NA對唾液酸殘基的水解可能改變了細胞表面的信號分子結構，影響了細胞內與病毒感染相關的信號傳導通路。例如，唾液酸殘基的水解可能導致某些細胞表面受體的活化狀態(tài)發(fā)生改變，進而影響細胞內的抗病毒免疫信號通路。這些信號通路的變化可能激活細胞內的抗病毒防御機制，或者抑制病毒在細胞內的復制和裝配過程，從而對IBVM41株的感染產生抑制作用。綜上所述，NA對CEK細胞感染IBVM41株的抑制作用是通過多種機制共同實現(xiàn)的，包括干擾病毒的吸附和侵入、抑制病毒的釋放以及影響細胞內的信號傳導通路等。這些機制的深入研究，有助于全面理解病毒感染過程中NA的作用，為開發(fā)針對IBV感染的新型抗病毒策略提供重要的理論依據(jù)。4.3肝素酶Ⅲ影響CEK細胞感染IBVM41株的機制探討肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的抑制作用具有劑量依賴性，這一現(xiàn)象背后的機制主要涉及細胞外基質的作用以及病毒與細胞表面受體的相互作用。細胞外基質在維持細胞的結構和功能方面發(fā)揮著重要作用，同時也參與病毒感染過程。硫酸乙酰肝素（HS）是細胞外基質和細胞表面的重要組成部分，它由重復的二糖單位組成，這些二糖單位包含葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸以及N-乙酰氨基葡萄糖，并且在不同位置存在硫酸化修飾。對于IBVM41株而言，HS是其感染CEK細胞的重要受體或輔助受體。病毒表面的S蛋白等結構可以特異性地識別并結合細胞表面HS的特定硫酸化位點，從而介導病毒與細胞的吸附和侵入過程。當加入肝素酶Ⅲ后，它能夠特異性地降解HS。肝素酶Ⅲ作用于HS中葡萄糖胺和糖醛酸之間的α（1-4）糖苷鍵，將大分子的HS降解為小分子片段。隨著肝素酶Ⅲ濃度的增加，其對HS的降解作用增強。當肝素酶Ⅲ濃度為0.05IU/mL時，雖然能夠對HS進行一定程度的降解，但可能仍有部分HS的關鍵結合位點未被完全破壞，使得病毒仍能與細胞表面剩余的HS結合，導致病毒感染仍能在一定程度上發(fā)生，只是細胞病變程度和病毒核酸拷貝數(shù)較對照組有所降低。而當肝素酶Ⅲ濃度升高到0.8IU/mL時，HS被大量降解，細胞表面幾乎沒有完整的、可供病毒識別和結合的HS位點。病毒無法有效吸附到細胞表面，也就難以侵入細胞，從而使得細胞病變程度顯著減輕，病毒核酸拷貝數(shù)大幅降低，對病毒感染的抑制作用明顯增強。此外，肝素酶Ⅲ對HS的降解還可能影響細胞表面的信號傳導微環(huán)境。HS不僅是病毒的受體，還參與細胞內多種信號傳導通路的調控。HS與細胞表面的生長因子、細胞因子及其受體相互作用，形成信號傳導復合物，調節(jié)細胞的增殖、分化、遷移等生理過程。肝素酶Ⅲ降解HS后，可能破壞了這些信號傳導復合物的形成，影響了細胞內與病毒感染相關的信號通路。例如，HS的降解可能導致細胞表面某些受體的活化狀態(tài)發(fā)生改變，使得細胞內抗病毒免疫信號通路被激活，從而增強細胞的抗病毒防御能力，抑制病毒在細胞內的復制和裝配過程。綜上所述，肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株的抑制作用主要通過降解細胞表面和細胞外基質中的硫酸乙酰肝素，阻斷病毒與細胞表面受體的結合，以及影響細胞內的信號傳導通路來實現(xiàn)，且其抑制效果隨著肝素酶Ⅲ濃度的增加而增強。4.4三種物質影響的比較與綜合分析通過對Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ對CEK細胞感染IBVM41株影響的實驗結果進行對比分析，可以發(fā)現(xiàn)這三種物質在抑制病毒感染方面既有相同點，也有不同點。相同點在于，Bestatin、NA和肝素酶Ⅲ都能夠抑制CEK細胞感染IBVM41株后的病毒復制，減輕細胞病變程度，且在一定條件下對細胞具有保護作用，維持細胞活力。這表明它們在不同的作用機制下，都能夠干擾病毒的感染進程，降低病毒對細胞的損害。不同點方面，Bestatin的抑制作用主要呈現(xiàn)濃度依賴性，通過抑制氨肽酶活性，可能從阻斷病毒吸附和侵入、增強細胞抗病毒免疫反應以及干擾病毒感染所依賴的細胞代謝途徑等多個方面發(fā)揮作用。NA的抑制作用與劑量和作用時間相關，主要通過干擾病毒的吸附和侵入、抑制病毒的釋放以及影響細胞內的信號傳導通路來實現(xiàn)對病毒感染的抑制。肝素酶Ⅲ的抑制作用具有劑量依賴性，主要通過降解細胞表面和細胞外基質中的硫酸乙酰肝素，阻斷病毒與細胞表面受體的結合，以及影響細胞內的信號傳導通路來抑制病毒感染。從作用效果的強弱來看，在本實驗設定的條件下，當Bestatin濃度達到1000μmol/L、NA劑量為80μg/mL且作用時間為4小時、肝素酶Ⅲ濃度為0.8IU/mL時，對病毒核酸復制的抑制作用較為顯著，病毒核酸拷貝數(shù)明顯降低。但由于它們的作用機制不同，難以直接比較哪種物質的抑制效果最佳。關