動物病毒基因工程疫苗

研究進展郭萬柱教授

疫苗的發(fā)展階段基因工程疫苗的種類

疫苗的發(fā)展階段：

第一代疫苗：由受感染動物組織制備的病毒疫苗。

第二代疫苗：由受感染組織培養(yǎng)細胞制備的疫苗。

第三代疫苗：采用ＤＮＡ重組技術(shù)生產(chǎn)的基因工程疫苗。

基因工程疫苗的種類重組DNA亞單位疫苗化學合成多肽疫苗基因缺失疫苗重組病毒疫苗基因疫苗（核酸疫苗）反義RNA

一、重組DNA亞單位疫苗

制備亞單位疫苗的基本步驟：

1、確定疫苗中的免疫原必須時保護性抗原。

2、通過不同途徑克隆保護性抗原基因片段。

3、將保護性抗原片段克?。ㄖ亟M）到載體中表達。二、化學合成多肽疫苗

人工合成多肽（免疫原）能誘導機體產(chǎn)生抗體，抵抗病原攻擊。其僅能誘導機體產(chǎn)生體液免疫，且成本較高，難以推廣三、基因缺失疫苗

通過基因操作，將傳染病病原體的毒力基因剔除而致弱，從而降低其對易感動物的毒力，而其繁殖能力和表達免疫顯性決定簇的能力不受損害。病毒偽狂犬病基因缺失疫苗的研究本項目得到了國家自然科學基金，國家“九五”、“十五”攻關(guān)，863，國家成果轉(zhuǎn)化基金，四川省“八五”、“九五”、“十五”攻關(guān)等重大項目的資助?；蛉笔б呙缰甑臉?gòu)建TK基因缺失株的構(gòu)建---1PRVFaTK基因缺失株的構(gòu)建--2PRVFagI/gp63基因缺失株的構(gòu)建偽狂犬病三基因缺失疫苗SA215

生物學特性研究SA215在Vero細胞上致病變效應過程

SA215在接種Vero細胞后第8小時，引起細胞變圓、變亮，集聚成團；第12小時，可見局部細胞萎縮，細胞界限消失（見附圖2）；第16小時有少量細胞脫落，形成小的蝕斑（見附圖3）；第20小時，蝕斑進一步擴大（見附圖4）；第24小時，約有50%的區(qū)域，形成中等大小的蝕斑（見附圖5）；第36小時，相鄰的蝕斑相互融合形成較大的蝕斑，蝕斑邊緣的細胞面向下凹陷，形成特征性的“空洞”（見附圖6）。第40小時形成的蝕斑面積可占總面積的90%。蝕斑的平均直徑約為0.43mm。圖2接種SA215株12小時后的vero

細胞（10×10）圖3接種SA215株16小時后的vero

細胞（10×10）圖4接種SA215株20小時后的Vero細胞（10×10）圖1正常Vero細胞（10×10）圖5

接種SA215株24小時后的Vero細胞（10×10）圖6接種SA215株36小時后的Vero細胞（10×10）增殖特性`PRVSA215疫苗株的穿入動力學和一步生長曲線的測定試驗結(jié)果表明，基因缺失對該毒株在培養(yǎng)細胞的吸附和穿入過程沒有造成阻礙。SA215在細胞培養(yǎng)上易于生長和增殖。與親本株Fa株相比，表現(xiàn)為生長掩蔽期延長，增殖速度減緩，但能達到相似的增殖滴度。提示在增殖病毒時，最佳收毒時間是培養(yǎng)24-36小時、細胞病變約出現(xiàn)75-90%時。穿入動力測定一步生長曲線（1）一步生長曲線（2）理化特性偽狂犬病病毒SA215株的理化特性研究表明，其具有與Fa株相似的特性。該病毒對熱和反復凍融敏感，但有一定的抵抗力；在一定的pH值范圍內(nèi)（pH5-9），該病毒相對穩(wěn)定。結(jié)果表明基因缺失對病毒的理化特性影響很小。該數(shù)據(jù)的獲得對于毒種的保存和疫苗試制時耐熱保護劑的使用來延長疫苗的保存期具有指導意義。熱穩(wěn)定性酸堿穩(wěn)定性凍融穩(wěn)定性形態(tài)發(fā)生

電鏡掃描分析結(jié)果確定了PRVSA215株在細胞培養(yǎng)上正常形態(tài)發(fā)生，能形成感染性病毒粒子，但表現(xiàn)為延緩的復制過程。主要由于gE的缺失對于PRVSA215株在由核膜出芽和囊膜形成過程中一定程度的阻礙和延緩作用造成的。

gE/gI和gM在形態(tài)發(fā)生上共同作用于一相似步驟，均涉及到通過存在于囊泡膜上與被膜成分相互作用，從而將被膜蛋白導向二級囊膜出芽位點。gE胞質(zhì)尾區(qū)以次要方式涉及到該過程。所以gE和gI的缺失對于PRVSA215株在由核膜出芽和囊膜形成過程表現(xiàn)一定程度的阻礙和延緩作用。病毒粒子吸附和穿入過程（35，000×）PRVSA215株形態(tài)發(fā)生過程核衣殼在核內(nèi)發(fā)生過程（30,000×）大量形成的核衣殼以副晶體（pseudocrystals）狀在靠近核膜處聚集、排列。核膜擴張不明顯，可看見病毒粒子出芽到核膜間隙（20,000×）PRVSA215株形態(tài)發(fā)生過程核衣殼從內(nèi)核膜出芽獲得初級囊膜，從外核膜出芽時初級囊膜丟失，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域獲得次級囊膜（20,000×）

核膜下和核膜間隙聚集大量核衣殼（25,000×）PRVSA215株形態(tài)發(fā)生過程核內(nèi)含有大量核衣殼的囊泡（15,000×）

核衣殼通過核膜釋放的過程，另外可見到管狀囊泡包裹的病毒粒子（30,000×）PRVSA215株形態(tài)發(fā)生過程胞漿中核衣殼通過向囊泡出芽獲得囊膜（30,000×）

病毒釋放（30,000×）

PRVSA215株形態(tài)發(fā)生過程胞漿內(nèi)存在與被認為是皮層蛋白聚積物衍生的電子密度材料相伴的非囊膜衣殼聚集。（20,000×）PRVSA215疫苗株遺傳穩(wěn)定性研究SA215疫苗株在多種細胞和非免疫仔豬體內(nèi)連續(xù)傳代后，沒有發(fā)生遺傳變異。結(jié)果表明，該毒株具有良好遺傳穩(wěn)定性，該毒株用于疫苗生產(chǎn)不存在毒力返強之危險。PRVSA215疫苗株安全性試驗

新生仔豬、斷奶仔豬、妊娠母豬、家兔、犬、綿羊、黃牛和水牛在接種本病毒株后一周內(nèi)，除犬在接種后連續(xù)3天出現(xiàn)體溫輕微升高外，其余動物均精神狀態(tài)良好、食欲正常、接種部位無紅腫熱痛等不良反應。沒影響妊娠母豬正常產(chǎn)仔。該病毒株在接種后不能從接種動物體散毒。

PRVSA215疫苗株免疫原性（1）PRVSA215疫苗株免疫原性（2）PRVSA215疫苗株免疫原性（3）PRVSA215疫苗株免疫原性（4）表3-6PRVSA215株和Bartha株疫苗效力試驗結(jié)果組別死亡頭數(shù)/試驗頭數(shù)攻毒后（平均天數(shù)）增重受阻發(fā)熱期散毒期SA215試驗組20011批試驗組0/435520012批試驗組0/434520022批試驗組0/4344Bartha試驗組0/4465對照組3/4大于7大于7大于7PRVSA215疫苗株抗?jié)摲腥咎匦匝芯?/p>

應用PCR和核酸斑點雜交方法沒能從該毒株免疫后用強毒攻毒試驗豬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢出疫苗毒和強毒。結(jié)果表明該毒株具有一定抗野毒潛伏感染的能力。偽狂病基因缺失疫苗SA215

研制成功?。。＜诣b定：開創(chuàng)了我國動物病毒基因工程疫苗實用化的先河偽狂犬病三基因缺失疫苗（SA215)獲得新獸藥證書命名為豬偽狂犬病活疫苗（SA215株）2005年獲國家科技進步二等獎四、活載體疫苗或重組病毒疫苗近年來，人們已經(jīng)應用基因工程技術(shù)對一些病毒的基因進行改造，使其失去致病作用，又能攜帶其他病原的免疫原基因，從而形成減毒或無毒的重組病毒，這種病毒用作疫苗，稱為活載體疫苗或重組病毒疫苗。這種疫苗的產(chǎn)生不僅對基礎研究起了很大作用，也為基因工程疫苗產(chǎn)業(yè)化作出了很大貢獻。是目前疫苗研制領域最活躍也是最有希望的領域之一。特別是對于沒有足夠現(xiàn)成疫苗，或不安全和難于生產(chǎn)疫苗的疾病尤顯重要。

目前，用于基因工程的載體系統(tǒng)主要有：

質(zhì)粒、噬菌體衍生物、單鏈DNA的噬菌體M13、動物病毒等，其中動物病毒最引人注目。動物病毒除具有上述作為載體的條件外，還具有基因組結(jié)構(gòu)簡單、分子背景較清楚、易于改造和操作以及表達外源基因后能保持產(chǎn)物的天然構(gòu)形和免疫原性的優(yōu)點，這些優(yōu)點是其它載體所無法比擬的。從理論上講，任何一種病毒都可以發(fā)展為載體系統(tǒng)，但真正用作表達載體系統(tǒng)的病毒載體并不多。這是因為它們都存在這樣或那樣的問題，或技術(shù)條件不成熟，或宿主范圍不廣。目前，常用的動物病毒載體系統(tǒng)有：痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒、細小病毒、桿狀病毒、皰疹病毒等

Moss實驗室于1982年開病毒載體研制之先河，將皰疹病毒的TK基因插入痘病毒的TK基因中，首次推出痘苗病毒表達載體。迄今為止，已有36種來源于動物、植物乃至人類的不同基因應用這種重組痘苗病毒的方法進行了表達。作為疫苗載體而言，痘苗病毒具有廣泛的宿主范圍，龐大的基因組（約190Kb）和較大的外源基因插入容量（40Kb）。因此，它是一個良好的載體研制模型。然而，其潛在的致病性，限制了其在臨床上的應用。

腺病毒、細小病毒、桿狀病毒等，雖然也有作載體研制和應用的，但是鑒于以上病毒中部分因表達產(chǎn)量偏低，更重要的是它們對人畜均有不同程度的致病或致癌作用，故也應謹慎評價它們作為載體的用途。PRV載體系統(tǒng)特點

1）完整的感染性：PRV載體的重組區(qū)域是基因組的非必需區(qū)。其部分或全部缺失仍能形成感染性的病毒粒子。

2）較大容量：容納外源基因的能力大，約占基因組的40%，估計可達30Kb。

3）簡便的標記：本身具有TK基因，也可插入LacZ等報告基因。

4）可構(gòu)建多價疫苗：可以克隆多個外源基因，進行“多價重組”，構(gòu)建多價基因工程疫苗。

5）構(gòu)建標記疫苗：通過外源基因插入“標記基因”，使重組病毒不產(chǎn)生特異糖蛋白。從而不能誘導機體產(chǎn)生相應抗體。通過鑒別診斷方法，可區(qū)分開疫苗免疫動物和野毒感染動物。

6）更為安全：PRV不感染人，缺失了主要毒力基因后，對多種動物安全。豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗的研究本項目得到了教育部、四川省“九五”、“十五”攻關(guān)和“十一五”863預研項目等的資助。E2基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建pp63LacZgDgIsv40

LacZsv40cmv

gI

28kgD

gIsv40LacZ

E2LacZsv40cmvgI

pHCE2

E2gene

28kgIgDgXPRVSA215sv40LacZgI28kTk基因殘余序列pHCE2gDgIsv40LacZsv40cmvgI28k

E2LacZgXgDgIsv40LacZLacZsv40gIE2豬瘟病毒活載體疫苗株的構(gòu)建28K豬瘟偽狂犬病重組病毒SA215（A）株

部分生物學特性研究

對重組病毒SA215（A）株進行形態(tài)學、血清學特性、培養(yǎng)特性、在動物體內(nèi)定殖特性、免疫原性以及最低免疫劑量等部分生物學特性研究。未接種病毒的vero細胞熒光檢測結(jié)果

接種SA215（A）株24小時后熒光檢測結(jié)果接種SA215（A）株36小時后熒光檢測結(jié)果接種SA215（A）株48小時后熒光檢測結(jié)果Vero細胞接種SA215（A）后熒光檢抗體測結(jié)果PRVSA215株和重組病毒SA215（A）株

電鏡觀察結(jié)果

（1）SA215株（2）SA215（A）致細胞病變效應

SA215（A）株接種Vero細胞12小時

引起的細胞病變（10×10）SA215株接種Vero細胞12小時引起的細胞病變(10x10)12小時SA215（A）株接種Vero細胞24小時

引起的細胞病變(10x10)

SA215株接種Vero細胞24小時

引起的細胞病變24小時SA215（A）株接種Vero細胞36小時

引起的細胞病變

SA215株接種Vero細胞36小時引起的細胞病變36小時活疫苗SA215（A）的試制及其

保存期、安全性和免疫期的研究豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗

SA215（A）的試制

病毒增埴（雞胚成纖維細胞單層，1-3天）→收獲（過濾除細胞碎片，-20℃保存）→中間檢驗（無菌檢驗、外源病毒檢驗、支原體檢驗、效力檢驗、）→配苗（加保護劑）→分裝→冷凍真空干燥→封口→貼簽→批號→成品檢驗（性狀、效力檢驗、安全檢驗、特異性檢驗、無菌檢驗、外源病毒檢驗、支原體、水分、真空度）→儲存，使用按說明進行。

SA215（A）株和SA215株疫苗免疫原性比較

組別死亡頭數(shù)/試驗頭數(shù)增重受阻（天數(shù)）發(fā)熱期（天數(shù)）散毒期（天數(shù)）SA215（A）試驗組0/4445SA215試驗組0/4555對照組3/4大于7*大于7*大于7*SA215（A）株和SA215株疫苗免疫原性比較

組別死亡頭數(shù)/試驗頭數(shù)增重受阻（天數(shù)）發(fā)熱期（天數(shù)）散毒期（天數(shù)）SA215（A）試驗組0/4445SA215試驗組0/4555對照組3/4大于7*大于7*大于7*SA215（A）株最低免疫劑量測定結(jié)果表

組別攻毒試驗結(jié)果（死亡豬頭數(shù)/試驗豬頭數(shù)）攻毒保護率第一次攻毒第二次攻毒SA215（A）試驗組1×104PFU接種組1/43/30%5×104PFU接種組0/42/450%1×105PFU接種組0/40/4100%5×105PFU接種組0/40/4100%1×106PFU接種組0/40/4100%對照組3/44/40%豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗SA215（A）

半成品和成品檢驗

2001年共試制疫苗3批，分別編號為01001、01002和01003。按照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》2001年版附錄有關(guān)要求對收獲的3批半成品和成品疫苗（雞胚成纖維細胞毒液）進行了細菌、霉菌、支原體、外源病毒檢驗和毒價測定。結(jié)果3批半成品疫苗PFU均在106以上，詳細結(jié)果見表豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗SA215（A）

保存期試驗結(jié)果

將試制的3批疫苗分別按要求隨機抽樣，放置于-20℃，4-8℃和室溫三個不同溫度條件下，分別在1周、6個月和1年后測定疫苗的病毒滴度（PFU值）。豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗SA215（A）在-200C保存1年未引起毒價下降；4-80C保存1年毒價僅輕微下降，但仍然滿足疫苗最低免疫劑量要求；室溫條件下保存時短期內(nèi)即表現(xiàn)毒價明顯下降，故將疫苗SA215（A）保存期確定為4-80C保存1年。新生仔豬和斷乳仔豬安全性試驗結(jié)果

疫苗批次新生仔豬斷乳仔豬劑量頭數(shù)觀察結(jié)果劑量頭數(shù)觀察結(jié)果0100144正常，無不良反應504正常，無不良反應0100244正常，無不良反應504正常，無不良反應0100344正常，無不良反應504正常，無不良反應妊娠母豬安全性試驗結(jié)果

疫苗批次妊娠母豬（試驗組）妊娠母豬（對照組）劑量頭數(shù)觀察結(jié)果劑量頭數(shù)觀察結(jié)果母豬活仔數(shù)死胎數(shù)活仔發(fā)育母豬活仔數(shù)死胎數(shù)活仔發(fā)育0100122健康190正常02健康181正常0100222健康211正常02健康191正常0100322健康180正常02健康230正常疫苗SA215（A）接種豬血清的偽狂犬病中和抗體效價以及攻毒保護率測定結(jié)果

時間01001批疫苗組01002批疫苗組01003批疫苗組小計接種組對照接種組對照接種組對照接種組對照組攻毒保護中和效價攻毒保護攻毒保護中和效價攻毒保護攻毒保護中和效價攻毒保護平均攻毒保護率平均中和效價平均攻毒保護率第4周4/4*720/44/4660/44/4720/4100%700%第8周4/4772/44/4722/44/4761/4100%7542%第12周4/4493/44/4453/44/4503/4100%4875%第16周4/4414/44/4374/44/4433/4100%4092%第20周4/4344/44/4324/44/4373/41003492%第24周4/4314/44/4294/44/4334/4100%31100%ELISA檢測疫苗SA215（A）接種豬的豬瘟抗體OD值以及攻毒保護率測定結(jié)果

時間01001批疫苗組01002批疫苗組01003批疫苗組小計接種組對照組接種組對照組接種組對照組接種組對照組攻毒保護平均OD值攻毒保護攻毒保護平均OD值攻毒保護攻毒保護平均OD值攻毒保護平均攻毒保護率總平均OD值平均攻毒保護率第6周4/4*0.540/44/40.580/44/40.540/4100%0.550%第10周4/40