低劑量三氧化二砷對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均位居前列。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌是全球第六大常見(jiàn)癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大疾病，5年生存率僅為18%。在中國(guó)，肝癌同樣是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)人口占全球的18.4%，但2018年中國(guó)肝癌新發(fā)病例和死亡病例分別高達(dá)全球總數(shù)的46.7%和47.2%。肝癌起病隱匿，早期無(wú)特異性癥狀，中國(guó)患者在首次診斷時(shí)80%都是中晚期，生存狀況亟待改善。即使是接受了根治性手術(shù)治療的患者，5年內(nèi)仍有60-70％的病人會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，肝癌的高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)特性嚴(yán)重影響了患者的長(zhǎng)期生存。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法和藥物，對(duì)于提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。小鼠H22肝癌細(xì)胞系是一種常用的肝癌細(xì)胞系，具有高度惡性和快速增殖的特性。它在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用，可用于模擬肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程，探索肝癌病理生理特點(diǎn)和分子機(jī)制，還可用于篩選和評(píng)價(jià)肝癌治療藥物和新型治療方法。通過(guò)對(duì)H22細(xì)胞的研究，能夠深入了解肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，為肝癌的治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。三氧化二砷（ArsenicTrioxide，ATO），即砒霜的主要成分，在癌癥治療領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。隨著現(xiàn)代制藥技術(shù)的發(fā)展，亞砷酸注射液已臨床廣泛用于惡性腫瘤，特別是肝癌和急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療。ATO參與肝癌細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖、抑制侵襲轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤干細(xì)胞等。目前，ATO在肝癌治療中有多種方式，主要包括單藥治療、聯(lián)合局部治療、聯(lián)合全身治療等。研究表明，ATO聯(lián)合TACE（經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)）治療中晚期原發(fā)性肝癌，可提高總有效率，延長(zhǎng)腫瘤無(wú)進(jìn)展生存期，且不增加不良反應(yīng)。然而，ATO在臨床應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題，如完全緩解所需時(shí)間較長(zhǎng)、毒副反應(yīng)較大、患者依從性較差等。本研究聚焦于ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體內(nèi)外研究，旨在深入探究ATO對(duì)H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察ATO對(duì)H22細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，從細(xì)胞層面揭示其抑制轉(zhuǎn)移的作用效果；利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立荷瘤小鼠模型，研究ATO在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制情況，進(jìn)一步驗(yàn)證其在整體生物體內(nèi)的作用。深入探討ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。本研究對(duì)于推動(dòng)肝癌治療領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐意義，有望為肝癌患者帶來(lái)新的治療希望和更好的生存預(yù)后。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其治療研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。在眾多肝癌治療研究中，三氧化二砷（ATO）因其獨(dú)特的抗癌特性而備受關(guān)注。在國(guó)外，ATO治療肝癌的研究取得了一定進(jìn)展。一些研究聚焦于ATO對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，揭示了ATO能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖的作用機(jī)制。例如，[具體文獻(xiàn)1]的研究發(fā)現(xiàn)，ATO可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，關(guān)于ATO對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響的研究相對(duì)較少，且現(xiàn)有研究主要集中在少數(shù)肝癌細(xì)胞系上，對(duì)于不同類型肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全明確。國(guó)內(nèi)對(duì)ATO治療肝癌的研究起步較早，且在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究方面都取得了顯著成果。在臨床應(yīng)用中，ATO聯(lián)合其他治療方法，如聯(lián)合經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE），已被證明能夠提高中晚期原發(fā)性肝癌患者的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期。在基礎(chǔ)研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者深入探究了ATO抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。[具體文獻(xiàn)2]的研究表明，ATO可能通過(guò)調(diào)節(jié)某些信號(hào)通路，如Wnt/β-連環(huán)素信號(hào)通路，來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而，目前國(guó)內(nèi)的研究在ATO抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制方面仍存在一些不足，部分研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，尚未形成統(tǒng)一的理論體系。小鼠肝癌H22細(xì)胞系在肝癌研究中具有重要地位，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用該細(xì)胞系開(kāi)展了大量研究。[具體文獻(xiàn)3]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察了ATO對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)ATO能夠顯著減小腫瘤體積，延長(zhǎng)小鼠生存期。但在H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面的研究相對(duì)薄弱，對(duì)于ATO如何抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制，還缺乏深入系統(tǒng)的研究。綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ATO治療肝癌的研究雖取得了一定成果，但在ATO抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面仍存在諸多不足。本研究聚焦于ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體內(nèi)外研究，有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略，具有重要的創(chuàng)新性和必要性。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究三氧化二砷（ATO）抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其潛在分子機(jī)制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：體外實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)小鼠肝癌H22細(xì)胞，采用不同濃度的ATO對(duì)其進(jìn)行處理。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)ATO對(duì)H22細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，觀察細(xì)胞穿過(guò)小室膜的數(shù)量變化，以此評(píng)估ATO對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制效果；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，直觀地觀察ATO處理后H22細(xì)胞在劃痕區(qū)域的遷移情況，測(cè)量劃痕愈合率，進(jìn)一步驗(yàn)證ATO對(duì)細(xì)胞遷移能力的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建小鼠肝癌H22細(xì)胞荷瘤模型，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和ATO治療組。對(duì)治療組小鼠給予不同劑量的ATO進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組給予等量的生理鹽水。觀察小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量腫瘤體積和重量，記錄小鼠的生存時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠的腫瘤組織及其他相關(guān)臟器進(jìn)行解剖，觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，通過(guò)病理切片分析腫瘤的侵襲范圍和轉(zhuǎn)移灶的形成，研究ATO在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。檢測(cè)指標(biāo)：在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，均檢測(cè)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)水平。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)變化，分析ATO對(duì)EMT過(guò)程的影響；檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員如MMP-2、MMP-9等的表達(dá)水平，探究ATO對(duì)腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)能力的作用，從而揭示ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。機(jī)制探究：深入探討ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)等手段，研究ATO可能作用的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，明確ATO抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點(diǎn)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為肝癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。1.4研究方法與技術(shù)路線細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)獲取小鼠肝癌H22細(xì)胞，將其置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取健康的BALB/c小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞以1×10?個(gè)/只的密度接種于小鼠右腋皮下，構(gòu)建荷瘤小鼠模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和ATO治療組，每組10只。治療組小鼠給予不同劑量（如低劑量5mg/kg、高劑量10mg/kg）的ATO腹腔注射，對(duì)照組給予等量的生理鹽水，每周注射3次，連續(xù)觀察3周。期間每隔3天測(cè)量小鼠的體重和腫瘤體積，記錄小鼠的生存情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，完整取出腫瘤組織、肝臟、肺臟等臟器，用生理鹽水沖洗干凈，稱重并拍照記錄，部分組織用于后續(xù)的病理分析和分子生物學(xué)檢測(cè)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的H22細(xì)胞（1×10?個(gè)/孔），下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。實(shí)驗(yàn)組上室加入不同濃度（如1μM、5μM、10μM）的ATO，對(duì)照組加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估ATO對(duì)H22細(xì)胞遷移能力的影響。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)價(jià)ATO對(duì)H22細(xì)胞侵襲能力的作用。劃痕實(shí)驗(yàn)：將H22細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至90%以上時(shí)，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，用PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度ATO的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基，分別于0h、24h、48h在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，以評(píng)估ATO對(duì)H22細(xì)胞遷移能力的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：收集體外培養(yǎng)的H22細(xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)獲取的腫瘤組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（如抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9等抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，再次洗膜后，利用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：采用Trizol試劑提取體外培養(yǎng)的H22細(xì)胞和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)獲取的腫瘤組織的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，引物序列根據(jù)目的基因（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9等）設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析ATO對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。生物信息學(xué)分析：利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如GeneExpressionOmnibus、TheCancerGenomeAtlas等）下載肝癌相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)分析工具（如DAVID、STRING等）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路和關(guān)鍵基因。通過(guò)分析ATO處理前后H22細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，初步預(yù)測(cè)ATO可能作用的信號(hào)通路和靶點(diǎn)，為后續(xù)機(jī)制研究提供理論依據(jù)?；虺聊瓦^(guò)表達(dá)技術(shù)：針對(duì)預(yù)測(cè)的ATO作用靶點(diǎn)基因，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的小干擾RNA（siRNA）和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H22細(xì)胞中，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，篩選出干擾或過(guò)表達(dá)效果最佳的細(xì)胞株。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別用ATO處理，采用上述Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Westernblot和qRT-PCR等方法，檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和相關(guān)蛋白、基因表達(dá)水平的變化，驗(yàn)證靶點(diǎn)基因在ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。本研究的技術(shù)路線圖如下：獲取小鼠肝癌H22細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，一部分細(xì)胞用于體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；同時(shí)提取蛋白和RNA，進(jìn)行Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)。另一部分細(xì)胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，給予ATO治療，觀察腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況，解剖獲取組織，進(jìn)行病理分析和分子生物學(xué)檢測(cè)。通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)ATO作用的信號(hào)通路和靶點(diǎn)，利用基因沉默和過(guò)表達(dá)技術(shù)驗(yàn)證靶點(diǎn)基因的作用，最終綜合分析數(shù)據(jù)，探究ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。二、ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體外研究2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：小鼠肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司）中，于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）中培養(yǎng)，定期傳代以保持細(xì)胞活性。試劑：三氧化二砷（ATO，Sigma公司），用無(wú)菌蒸餾水配制成10mM的母液，過(guò)濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆?。Transwell小室（Corning公司，8μm孔徑），Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），結(jié)晶紫染色液（Solarbio公司），RIPA裂解液（Beyotime公司），BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司），SDS凝膠制備試劑盒（Bio-Rad公司），PVDF膜（Millipore公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoScientific公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），SYBRGreen熒光染料（TaKaRa公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），倒置顯微鏡（Olympus），低速離心機(jī)（Eppendorf），酶標(biāo)儀（Bio-Tek），PCR儀（AppliedBiosystems），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與ATO處理：將復(fù)蘇后的H22細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（Solarbio公司）消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度ATO（0μM、1μM、5μM、10μM）的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量的不含ATO的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。Transwell小室實(shí)驗(yàn)：遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入200μL用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的H22細(xì)胞（1×10?個(gè)/孔），下室加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。實(shí)驗(yàn)組上室加入不同濃度的ATO，對(duì)照組加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min，然后用結(jié)晶紫染色15min，用PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)量，取平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn)類似，不同之處在于Transwell小室預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠（1:8稀釋）包被，4℃過(guò)夜，待基質(zhì)膠凝固后進(jìn)行后續(xù)操作，通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)價(jià)ATO對(duì)H22細(xì)胞侵襲能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)：將H22細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至90%以上時(shí)，用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，用PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度ATO的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基，分別于0h、24h、48h在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，以評(píng)估ATO對(duì)H22細(xì)胞遷移能力的影響。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：收集不同處理組的H22細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9抗體，均為1:1000稀釋，CellSignalingTechnology公司），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗（1:5000稀釋，JacksonImmunoResearch公司），室溫孵育1h，再次洗膜后，利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：采用Trizol試劑提取不同處理組H22細(xì)胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，引物序列如下：E-cadherin上游引物5'-CCGAGAGTGTCCAACGAGAT-3'，下游引物5'-CCGTTCTGAGTCTCCAGTCA-3'；N-cadherin上游引物5'-CCTTCCAGCCCTATCTGTCC-3'，下游引物5'-TGTCCTTGTTCCGCTCTTTC-3'；Vimentin上游引物5'-TGGAGATGAAGCTGGTGACG-3'，下游引物5'-CCCTTGGTCACATCTTCGGT-3'；MMP-2上游引物5'-GCCATGCTGTTCTACCTGGT-3'，下游引物5'-AGGGTCAGGGAAGACGAGAA-3'；MMP-9上游引物5'-TCTTCTGCTGGTGCTGACTC-3'，下游引物5'-TCTGCTGATGGCTGGTAGTG-3'；GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析ATO對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果ATO對(duì)H22細(xì)胞活力的影響：采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度ATO處理24h后H22細(xì)胞的活力。結(jié)果如圖1所示，隨著ATO濃度的增加，H22細(xì)胞的活力逐漸降低，呈濃度依賴性。與對(duì)照組（0μMATO）相比，1μMATO處理組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化（P>0.05），5μM和10μMATO處理組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01），表明高濃度的ATO對(duì)H22細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。ATO對(duì)H22細(xì)胞粘附能力的影響：通過(guò)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATO對(duì)H22細(xì)胞粘附能力的影響。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞在基質(zhì)上粘附良好，細(xì)胞形態(tài)飽滿。隨著ATO濃度的升高，細(xì)胞粘附數(shù)量逐漸減少。與對(duì)照組相比，1μMATO處理組細(xì)胞粘附數(shù)量略有下降，但差異不顯著（P>0.05）；5μM和10μMATO處理組細(xì)胞粘附數(shù)量明顯減少（P<0.05），表明ATO能夠抑制H22細(xì)胞的粘附能力，且呈濃度依賴性。ATO對(duì)H22細(xì)胞遷移能力的影響：Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量較多，而隨著ATO濃度的增加，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少（圖2）。與對(duì)照組相比，1μMATO處理組遷移細(xì)胞數(shù)略有降低（P>0.05），5μM和10μMATO處理組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01），表明ATO能夠抑制H22細(xì)胞的遷移能力，且抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transwell小室實(shí)驗(yàn)一致，隨著ATO濃度的升高，劃痕愈合率逐漸降低（圖3）。0h時(shí)，各組劃痕寬度無(wú)明顯差異；24h和48h時(shí)，1μMATO處理組劃痕愈合率與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（P>0.05），5μM和10μMATO處理組劃痕愈合率顯著低于對(duì)照組（P<0.01），進(jìn)一步證明ATO能夠抑制H22細(xì)胞的遷移能力。ATO對(duì)H22細(xì)胞侵襲能力的影響：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞能夠穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠并侵襲到下室，而ATO處理組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少（圖4）。與對(duì)照組相比，1μMATO處理組侵襲細(xì)胞數(shù)有所下降，但差異不顯著（P>0.05），5μM和10μMATO處理組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.01），說(shuō)明ATO能夠抑制H22細(xì)胞的侵襲能力，且呈濃度依賴性。ATO對(duì)H22細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響：Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1μMATO處理組E-cadherin表達(dá)略有升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)略有降低，但差異均不顯著（P>0.05）；5μM和10μMATO處理組E-cadherin表達(dá)顯著升高（P<0.01），N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著降低（P<0.01）（圖5）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與Westernblot一致，5μM和10μMATO處理組E-cadherin基因表達(dá)顯著上調(diào)，N-cadherin和Vimentin基因表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）（圖6），表明ATO可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程來(lái)抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。ATO對(duì)H22細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響：Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1μMATO處理組MMP-2和MMP-9表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05），5μM和10μMATO處理組MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著降低（P<0.01）（圖7）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，5μM和10μMATO處理組MMP-2和MMP-9基因表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）（圖8），提示ATO可能通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了三氧化二砷（ATO）對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)能力的影響，結(jié)果表明ATO能夠顯著抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，且呈濃度依賴性。在細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中，高濃度的ATO對(duì)H22細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，這為后續(xù)研究ATO對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞粘附是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的起始步驟，ATO能夠抑制H22細(xì)胞的粘附能力，減少細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，從而降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲潛能。Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，ATO能夠顯著抑制H22細(xì)胞的遷移能力，減少細(xì)胞穿過(guò)小室膜或在劃痕區(qū)域的遷移數(shù)量。細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，ATO處理后，H22細(xì)胞侵襲到下室的數(shù)量明顯減少，說(shuō)明ATO能夠有效抑制H22細(xì)胞的侵襲能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中起著重要作用。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。本研究中，ATO處理后，H22細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)顯著升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著降低，表明ATO可能通過(guò)抑制EMT過(guò)程來(lái)抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。ATO處理后，H22細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著降低，提示ATO可能通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果為ATO在肝癌治療中的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，揭示了ATO抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。然而，本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，后續(xù)研究可進(jìn)一步在體內(nèi)動(dòng)物模型中驗(yàn)證ATO的作用，并深入探究其具體的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，為肝癌的臨床治療提供更有力的理論支持。同時(shí)，考慮到ATO的毒性問(wèn)題，未來(lái)研究可探索如何優(yōu)化ATO的給藥方式和劑量，以提高其治療效果并降低毒副作用。三、ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重18-22g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠在溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。試劑與儀器：三氧化二砷（ATO，Sigma公司），用無(wú)菌生理鹽水配制成所需濃度的溶液；RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司），胎牛血清（FBS，Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Solarbio公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（Beyotime公司），免疫組織化學(xué)染色試劑盒（ZSGB-BIO公司）；游標(biāo)卡尺，電子天平，石蠟切片機(jī)（Leica公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus公司）。動(dòng)物模型建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肝癌H22細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在無(wú)菌條件下，將0.2mL細(xì)胞懸液接種于BALB/c小鼠右腋皮下，每只小鼠接種2×10?個(gè)細(xì)胞。接種后每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神、飲食、活動(dòng)等情況，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和ATO治療組，每組10只。ATO給藥：ATO治療組小鼠給予不同劑量的ATO腹腔注射，低劑量組為5mg/kg，高劑量組為10mg/kg，每周注射3次，連續(xù)注射3周；對(duì)照組小鼠給予等量的無(wú)菌生理鹽水腹腔注射，注射頻率和時(shí)間與治療組相同。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并記錄小鼠的體重變化。檢測(cè)指標(biāo)及方法腫瘤生長(zhǎng)情況：定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和體重變化曲線，觀察ATO對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用以及對(duì)小鼠體重的影響。腫瘤轉(zhuǎn)移情況：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整取出腫瘤組織、肝臟、肺臟等臟器，用生理鹽水沖洗干凈，稱重并拍照記錄。將臟器用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的侵襲范圍和轉(zhuǎn)移灶的形成情況，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，評(píng)估ATO對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果。免疫組織化學(xué)染色：選取部分腫瘤組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員MMP-2、MMP-9等蛋白的表達(dá)情況。具體操作按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，以陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度來(lái)評(píng)估蛋白表達(dá)水平。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠成瘤情況：在接種H22細(xì)胞后，對(duì)照組和ATO治療組小鼠均成功成瘤。從腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖9）可以看出，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組小鼠腫瘤體積逐漸增大，增長(zhǎng)速度較快。而ATO治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，低劑量組（5mg/kg）和高劑量組（10mg/kg）腫瘤體積均顯著小于對(duì)照組（P<0.01）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組小鼠腫瘤平均重量為（1.56±0.23）g，低劑量組為（0.89±0.15）g，高劑量組為（0.62±0.12）g，高劑量組的腫瘤重量顯著低于低劑量組（P<0.05）。小鼠肺轉(zhuǎn)移情況：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠肺臟進(jìn)行解剖觀察并計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移灶。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺表面可見(jiàn)大量明顯的轉(zhuǎn)移灶，平均肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（18.6±3.2）個(gè)；ATO治療組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，低劑量組平均肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（10.2±2.5）個(gè)，高劑量組為（5.8±1.8）個(gè)，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且高劑量組的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著低于低劑量組（P<0.05）。小鼠生存情況：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)，對(duì)照組小鼠生存狀況較差，精神萎靡，活動(dòng)減少，進(jìn)食量下降，體重逐漸減輕，部分小鼠在實(shí)驗(yàn)后期出現(xiàn)死亡。而ATO治療組小鼠精神狀態(tài)相對(duì)較好，活動(dòng)和進(jìn)食量較對(duì)照組有所改善，體重下降幅度較小。生存曲線（圖10）顯示，對(duì)照組小鼠中位生存時(shí)間為21天，低劑量組為25天，高劑量組為28天，ATO治療組小鼠生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P<0.01），且高劑量組生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于低劑量組（P<0.05）。組織病理變化：對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大且深染，可見(jiàn)較多病理性核分裂象，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈現(xiàn)出典型的惡性腫瘤特征；ATO治療組腫瘤細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞核染色變淺，病理性核分裂象明顯減少，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為一致，腫瘤組織中出現(xiàn)較多壞死灶。在肺組織病理切片中，對(duì)照組肺組織可見(jiàn)大量癌細(xì)胞浸潤(rùn)，形成大小不一的轉(zhuǎn)移灶，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重；ATO治療組肺組織中癌細(xì)胞浸潤(rùn)減少，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小均明顯降低，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。3.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠肝癌H22細(xì)胞荷瘤模型，對(duì)ATO抑制小鼠體內(nèi)H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用進(jìn)行了深入探究，結(jié)果顯示ATO在體內(nèi)具有顯著的抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果。在腫瘤生長(zhǎng)方面，ATO治療組小鼠腫瘤體積和重量均顯著小于對(duì)照組，且高劑量組的抑制效果更為明顯。這表明ATO能夠有效抑制小鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的增殖，減緩腫瘤的生長(zhǎng)速度。這一結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)中ATO對(duì)H22細(xì)胞活力的抑制作用相一致，進(jìn)一步證實(shí)了ATO對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用在體內(nèi)同樣顯著。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是肝癌治療面臨的重大挑戰(zhàn)，也是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因。在本研究中，ATO治療組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，表明ATO能夠顯著抑制H22細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。肺是肝癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位之一，肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量的減少意味著ATO可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)散，從而減少了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。從生存情況來(lái)看，ATO治療組小鼠生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，高劑量組生存時(shí)間又顯著長(zhǎng)于低劑量組。這充分說(shuō)明ATO不僅能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，還能明顯改善荷瘤小鼠的生存狀況，延長(zhǎng)其生存期。這對(duì)于肝癌的治療具有重要意義，提示ATO可能成為提高肝癌患者生存率的有效治療藥物。通過(guò)對(duì)腫瘤組織和肺組織的病理分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了ATO對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。ATO治療組腫瘤細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，病理性核分裂象減少，腫瘤組織中出現(xiàn)較多壞死灶，表明ATO能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖。在肺組織中，ATO治療組癌細(xì)胞浸潤(rùn)減少，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小均明顯降低，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，直觀地展示了ATO對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ATO治療組腫瘤組織中E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低，MMP-2和MMP-9表達(dá)也顯著降低，這與體外實(shí)驗(yàn)中ATO對(duì)EMT相關(guān)蛋白和MMPs表達(dá)的影響一致。表明ATO在體內(nèi)可能同樣通過(guò)抑制EMT過(guò)程，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果表明，ATO在體內(nèi)能夠顯著抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，改善荷瘤小鼠的生存狀況。這為ATO在肝癌治療中的應(yīng)用提供了有力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，揭示了ATO作為肝癌治療藥物的潛在價(jià)值。然而，本研究仍存在一定局限性，如僅研究了兩種劑量的ATO對(duì)H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化ATO的給藥劑量和方案，以確定最佳治療劑量。同時(shí)，ATO抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體信號(hào)通路和分子機(jī)制尚未完全明確，后續(xù)研究可深入探究，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：小鼠肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司）中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司）中培養(yǎng)。三氧化二砷（ATO，Sigma公司）用無(wú)菌蒸餾水配制成10mM母液，過(guò)濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆?。此外，?shí)驗(yàn)還用到了蛋白質(zhì)提取試劑盒（Beyotime公司）、BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）、SDS凝膠制備試劑盒（Bio-Rad公司）、PVDF膜（Millipore公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoScientific公司）、鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9抗體及相應(yīng)的二抗（CellSignalingTechnology公司）。蛋白質(zhì)組學(xué)分析：收集經(jīng)不同濃度ATO（0μM、5μM、10μM）處理24h的H22細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，加入適量的蛋白質(zhì)提取試劑盒中的裂解液，冰上裂解30min，期間不斷輕柔吹打。4℃、12000rpm離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將定量后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，切取目的條帶。將切下的凝膠條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解，使用胰蛋白酶在37℃條件下酶解過(guò)夜。酶解后的肽段通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）進(jìn)行分析，質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置如下：離子源為電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測(cè)；掃描范圍為m/z300-1800；噴霧電壓為3.5kV；毛細(xì)管溫度為320℃。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)與小鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，使用MaxQuant軟件進(jìn)行分析，篩選出ATO處理前后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。差異表達(dá)蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：與對(duì)照組相比，表達(dá)倍數(shù)變化≥1.5或≤0.67，且P<0.05。Westernblotting檢測(cè)：將經(jīng)不同濃度ATO處理的H22細(xì)胞和荷瘤小鼠腫瘤組織，按照上述蛋白質(zhì)提取方法獲取總蛋白。取等量蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，使蛋白充分變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30min，分離膠120V，電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流250mA，轉(zhuǎn)膜90min。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2h，以減少非特異性結(jié)合。加入一抗（抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9抗體，均為1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目的蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，增強(qiáng)信號(hào)。再次用TBST洗膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析目的蛋白的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，校正目的蛋白的表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)：采用Trizol試劑提取經(jīng)不同濃度ATO處理的H22細(xì)胞和荷瘤小鼠腫瘤組織的總RNA，具體操作按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，引物序列根據(jù)目的基因（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9等）設(shè)計(jì)合成，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析ATO對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)：針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析和文獻(xiàn)報(bào)道篩選出的可能參與ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，選用相應(yīng)的信號(hào)通路抑制劑LY294002。將H22細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%-70%時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化處理12h。然后，實(shí)驗(yàn)組加入含LY294002（10μM）的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)處理1h，再加入含5μMATO的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h；對(duì)照組加入等量的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)處理1h后，加入含5μMATO的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，采用Westernblotting和qRT-PCR方法檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，以及細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白和基因（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9等）的表達(dá)變化，驗(yàn)證該信號(hào)通路在ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白鑒定結(jié)果：通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出102個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中與對(duì)照組相比，5μMATO處理組有35個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，67個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；10μMATO處理組有42個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，60個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物學(xué)過(guò)程，以及PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路。在細(xì)胞黏附相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中，多個(gè)參與細(xì)胞間連接和細(xì)胞與基質(zhì)黏附的蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，如鈣黏蛋白家族成員的表達(dá)下調(diào)，這可能影響細(xì)胞間的黏附力，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生影響。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，關(guān)鍵蛋白如PI3K的催化亞基和Akt的磷酸化水平發(fā)生改變，提示該信號(hào)通路可能在ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-2和nm23-M1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5μM和10μMATO處理組的H22細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），而nm23-M1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）（圖11）。在荷瘤小鼠腫瘤組織中也觀察到類似結(jié)果，ATO治療組腫瘤組織中MMP-2蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，nm23-M1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（圖12）。MMP-2作為一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，其表達(dá)降低意味著腫瘤細(xì)胞降解周圍基質(zhì)、為轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路的能力減弱。而nm23-M1是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其表達(dá)升高有助于抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明ATO可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2和nm23-M1的表達(dá)來(lái)抑制H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。4.3結(jié)果分析與討論本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析、Westernblotting以及信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)等多維度實(shí)驗(yàn)，深入探究ATO抑制小鼠肝癌H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，ATO處理后H22細(xì)胞中多個(gè)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化，這些差異表達(dá)蛋白主要富集在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞黏附是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始步驟，細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附相關(guān)蛋白表達(dá)的改變，可能通過(guò)影響細(xì)胞間的相互作用，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力產(chǎn)生影響。在眾多差異表達(dá)蛋白中，MMP-2和nm23-M1與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系尤為關(guān)鍵。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原等成分，而Ⅳ型膠原是基底膜的主要組成部分。腫瘤細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)MMP-2，降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而為自身的遷移和侵襲開(kāi)辟道路，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究中，ATO處理后的H22細(xì)胞及荷瘤小鼠腫瘤組織中，MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低。這表明ATO可能通過(guò)抑制MMP-2的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而有效抑制H22細(xì)胞的遷移和侵襲能力，阻礙腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。nm23-M1作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其編碼的蛋白具有多種生物學(xué)功能，在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要作用。nm23-M1蛋白能夠通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。該蛋白還可以通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑。在本研究中，ATO處理后H22細(xì)胞和荷瘤小鼠腫瘤組織中nm23-M1蛋白表達(dá)顯著升高，提示ATO可能通過(guò)上調(diào)nm23-M1的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，從而降低H22細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。綜合來(lái)看，ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移與MMP-2下調(diào)、nm23-M1上調(diào)密切相關(guān)。ATO可能通過(guò)降低MMP-2的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，削弱腫瘤細(xì)胞突破基底膜和周圍組織屏障的能力；同時(shí)，通過(guò)上調(diào)nm23-M1的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和血管生成的抑制作用，從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在ATO抑制H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，該信號(hào)通路常常被異常激活，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。當(dāng)使用PI3K抑制劑LY294002阻斷該信號(hào)通路后，ATO對(duì)H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用受到顯著影響。這表明ATO可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)H22細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。具體來(lái)說(shuō)，ATO可能通過(guò)抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻