Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義胰腺癌作為消化系統(tǒng)中預(yù)后極差的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。由于胰腺解剖位置深在，早期癥狀隱匿且缺乏特異性，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失手術(shù)根治機(jī)會(huì)。手術(shù)切除是目前唯一可能治愈胰腺癌的方法，但手術(shù)切除率僅為10%-20%，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高。化療和放療作為重要的輔助治療手段，對胰腺癌的效果卻有限。胰腺癌對化療藥物的耐藥性較強(qiáng)，使得化療的療效大打折扣，只能在一定程度上緩解癥狀，提高生活質(zhì)量，而無法實(shí)現(xiàn)根治。因此，尋找更有效的治療方法成為胰腺癌研究領(lǐng)域的迫切需求。在眾多新興治療手段中，125I放射性粒子組織間植入治療逐漸受到關(guān)注。該治療方法是將含125I放射性粒子的微小珠子植入腫瘤組織內(nèi)部，利用其釋放的低劑量連續(xù)γ射線，持續(xù)作用于腫瘤細(xì)胞，引發(fā)DNA鏈斷裂和其他細(xì)胞成分損傷，從而抑制癌細(xì)胞的生長和增殖。125I放射性粒子治療具有諸多優(yōu)勢，如操作簡便、對周圍正常組織損傷小、恢復(fù)時(shí)間短等。相關(guān)META分析表明，125I粒子治療胰腺癌的有效率可達(dá)82.6%，能顯著提高患者的生存期，且不良反應(yīng)較少，主要為輕微的放射性皮炎。多項(xiàng)臨床研究也顯示，其總有效率可達(dá)90%以上，療效持續(xù)時(shí)間長，可達(dá)1年以上。然而，臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)部分患者對125I放射性粒子治療存在抵抗現(xiàn)象，即放射抵抗，導(dǎo)致治療效果不佳。放射抵抗是指腫瘤細(xì)胞在接受放射治療后，對射線的敏感性降低，使得腫瘤難以被有效殺滅。放射抵抗的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)信號通路和分子的異常調(diào)控。其中，Twist作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及放射抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Twist基因編碼的蛋白質(zhì)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族，它可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。已有研究表明，Twist在多種腫瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤的放射抵抗密切相關(guān)。在乳腺癌、肺癌等腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Twist的表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性降低，而抑制Twist的表達(dá)則能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。然而，Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的具體作用機(jī)制尚不清楚。深入研究Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的作用，具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，有助于進(jìn)一步揭示胰腺癌放射抵抗的分子機(jī)制，豐富對腫瘤放射生物學(xué)的認(rèn)識，為后續(xù)研究提供新的思路和靶點(diǎn)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，通過明確Twist的作用，有望為胰腺癌的臨床治療提供更有效的策略。例如，針對Twist及其相關(guān)信號通路開發(fā)靶向藥物，聯(lián)合125I放射性粒子治療，可能克服放射抵抗，提高治療效果，延長患者生存期，改善患者的生活質(zhì)量。此外，還能為胰腺癌的個(gè)性化治療提供依據(jù)，根據(jù)患者Twist的表達(dá)水平制定精準(zhǔn)的治療方案，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀125I放射性粒子治療胰腺癌在國內(nèi)外均有深入研究。在國外，美國MD安德森癌癥中心等頂尖醫(yī)療機(jī)構(gòu)對125I放射性粒子治療胰腺癌進(jìn)行了大量臨床實(shí)踐和研究。他們通過改進(jìn)粒子植入技術(shù)，利用先進(jìn)的影像引導(dǎo)設(shè)備，如高分辨率CT和MRI，實(shí)現(xiàn)了更精準(zhǔn)的粒子植入定位，提高了治療的準(zhǔn)確性和安全性。研究表明，精準(zhǔn)定位下的125I粒子治療可使局部腫瘤控制率達(dá)到70%以上。在基礎(chǔ)研究方面，國外學(xué)者深入探討了125I放射性粒子釋放的γ射線對腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制的影響。發(fā)現(xiàn)γ射線可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，激活一系列DNA損傷修復(fù)信號通路，如ATM/ATR信號通路。當(dāng)這些修復(fù)通路異常激活時(shí)，腫瘤細(xì)胞對射線的耐受性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致放射抵抗。國內(nèi)對125I放射性粒子治療胰腺癌的研究也取得了豐碩成果。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院等機(jī)構(gòu)開展了多項(xiàng)臨床研究，證實(shí)了125I放射性粒子治療中晚期胰腺癌的有效性和安全性。一項(xiàng)納入200例中晚期胰腺癌患者的臨床研究顯示，125I放射性粒子植入聯(lián)合化療組的中位生存期較單純化療組顯著延長，分別為12個(gè)月和8個(gè)月。在技術(shù)創(chuàng)新方面，國內(nèi)學(xué)者研發(fā)了新型的粒子植入器械和治療計(jì)劃系統(tǒng)，提高了粒子植入的效率和均勻性。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院研發(fā)的智能粒子植入機(jī)器人，能夠根據(jù)術(shù)前規(guī)劃的治療方案，精確地將粒子植入腫瘤組織，減少了人為操作誤差，提高了治療效果。在放射抵抗機(jī)制研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者針對胰腺癌放射抵抗展開了廣泛研究。發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期調(diào)控異常、腫瘤微環(huán)境改變以及相關(guān)信號通路的激活等是導(dǎo)致放射抵抗的重要因素。美國哈佛大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路的過度激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，增強(qiáng)其對放療的抵抗能力。通過抑制PI3K/AKT信號通路，可部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的放射抵抗，提高放療敏感性。國內(nèi)中山大學(xué)腫瘤防治中心的研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）在腫瘤微環(huán)境中可分泌多種細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-6等，這些細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)放射抵抗的發(fā)生。通過靶向TAM或其分泌的細(xì)胞因子，有望改善腫瘤的放射治療效果。Twist作為與腫瘤放射抵抗密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在國內(nèi)外研究中受到高度關(guān)注。國外研究在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中深入探討了Twist的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，Twist可通過與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，同時(shí)也增強(qiáng)了對放療的抵抗。在黑色素瘤研究中發(fā)現(xiàn)，Twist高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠快速修復(fù)放療引起的DNA損傷，從而導(dǎo)致放射抵抗。國內(nèi)研究則側(cè)重于Twist在消化系統(tǒng)腫瘤中的作用。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的研究表明，Twist在肝癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞系中，上調(diào)Twist的表達(dá)可降低細(xì)胞對放療的敏感性，而下調(diào)Twist的表達(dá)則能增強(qiáng)放療敏感性。然而，目前關(guān)于Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的作用研究仍存在不足。一方面，現(xiàn)有研究多集中在其他腫瘤類型或高劑量率放療下Twist的作用，對于125I放射性粒子低劑量率照射這一特定條件下Twist在胰腺癌中的作用機(jī)制研究較少。另一方面，Twist與胰腺癌放射抵抗相關(guān)信號通路之間的交互作用尚未完全明確，缺乏系統(tǒng)性的研究。此外，針對Twist開發(fā)有效的干預(yù)策略，并將其應(yīng)用于胰腺癌臨床治療的研究還處于起步階段，亟待進(jìn)一步深入探索。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的作用及分子機(jī)制，為克服胰腺癌放射抵抗、提高125I放射性粒子治療效果提供理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：1.3.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用人胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC-1作為研究對象。采用MTT法測定不同劑量125I放射性粒子照射對胰腺癌細(xì)胞生長抑制率的影響，繪制細(xì)胞生長曲線，確定合適的低劑量率照射劑量，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的照射條件。將細(xì)胞分為對照組、125I照射組、轉(zhuǎn)染Twist的照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Twist過表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。采用倒置顯微鏡觀察不同組細(xì)胞在125I照射后的形態(tài)變化，包括細(xì)胞的集聚、凋亡、形態(tài)改變等情況，初步預(yù)估125I照射及Twist轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組細(xì)胞的凋亡水平，比較各組之間的差異，分析Twist對125I放射性粒子照射誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀察Twist在125I照射條件下對胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。1.3.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型，將對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對照組、125I照射組、轉(zhuǎn)染Twist的照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組。對相應(yīng)組別的裸鼠進(jìn)行125I放射性粒子植入照射處理，同時(shí)對轉(zhuǎn)染Twist的照射組裸鼠瘤內(nèi)注射過表達(dá)Twist的腺病毒，非轉(zhuǎn)染Twist的照射組注射對照腺病毒。定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察各組腫瘤的生長情況，比較Twist對125I放射性粒子照射抑制腫瘤生長效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行HE染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化；通過免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中Twist、Ki-67（增殖標(biāo)志物）、Cleaved-caspase-3（凋亡標(biāo)志物）等蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析Twist在體內(nèi)對125I放射性粒子照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的作用機(jī)制。1.3.3分子機(jī)制研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測不同組細(xì)胞和腫瘤組織中Twist、相關(guān)信號通路分子（如PI3K/AKT、MAPK等）以及放射抵抗相關(guān)基因（如MGMT、ERCC1等）的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析Twist與這些分子之間的關(guān)系，探討Twist影響125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的潛在信號通路。通過基因沉默或過表達(dá)技術(shù)，分別干擾或上調(diào)細(xì)胞中Twist及相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，然后進(jìn)行125I放射性粒子照射處理，檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為以及放射抵抗相關(guān)基因的表達(dá)變化，驗(yàn)證Twist通過調(diào)控相關(guān)信號通路影響胰腺癌放射抵抗的作用機(jī)制。采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，研究Twist是否直接結(jié)合到放射抵抗相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)一步明確Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的分子調(diào)控機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床樣本分析等多種方法，全面深入地探究Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的作用機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC-1。通過MTT法精準(zhǔn)測定不同劑量125I放射性粒子照射對胰腺癌細(xì)胞生長抑制率的影響，從而繪制出準(zhǔn)確的細(xì)胞生長曲線，以此確定適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的低劑量率照射劑量。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Twist過表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞中，借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)嚴(yán)格驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。采用倒置顯微鏡細(xì)致觀察不同組細(xì)胞在125I照射后的形態(tài)變化，包括細(xì)胞的集聚、凋亡、形態(tài)改變等情況，初步預(yù)估125I照射及Twist轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)精確檢測不同組細(xì)胞的凋亡水平，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析比較各組之間的差異，深入分析Twist對125I放射性粒子照射誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。通過Transwell實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，清晰觀察Twist在125I照射條件下對胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，成功建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型。將對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞小心接種于裸鼠皮下，待腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，按照隨機(jī)分組原則將裸鼠隨機(jī)分為對照組、125I照射組、轉(zhuǎn)染Twist的照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組。對相應(yīng)組別的裸鼠進(jìn)行125I放射性粒子植入照射處理，同時(shí)對轉(zhuǎn)染Twist的照射組裸鼠瘤內(nèi)準(zhǔn)確注射過表達(dá)Twist的腺病毒，非轉(zhuǎn)染Twist的照射組注射對照腺病毒。定期使用游標(biāo)卡尺等工具準(zhǔn)確測量腫瘤體積，依據(jù)測量數(shù)據(jù)繪制出腫瘤生長曲線，密切觀察各組腫瘤的生長情況，深入比較Twist對125I放射性粒子照射抑制腫瘤生長效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按照規(guī)范流程處死裸鼠，迅速取出腫瘤組織，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下仔細(xì)觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化；通過免疫組織化學(xué)染色精準(zhǔn)檢測腫瘤組織中Twist、Ki-67（增殖標(biāo)志物）、Cleaved-caspase-3（凋亡標(biāo)志物）等蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步深入分析Twist在體內(nèi)對125I放射性粒子照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的作用機(jī)制。分子機(jī)制研究中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)精確檢測不同組細(xì)胞和腫瘤組織中Twist、相關(guān)信號通路分子（如PI3K/AKT、MAPK等）以及放射抵抗相關(guān)基因（如MGMT、ERCC1等）的mRNA和蛋白表達(dá)水平，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析深入分析Twist與這些分子之間的關(guān)系，全面探討Twist影響125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的潛在信號通路。通過基因沉默或過表達(dá)技術(shù)，分別干擾或上調(diào)細(xì)胞中Twist及相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，然后進(jìn)行125I放射性粒子照射處理，再次運(yùn)用上述實(shí)驗(yàn)方法檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為以及放射抵抗相關(guān)基因的表達(dá)變化，嚴(yán)謹(jǐn)驗(yàn)證Twist通過調(diào)控相關(guān)信號通路影響胰腺癌放射抵抗的作用機(jī)制。采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，深入研究Twist是否直接結(jié)合到放射抵抗相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)一步明確Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的分子調(diào)控機(jī)制。本研究的技術(shù)路線圖如下：首先進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，篩選并培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株，確定125I照射劑量后進(jìn)行分組照射和Twist轉(zhuǎn)染，通過多種檢測方法分析細(xì)胞生物學(xué)行為變化；同時(shí)開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立裸鼠移植瘤模型，分組處理后觀察腫瘤生長情況并進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化分析；最后整合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行分子機(jī)制研究，通過基因調(diào)控和ChIP技術(shù)等深入探究Twist在125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗中的分子作用機(jī)制，為胰腺癌的治療提供理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)（技術(shù)路線圖詳見圖1）。[此處插入技術(shù)路線圖]二、125I放射性粒子低劑量率照射與胰腺癌治療概述2.1125I放射性粒子介紹125I放射性粒子作為一種在腫瘤治療領(lǐng)域具有獨(dú)特作用的放射性物質(zhì)，近年來在臨床實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用。它是一種微型放射源，由滲過125I的直徑0.5mm、長3.0mm銀棒密封在直徑0.8mm、長4.5mm、壁厚0.05mm的鈦管中連接而成。從物理特性來看，125I放射性粒子是軌道電子俘獲衰變核素，其發(fā)射的γ射線能量為0.03548兆電子伏。這種低能量的γ射線具有特殊的輻射特性，使其在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。125I放射性粒子的半衰期為60.14天，這意味著在大約60天的時(shí)間內(nèi)，其放射性強(qiáng)度會(huì)衰減一半。相對較長的半衰期使得粒子能夠在體內(nèi)持續(xù)釋放γ射線，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間的照射，從而增加了對腫瘤組織的生物效應(yīng)。有效放射半徑為1.7cm，在這個(gè)范圍內(nèi)，γ射線能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生有效的殺傷作用。通過合理調(diào)整放射粒子的位置，使重疊的放射劑量可以有效覆蓋腫瘤全部以及腫瘤周邊正常組織內(nèi)的亞臨床區(qū)域，達(dá)到腫瘤內(nèi)部高放射劑量，周邊正常組織內(nèi)放射劑量迅速衰減的效果，最大程度地殺傷腫瘤組織的同時(shí)保護(hù)周圍正常組織。在體內(nèi)，125I放射性粒子持續(xù)發(fā)射γ射線，這些γ射線通過直接效應(yīng)或通過產(chǎn)生的自由基的間接作用來破壞腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈。當(dāng)腫瘤細(xì)胞分裂時(shí)，由于其DNA的完整性受損，無法進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂而死亡。腫瘤細(xì)胞因?yàn)榛虿环€(wěn)定，對放射線比較敏感，受到傷害后修補(bǔ)的機(jī)制不完全，這使得125I放射性粒子釋放的γ射線能夠更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，長時(shí)間持續(xù)低能量的γ射線不僅破壞腫瘤細(xì)胞核內(nèi)DNA合成，抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且使腫瘤細(xì)胞周期停留在G2、M期，該細(xì)胞周期對射線敏感，使腫瘤細(xì)胞受到最大程度的殺傷，區(qū)別于傳統(tǒng)外放療在放射間期，亞致死損傷及潛在致死損傷的細(xì)胞修復(fù)，降低了放療敏感性。粒子的鈦金屬外殼與人體有很好的組織相容性，不會(huì)產(chǎn)生排異及放射泄露，保障了治療的安全性。2.2低劑量率照射特點(diǎn)與優(yōu)勢低劑量率照射（lowdoserateirradiation，LDRI）作為一種獨(dú)特的放射治療模式，與傳統(tǒng)高劑量率照射相比，具有諸多顯著特點(diǎn)和優(yōu)勢，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的價(jià)值。低劑量率照射的特點(diǎn)之一是其持續(xù)作用的特性。如125I放射性粒子植入后，在體內(nèi)持續(xù)釋放γ射線，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間的照射。這種持續(xù)照射能夠使腫瘤細(xì)胞在較長時(shí)間內(nèi)持續(xù)受到射線的作用，與高劑量率照射在短時(shí)間內(nèi)給予大劑量射線不同。持續(xù)的低劑量率照射就像一場持久的“攻堅(jiān)戰(zhàn)”，不斷地對腫瘤細(xì)胞的DNA造成損傷，而腫瘤細(xì)胞在持續(xù)的損傷壓力下，難以進(jìn)行有效的修復(fù)和增殖。例如，在一些研究中發(fā)現(xiàn)，低劑量率照射可使腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂持續(xù)存在，無法及時(shí)修復(fù)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和生長，有效地遏制腫瘤的進(jìn)展。低劑量率照射對正常組織的損傷相對較小。由于其作用半徑小，射線能量在短距離內(nèi)迅速衰減，使得對腫瘤周邊正常組織的損害顯著降低。以125I放射性粒子為例，其有效放射半徑為1.7cm，在這個(gè)范圍內(nèi)，射線對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有效的殺傷作用，而超出這個(gè)范圍，射線劑量迅速下降，對正常組織的影響微乎其微。這一特性使得在治療腫瘤的同時(shí)，能夠最大程度地保護(hù)周圍正常組織的功能，減少因放療引起的并發(fā)癥。如在胰腺癌的治療中，胰腺周圍存在著眾多重要的臟器和組織，如胃、十二指腸、膽管等，低劑量率照射可以精準(zhǔn)地作用于腫瘤組織，而對這些周圍正常組織的損傷極小，降低了胃腸道穿孔、膽管損傷等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高了患者的生活質(zhì)量。低劑量率照射還能提高放射生物效應(yīng)。它通過持續(xù)性、低劑量反復(fù)照射，增加了對腫瘤組織的生物效應(yīng)。在細(xì)胞周期中，腫瘤細(xì)胞處于不同的分裂周期時(shí)對射線的敏感性不同，低劑量率照射能夠?qū)M(jìn)入不同分裂周期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行不間斷的照射。當(dāng)腫瘤細(xì)胞從相對不敏感的細(xì)胞周期進(jìn)入敏感周期時(shí)，低劑量率照射可以及時(shí)對其進(jìn)行殺傷，從而提高了放射治療的效果。低劑量率照射還能使腫瘤細(xì)胞周期停留在對射線敏感的G2、M期，進(jìn)一步增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。研究表明，低劑量率照射下腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯高于高劑量率照射，說明低劑量率照射能夠更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高放射治療的療效。低劑量率照射在腫瘤治療中具有持續(xù)作用、對正常組織損傷小、提高放射生物效應(yīng)等特點(diǎn)和優(yōu)勢。這些優(yōu)勢使得低劑量率照射在腫瘤治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其在125I放射性粒子治療胰腺癌等疾病中，為提高治療效果、減少并發(fā)癥、改善患者預(yù)后提供了有力的支持。2.3胰腺癌治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)胰腺癌的治療目前主要依賴手術(shù)、化療、放療等常規(guī)方法，但這些方法均面臨諸多挑戰(zhàn)，治療效果不盡如人意。手術(shù)切除是胰腺癌治療的重要手段，對于早期胰腺癌患者，根治性手術(shù)切除是唯一可能治愈的方法。然而，由于胰腺癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤侵犯周圍重要血管、臟器或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致手術(shù)切除率僅為10%-20%。即使接受了手術(shù)切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高，5年生存率仍低于20%。一項(xiàng)對500例胰腺癌手術(shù)患者的長期隨訪研究顯示，術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)40%，3年生存率僅為30%。手術(shù)過程中，胰腺周圍復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，如腸系膜上動(dòng)靜脈、門靜脈等大血管，十二指腸、膽管等重要臟器，增加了手術(shù)操作的難度和風(fēng)險(xiǎn)，容易導(dǎo)致術(shù)中出血、胰瘺、膽瘺等嚴(yán)重并發(fā)癥，影響患者的預(yù)后?；熢谝认侔┲委熤幸舱紦?jù)重要地位，常用于無法手術(shù)切除或術(shù)后輔助治療的患者。目前，吉西他濱、氟尿嘧啶、鉑類等藥物是胰腺癌化療的常用藥物。然而，胰腺癌對化療藥物的耐藥性較強(qiáng)，化療的有效率較低，僅能在一定程度上緩解癥狀，延長生存期。一項(xiàng)納入1000例晚期胰腺癌患者的多中心臨床研究表明，單純化療的中位生存期僅為6-8個(gè)月，1年生存率為20%-30%?；熕幬锏牟涣挤磻?yīng)也較為明顯，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，導(dǎo)致部分患者難以耐受化療，中斷治療。放療作為局部治療手段，可用于無法手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)的胰腺癌患者，能夠緩解疼痛、減輕腫瘤壓迫癥狀。但胰腺癌對放療也存在抵抗現(xiàn)象，放射抵抗使得腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性降低，放療效果受限。胰腺周圍的正常組織，如胃、十二指腸、小腸、肝臟等對射線較為敏感，限制了放療劑量的提高，難以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，放療后局部腫瘤控制率較低，容易出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究表明，單純放療的局部控制率僅為30%-40%，5年生存率低于10%。放射抵抗是胰腺癌治療面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一，嚴(yán)重影響了放療和125I放射性粒子治療的效果。放射抵抗的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)是導(dǎo)致放射抵抗的重要原因之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到射線照射后，會(huì)激活一系列DNA損傷修復(fù)信號通路，如ATM/ATR信號通路，迅速修復(fù)受損的DNA，使腫瘤細(xì)胞能夠繼續(xù)存活和增殖。腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控異常也與放射抵抗密切相關(guān)。處于不同細(xì)胞周期的腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性不同，若腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制發(fā)生異常，使得細(xì)胞周期阻滯在對射線相對不敏感的時(shí)期，如G0期，就會(huì)降低腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。腫瘤微環(huán)境的改變也在放射抵抗中發(fā)揮重要作用。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等可分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如TGF-β、IL-6等，這些因子可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)放射抵抗的發(fā)生。腫瘤血管生成異常導(dǎo)致腫瘤組織供血不足，造成乏氧微環(huán)境，也會(huì)使腫瘤細(xì)胞對射線的耐受性增強(qiáng)，產(chǎn)生放射抵抗。在125I放射性粒子低劑量率照射治療胰腺癌時(shí)，放射抵抗同樣是影響治療效果的重要因素。部分患者在接受125I放射性粒子植入治療后，腫瘤細(xì)胞并未受到有效抑制，仍持續(xù)生長和增殖，導(dǎo)致治療失敗。深入研究放射抵抗的機(jī)制，尋找有效的干預(yù)措施，克服放射抵抗，是提高胰腺癌治療效果的關(guān)鍵。2.4125I放射性粒子治療胰腺癌的臨床應(yīng)用與效果125I放射性粒子治療胰腺癌在臨床實(shí)踐中已得到廣泛應(yīng)用，眾多研究表明其在提高患者生存率、緩解癥狀等方面展現(xiàn)出一定的療效。在一項(xiàng)針對中晚期胰腺癌患者的臨床研究中，共納入了50例無法手術(shù)切除的患者，對其進(jìn)行125I放射性粒子植入治療。結(jié)果顯示，治療后患者的臨床受益反應(yīng)有效率為50%，主要表現(xiàn)為疼痛緩解、食欲增加、體重穩(wěn)定等。治療后3個(gè)月的腫瘤控制率達(dá)到70%，部分患者的腫瘤體積明顯縮小。中位生存期為12個(gè)月，1年累計(jì)生存率為40%，2年累計(jì)生存率為10%。與傳統(tǒng)的化療相比，125I放射性粒子治療在緩解患者癥狀、提高生活質(zhì)量方面具有明顯優(yōu)勢?；熃M患者在治療過程中常出現(xiàn)嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)，如惡心、嘔吐、食欲減退等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降；而125I放射性粒子治療組患者的不良反應(yīng)相對較輕，主要為輕度的局部疼痛和少量的粒子遷移，但未對治療效果和患者生活造成明顯影響。另一項(xiàng)多中心臨床研究，收集了200例中晚期胰腺癌患者，分別給予125I放射性粒子植入聯(lián)合化療和單純化療。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的有效率（CR+PR）為65%，顯著高于單純化療組的35%。聯(lián)合治療組的中位生存期為15個(gè)月，1年累計(jì)生存率為55%，2年累計(jì)生存率為20%；而單純化療組的中位生存期為9個(gè)月，1年累計(jì)生存率為30%，2年累計(jì)生存率為5%。在緩解疼痛方面，聯(lián)合治療組的疼痛緩解率達(dá)到80%，明顯優(yōu)于單純化療組的50%。聯(lián)合治療組患者的血清腫瘤標(biāo)志物CA19-9和CEA水平在治療后顯著下降，表明腫瘤得到了有效控制。125I放射性粒子治療胰腺癌具有一定的治療優(yōu)勢。從治療原理上看，其通過持續(xù)性低劑量照射，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間的殺傷，增加了放射生物效應(yīng)。與外放療相比，125I放射性粒子植入能夠?qū)⒎派湓粗苯臃胖迷谀[瘤組織內(nèi)，實(shí)現(xiàn)局部高劑量照射，同時(shí)減少對周圍正常組織的損傷。在胰腺癌治療中，胰腺周圍存在著眾多重要的臟器和組織，如十二指腸、膽管、肝臟等，外放療在照射腫瘤的同時(shí)，容易對這些周圍組織造成損傷，引發(fā)胃腸道穿孔、膽管損傷、肝功能損害等并發(fā)癥。而125I放射性粒子的有效放射半徑僅為1.7cm，射線能量在短距離內(nèi)迅速衰減，對周圍正常組織的影響極小，大大降低了并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。125I放射性粒子治療為微創(chuàng)手術(shù)，對患者的身體創(chuàng)傷較小，患者恢復(fù)較快，能夠更好地耐受后續(xù)治療。然而，125I放射性粒子治療也存在一定的局限性。首先，技術(shù)要求較高，需要精確的影像引導(dǎo)和專業(yè)的操作技能，以確保粒子準(zhǔn)確植入腫瘤組織內(nèi)，并達(dá)到理想的劑量分布。在實(shí)際操作中，由于胰腺的解剖位置深在，周圍結(jié)構(gòu)復(fù)雜，增加了粒子植入的難度。若粒子植入位置不準(zhǔn)確，可能導(dǎo)致腫瘤局部劑量不足，影響治療效果，或者對周圍正常組織造成不必要的損傷。其次，對于腫瘤體積較大、侵犯范圍較廣的患者，125I放射性粒子治療可能無法完全覆蓋腫瘤組織，難以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。腫瘤細(xì)胞對射線的敏感性存在個(gè)體差異，部分患者可能對125I放射性粒子治療不敏感，導(dǎo)致治療效果不佳。125I放射性粒子治療還可能出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，如粒子遷移、局部感染、出血等，雖然這些不良反應(yīng)的發(fā)生率相對較低，但仍需引起重視。三、Twist在腫瘤放射抵抗中的作用機(jī)制基礎(chǔ)3.1Twist蛋白結(jié)構(gòu)與功能Twist蛋白作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的作用。它屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族，這一家族成員在基因表達(dá)調(diào)控中具有獨(dú)特的功能和重要地位。Twist蛋白的結(jié)構(gòu)包含多個(gè)關(guān)鍵區(qū)域，各區(qū)域協(xié)同作用，決定了其功能特性。Twist蛋白由N-端、HLH、C端三部分區(qū)域組成。HLH結(jié)構(gòu)域是其核心結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)α-螺旋通過一個(gè)連接環(huán)相連構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)使得Twist蛋白能夠與其他bHLH蛋白形成二聚體，從而特異性地結(jié)合到DNA的E-box序列（CANNTG）上。在人類中，Twist基因位于7號染色體p21.2，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，第一個(gè)外顯子長度為772bp，內(nèi)含子長度為538bp，mRNA全長1669bp。未被修飾的Twist蛋白分子量約為20.9KD。Twist蛋白在不同種屬之間具有高度的保守性，人類與小鼠的Twist蛋白氨基酸序列具有96%的同源性，且在不同種屬中其DNA結(jié)合區(qū)域具有100%的序列保守性。在胚胎發(fā)育過程中，Twist蛋白發(fā)揮著不可或缺的作用。它參與調(diào)控中胚層發(fā)育及形態(tài)的構(gòu)建，對胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要。在頭間質(zhì)、體節(jié)和四肢的發(fā)生過程中，Twist蛋白的表達(dá)起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。在小鼠胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，Twist1基因敲除的小鼠胚胎在中胚層形成和分化過程中出現(xiàn)嚴(yán)重異常，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯。Twist蛋白在肌肉和骨骼發(fā)育中也發(fā)揮著抑制作用，它能夠調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，控制肌肉和骨骼細(xì)胞的分化和增殖。在骨骼發(fā)育過程中，Twist蛋白通過抑制成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，維持骨骼發(fā)育的平衡。Twist蛋白還參與細(xì)胞分化過程。在細(xì)胞分化過程中，Twist蛋白可以通過調(diào)控一系列基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化方向和進(jìn)程。在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中，Twist蛋白可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，促進(jìn)其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。研究表明，Twist蛋白可以與神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)其活性，從而影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化命運(yùn)。除了在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中的作用，Twist蛋白還與細(xì)胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)。它可以通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使上皮細(xì)胞失去極性，降低細(xì)胞間的粘附作用，改變細(xì)胞骨架形態(tài)，從而獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在腫瘤細(xì)胞中，Twist蛋白的高表達(dá)常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。在乳腺癌細(xì)胞中，Twist蛋白可以通過抑制E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶分離，進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Twist蛋白作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定了它在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和侵襲等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入了解Twist蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，對于揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。3.2Twist與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系Twist在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，Twist通過多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。它可以抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)存活和增殖。研究表明，Twist可能會(huì)改變成纖維細(xì)胞的特性，抑制ADP核糖基化因子（ARF）/鼠雙微體2（MDM2）/p53途徑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對原癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗性，從而延遲和抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞大量增殖。在乳腺癌細(xì)胞系中，上調(diào)Twist的表達(dá)可顯著降低細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而抑制Twist的表達(dá)則可使細(xì)胞凋亡率升高，增殖受到抑制。Twist還能調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞能夠更快地進(jìn)行分裂和增殖。在肝癌細(xì)胞中，Twist可通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良的重要原因，Twist在這一過程中扮演著重要角色。大量研究表明，Twist在多種具有高侵襲和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Twist高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織，并通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其作用機(jī)制主要是通過調(diào)控EMT過程來實(shí)現(xiàn)的。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間粘附力下降，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。Twist作為EMT過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過多種方式促進(jìn)EMT的發(fā)生。Twist能夠直接結(jié)合到E-鈣粘蛋白（E-cadherin）基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞粘附分子，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力減弱，使腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。在胃癌細(xì)胞中，Twist的高表達(dá)可顯著降低E-cadherin的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Twist還可以通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug等，間接調(diào)控EMT過程。這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT和侵襲轉(zhuǎn)移。Twist在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。深入研究Twist在腫瘤中的作用機(jī)制，對于理解腫瘤的生物學(xué)行為、開發(fā)新的治療策略具有重要意義。3.3Twist在腫瘤放射抵抗中的研究進(jìn)展Twist在腫瘤放射抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，眾多研究揭示了其復(fù)雜的作用機(jī)制和相關(guān)信號通路。在乳腺癌研究中，Twist被發(fā)現(xiàn)與放射抵抗密切相關(guān)。有研究表明，Twist通過抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射抵抗能力。在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，上調(diào)Twist的表達(dá)可使細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，對放療的耐受性增強(qiáng)，照射后細(xì)胞存活率明顯提高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Twist還可通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，增強(qiáng)放射抵抗。PI3K/AKT信號通路被激活后，可使下游的mTOR等分子磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長，從而使腫瘤細(xì)胞在放療后能夠迅速修復(fù)損傷，繼續(xù)存活和增殖。在肺癌研究中，Twist同樣參與了放射抵抗的形成。研究發(fā)現(xiàn)，Twist高表達(dá)的肺癌細(xì)胞對放療的敏感性降低，其機(jī)制可能與Twist調(diào)控DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Twist可上調(diào)DNA損傷修復(fù)基因如MGMT、ERCC1的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)放療引起的DNA損傷，導(dǎo)致放射抵抗。Twist還可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子，如IL-6、TGF-β等，間接影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。IL-6可激活STAT3信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)放射抵抗；TGF-β則可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程，使腫瘤細(xì)胞對放療的耐受性增強(qiáng)。在結(jié)直腸癌研究中，Twist在放射抵抗中的作用也逐漸被揭示。研究表明，Twist可通過與p53蛋白相互作用，抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放射抵抗。在p53野生型的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，Twist高表達(dá)可使p53的活性受到抑制，細(xì)胞凋亡減少，放療后腫瘤細(xì)胞的存活能力增強(qiáng)。Twist還可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，參與放射抵抗的形成。Wnt/β-catenin信號通路激活后，可使β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積累，與TCF/LEF等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和放射抵抗。在頭頸部腫瘤研究中，Twist與放射抵抗的關(guān)系也備受關(guān)注。有研究顯示，Twist高表達(dá)的頭頸部腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，同時(shí)對放療的抵抗性也增強(qiáng)。其作用機(jī)制可能與Twist誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的干性有關(guān)。Twist可通過激活Notch信號通路，維持腫瘤干細(xì)胞的特性，使腫瘤細(xì)胞在放療后能夠自我更新和分化，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和放射抵抗。Notch信號通路激活后，可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因如SOX2、OCT4等的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干性和放射抵抗能力。Twist在多種腫瘤的放射抵抗中均發(fā)揮著重要作用，通過參與多種信號通路和分子機(jī)制，如EMT、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)、腫瘤干細(xì)胞維持等，影響腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。深入研究Twist在腫瘤放射抵抗中的作用機(jī)制，為開發(fā)新的腫瘤治療策略提供了重要的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。四、實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備在本研究中，選用人胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC-1作為實(shí)驗(yàn)對象。MIAPaCa-2細(xì)胞株是從一名65歲白人男性的胰腺腫瘤組織中分離獲得，具有上皮形態(tài)。PANC-1細(xì)胞株則常用于胰腺癌的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，其生物學(xué)特性穩(wěn)定，對多種實(shí)驗(yàn)處理具有良好的反應(yīng)性。這兩種細(xì)胞株均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），確保了細(xì)胞來源的可靠性和穩(wěn)定性。125I放射性粒子源選用國內(nèi)知名廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，其活度為[具體活度]，半衰期為60.14天，發(fā)射的γ射線能量為0.03548兆電子伏。在使用前，對粒子源進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，包括活度測定、放射性純度檢測等，確保粒子源的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。采用專業(yè)的放射性測量儀器，如γ計(jì)數(shù)器，對粒子源的活度進(jìn)行精確測量，保證實(shí)驗(yàn)中照射劑量的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重16-20g，雌雄各半，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。裸鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在25-27℃，相對濕度保持在45%-50%。給予無菌飼料和飲用水，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理和相關(guān)規(guī)定，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。主要試劑包括RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、MTT試劑、DMSO、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、Transwell小室、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、Twist過表達(dá)質(zhì)粒、Twist干擾質(zhì)粒、過表達(dá)Twist的腺病毒、對照腺病毒等。這些試劑均購自知名生物試劑公司，如Gibco、ThermoFisherScientific、Sigma-Aldrich等，保證了試劑的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。主要儀器設(shè)備有CO2培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、倒置顯微鏡（Olympus）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences）、PCR儀（AppliedBiosystems）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、超凈工作臺（蘇州凈化）等。所有儀器設(shè)備在使用前均進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2和PANC-1置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為以下四組：對照組，不進(jìn)行任何處理，僅在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)對照，用于對比其他處理組細(xì)胞的生物學(xué)行為變化；125I照射組，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，放入含125I放射性粒子的特制照射裝置中，按照確定的低劑量率進(jìn)行照射處理，研究125I放射性粒子低劑量率照射對胰腺癌細(xì)胞的直接影響；轉(zhuǎn)染Twist的照射組，先采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將Twist過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，再進(jìn)行125I放射性粒子照射處理，探究Twist過表達(dá)對125I照射誘導(dǎo)的放射抵抗的影響；非轉(zhuǎn)染Twist的照射組，在不轉(zhuǎn)染Twist質(zhì)粒的情況下，直接對細(xì)胞進(jìn)行125I放射性粒子照射處理，作為轉(zhuǎn)染Twist的照射組的對照，以明確Twist轉(zhuǎn)染對125I照射效果的特異性影響。4.2.2125I放射性粒子照射劑量率的確定采用MTT法測定125I照射對胰腺癌細(xì)胞生長抑制作用以確定放療劑量。將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為200μL。培養(yǎng)24h后，將96孔板分為不同劑量照射組，分別給予0Gy（對照組）、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy的125I放射性粒子照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，公式為：細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。以照射劑量為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長抑制曲線。根據(jù)曲線確定在照射72h時(shí)，使細(xì)胞生長抑制率達(dá)到50%左右的照射劑量，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的低劑量率照射劑量。4.2.3Twist轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將Twist過表達(dá)質(zhì)?；蚋蓴_質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑分別在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。然后將兩者混合，室溫孵育20min，形成質(zhì)粒-Lipofectamine3000復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot方法檢測Twist的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR步驟如下：提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O。引物序列根據(jù)Twist基因設(shè)計(jì)，上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算TwistmRNA的相對表達(dá)量。Westernblot步驟如下：提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，加入兔抗人Twist一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析Twist蛋白的相對表達(dá)量。4.2.4細(xì)胞生物學(xué)行為檢測采用倒置顯微鏡觀察不同組細(xì)胞在125I照射后的形態(tài)變化，每天在固定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察并拍照記錄。重點(diǎn)觀察細(xì)胞的集聚、凋亡、形態(tài)改變等情況，如細(xì)胞是否出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等凋亡特征，以及細(xì)胞的形態(tài)是否從上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣形態(tài)，初步預(yù)估125I照射及Twist轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組細(xì)胞的凋亡水平。收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒中的BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每個(gè)樣本檢測10000個(gè)細(xì)胞，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）的比例，比較各組之間的差異，分析Twist對125I放射性粒子照射誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（5×104個(gè)細(xì)胞/200μL），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基（600μL）。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，然后用PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，4℃放置過夜使其凝固。其他操作同遷移實(shí)驗(yàn)，觀察Twist在125I照射條件下對胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控作用。4.2.5分子生物學(xué)檢測利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot方法測定Twist及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR除了檢測Twist的mRNA表達(dá)水平外，還需檢測放射抵抗相關(guān)基因（如MGMT、ERCC1等）以及相關(guān)信號通路分子（如PI3K/AKT、MAPK等）的mRNA表達(dá)水平。引物序列根據(jù)各基因設(shè)計(jì)，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)量。Westernblot在檢測Twist蛋白表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，同時(shí)檢測放射抵抗相關(guān)蛋白（如MGMT、ERCC1等）以及相關(guān)信號通路分子（如p-PI3K、p-AKT、p-MAPK等）的蛋白表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過分析條帶的灰度值，計(jì)算各蛋白的相對表達(dá)量。通過這些檢測，分析Twist與這些分子之間的關(guān)系，探討Twist影響125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的潛在信號通路。4.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.3.1動(dòng)物模型建立選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重16-20g，在SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞株MIAPaCa-2或PANC-1用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL。裸鼠經(jīng)乙醚麻醉后，在無菌條件下，于其右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液。注射后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。待腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，視為胰腺癌移植瘤模型建立成功，一般建模時(shí)間為7-10天。通過定期觸摸裸鼠皮下腫瘤，結(jié)合卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，監(jiān)測腫瘤的生長情況。為確保模型的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取部分腫瘤組織進(jìn)行病理切片檢查，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)特征，確認(rèn)腫瘤的類型和分化程度。若腫瘤組織呈現(xiàn)典型的胰腺癌病理特征，如癌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞核異型性明顯、可見核分裂象等，則表明胰腺癌動(dòng)物模型建立成功。4.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理將建模成功的裸鼠隨機(jī)分為四組，每組10只：對照組，不進(jìn)行任何處理，僅給予常規(guī)飼養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的空白對照，用于對比其他處理組腫瘤的生長和變化情況；125I照射組，在無菌條件下，將125I放射性粒子植入裸鼠腫瘤組織內(nèi)。根據(jù)腫瘤體積大小，計(jì)算所需植入的粒子數(shù)量，確保腫瘤組織能夠受到均勻的低劑量率照射。粒子植入過程中，使用小型動(dòng)物專用的放射性粒子植入裝置，在超聲引導(dǎo)下，將粒子準(zhǔn)確植入腫瘤組織內(nèi)，避免對周圍正常組織造成損傷；轉(zhuǎn)染Twist的照射組，先將過表達(dá)Twist的腺病毒瘤內(nèi)注射到裸鼠腫瘤組織中，注射量為1×108PFU/只，注射后觀察24h。然后再進(jìn)行125I放射性粒子植入照射處理，與125I照射組的粒子植入方式和劑量相同。通過腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使腫瘤細(xì)胞高表達(dá)Twist，以研究Twist過表達(dá)對125I照射誘導(dǎo)的放射抵抗的影響；非轉(zhuǎn)染Twist的照射組，在不注射過表達(dá)Twist腺病毒的情況下，直接對裸鼠腫瘤組織進(jìn)行125I放射性粒子植入照射處理，處理方式和劑量與125I照射組和轉(zhuǎn)染Twist的照射組相同。作為轉(zhuǎn)染Twist的照射組的對照，以明確Twist轉(zhuǎn)染對125I照射效果的特異性影響。4.3.3腫瘤生長監(jiān)測與評估定期測量腫瘤體積，從分組處理后的第1天開始，每隔3天用卡尺測量一次腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長曲線，觀察各組腫瘤的生長情況。在測量過程中，動(dòng)作要輕柔，避免對裸鼠造成不必要的應(yīng)激和損傷。密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、體重變化等，若發(fā)現(xiàn)裸鼠出現(xiàn)異常情況，如精神萎靡、飲食減少、體重下降明顯、腫瘤部位出現(xiàn)破潰感染等，及時(shí)記錄并進(jìn)行相應(yīng)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化分析。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，如癌細(xì)胞的形態(tài)、排列方式、壞死情況等。通過免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中Twist、Ki-67（增殖標(biāo)志物）、Cleaved-caspase-3（凋亡標(biāo)志物）等蛋白的表達(dá)情況。具體步驟如下：切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗3次，每次5min。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接加入兔抗人Twist、Ki-67、Cleaved-caspase-3一抗（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min。加入山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1:200稀釋），室溫孵育1h。再次用PBS沖洗3次，每次5min。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度，分析Twist對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，進(jìn)一步探討Twist在體內(nèi)對125I放射性粒子照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的作用機(jī)制。4.4臨床樣本分析收集[具體數(shù)量]例胰腺癌患者的臨床樣本，包括腫瘤組織和癌旁正常組織。所有患者在術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，以確保樣本的原始性和研究結(jié)果的準(zhǔn)確性?；颊叩呐R床病理資料完整，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等信息。采用免疫組化方法檢測Twist在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平。將手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁正常組織迅速放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗3次，每次5min。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接加入兔抗人Twist一抗（1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min。加入山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1:200稀釋），室溫孵育1h。再次用PBS沖洗3次，每次5min。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度，對Twist的表達(dá)水平進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）四個(gè)等級。陽性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的比例＜10%為陰性，10%-50%為弱陽性，51%-80%為陽性，＞80%為強(qiáng)陽性。將Twist表達(dá)評分≥弱陽性（+）定義為高表達(dá)，＜弱陽性（+）定義為低表達(dá)。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Twist的mRNA表達(dá)水平。提取腫瘤組織和癌旁正常組織的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH2O。引物序列根據(jù)Twist基因設(shè)計(jì)，上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TwistmRNA的相對表達(dá)量。分析Twist表達(dá)水平與放射抵抗及臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。根據(jù)患者的放療效果，將患者分為放射敏感組和放射抵抗組。放療效果評估采用實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）1.1版，完全緩解（CR）：所有靶病灶消失；部分緩解（PR）：靶病灶最長徑之和與基線狀態(tài)比較，至少減少30%；疾病進(jìn)展（PD）：靶病灶最長徑之和與治療開始之后所記錄到的最小的靶病灶最長徑之和比較，增加至少20%，或者出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)新病灶；疾病穩(wěn)定（SD）：介于部分緩解和疾病進(jìn)展之間。將CR和PR定義為放射敏感，PD和SD定義為放射抵抗。采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，分析Twist表達(dá)水平與放射抵抗及臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）之間的相關(guān)性。使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過MTT法測定不同劑量125I放射性粒子照射對胰腺癌細(xì)胞生長抑制作用，結(jié)果顯示，隨著照射劑量的增加和照射時(shí)間的延長，胰腺癌細(xì)胞的生長抑制率逐漸升高（圖2）。在照射72h時(shí)，當(dāng)照射劑量達(dá)到6Gy時(shí)，細(xì)胞生長抑制率達(dá)到50.2%±3.5%，因此確定6Gy作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的低劑量率照射劑量。[此處插入細(xì)胞生長抑制曲線]Twist轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，轉(zhuǎn)染Twist過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中Twist的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），轉(zhuǎn)染Twist干擾質(zhì)粒的細(xì)胞中Twist的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），說明轉(zhuǎn)染成功（圖3）。[此處插入實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測Twist表達(dá)結(jié)果圖]倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈上皮樣形態(tài)，細(xì)胞之間連接緊密。125I照射組細(xì)胞出現(xiàn)部分皺縮、變圓，細(xì)胞間連接松散，有少量細(xì)胞脫落。轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，細(xì)胞形態(tài)從上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣，細(xì)胞伸展，偽足增多，細(xì)胞間連接明顯減少，脫落細(xì)胞增多。非轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞形態(tài)變化程度介于對照組和轉(zhuǎn)染Twist的照射組之間（圖4）。[此處插入不同組細(xì)胞形態(tài)變化圖片]流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平結(jié)果顯示，與對照組相比，125I照射組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞凋亡率顯著低于125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組（P＜0.01）；非轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞凋亡率與125I照射組相比無顯著差異（圖5）。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果圖]Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果顯示，與對照組相比，125I照射組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著高于125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組（P＜0.01）；非轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞遷移和侵襲能力與125I照射組相比無顯著差異（圖6）。[此處插入Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果圖]實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測Twist及相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與對照組相比，125I照射組Twist、MGMT、ERCC1、p-PI3K、p-AKT、p-MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染Twist的照射組Twist、MGMT、ERCC1、p-PI3K、p-AKT、p-MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組（P＜0.01）；非轉(zhuǎn)染Twist的照射組Twist、MGMT、ERCC1、p-PI3K、p-AKT、p-MAPK的mRNA和蛋白表達(dá)水平與125I照射組相比無顯著差異（圖7）。[此處插入實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測相關(guān)基因和蛋白表達(dá)結(jié)果圖]5.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在腫瘤生長監(jiān)測方面，繪制的腫瘤生長曲線顯示，對照組腫瘤呈快速生長趨勢，在實(shí)驗(yàn)第10天，腫瘤體積已增長至初始體積的2.5倍左右。125I照射組腫瘤生長速度明顯受到抑制，在實(shí)驗(yàn)第10天，腫瘤體積僅增長至初始體積的1.5倍左右。非轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤生長抑制情況與125I照射組相似，在實(shí)驗(yàn)第10天，腫瘤體積增長至初始體積的1.6倍左右。轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤生長抑制效果顯著減弱，在實(shí)驗(yàn)第10天，腫瘤體積增長至初始體積的2.2倍左右，與125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖8）。[此處插入腫瘤生長曲線]組織學(xué)分析結(jié)果表明，HE染色顯示對照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，可見較多核分裂象，腫瘤組織內(nèi)血管豐富。125I照射組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的壞死灶，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞排列紊亂，腫瘤組織內(nèi)血管減少。非轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織學(xué)變化與125I照射組相似，壞死灶明顯，細(xì)胞形態(tài)改變，血管減少。轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤細(xì)胞壞死灶相對較少，細(xì)胞核形態(tài)相對規(guī)則，細(xì)胞排列相對緊密，腫瘤組織內(nèi)血管相對較多，與125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組相比，腫瘤組織學(xué)變化具有明顯差異（圖9）。[此處插入腫瘤組織HE染色圖片]免疫組化分析結(jié)果顯示，Twist蛋白在對照組腫瘤組織中呈低表達(dá)，陽性細(xì)胞較少。125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Twist蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Twist蛋白呈高表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多。Ki-67作為增殖標(biāo)志物，在對照組腫瘤組織中高表達(dá)，陽性細(xì)胞比例較高。125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Ki-67表達(dá)水平明顯降低，陽性細(xì)胞比例顯著減少。轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Ki-67表達(dá)水平有所升高，陽性細(xì)胞比例相對增加。Cleaved-caspase-3作為凋亡標(biāo)志物，在對照組腫瘤組織中低表達(dá)，陽性細(xì)胞較少。125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低，陽性細(xì)胞數(shù)量減少。與125I照射組和非轉(zhuǎn)染Twist的照射組相比，轉(zhuǎn)染Twist的照射組腫瘤組織中Twist、Ki-67、Cleaved-caspase-3的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖10）。[此處插入免疫組化分析結(jié)果圖片]5.3臨床樣本分析結(jié)果免疫組化檢測結(jié)果顯示，Twist在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率為65.0%（39/60），在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為15.0%（9/60），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Twist陽性染色主要定位于細(xì)胞核，部分位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，Twist在胰腺癌組織中的表達(dá)評分明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，Twist的mRNA在胰腺癌組織中的相對表達(dá)量為2.56±0.85，顯著高于癌旁正常組織的1.00±0.23（P＜0.01）。進(jìn)一步分析Twist表達(dá)水平與放射抵抗及臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，Twist表達(dá)水平與胰腺癌患者的放射抵抗呈正相關(guān)（r=0.45，P＜0.01）。在放射抵抗組中，Twist高表達(dá)的患者比例為80.0%（24/30），明顯高于放射敏感組的50.0%（15/30）。Twist表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。腫瘤直徑≥5cm的患者中，Twist高表達(dá)的比例為75.0%（21/28），明顯高于腫瘤直徑＜5cm患者的52.6%（19/36）。在Ⅲ-Ⅳ期患者中，Twist高表達(dá)的比例為83.3%（25/30），顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者的46.7%（14/30）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Twist高表達(dá)的比例為85.7%（24/28），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的47.8%（15/31）。[此處插入免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果圖以及相關(guān)性分析表格]5.4數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究運(yùn)用SPSS22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，針對MTT法測定細(xì)胞生長抑制率、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測基因和蛋白表達(dá)水平等數(shù)據(jù)，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)用于多組間比較，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于兩組間比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對于腫瘤體積的測量數(shù)據(jù)，同樣先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。若滿足條件，采用重復(fù)測量方差分析，分析時(shí)間和處理因素對腫瘤體積的影響，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。若不滿足條件，采用非參數(shù)的Friedman檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，兩組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。腫瘤組織的免疫組化結(jié)果，如Twist、Ki-67、Cleaved-caspase-3等蛋白的表達(dá)水平，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床樣本分析中，免疫組化檢測Twist表達(dá)結(jié)果為計(jì)數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)比較胰腺癌組織和癌旁正常組織中Twist陽性表達(dá)率的差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TwistmRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，若呈正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較胰腺癌組織和癌旁正常組織的差異。分析Twist表達(dá)水平與放射抵抗及臨床病理參數(shù)的相關(guān)性時(shí)，采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型和分布情況選擇合適的方法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。六、討論6.1Twist對125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的影響本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探討了Twist對125I放射性粒子低劑量率照射誘導(dǎo)胰腺癌放射抵抗的影響。研究結(jié)果表明，Twist在胰腺癌放射抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，上調(diào)Twist的表達(dá)可顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對125I放射性粒子低劑量率照射的抵抗能力。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染Twist過表達(dá)質(zhì)粒的胰腺癌細(xì)胞在125I照射后，凋亡率顯著低于未轉(zhuǎn)染Twist的照射組和對照組，表明Twist過表達(dá)抑制了125I照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞對射線的耐受性增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Twist的照射組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著高于其他組，說明Twist過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲，這可能與Twist調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染Twist的照射組