ICS11.020CCSC62瘧原蟲核酸檢測(cè)多重PCR法上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布IT/SPMA010—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14儀器設(shè)備 25試劑材料 26檢測(cè)步驟 37廢棄物的處理和防止污染的措施 4附錄A（資料性）多重PCR技術(shù)原理 5附錄B（規(guī)范性）多重PCR檢測(cè)方法 6附錄C（規(guī)范性）多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法 10附錄D（規(guī)范性）試劑的配制 15附錄E（規(guī)范性）樣本準(zhǔn)備 16參考文獻(xiàn) T/SPMA010—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》起草。本文件由上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件主要起草單位：上海市疾病預(yù)防控制中心、深圳生科原生物有限公司、上海思路迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。本文件主要起草人：江莉、張耀光、田仁鵬、陳健、王真瑜、朱民、巫益鳴、余晴、吳寰宇、竇文祥。T/SPMA010—20232021年6月30日，世界衛(wèi)生組織正式公告中國(guó)獲得消除瘧疾認(rèn)證，目前我國(guó)的瘧疾病例全部是境外輸入。高效準(zhǔn)確地及時(shí)發(fā)現(xiàn)、報(bào)告、診斷輸入性瘧疾病例，防止瘧疾輸入再傳播，不僅是維持消除瘧疾的關(guān)鍵，在傳染病的常態(tài)化防控工作中也具有重要的意義。目前已有的瘧原蟲核酸檢測(cè)相關(guān)方法和標(biāo)準(zhǔn)都是單基因檢測(cè)，應(yīng)用在瘧疾監(jiān)測(cè)工作中效率不高。本文件借鑒國(guó)際先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，聚焦瘧原蟲核酸檢測(cè)的關(guān)鍵參數(shù)、目前瘧疾感染現(xiàn)狀、檢測(cè)方法研究成熟度，制定了常規(guī)的多重PCR和多重?zé)晒釶CR兩種檢測(cè)方法，可以同時(shí)檢測(cè)5個(gè)目標(biāo)基因，提高檢測(cè)效率。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到附錄B與附錄C中引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系的配制方法和相關(guān)參數(shù)設(shè)置的專利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無(wú)任何立場(chǎng)。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾，他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無(wú)歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過(guò)以下聯(lián)系方式獲得：專利持有人姓名：上海市疾病預(yù)防控制中心、深圳生科原生物有限公司。地址：上海市中山西路1380號(hào)、深圳市南山區(qū)打石一路深圳國(guó)際創(chuàng)新谷三期7棟A座8層。請(qǐng)注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。1T/SPMA010—2023瘧原蟲核酸檢測(cè)多重PCR法本文件規(guī)定了瘧原蟲核酸檢測(cè)多重PCR和多重?zé)晒釶CR的方法。本文件適用于人體血液樣本中瘧原蟲檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用WS/T569瘧原蟲檢測(cè)血涂片鏡檢法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1瘧原蟲Plasmodiumspp.瘧原蟲是一類單細(xì)胞、寄生性的真核動(dòng)物，是瘧疾（malaria）的病原體。寄生于人體的瘧原蟲主要有惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)和卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale)等。[來(lái)源：WS/T569-2017，2.1]3.2瘧原蟲核酸檢測(cè)plasmodiumnucleicacidtesting采用核酸檢測(cè)方法，從瘧疾患者血液樣本中檢測(cè)瘧原蟲特異性基因片段。3.3多重PCRmultiplexPCR在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加入多對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定同屬不同種的病原體感染。3.4Ct值cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。2T/SPMA010—20234儀器設(shè)備4.1PCR擴(kuò)增儀：溫度范圍為4℃~99℃,溫度精確為0.1℃,熱蓋為105℃。4.2凝膠成像系統(tǒng)：圖像分辨率大于140萬(wàn)，光源為透射UV。4.3核酸電泳儀：電壓為5V～250V。4.4熒光定量PCR儀：不少于3個(gè)熒光通道。4.5二級(jí)生物安全柜。4.6醫(yī)用冰箱：冷藏溫度2℃~8℃,冷凍溫度-15℃~-25℃。4.7超低溫冰箱：最低溫度至少可達(dá)到-70℃。4.8天平：精密度0.01g以上。4.9微波爐。4.10高壓滅菌蒸汽鍋。4.11臺(tái)式高速離心機(jī)：最大相對(duì)離心力為12000g。4.12渦旋振蕩器：無(wú)極調(diào)速范圍為200r/min～3000r/min。4.13微量可調(diào)移液器:1μL、10μL、100μL、1000μL。5試劑材料5.1試劑5.1.1除特別說(shuō)明以外，所用試劑均達(dá)到分析純標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。5.1.2核酸提取試劑：全血DNA提取試劑盒。5.1.3分子生物學(xué)試劑包括：a)多重PCR方法：2×MultiplexPCRMasterMix（含有Taq酶、dNTPs、Mg2+、其他鹽離子、蛋白穩(wěn)定劑和PCR增強(qiáng)劑的多重PCR預(yù)混液）、分子質(zhì)量指示物（DNAMarker）、核酸染料；b)熒光多重PCR方法：5×buffer（鹽離子緩沖系統(tǒng)、PCR增強(qiáng)劑，不含鎂離子）、MgCl2（25mmol）、dNTPs（25mmol）、UNG酶、Taq酶。5.1.4特異性引物、探針：多重PCR方法按附錄B方法進(jìn)行，多重?zé)晒釶CR方法按附錄C方法進(jìn)行。5.1.5核酸電泳試劑：按附錄D方法配制。5.1.6質(zhì)控品包括：a)陽(yáng)性對(duì)照為瘧疾患者全血基因組DNA或含有瘧原蟲特異性基因序列的質(zhì)粒DNA；b)陰性對(duì)照為健康人全血基因組DNA。5.2材料5.2.1防護(hù)用品：乳膠手套、口罩、帽子、工作服等。5.2.2一次性耗材：1.5mL離心管、0.5mL離心管、PCR反應(yīng)管、熒光PCR反應(yīng)管（或96孔板）、濾芯吸頭等。3T/SPMA010—20236檢測(cè)步驟6.1樣本準(zhǔn)備樣本為人體靜脈血或者末梢血。樣本的采集、運(yùn)輸和保存及核酸樣本DNA的提取方法，按附錄E方法進(jìn)行。6.2多重PCR方法6.2.1原理設(shè)計(jì)瘧原蟲屬和種特異性引物共5對(duì)，放在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的位置進(jìn)行分型。6.2.2核酸擴(kuò)增以樣本DNA為模板，多重PCR反應(yīng)體系的配制和反應(yīng)條件的參數(shù)設(shè)置，按附錄B操作。6.2.3電泳分析取多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL與2μL6×加樣緩沖液混合，加樣于含核酸染料的2％瓊脂糖凝膠加樣孔中，在1×TAE緩沖液中，5V/cm電泳約30min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止電泳，用凝膠成像系統(tǒng)或紫外分析儀記錄結(jié)果。6.2.4電泳結(jié)果的判定6.2.4.1試驗(yàn)有效性判定陰性對(duì)照和/或空白對(duì)照未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，混合陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出5個(gè)條帶，本次檢測(cè)試驗(yàn)有效；陰性對(duì)照和/或空白對(duì)照擴(kuò)增出條帶，本次試驗(yàn)無(wú)效。需要檢查原因并重新測(cè)試。6.2.4.2樣本檢測(cè)結(jié)果判定在檢測(cè)試驗(yàn)有效時(shí)，根據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)量和大小進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判定：a)待測(cè)樣本未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，為多重PCR檢測(cè)陰性；待測(cè)樣本擴(kuò)增出1個(gè)以上條帶，為多重PCR檢測(cè)陽(yáng)性；b)以DNAMarker為參照，確定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。陽(yáng)性樣本一般顯示為屬特異性和種特異性2個(gè)條帶，混合感染為2個(gè)條帶以上。屬特異性擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為334bp，種特異性產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為：惡性瘧原蟲256bp、卵形瘧原蟲400bp、三日瘧原蟲582bp、間日瘧原蟲778bp；附錄B.8給出了四種瘧原蟲特異性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的電泳圖型示意圖；c）若只擴(kuò)增出屬特異性條帶沒(méi)有種特異性條帶，可能是樣本的原蟲密度低于本方法檢出限（見(jiàn)附錄A）或?yàn)槠渌N類的瘧原蟲，應(yīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析后判定結(jié)果。6.3多重?zé)晒釶CR方法6.3.1原理設(shè)計(jì)瘧原蟲屬和種特異性引物及探針共5套?？紤]到檢測(cè)儀器的普遍適用性，分別組成三重和雙重共五重的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。4T/SPMA010—20236.3.2核酸擴(kuò)增以樣本DNA為模板，多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系的配制和反應(yīng)條件的參數(shù)設(shè)置，按附錄C進(jìn)行。6.3.3熒光自動(dòng)采集分析根據(jù)探針標(biāo)記熒光素的種類，在多通道熒光PCR儀上設(shè)定不同的通道，每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)結(jié)束儀器會(huì)自動(dòng)收集熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出。6.3.4熒光檢測(cè)結(jié)果的判定6.3.4.1試驗(yàn)有效性判定陽(yáng)性對(duì)照的Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)。陰性對(duì)照的Ct值＞39或無(wú)曲線，線形為直線或輕微斜線，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期或無(wú)Ct值，本次檢測(cè)試驗(yàn)有效。6.3.4.2樣本檢測(cè)結(jié)果判定在檢測(cè)試驗(yàn)有效時(shí)，根據(jù)Ct值和擴(kuò)增曲線線形進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判定：a）陽(yáng)性：待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤39，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)。四種瘧原蟲的分型及瘧原蟲屬陽(yáng)性的判定按表C.5執(zhí)行；四種瘧原蟲的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果示意圖見(jiàn)C.7；b）陰性：待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞39或無(wú)曲線，線形為直線或輕微斜線，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期或無(wú)Ct值。7廢棄物的處理和防止污染的措施樣本采集、運(yùn)輸及檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的廢物（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物除外應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌，103.4kPa（1.05kg/cm2）高壓蒸汽滅菌20min。檢測(cè)過(guò)程中交叉污染的預(yù)防和控制措施，按WS/T230規(guī)定進(jìn)行。5T/SPMA010—2023（資料性）多重PCR技術(shù)原理A.1多重PCR多重PCR（multiplexPCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。本文件推薦的是一種嵌合引物多重PCR方法，以瘧原蟲的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位（CytochromeoxidasesubunitI,COI）基因?yàn)槟繕?biāo)序列，設(shè)計(jì)瘧原蟲屬特異性引物1對(duì)。以核糖體18SrDNA基因?yàn)槟繕?biāo)序列，設(shè)計(jì)瘧原蟲種特異性引物共4對(duì)。上述基因特異性引物分別與一段共同的非特異性核酸片段（通用引物，5＇-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3連接。使每一條引物的3＇端為序列特異性識(shí)別位點(diǎn)，5＇端為一段21bp的無(wú)關(guān)序列，形成嵌合引物（chimericprimers）。使在低溫循環(huán)中擴(kuò)增的帶有嵌合引物的產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)增，高溫循環(huán)（68℃)僅利用通用引物使不同大小的產(chǎn)物高效同步擴(kuò)增。由于反應(yīng)的溫度逐級(jí)遞增，低溫循環(huán)中產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物在后期循環(huán)中不能繼續(xù)擴(kuò)增，提高了檢測(cè)敏感性和特異性。該體系檢測(cè)不同原蟲密度樣本的結(jié)果顯示，種特異性檢測(cè)靈敏度平均值為4.85個(gè)蟲/μL血（間日瘧原蟲為4.49、三日瘧原蟲為5.45、卵形瘧原蟲為6.39、惡性瘧原蟲為4.07個(gè)蟲/μL血屬特異性檢測(cè)靈敏度平均值為0.41個(gè)蟲/μL血（范圍0.1～1.07個(gè)蟲/μL血）。檢測(cè)含有50～200個(gè)蟲/μL血的兩種瘧原蟲模擬混合樣本，各特異性擴(kuò)增條帶均清晰可見(jiàn)?？梢杂行^(qū)分不同強(qiáng)度的兩種瘧原蟲的混合感染，也可以檢測(cè)卵形瘧原蟲的wallikeri亞種。A.2多重?zé)晒釶CR采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。反應(yīng)液含有各目標(biāo)基因的特異性擴(kuò)增引物和檢測(cè)探針，探針為包含5＇端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)和3＇端標(biāo)記淬滅基團(tuán)的寡核苷酸序列。若探針保持完整，發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到信號(hào)。在PCR擴(kuò)增進(jìn)程中，與模板特異性結(jié)合的探針會(huì)被Taq酶（具5＇-3'外切酶活性）切斷，發(fā)光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。本文件推薦的是一種多重?zé)晒釶CR方法。選擇瘧原蟲的核糖體18SrDNA基因?yàn)槟繕?biāo)序列。設(shè)計(jì)瘧原蟲屬和種特異性引物及探針共5套?？紤]到檢測(cè)儀器的普遍適用性，將惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲和瘧原蟲屬的引物及探針?lè)旁谕还芊磻?yīng)液中（熒光信號(hào)分別標(biāo)記為FAM、JOE、CY5三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲的引物及探針?lè)旁谕还芊磻?yīng)液中（熒光信號(hào)分別標(biāo)記為FAM、JOE分別組成三重和兩重共五重的瘧原蟲檢測(cè)反應(yīng)體系?？梢酝瑫r(shí)對(duì)瘧原蟲屬和四種瘧原蟲進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)不同密度原蟲樣本核酸進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果顯示，每個(gè)熒光信號(hào)通道結(jié)果呈S型曲線，質(zhì)粒DNA模板梯度稀釋曲線方程R2分別為0.998、0.999、0.999、1，結(jié)果可信。在原蟲密度為0.5個(gè)蟲/μL血時(shí)，檢出率均<95%；原蟲密度為1個(gè)蟲/μL血時(shí)，檢出率均>95%，因此，該檢測(cè)體系的最低檢測(cè)限（靈敏度）為1個(gè)蟲/μL血。在對(duì)不同種原蟲樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，樣本中原蟲密度為1個(gè)蟲/μL血時(shí)，反應(yīng)體系能有效檢出，具有較好的靈敏度。樣本中原蟲密度為1000個(gè)原蟲/μL時(shí)，反應(yīng)體系無(wú)種間交叉反應(yīng)，具有較好的檢測(cè)特異性。6T/SPMA010—2023（規(guī)范性）多重PCR檢測(cè)方法B.1引物序列瘧原蟲核酸檢測(cè)多重PCR擴(kuò)增引物的序列見(jiàn)表B.1。每條嵌合引物的3＇端為序列特異性識(shí)別位點(diǎn)（下劃線5＇端為一段21bp的通用引物序列。表B.1多重PCR引物序列PlasmodiumF：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATAGAAACAGATGCCAR：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTATGTTAGAAGCAAACACTAF1：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGR1：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTACAATGAACTCAATCATGACTF2：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGCTAATACTTGCTTTAATGCGTR2：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTCCAATTACAAAACCATGAAAF3：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATTTCAAGGAATCAATATTTTAR3：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATGTCTCTTTTATTTTTTACTF4：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTTAAGGACTTTCTTTGCTTCR4：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTAAATCAACCGAATTCAGTB.2引物混合液配制在試劑配制區(qū)進(jìn)行。用滅菌去離子水將合成的引物溶解后，配制成20mmol/L的保存液，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩⒈鞡.1中的各引物混合配制成引物混合液，10條嵌合特異性引物的濃度分別為0.56mmol/L，1條通用引物的濃度為5mmol/L。B.3反應(yīng)體系配制在試劑配制區(qū)進(jìn)行。取出反應(yīng)體系各組分的試劑，室溫融化后漩渦混勻，快速離心。反應(yīng)體系配制見(jiàn)表B.2。根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量配制適當(dāng)體積的反應(yīng)混合液，分裝至PCR反應(yīng)管中，每管18μL。表B.2多重PCR反應(yīng)體系的配制7T/SPMA010—2023B.4加樣在樣本處理區(qū)進(jìn)行。在PCR反應(yīng)管中加入待測(cè)樣本DNA2μL，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和/或空白對(duì)照。蓋緊管蓋，做好標(biāo)記，瞬時(shí)離心使反應(yīng)液集中于管底。B.5擴(kuò)增反應(yīng)條件擴(kuò)增反應(yīng)在核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表B.3：表B.3多重PCR循環(huán)反應(yīng)參數(shù)設(shè)置B.6擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析在擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL進(jìn)行2%瓊脂糖電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)或紫外分析儀中觀察并拍照。以100bpDNAMarker為參照，確定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。B.7電泳結(jié)果的判定B7.1試驗(yàn)有效性判定陰性對(duì)照和/或空白對(duì)照未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，混合陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出5個(gè)條帶，本次檢測(cè)試驗(yàn)有效；陰性對(duì)照和/或空白對(duì)照擴(kuò)增出條帶，本次試驗(yàn)無(wú)效。需要檢查原因并重新測(cè)試。B7.2樣本檢測(cè)結(jié)果判定在檢測(cè)試驗(yàn)有效時(shí)，根據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)量和大小進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判定：a)待測(cè)樣本未見(jiàn)擴(kuò)增條帶，為多重PCR檢測(cè)陰性；待測(cè)樣本擴(kuò)增出1個(gè)以上條帶，為多重PCR檢測(cè)陽(yáng)性；b)以DNAMarker為參照，確定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。陽(yáng)性樣本一般顯示為屬特異性和種特異性2個(gè)條帶，混合感染為2個(gè)條帶以上。屬特異性擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為334bp，種特異性產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為：8T/SPMA010—2023惡性瘧原蟲256bp、卵形瘧原蟲400bp、三日瘧原蟲582bp、間日瘧原蟲778bp；B.8為四種瘧原蟲特異性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的電泳圖型示意圖。c）若只擴(kuò)增出屬特異性條帶沒(méi)有種特異性條帶，可能是樣本的原蟲密度低于本方法的檢出限（見(jiàn)附錄A）或?yàn)槠渌N類的瘧原蟲，需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析后判定結(jié)果。B.8多重PCR電泳結(jié)果示意圖圖B.1給出多重PCR電泳圖示例。圖B.1多重PCR電泳圖B.9標(biāo)準(zhǔn)參考序列B.9.1惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)參考序列（序列號(hào)XR_002273095.1，擴(kuò)增序列位于該區(qū)域的654-867bp）CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGATGTTTCATTTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATTATATATTTTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTTTTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCATTGTAATTTGAGACCGCAGGACTCG（256bp）B.9.2卵形瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)參考序列（序列號(hào)KF696365，擴(kuò)增序列位于該區(qū)域的164-521bp）CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGCTAATACTTGCTTTAATGCGTTTGATTCATTTTTGTGTCTTACGTATGTACTTGTTAAGCCTTTAAGAGAAAAGTTTACAACTTAAGGAATTATAACAAAGAAGTAACACATAATAAGTTTACCTTATTTAGTGTGTATCAATCGAGTTTCTGACCTATCAGCTTTTGATGTTAGGGTATTGGCCTAACATGGCTATGACGGGTAACGGGGAATTAGAGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAATAGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATTCTAAAGAAGAGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAAGGCCATTTCATGGTTTTGTAATTGGAATTTGAGACCGCAGGACTCG（400bp）B.9.3三日瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)參考序列（序列號(hào)AF145336，擴(kuò)增序列位于該區(qū)域的33-572bp）CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATTTCAAGGAATCAATATTTTAAGTAATGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTGTACGTTAAGAATAAACGCCAAGCGTTATATTTTTTCTGTTACATTTTGTTTTATTAATATATATATGCGTTCTTATTATAAAAATGATTCTTTTTAAAATTCTTTTGTATAATTTTTTATGCATGGGAATTTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGTTAAAACAGTTTCTGTGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGTCAGAATTTTGTTCTTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAG9T/SPMA010—2023TAGCTTGGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAGCAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAAAATAAAAGAGACATTCAATTTGAGACCGCAGGACTCG（582bp）B.9.4間日瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)參考序列（序列號(hào)U03079.1，擴(kuò)增序列位于該區(qū)域的757-1493bp）CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGGCTTGGAAGTCCTTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAAACAGATATAGCATTGCGCGTTTGAATACTACAGCATGGAATAACAAAATTGAACAAGTCAGAATTTTGTTCTTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGCTTGGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAACAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGCTTTGGATGAAAGATTTTAAAATAAGAATTTTCTCTTCGGAGTTTATTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTGCCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATGGTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACCTGCTAATTAGCGGCAAATACGATATATTCTTACGTGGGACTGAATTCGGTTGATTTAATTTGAGACCGCAGGACTCG（778bp）B.9.5瘧原蟲屬標(biāo)準(zhǔn)參考序列（序列號(hào)NC007243，擴(kuò)增序列位于該區(qū)域的1436-1727bp）CGAGTCCTGCGGTCTCAAATTGAATAGAAACAGATGCCAGGCCAAAAACCCAAAAATAGAGCTATGACGCTATCAATTTGACAAGGCAGATAAATTCTTTCATAGAACTTAACGTTTCATCCTCCATACATAAATAAAACGGTAGATAGGGAACAAACTGCCTCAAGACGTTCTTAACCCAGCTCACGCATCGCTTCTAACGGTGAACTCTCATTCCAATGGAACCTTGTTCAAGTTCAAATAGATTGGTAAGGTATAGCGTTTACTATCGAATGAAACAATGTATTCCACCGCTAGTGTTTGCTTCTAACATAATTTGAGACCGCAGGACTCG（334bp）T/SPMA010—2023（規(guī)范性）多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法C.1引物和探針序列瘧原蟲核酸檢測(cè)多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增引物和探針的序列見(jiàn)表C.1。探針的5＇端標(biāo)記有熒光素，3＇端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。表C.1瘧原蟲種特異性檢測(cè)引物和探針CTAGTYGGCATAGTTTATGCY5-CGACGGTATCTGATCGTCTTCACTCC-BQ2TGCTTTTGAGAGRTTTTGTTGTAGTATTCAAACACAATGJOE-TCATAACAGACGGGTAGTCATGATFAM-CGACTTTGTGCGCATTTTGCTATTAFAM-TACGTTAAGAATAACCGCCAAGJOE-AGRTGCTTAGRACAATACAC.2多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑配制試劑配制在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。取出反應(yīng)體系各組分的試劑，室溫融化后漩渦混勻，快速離心。先用去離子水將表C.1引物和探針配置成50mmol/L的保存液，然后按表C.2、表C.3進(jìn)行PCR反應(yīng)液A管和B管的配制。根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量配制適當(dāng)體積的反應(yīng)混合液，分裝至PCR反應(yīng)管中，每管20μL。表C.2PCR反應(yīng)液A管配制方法MgClT/SPMA010—2023表C.2PCR反應(yīng)液A管配制方法（續(xù)）表C.3PCR反應(yīng)液B管配制方法MgClC.3加樣C.3.1取出試劑準(zhǔn)備區(qū)準(zhǔn)備好的八聯(lián)PCR反應(yīng)管（或96孔板），低速離心10s。C.3.2在樣本處理區(qū)，每管加入相應(yīng)的待測(cè)DNA樣本模板5μL。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別加入5μL。C.3.3蓋好PCR反應(yīng)管蓋（96孔板需封膜），記錄待測(cè)樣本加樣順序，低速離心10s后將PCR反應(yīng)管（或96孔板）轉(zhuǎn)移至核酸擴(kuò)增區(qū)。C.4上機(jī)檢測(cè)C.4.1開(kāi)機(jī)預(yù)熱并檢驗(yàn)儀器性能。T/SPMA010—2023C.4.2取準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管（或96孔板放置在儀器樣本槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。C.4.3按表C.4設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。C.4.4檢測(cè)熒光選擇：A管采用FAM通道、HEX/JOE/VIC通道和CY5通道進(jìn)行熒光信號(hào)采集；B管采用FAM通道和HEX/JOE/VIC通道進(jìn)行熒光信號(hào)采集。表C.4儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)1140～45C.5結(jié)果分析C.5.1反應(yīng)結(jié)束后，點(diǎn)擊分析（Analysis）自動(dòng)獲得分析結(jié)果。Start值可以在3～15的范圍、End值可以設(shè)在5～20范圍，調(diào)整陰性對(duì)照的曲線平直或低于閾值線。C.5.3保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在報(bào)告（Report）界面查看結(jié)果，根據(jù)需要進(jìn)行打印。C.6結(jié)果判定C.6.1試驗(yàn)有效性判定陽(yáng)性對(duì)照的Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)。陰性對(duì)照的Ct值＞39或無(wú)曲線，線形為直線或輕微斜線，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期或無(wú)Ct值，本次檢測(cè)有效。C.6.2樣本檢測(cè)結(jié)果判定在檢測(cè)試驗(yàn)有效時(shí)，根據(jù)Ct值和擴(kuò)增曲線線形進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判定：a)陽(yáng)性：待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤39，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)。四種瘧原蟲的分型及瘧原蟲屬陽(yáng)性的判定見(jiàn)表C.5。四種瘧原蟲的多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果示意圖見(jiàn)C.7。b)陰性：待測(cè)樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞39或無(wú)曲線，線形為直線或輕微斜線，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期或無(wú)Ct值。表C.5多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果判定T/SPMA010—2023C.7多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果圖C.1給出了多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增曲線的示例。圖C.1多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增A管（上）和B管（下）示意圖C.8多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)序列C.8.1瘧原蟲屬標(biāo)準(zhǔn)序列(18SrDNA)GCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGC.8.2惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)序列(18SrDNA)TGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCATTGTGTTTGAATACTACAC.8.3間日瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)序列(18SrDNA)T/SPMA010—2023CAACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATACTTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGCTATTATGTGTTCTTTTAATTAAAATGATTCTTTTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGGCTTC.8.4三日瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)序列(18SrDNA)CAAGGAATCAATATTTTAAGTAATGCTTTGTATATTTATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGCCAAGGCTTATATTTTTTCTGTTACATTTTGTTTTATTAATATATATATGCGTTCTTATTATAAAAATGATTCTTTTTAAAATTCTTTTGTATAATTTTTTATGCATGGGAATTTTGTTACTTTGC.8.5卵形瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)序列(18SrDNA)TCAAAGAATCAATATTTTAAGTAATGCTTTTGGTTTAAGATGCTTAGGACAATACAACGTATCTGCTCTTTGCATTCCTTT/SPMA010—2023（規(guī)范性）試劑的配制D.16×加樣緩沖液溴酚藍(lán)0.25g，蔗糖40g，加蒸餾水至100mL。置于2～8℃保存?zhèn)溆?。D.22%瓊脂糖凝膠瓊脂糖2.0g加1×TAE定溶至100mL，微波爐加熱完全融化后，溶液冷卻至60℃,加核酸染料5μL，輕輕混勻后，倒入模具中制備凝膠。D.3Tris-乙酸電泳緩沖液（TAE）儲(chǔ)存液100mL，加去離子滅菌水定溶至1000mL，混勻2～8℃保存?zhèn)溆?。D.4TAE使用液50×TAE20mL加蒸餾水定溶至1000mL，混勻備用。T/SPMA010—2023樣本準(zhǔn)備E.1樣本采集E.1.1靜脈血樣用抗凝采血管采集人體靜脈血，吸取適量血液后混勻，每份樣本標(biāo)記編號(hào)、名稱、樣本來(lái)源和性質(zhì)、采集時(shí)間等相關(guān)信息。E.1.2末梢血樣用一次性采血針采集耳垂或手指末端血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。將適量血滴于濾紙上，自然干燥后裝入自封袋保存。E.2樣本保存和運(yùn)輸采集樣本密封后，應(yīng)縮短運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間，運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)在生物安全轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)加冰袋，或使用保溫箱。全血樣本24小時(shí)內(nèi)不開(kāi)展檢測(cè)應(yīng)冷凍保存，在-20℃±5℃冷凍條件下保存不超過(guò)3個(gè)月；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，不應(yīng)反復(fù)凍融。E.3樣本DNA提取新鮮采集的靜脈血樣可直接用于核酸提取，冷凍保存的血樣需先在室溫融化。末梢采集的微量血樣和濾紙保存血樣應(yīng)估算血量用于核酸提取。濾紙保存血樣放入PBS中浸泡，洗脫后按全血方法提取DNA。DNA樣本提取應(yīng)根據(jù)使用量和樣本量確定，推薦血液樣本使用量與提取后獲得的DNA樣本量一致，即用100μL血樣提取100μLDNA樣本。樣本DNA提取使用有質(zhì)量保證的全血DNA提取試劑盒，應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行樣本處理和DNA的提取。E.4生物安全樣本采集、樣本保存和運(yùn)輸及樣本DNA提取等應(yīng)避免交叉污染，生物安全應(yīng)符合GB19489規(guī)定。T/SPMA010—2023參考文獻(xiàn)[1]WHO.GlobalTechnicalStrategyforMalaria2016-2030[EB/OL].2015:1-35.[2]ChewCH,LimYA,LeePC,MahmudR,ChuaKH.HexaplexPCRdetectionsystemforidentificationoffivehumanPlasmodiumspecieswithaninternalcontrol.JClinMicrobiol.