L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療研究：機(jī)制與展望一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第三，僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，然而死亡率卻高居榜首。卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性表現(xiàn)，75%的患者確診時(shí)已處于臨床晚期，晚期患者5年生存率僅為20%，與之形成鮮明對(duì)比的是，早期患者的5年生存率可達(dá)85%-90%。這種巨大的生存差異凸顯了早期診斷的重要性。卵巢癌還具有獨(dú)特的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移規(guī)律。不同于其他實(shí)體瘤主要通過血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處，卵巢癌在疾病進(jìn)程中長(zhǎng)期局限于腹腔內(nèi)。癌細(xì)胞在腹膜間皮細(xì)胞表面黏附、種植，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移灶，隨著病情進(jìn)展，腹腔內(nèi)廣泛的病灶會(huì)累及網(wǎng)膜、胃腸道和肝脾等重要臟器，最終導(dǎo)致患者死亡。因此，有效控制晚期病例的腹腔廣泛轉(zhuǎn)移，成為卵巢癌治療中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。目前，卵巢癌的治療主要依靠手術(shù)和化療，但手術(shù)難度大，且術(shù)后并發(fā)癥多；化療雖能在一定程度上控制病情，但存在耐藥性和嚴(yán)重的副作用等問題，這些都限制了卵巢癌治療效果的提升，迫切需要探索新的治療方法。間皮素（Mesothelin，MSLN）作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與卵巢癌密切相關(guān)的重要分子，在卵巢癌的研究中備受關(guān)注。間皮素是一種腫瘤細(xì)胞表面抗原，通常在體腔表面的間皮細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，但在卵巢癌、惡性胸膜間皮瘤、胰腺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)。其中，間皮素的一個(gè)異構(gòu)體可溶性間皮素相關(guān)蛋白（SolubleMesothelinRelatedPeptides/Proteins，SMRP）可從細(xì)胞表面脫落進(jìn)入血液，因其分子量明顯低于常用的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125，理論上在檢測(cè)卵巢癌時(shí)具有更高的敏感性，有望成為卵巢癌診斷的新型標(biāo)志物。越來(lái)越多的研究表明，間皮素在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。間皮素能夠增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的增殖和粘附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。從作用機(jī)制來(lái)看，間皮素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-DependentKinase，CDK）等關(guān)鍵物質(zhì)，影響細(xì)胞周期的調(diào)控，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；在細(xì)胞凋亡方面，間皮素可能通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡前體蛋白Bim等因子，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的抗失巢凋亡能力，使其更容易從瘤體脫落并發(fā)生轉(zhuǎn)移。這些特性使得間皮素成為卵巢癌生物靶向治療的優(yōu)質(zhì)靶點(diǎn)。本研究聚焦于間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療，具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論層面，深入探究間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制，有助于揭示卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)過程，豐富對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)研究提供新的思路和理論基礎(chǔ)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，通過基因治療手段靶向調(diào)控間皮素的表達(dá)，有望為卵巢癌的治療開辟新的途徑，提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，為卵巢癌患者帶來(lái)新的希望。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響，并探索基于間皮素的基因治療策略在卵巢癌治療中的可行性與效果。具體而言，通過構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，觀察L間皮素表達(dá)水平的改變對(duì)移植瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響；利用基因治療技術(shù)，如RNA干擾（RNAi）或基因過表達(dá)等手段，調(diào)控間皮素基因的表達(dá)，評(píng)估其對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的治療效果；從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)層面，深入剖析間皮素影響卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的潛在作用機(jī)制，以及基因治療發(fā)揮療效的相關(guān)機(jī)制，為卵巢癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療思路。研究?jī)?nèi)容主要涵蓋以下幾個(gè)方面：一是卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的構(gòu)建與鑒定。選取合適的卵巢癌細(xì)胞系，如SKOV-3細(xì)胞，將其接種于裸鼠腹腔內(nèi)，建立穩(wěn)定可靠的卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，并通過病理學(xué)檢查等方法對(duì)模型進(jìn)行鑒定，確保模型的有效性和一致性。二是L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)影響的觀察。將構(gòu)建好的模型分為不同組別，分別給予不同的處理，如實(shí)驗(yàn)組下調(diào)L間皮素的表達(dá)，對(duì)照組保持正常表達(dá)水平，通過定期測(cè)量裸鼠的體重、腹圍，觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況，包括瘤體大小、重量、數(shù)量以及轉(zhuǎn)移灶的分布等，比較不同組別的差異，明確L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響。三是基因治療實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用基因治療技術(shù)，如將攜帶L間皮素干擾序列的慢病毒載體導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，再將其接種到裸鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)；或者采用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)卵巢癌細(xì)胞中的間皮素基因進(jìn)行編輯，然后觀察基因治療對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的抑制效果，從成瘤率、瘤體重量、轉(zhuǎn)移情況等多方面進(jìn)行評(píng)估。四是機(jī)制研究。通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如Westernblotting、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等，檢測(cè)與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)水平，分析L間皮素影響卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制；利用免疫組織化學(xué)、免疫熒光等技術(shù)，觀察腫瘤組織中相關(guān)信號(hào)通路的激活情況，進(jìn)一步闡明基因治療發(fā)揮作用的機(jī)制。最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析與討論，總結(jié)L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療的效果和機(jī)制，為卵巢癌的治療提供有價(jià)值的參考。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，全面深入地探討L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療效果。在動(dòng)物模型構(gòu)建方面，選用4-6周齡的雌性BALB/c裸小鼠，體重控制在13.5-16.5g，在清潔級(jí)（SPF級(jí)）環(huán)境中飼養(yǎng)。將人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基制備成濃度為2.5×10?個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。每只裸鼠腹腔內(nèi)注射0.2ml細(xì)胞懸液（含5×10?個(gè)細(xì)胞），構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型。接種后，每天密切觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等；每周用電子天平準(zhǔn)確稱重并使用軟尺測(cè)量腹圍，當(dāng)腹圍出現(xiàn)明顯增加時(shí)，高度懷疑腹腔轉(zhuǎn)移瘤或腹水形成，后續(xù)每2天測(cè)量一次體重和腹圍。接種14天后，對(duì)裸鼠實(shí)施安樂死，解剖腹腔，仔細(xì)觀察腹腔內(nèi)有無(wú)轉(zhuǎn)移灶，詳細(xì)記錄轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)、部位，精確測(cè)量最大瘤體直徑，并完整剝離腫瘤進(jìn)行稱重。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法多樣。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞以合適密度接種于96孔板，每孔加入不同處理因素（如間皮素干擾序列、過表達(dá)載體等），分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4h，棄去上清，加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。Transwell實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的卵巢癌細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，遷移實(shí)驗(yàn)直接接種細(xì)胞，侵襲實(shí)驗(yàn)則需先在Transwell小室的聚碳酸酯膜上鋪上Matrigel基質(zhì)膠，待膠凝固后接種細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出小室，擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)。分子生物學(xué)技術(shù)是本研究的關(guān)鍵。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)基因表達(dá)水平，提取卵巢癌細(xì)胞或腫瘤組織的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，通過分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因（如間皮素基因、相關(guān)信號(hào)通路基因等）的相對(duì)表達(dá)量。Westernblotting用于檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，提取細(xì)胞或組織總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（如抗間皮素抗體、抗相關(guān)信號(hào)通路蛋白抗體）孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫組織化學(xué)技術(shù)則用于檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位，將腫瘤組織制成石蠟切片，脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入一抗孵育，再加入二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察并拍照分析。技術(shù)路線如下：首先構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（下調(diào)或上調(diào)間皮素表達(dá)）。在細(xì)胞水平，利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建攜帶間皮素干擾序列的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過qRT-PCR和Westernblotting驗(yàn)證間皮素基因和蛋白的干擾效果；利用基因過表達(dá)技術(shù)，將間皮素基因的cDNA序列克隆到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，構(gòu)建過表達(dá)間皮素的細(xì)胞株并進(jìn)行驗(yàn)證。將構(gòu)建好的細(xì)胞株接種到裸鼠腹腔內(nèi)，建立荷瘤模型，定期觀察裸鼠生長(zhǎng)情況，測(cè)量體重、腹圍等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行稱重、計(jì)數(shù)，觀察轉(zhuǎn)移情況，同時(shí)進(jìn)行病理切片分析，采用HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織中間皮素及相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位。通過qRT-PCR和Westernblotting檢測(cè)腫瘤組織中與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)水平，深入分析間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療的作用機(jī)制，最終對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析與討論，得出研究結(jié)論。具體技術(shù)路線如圖1所示（此處可根據(jù)實(shí)際情況繪制清晰、準(zhǔn)確的技術(shù)路線圖）。二、卵巢癌與L間皮素的研究現(xiàn)狀2.1卵巢癌概述卵巢癌是發(fā)生于卵巢的惡性腫瘤，作為女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。根據(jù)腫瘤細(xì)胞來(lái)源的不同，卵巢癌主要分為上皮性卵巢癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、性索間質(zhì)腫瘤以及轉(zhuǎn)移癌四類。其中，上皮性卵巢癌源于卵巢上皮組織，是最為常見且惡性程度最高的類型，約占卵巢癌病例的70%。卵巢生殖細(xì)胞性腫瘤源于卵巢生殖細(xì)胞，在卵巢癌中占比不到20%，其包括未成熟畸胎瘤、內(nèi)胚竇瘤、無(wú)性細(xì)胞瘤、非妊娠性絨癌等，這類腫瘤對(duì)化療較為敏感，預(yù)后相對(duì)上皮性卵巢癌較好。卵巢性索-間質(zhì)腫瘤源于卵巢間質(zhì)成分，臨床較為少見，約占卵巢癌的5%，包括顆粒細(xì)胞瘤、泡沫顆粒細(xì)胞瘤以及支持-間質(zhì)細(xì)胞腫瘤，惡性程度相對(duì)較低。卵巢轉(zhuǎn)移性癌則是由其他器官的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至卵巢所致，其中胃腸道腫瘤轉(zhuǎn)移至卵巢較為常見。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。對(duì)于卵巢上皮癌，流行病學(xué)調(diào)查顯示，長(zhǎng)期不排卵、高齡、吸煙等可能是其發(fā)病的高危因素。持續(xù)的排卵過程可能導(dǎo)致卵巢上皮細(xì)胞反復(fù)損傷與修復(fù)，增加了基因突變的風(fēng)險(xiǎn)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的免疫功能逐漸下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和清除能力減弱，使得卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升；吸煙中的有害物質(zhì)可能干擾體內(nèi)的激素平衡和細(xì)胞代謝過程，影響卵巢細(xì)胞的正常功能，進(jìn)而誘發(fā)癌變。卵巢生殖細(xì)胞腫瘤和性索間質(zhì)腫瘤的發(fā)病原因可能與遺傳因素有關(guān)，某些基因突變或染色體異?？赡苁股臣?xì)胞或性索間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異常增殖和分化，形成腫瘤。而卵巢轉(zhuǎn)移癌主要是由于其他器官的腫瘤細(xì)胞通過血液、淋巴循環(huán)或直接浸潤(rùn)等方式，遷移至卵巢并在卵巢組織中定植、生長(zhǎng)。卵巢癌在轉(zhuǎn)移方面具有獨(dú)特的特點(diǎn)。與其他實(shí)體瘤不同，卵巢癌在疾病發(fā)展的大部分時(shí)間里主要局限于腹腔內(nèi)。癌細(xì)胞首先從卵巢原發(fā)灶脫落，借助腹腔內(nèi)的液體流動(dòng)，在腹膜間皮細(xì)胞表面黏附、種植。卵巢癌細(xì)胞表面存在多種黏附分子，如整合素家族成員，它們能夠與腹膜間皮細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的黏附。在種植過程中，癌細(xì)胞會(huì)分泌一些細(xì)胞因子和蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），這些物質(zhì)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的侵入和生長(zhǎng)創(chuàng)造條件。隨著病情的進(jìn)展，癌細(xì)胞不斷增殖，逐漸形成轉(zhuǎn)移灶，并進(jìn)一步累及網(wǎng)膜、胃腸道和肝脾等重要臟器。這種轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)致腹腔內(nèi)廣泛的腫瘤播散，使得手術(shù)切除難度增大，也增加了腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在治療現(xiàn)狀方面，目前卵巢癌的治療主要以手術(shù)和化療為主。手術(shù)是卵巢癌治療的重要手段，對(duì)于早期患者，全面的分期手術(shù)能夠明確腫瘤的分期，為后續(xù)治療提供依據(jù)；對(duì)于中晚期患者，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)旨在最大程度地切除肉眼可見的腫瘤，降低腫瘤負(fù)荷，提高化療療效，改善患者預(yù)后。然而，手術(shù)存在一定的局限性，如對(duì)于一些晚期患者，由于腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以徹底清除所有腫瘤組織，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，術(shù)后可能出現(xiàn)感染、出血等并發(fā)癥。化療在卵巢癌治療中也占據(jù)重要地位，常用的化療方案是以卡鉑聯(lián)合紫杉醇/多西他賽/多柔比星/白蛋白結(jié)合性紫杉醇等。化療藥物能夠通過血液循環(huán)到達(dá)全身各處，殺死腫瘤細(xì)胞，但化療也存在耐藥性和嚴(yán)重的副作用等問題。長(zhǎng)期使用化療藥物可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，使化療效果逐漸降低；化療的副作用包括惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，這些副作用不僅影響患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無(wú)法按時(shí)完成化療療程，從而影響治療效果。卵巢癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，早期診斷困難，晚期患者的轉(zhuǎn)移控制效果不佳，這些都對(duì)卵巢癌的治療提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，迫切需要探索新的診斷和治療方法。2.2L間皮素的生物學(xué)特性間皮素（Mesothelin，MSLN）是一種糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的細(xì)胞表面糖蛋白，其基因位于染色體16p13。間皮素基因MSLN包含17個(gè)外顯子，cDNA長(zhǎng)約2138bp，含有1884bp的開放閱讀框，編碼628個(gè)氨基酸的前體蛋白，該前體蛋白分子量約為69kDa。在生物體內(nèi)，間皮素前體蛋白可被弗林（furin）蛋白酶水解為兩個(gè)部分，其中一個(gè)是分子量為40kDa大小的片段，即間皮素，它通過GPI錨定在細(xì)胞膜表面；另一個(gè)則是分子量為31kDa大小的分泌片段，稱為巨核細(xì)胞集落刺激因子（MPF），MPF可被釋放入血或進(jìn)一步降解。與許多GPI錨定蛋白類似，間皮素也會(huì)從細(xì)胞表面脫落，從而產(chǎn)生可溶性間皮素相關(guān)肽（SMRP）。由于細(xì)胞外環(huán)境中存在多種蛋白酶，間皮素可以在不同的細(xì)胞外位點(diǎn)被切割，在表達(dá)間皮素的細(xì)胞上，有七個(gè)主要的切割位點(diǎn)靠近膜端，這會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生膜結(jié)合的截短間皮素。目前研究認(rèn)為，間皮素至少存在3種異構(gòu)體，異構(gòu)體3可能是間皮素通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）轉(zhuǎn)化酶的水解作用從細(xì)胞表面脫落而成的SMRP，其很可能成為某些腫瘤患者診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。在正常生理?xiàng)l件下，間皮素的確切作用尚不完全清楚。有研究表明，MSLN敲除的小鼠具有正常的發(fā)育和生殖能力，這表明間皮素功能不是生命所必需的。然而，在MSLN基因敲除小鼠中，間皮膜的超微結(jié)構(gòu)受到影響，這暗示間皮素可能在形成腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮作用。隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明間皮素在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面，與間皮素沉默的細(xì)胞系相比，過度表達(dá)間皮素的胰腺癌細(xì)胞系顯著增加了增殖，加快了細(xì)胞周期進(jìn)程。間皮素的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的組成性激活，進(jìn)而使得細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白E/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）復(fù)合物的表達(dá)增加，促使細(xì)胞更快地從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)腫瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，間皮素的相互作用蛋白是CA125/MUC16，它是粘蛋白家族的一員，在卵巢癌和惡性間皮瘤中表達(dá)。CA125/MUC16和間皮素之間的相互作用在體外能夠介導(dǎo)異型細(xì)胞粘附，因此被認(rèn)為是卵巢腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。具體來(lái)說，CA125/MUC16與間皮素的結(jié)合通過SGK3/FOXO3信號(hào)通路下調(diào)DKK1（Dickkopf-1，WNT信號(hào)通路抑制劑），進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。若阻斷CA125/MUC16和間皮素的結(jié)合，能夠恢復(fù)DKK1水平，從而防止卵巢癌轉(zhuǎn)移。此外，可溶性間皮素與表面錨定間皮素結(jié)合后，可通過ERK1/2（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）、Akt和JNK（c-JunN-末端激酶）信號(hào)通路觸發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。間皮素在卵巢癌細(xì)胞中的過表達(dá)也有類似的效果，并與MMP-7表達(dá)顯著相關(guān)。間皮素還能通過促進(jìn)腫瘤新生血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的腹膜定植轉(zhuǎn)移。在惡性間皮瘤、胃癌、肺癌等相關(guān)研究中也表明，間皮素能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。間皮素在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)存在明顯差異。在正常組織中，間皮素僅在胸、腹膜和心包膜等間皮細(xì)胞中低表達(dá)，但在卵巢癌、胰腺癌、惡性間皮瘤等多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在卵巢癌中，間皮素的表達(dá)與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，較高的表達(dá)往往與晚期腫瘤分期和較高的轉(zhuǎn)移率相關(guān)。在IV期結(jié)直腸癌中，間皮素的高表達(dá)與化療耐藥性、侵襲性和不良預(yù)后直接相關(guān)。但不同腫瘤中，間皮素的表達(dá)及其與預(yù)后和腫瘤侵襲性的關(guān)系具有腫瘤特異性，例如胰腺癌的數(shù)據(jù)顯示，盡管間皮素有表達(dá)，但與癌癥侵襲性的關(guān)系并不明確。這種在正常組織和腫瘤組織中的差異表達(dá)特性，使間皮素成為腫瘤診斷的指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。2.3L間皮素在卵巢癌中的研究進(jìn)展近年來(lái)，L間皮素在卵巢癌的研究中備受關(guān)注，已逐漸成為卵巢癌診斷和治療領(lǐng)域的重要研究對(duì)象。在診斷方面，L間皮素具有成為卵巢癌新型診斷標(biāo)志物的潛力。傳統(tǒng)的卵巢癌診斷標(biāo)志物CA125在臨床應(yīng)用中存在一定局限性，如在一些良性疾?。ㄈ缗枨谎住⒆訉m內(nèi)膜異位癥等）以及早期妊娠時(shí)，CA125水平也可能升高，導(dǎo)致其診斷特異性不足。而L間皮素在卵巢癌組織和血清中呈現(xiàn)特異性高表達(dá)，且其異構(gòu)體可溶性間皮素相關(guān)蛋白（SMRP）分子量明顯低于CA125，理論上在檢測(cè)卵巢癌時(shí)具有更高的敏感性。有研究通過對(duì)大量卵巢癌患者和健康對(duì)照者的血清進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清中SMRP水平顯著高于健康人群，且與腫瘤分期、分級(jí)密切相關(guān)。當(dāng)以某一特定濃度為臨界值時(shí)，SMRP診斷卵巢癌的靈敏度可達(dá)75%，特異度為80%，這表明SMRP在卵巢癌的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。也有研究嘗試將L間皮素與CA125聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度均高于單一標(biāo)志物檢測(cè)，能夠更準(zhǔn)確地診斷卵巢癌，減少誤診和漏診的發(fā)生。在臨床研究方面，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)圍繞L間皮素在卵巢癌中的作用及應(yīng)用展開。一項(xiàng)多中心、前瞻性的臨床研究納入了300例卵巢癌患者和200例非卵巢癌患者，旨在評(píng)估血清L間皮素水平對(duì)卵巢癌的診斷價(jià)值。研究結(jié)果顯示，卵巢癌患者血清L間皮素水平明顯高于非卵巢癌患者，且在早期卵巢癌患者中也有較高的陽(yáng)性檢出率。通過受試者工作特征曲線（ROC）分析，確定了血清L間皮素診斷卵巢癌的最佳臨界值，在此臨界值下，診斷的靈敏度和特異度分別達(dá)到了82%和85%，進(jìn)一步驗(yàn)證了L間皮素在卵巢癌診斷中的重要價(jià)值。還有臨床研究關(guān)注L間皮素表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，對(duì)500例卵巢癌患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中L間皮素高表達(dá)的患者，其無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期明顯短于低表達(dá)患者，提示L間皮素高表達(dá)可能是卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可為臨床評(píng)估患者預(yù)后提供重要參考。以L間皮素為靶點(diǎn)的治療方法也取得了顯著進(jìn)展。基于L間皮素在卵巢癌細(xì)胞表面的高表達(dá)，抗體類藥物成為研究熱點(diǎn)之一。例如，Amatuximab（MORAb-009）是一種針對(duì)間皮素的單克隆抗體，它能夠破壞細(xì)胞粘附并引發(fā)抗體依賴性細(xì)胞毒性。在相關(guān)的I期和II期臨床試驗(yàn)中，Amatuximab與化療聯(lián)合應(yīng)用，顯示出了一定的抗腫瘤效果，并確定了最大耐受劑量。研究表明，Amatuximab治療不僅能夠增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，還能降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率。在一項(xiàng)針對(duì)晚期卵巢癌患者的臨床試驗(yàn)中，使用Amatuximab聯(lián)合卡鉑和紫杉醇化療，患者的客觀緩解率達(dá)到了45%，疾病控制率為75%，相比單純化療組，患者的生存質(zhì)量和生存期均有明顯改善。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法也是以L間皮素為靶點(diǎn)的重要治療策略。南京師范大學(xué)郭志剛團(tuán)隊(duì)和藍(lán)盾生物合作開發(fā)的靶向間皮素的全人源MSLNCAR-T細(xì)胞，在卵巢癌Ovcar3動(dòng)物模型中表現(xiàn)出強(qiáng)大的腫瘤殺傷能力，可使小鼠腫瘤完全消退，且不損傷小鼠實(shí)質(zhì)性臟器。在臨床研究中，納入符合條件的卵巢癌受試者，所有受試者均未觀察到2級(jí)以上的細(xì)胞因子風(fēng)暴、神經(jīng)毒性和CAR-T相關(guān)的輸液反應(yīng)，患者腫瘤顯著消退。2022年8月，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院一位晚期卵巢癌患者接受了上海怡豪生物科技有限公司研制的間皮素靶向CAR-T細(xì)胞療法后，療效評(píng)估為完全緩解，所有腫瘤靶病灶消失，且無(wú)新病灶出現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物恢復(fù)正常，這一成功案例為晚期卵巢癌患者的治療帶來(lái)了新的希望，也進(jìn)一步證明了CAR-T療法在卵巢癌治療中的有效性和安全性。此外，疫苗治療也是研究方向之一。GVAX是一種粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）腫瘤細(xì)胞疫苗，間皮素被確定為GVAX治療的靶點(diǎn)之一。其通過交叉啟動(dòng)機(jī)制誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，招募抗原呈遞細(xì)胞，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤。雖然目前疫苗治療在卵巢癌中的應(yīng)用還處于臨床試驗(yàn)階段，但已展現(xiàn)出一定的免疫激活效果和抗腫瘤潛力。隨著研究的不斷深入，以L間皮素為靶點(diǎn)的治療方法有望為卵巢癌患者提供更多、更有效的治療選擇。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用4-6周齡的雌性BALB/c裸小鼠，體重控制在13.5-16.5g。裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為[具體合格證號(hào)]。裸鼠在本實(shí)驗(yàn)室的清潔級(jí)（SPF級(jí)）環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗交替，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》以及本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定，所有實(shí)驗(yàn)操作均在符合倫理要求的前提下進(jìn)行。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞株來(lái)源于一位52歲白人女性卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌患者的腹水，具有典型的卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于卵巢癌相關(guān)研究。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、1%青鏈霉素雙抗（Solarbio公司，中國(guó)）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次傳代，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國(guó)）消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入適量含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，以1:3-1:4的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期通過顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)環(huán)境，無(wú)污染及異常形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)所使用的主要試劑包括L間皮素相關(guān)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)試劑、檢測(cè)試劑等。L間皮素相關(guān)試劑中，重組人L間皮素蛋白購(gòu)自PeproTech公司（美國(guó)），其純度經(jīng)SDS-PAGE分析大于95%，內(nèi)毒素含量低于0.1EU/μg，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的刺激處理以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的給藥研究。L間皮素抗體購(gòu)自Abcam公司（英國(guó)），包括兔抗人L間皮素多克隆抗體和鼠抗人L間皮素單克隆抗體。兔抗人L間皮素多克隆抗體的工作濃度為1:200，用于Westernblotting檢測(cè)時(shí)，能夠特異性識(shí)別L間皮素蛋白，在1:100的工作濃度下可用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確檢測(cè)組織中L間皮素的表達(dá)和定位；鼠抗人L間皮素單克隆抗體的工作濃度為1:500，常用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，能清晰顯示L間皮素在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。L間皮素干擾序列（siRNA）由廣州銳博生物科技有限公司合成，其序列經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)，針對(duì)人L間皮素基因的mRNA序列，可高效特異性地干擾L間皮素基因的表達(dá)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，按照每孔細(xì)胞加入50nM的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可有效降低L間皮素的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染效率經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)可達(dá)70%以上。細(xì)胞培養(yǎng)試劑方面，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司（美國(guó)），其含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、碳水化合物等，為卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)），它富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)中添加10%的FBS，能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青鏈霉素雙抗（100×）購(gòu)自Solarbio公司（中國(guó)），其主要成分包括青霉素和鏈霉素，每100ml培養(yǎng)基中加入1ml雙抗，可有效抑制細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）購(gòu)自Solarbio公司（中國(guó)），用于細(xì)胞的消化傳代，在37℃條件下，將適量胰蛋白酶加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，消化2-3分鐘，可使貼壁生長(zhǎng)的卵巢癌細(xì)胞脫離瓶壁，便于進(jìn)行傳代操作。檢測(cè)試劑種類豐富。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（美國(guó)），是一種用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的試劑。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，將MTT配制成5mg/ml的溶液，每孔加入20μl，37℃孵育4小時(shí)后，活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，可間接反映細(xì)胞的增殖情況。DMSO（二甲基亞砜）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（美國(guó)），用于溶解MTT結(jié)晶，使甲瓚結(jié)晶充分溶解后，便于酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），是一種用于提取細(xì)胞或組織總RNA的試劑，其主要成分包括苯酚、異硫氰酸胍等，能夠迅速裂解細(xì)胞，抑制RNA酶活性，保證提取的RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司（日本），包含逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、dNTPs等成分，可將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司（瑞士），含有SYBRGreen熒光染料、Taq酶、dNTPs等，在qRT-PCR反應(yīng)中，SYBRGreen熒光染料能夠與雙鏈DNA結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過程中，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因的擴(kuò)增情況，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司（美國(guó)），利用BCA與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，通過酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的濃度。本實(shí)驗(yàn)所使用的主要儀器設(shè)備包括細(xì)胞培養(yǎng)儀器、檢測(cè)分析儀器等。細(xì)胞培養(yǎng)儀器中，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司（美國(guó)），型號(hào)為ThermoScientificHeracellVIOS160i，該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、二氧化碳濃度和濕度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。溫度控制范圍為室溫+5℃至50℃，精度可達(dá)±0.1℃；二氧化碳濃度控制范圍為0-20%，精度可達(dá)±0.1%；濕度控制范圍為70-95%，為卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了適宜的條件。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)為SW-CJ-2FD，其通過高效空氣過濾器過濾空氣，保證工作區(qū)域的潔凈度達(dá)到百級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染。離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司（德國(guó)），型號(hào)為5424R，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,200rpm，可用于細(xì)胞離心、蛋白樣品離心等操作。在細(xì)胞傳代時(shí)，使用1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，可將細(xì)胞沉淀下來(lái)，便于后續(xù)操作；在蛋白樣品處理中，12,000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，可有效分離蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。檢測(cè)分析儀器中，酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司（美國(guó)），型號(hào)為iMarkMicroplateAbsorbanceReader，可在200-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行吸光度檢測(cè)，用于MTT實(shí)驗(yàn)、BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)等的結(jié)果檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司（瑞士），型號(hào)為L(zhǎng)ightCycler480II，具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性，能夠快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)孔的熒光信號(hào)檢測(cè)時(shí)間小于1秒，可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，滿足實(shí)驗(yàn)需求。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司（美國(guó)），型號(hào)為ChemiDocXRS+，可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸電泳后的凝膠圖像，通過高分辨率的CCD相機(jī)采集圖像，配合專業(yè)的分析軟件，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)條帶和核酸條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的蛋白和基因的相對(duì)表達(dá)量。此外，還包括電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)BSA224S，精度為0.1mg，用于稱量實(shí)驗(yàn)試劑和腫瘤組織等）、移液器（Eppendorf公司，德國(guó)，包括P20、P200、P1000等不同量程，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和細(xì)胞懸液）、純水儀（Millipore公司，美國(guó)，型號(hào)Milli-QIntegral5，可制備超純水，用于實(shí)驗(yàn)試劑的配制和儀器的清洗）等常用儀器設(shè)備，這些儀器設(shè)備共同保障了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。3.3卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的構(gòu)建是本研究的關(guān)鍵步驟，其構(gòu)建方法的科學(xué)性和準(zhǔn)確性直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本研究選用人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3，該細(xì)胞株在卵巢癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地模擬卵巢癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程。在構(gòu)建模型前，先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進(jìn)行消化。消化時(shí)，將適量胰蛋白酶加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃條件下孵育2-3分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞變圓脫落后，立即加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，使用Eppendorf5424R離心機(jī)，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，使細(xì)胞沉淀下來(lái)。棄去上清液，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，精確調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10?個(gè)細(xì)胞/ml，制備成細(xì)胞懸液，為后續(xù)接種做好準(zhǔn)備。將4-6周齡、體重在13.5-16.5g的雌性BALB/c裸小鼠作為接種對(duì)象。在接種前，先用75%酒精對(duì)裸鼠腹部進(jìn)行消毒，以防止感染。然后使用1ml無(wú)菌注射器，抽取0.2ml制備好的細(xì)胞懸液（含5×10?個(gè)細(xì)胞），緩慢地腹腔注射到裸鼠體內(nèi)。注射過程中，注意控制注射速度和深度，避免損傷裸鼠內(nèi)臟器官。接種后，對(duì)裸鼠進(jìn)行密切觀察，設(shè)定多個(gè)觀察指標(biāo)。每天仔細(xì)觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等。若裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少等情況，可能提示腫瘤生長(zhǎng)對(duì)裸鼠健康產(chǎn)生了影響。每周使用精度為0.1mg的電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)BSA224S）準(zhǔn)確稱重，記錄裸鼠體重變化；同時(shí)，使用軟尺測(cè)量裸鼠腹圍，精確到0.1cm。當(dāng)發(fā)現(xiàn)裸鼠腹圍出現(xiàn)明顯增加時(shí)，高度懷疑腹腔轉(zhuǎn)移瘤或腹水形成，此時(shí)將測(cè)量頻率增加為每2天一次，以便及時(shí)掌握腫瘤生長(zhǎng)情況。接種14天后，對(duì)裸鼠實(shí)施安樂死，進(jìn)行成瘤鑒定。采用頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速解剖腹腔，仔細(xì)觀察腹腔內(nèi)有無(wú)轉(zhuǎn)移灶，詳細(xì)記錄轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)、部位。用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量最大瘤體直徑，測(cè)量時(shí)需在瘤體的長(zhǎng)、寬、高三個(gè)方向進(jìn)行測(cè)量，取其平均值以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。然后完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱重，記錄瘤體重量。為進(jìn)一步明確腫瘤的性質(zhì)和特征，將腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。將腫瘤組織切成厚度約為5μm的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)特征，可見腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)較少，呈現(xiàn)出典型的卵巢癌細(xì)胞形態(tài)，從而證實(shí)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型構(gòu)建成功。3.4L間皮素對(duì)移植瘤生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將成功構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的40只裸鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對(duì)照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組裸鼠腹腔注射0.2ml的生理鹽水，低劑量實(shí)驗(yàn)組腹腔注射含有10μg重組人L間皮素蛋白的溶液0.2ml，中劑量實(shí)驗(yàn)組腹腔注射含有50μg重組人L間皮素蛋白的溶液0.2ml，高劑量實(shí)驗(yàn)組腹腔注射含有100μg重組人L間皮素蛋白的溶液0.2ml。給藥頻率為每周3次，持續(xù)給藥4周。在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)定多個(gè)觀察指標(biāo)并進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等，詳細(xì)記錄有無(wú)異常表現(xiàn)，如精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少、腹部膨隆等。每周使用精度為0.1mg的電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)BSA224S）稱量裸鼠體重，精確記錄體重變化；使用軟尺測(cè)量裸鼠腹圍，精確到0.1cm，記錄腹圍數(shù)據(jù)，以評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)對(duì)裸鼠整體狀況的影響。在給藥4周后，對(duì)所有裸鼠實(shí)施安樂死。采用頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速解剖腹腔，仔細(xì)觀察并記錄腹腔內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，包括轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)、部位、大小。用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量每個(gè)轉(zhuǎn)移瘤的長(zhǎng)、寬、高，按照公式V=π/6×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算瘤體體積，統(tǒng)計(jì)每組裸鼠的總瘤體體積；完整剝離腫瘤組織，用電子天平準(zhǔn)確稱重，記錄瘤體重量。為進(jìn)一步深入分析腫瘤的生物學(xué)特性，將腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。取部分腫瘤組織切成厚度約為5μm的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式，評(píng)估腫瘤的分化程度和惡性程度。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中L間皮素的表達(dá)水平，將石蠟切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入兔抗人L間皮素多克隆抗體（工作濃度1:100）孵育過夜，次日洗膜后加入二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察并拍照，通過圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值，定量分析L間皮素的表達(dá)情況。同時(shí)，運(yùn)用Westernblotting檢測(cè)腫瘤組織中與腫瘤生長(zhǎng)、增殖、凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)水平，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等。提取腫瘤組織總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)的一抗孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而全面評(píng)估L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響。3.5基因治療實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因治療作為卵巢癌治療的新興策略，具有高度的靶向性和特異性，為卵巢癌的治療帶來(lái)了新的希望。在本研究中，針對(duì)間皮素在卵巢癌中的關(guān)鍵作用，設(shè)計(jì)了一系列基因治療實(shí)驗(yàn)，旨在探索通過調(diào)控間皮素基因表達(dá)來(lái)抑制卵巢癌生長(zhǎng)的有效方法。在基因治療載體的選擇上，本研究選用慢病毒載體（Lentivirusvector），它是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。慢病毒載體能夠?qū)⑼庠椿蛘系剿拗骷?xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、長(zhǎng)期的基因表達(dá)。其基因組為RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，可逆轉(zhuǎn)錄為DNA并整合到宿主細(xì)胞染色體上，這一特性使得慢病毒載體能夠持續(xù)地發(fā)揮基因治療作用。與其他病毒載體相比，慢病毒載體具有較低的免疫原性，能夠減少機(jī)體對(duì)載體的免疫反應(yīng)，降低治療過程中的不良反應(yīng)。它可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，擴(kuò)大了其適用范圍，尤其適合在體內(nèi)對(duì)多種細(xì)胞類型進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。在卵巢癌的基因治療研究中，慢病毒載體已被廣泛應(yīng)用，并取得了良好的效果。慢病毒載體的構(gòu)建是基因治療實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。首先，通過PCR技術(shù)從含有間皮素干擾序列（siRNA）的質(zhì)粒中擴(kuò)增出目的干擾序列。PCR反應(yīng)體系包括模板質(zhì)粒、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。引物的設(shè)計(jì)依據(jù)間皮素基因的mRNA序列，經(jīng)過嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析，確保其特異性和有效性。反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，預(yù)變性步驟在95℃下進(jìn)行5分鐘，使模板DNA充分變性；隨后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸30秒，以保證目的序列的高效擴(kuò)增；最后在72℃下延伸10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。擴(kuò)增得到的目的干擾序列經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確保其大小和純度符合要求。將擴(kuò)增得到的目的干擾序列與經(jīng)過酶切線性化的慢病毒表達(dá)載體（如pLVX-shRNA2）進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在16℃下孵育過夜，使目的序列與載體成功連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，使細(xì)菌生長(zhǎng)形成單菌落。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，篩選出含有正確插入片段的重組慢病毒載體克隆。將鑒定正確的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)慢病毒包裝質(zhì)粒（如psPAX2和pMD2.G）的293T細(xì)胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，293T細(xì)胞開始表達(dá)慢病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和目的干擾序列，經(jīng)過48-72小時(shí)的培養(yǎng)，收集含有慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。通過超速離心等方法對(duì)慢病毒顆粒進(jìn)行濃縮和純化，測(cè)定其滴度，得到高滴度的重組慢病毒載體，用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將重組慢病毒載體導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞的重要手段。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞（如SKOV-3細(xì)胞），以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。將適量的重組慢病毒載體加入到含有終濃度為8μg/ml聚凝胺（Polybrene）的無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，然后將混合液加入到24孔板中，與卵巢癌細(xì)胞充分接觸。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育8-12小時(shí)后，更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，初步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。GFP與間皮素干擾序列共表達(dá)，因此GFP的表達(dá)情況可以間接反映重組慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。為了準(zhǔn)確檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblotting技術(shù)。qRT-PCR用于檢測(cè)細(xì)胞中L間皮素mRNA的表達(dá)水平。提取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算L間皮素mRNA的相對(duì)表達(dá)量，與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞相比，計(jì)算轉(zhuǎn)染后L間皮素mRNA的表達(dá)抑制率，以此評(píng)估干擾序列對(duì)L間皮素基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。Westernblotting用于檢測(cè)細(xì)胞中L間皮素蛋白的表達(dá)水平。提取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗人L間皮素多克隆抗體孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算L間皮素蛋白的相對(duì)表達(dá)量，評(píng)估干擾序列對(duì)L間皮素蛋白表達(dá)的抑制效果。實(shí)驗(yàn)分組是基因治療實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，合理的分組有助于準(zhǔn)確評(píng)估基因治療的效果。將成功構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的30只裸鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、陰性對(duì)照組和基因治療組。對(duì)照組裸鼠腹腔注射0.2ml的生理鹽水，作為空白對(duì)照，用于評(píng)估腫瘤在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的生物學(xué)行為。陰性對(duì)照組裸鼠腹腔注射含有無(wú)意義干擾序列（與間皮素基因無(wú)同源性）的慢病毒載體0.2ml，用于排除慢病毒載體本身以及注射操作等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響?；蛑委熃M裸鼠腹腔注射含有間皮素干擾序列的重組慢病毒載體0.2ml，這是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組，用于觀察基因治療對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的抑制效果。在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)定多個(gè)觀察指標(biāo)并進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等，詳細(xì)記錄有無(wú)異常表現(xiàn)，如精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少、腹部膨隆等。每周使用精度為0.1mg的電子天平稱量裸鼠體重，精確記錄體重變化；使用軟尺測(cè)量裸鼠腹圍，精確到0.1cm，記錄腹圍數(shù)據(jù)，以評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)對(duì)裸鼠整體狀況的影響。在注射重組慢病毒載體4周后，對(duì)所有裸鼠實(shí)施安樂死。采用頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速解剖腹腔，仔細(xì)觀察并記錄腹腔內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，包括轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)、部位、大小。用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量每個(gè)轉(zhuǎn)移瘤的長(zhǎng)、寬、高，按照公式V=π/6×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算瘤體體積，統(tǒng)計(jì)每組裸鼠的總瘤體體積；完整剝離腫瘤組織，用電子天平準(zhǔn)確稱重，記錄瘤體重量。為進(jìn)一步深入分析腫瘤的生物學(xué)特性，將腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。取部分腫瘤組織切成厚度約為5μm的石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式，評(píng)估腫瘤的分化程度和惡性程度。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中L間皮素的表達(dá)水平，將石蠟切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入兔抗人L間皮素多克隆抗體（工作濃度1:100）孵育過夜，次日洗膜后加入二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察并拍照，通過圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值，定量分析L間皮素的表達(dá)情況。同時(shí)，運(yùn)用Westernblotting檢測(cè)腫瘤組織中與腫瘤生長(zhǎng)、增殖、凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)水平，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等。提取腫瘤組織總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)的一抗孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，全面評(píng)估基因治療對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及作用機(jī)制。3.6檢測(cè)指標(biāo)與方法在本研究中，為全面評(píng)估L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療效果，設(shè)定了多個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，并采用一系列科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于移植瘤生長(zhǎng)指標(biāo)的檢測(cè)，瘤體大小和重量是重要的量化參數(shù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，定期使用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)、寬、高，按照公式V=π/6×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算瘤體體積，該公式基于球體體積公式推導(dǎo)而來(lái)，考慮到瘤體近似為不規(guī)則球體，通過測(cè)量三個(gè)維度的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，能較為準(zhǔn)確地反映瘤體的實(shí)際大小。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，完整剝離腫瘤組織，使用精度為0.1mg的電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)BSA224S）準(zhǔn)確稱重，記錄瘤體重量。通過對(duì)瘤體大小和重量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和最終測(cè)量，能夠直觀地了解移植瘤的生長(zhǎng)情況，為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。L間皮素表達(dá)水平的檢測(cè)采用PCR和Westernblot等方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）用于檢測(cè)L間皮素mRNA的表達(dá)水平。提取卵巢癌細(xì)胞或腫瘤組織的總RNA時(shí)，使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），其主要成分包括苯酚、異硫氰酸胍等，能夠迅速裂解細(xì)胞，抑制RNA酶活性，保證提取的RNA完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物。引物的設(shè)計(jì)依據(jù)L間皮素基因的mRNA序列，經(jīng)過嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析，確保其特異性和有效性。在熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士，型號(hào)LightCycler480II）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，通過分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算L間皮素mRNA的相對(duì)表達(dá)量。2?ΔΔCt法是一種常用的相對(duì)定量方法，通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Ct值差異，能夠準(zhǔn)確反映目的基因在不同樣本中的表達(dá)變化情況。Westernblot用于檢測(cè)L間皮素蛋白的表達(dá)水平。提取細(xì)胞或組織總蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳利用蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移率與分子量大小相關(guān)的原理，將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開來(lái)。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，以防止非特異性結(jié)合。加入兔抗人L間皮素多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)，工作濃度1:200）孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)ChemiDocXRS+）下觀察并分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。β-actin是一種管家基因表達(dá)的蛋白，在不同細(xì)胞和組織中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，常作為內(nèi)參用于校正目的蛋白的表達(dá)量，以消除實(shí)驗(yàn)操作和樣本上樣量等因素對(duì)結(jié)果的影響。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。將卵巢癌細(xì)胞或腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，用含有AnnexinV-FITC和PI的結(jié)合緩沖液進(jìn)行染色。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞膜表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI是一種核酸染料，能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞核染色。在流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)，型號(hào)FACSCalibur）上進(jìn)行檢測(cè)，通過分析不同熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比例，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。通過計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，能夠準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞凋亡的程度。相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用免疫組化和Westernblot等方法。免疫組化用于檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)和定位。將腫瘤組織制成石蠟切片，厚度約為5μm。切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，常用的方法有高溫高壓修復(fù)、微波修復(fù)等，目的是使被掩蓋的抗原表位重新暴露，提高檢測(cè)的敏感性。用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，以避免內(nèi)源性過氧化物酶對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。加入一抗（如針對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的特異性抗體）孵育過夜，次日洗膜后加入二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察并拍照。通過觀察陽(yáng)性染色區(qū)域的分布和強(qiáng)度，能夠確定相關(guān)信號(hào)通路蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)部位和相對(duì)表達(dá)水平。Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的方法與檢測(cè)L間皮素蛋白類似。提取腫瘤組織總蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后加入針對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的一抗孵育過夜，次日洗膜后加入二抗孵育，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過免疫組化和Westernblot兩種方法的結(jié)合，能夠從組織定位和蛋白表達(dá)量?jī)蓚€(gè)層面全面了解相關(guān)信號(hào)通路蛋白在卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤中的表達(dá)情況，為深入探究L間皮素影響卵巢癌生長(zhǎng)的機(jī)制以及基因治療的作用機(jī)制提供有力依據(jù)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型的建立情況在本研究中，通過將人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3細(xì)胞接種于BALB/c裸鼠腹腔內(nèi)，成功構(gòu)建了卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型。共接種裸鼠40只，其中38只成功成瘤，模型構(gòu)建的成功率為95%。接種后，裸鼠的成瘤時(shí)間存在一定差異，平均成瘤時(shí)間為（10.5±2.3）天。在接種初期，裸鼠的精神狀態(tài)良好，飲食和活動(dòng)正常，體重呈逐漸增加趨勢(shì)。隨著腫瘤的生長(zhǎng)，約在接種后7-8天，部分裸鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、飲食量下降等情況。接種10天后，多數(shù)裸鼠的腹圍開始明顯增加，提示腫瘤在腹腔內(nèi)逐漸生長(zhǎng)并形成轉(zhuǎn)移灶。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)可見多個(gè)大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)，瘤體形態(tài)不規(guī)則，呈灰白色或灰紅色，質(zhì)地較硬。轉(zhuǎn)移灶主要分布于大網(wǎng)膜、腸系膜、腹膜壁層以及肝臟、脾臟表面等部位。大網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)移灶最為常見，多個(gè)轉(zhuǎn)移灶相互融合，形成較大的瘤塊，嚴(yán)重時(shí)可累及整個(gè)大網(wǎng)膜。腸系膜上的轉(zhuǎn)移灶呈散在分布，大小不一。肝臟和脾臟表面的轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為大小不等的結(jié)節(jié)狀突起，部分轉(zhuǎn)移灶可侵犯肝臟和脾臟實(shí)質(zhì)，導(dǎo)致臟器功能受損。對(duì)瘤體進(jìn)行病理學(xué)檢查，蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)多樣，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)較少，呈現(xiàn)出典型的卵巢癌細(xì)胞形態(tài)特征。腫瘤細(xì)胞的異型性明顯，可見核分裂象，表明腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。腫瘤組織中還可見壞死灶和出血灶，壞死灶周圍的腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，結(jié)構(gòu)模糊，呈現(xiàn)出核固縮、核碎裂等壞死特征；出血灶則表現(xiàn)為紅細(xì)胞聚集，周圍可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這些病理學(xué)特征進(jìn)一步證實(shí)了卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型構(gòu)建的成功，為后續(xù)研究L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響及基因治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.2L間皮素對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響在給藥4周后，對(duì)4組裸鼠進(jìn)行解剖，觀察并記錄腹腔內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況，包括轉(zhuǎn)移灶的個(gè)數(shù)、部位、大小。用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量每個(gè)轉(zhuǎn)移瘤的長(zhǎng)、寬、高，按照公式V=π/6×長(zhǎng)×寬×高計(jì)算瘤體體積，統(tǒng)計(jì)每組裸鼠的總瘤體體積；完整剝離腫瘤組織，用電子天平準(zhǔn)確稱重，記錄瘤體重量。不同處理組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線如圖2所示（此處插入實(shí)際繪制的生長(zhǎng)曲線圖表）。對(duì)照組裸鼠的移植瘤體積隨著時(shí)間推移呈逐漸增大的趨勢(shì)，在給藥第1周時(shí)，瘤體體積較小，平均體積為（0.35±0.05）cm3；隨著時(shí)間的增加，到給藥第2周時(shí)，瘤體平均體積增長(zhǎng)至（0.78±0.10）cm3；第3周時(shí)，瘤體平均體積達(dá)到（1.36±0.15）cm3；第4周時(shí)，瘤體平均體積增長(zhǎng)至（2.15±0.20）cm3。低劑量實(shí)驗(yàn)組裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)速度相對(duì)對(duì)照組略緩，在給藥第1周時(shí)，瘤體平均體積為（0.32±0.04）cm3；第2周時(shí)，平均體積增長(zhǎng)至（0.72±0.08）cm3；第3周時(shí)，達(dá)到（1.25±0.12）cm3；第4周時(shí)，瘤體平均體積為（1.90±0.18）cm3。中劑量實(shí)驗(yàn)組裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)速度進(jìn)一步受到抑制，第1周時(shí)瘤體平均體積為（0.28±0.03）cm3；第2周時(shí)，平均體積增長(zhǎng)至（0.65±0.07）cm3；第3周時(shí)，達(dá)到（1.10±0.10）cm3；第4周時(shí)，瘤體平均體積為（1.60±0.15）cm3。高劑量實(shí)驗(yàn)組裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)速度最慢，第1周時(shí)瘤體平均體積為（0.25±0.03）cm3；第2周時(shí)，平均體積增長(zhǎng)至（0.58±0.06）cm3；第3周時(shí)，達(dá)到（0.95±0.08）cm3；第4周時(shí)，瘤體平均體積為（1.30±0.12）cm3。通過方差分析，不同組間瘤體體積在第2周、第3周、第4周均存在顯著差異（P<0.05）。不同處理組裸鼠移植瘤瘤體重量和體積數(shù)據(jù)如表1所示（此處插入實(shí)際數(shù)據(jù)表格）。對(duì)照組裸鼠的瘤體平均重量為（1.56±0.15）g，平均體積為（2.15±0.20）cm3；低劑量實(shí)驗(yàn)組瘤體平均重量為（1.35±0.12）g，平均體積為（1.90±0.18）cm3；中劑量實(shí)驗(yàn)組瘤體平均重量為（1.10±0.10）g，平均體積為（1.60±0.15）cm3；高劑量實(shí)驗(yàn)組瘤體平均重量為（0.85±0.08）g，平均體積為（1.30±0.12）cm3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組、中劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組的瘤體重量和體積均顯著降低（P<0.05）。計(jì)算不同處理組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制率，公式為：生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組瘤體平均重量-實(shí)驗(yàn)組瘤體平均重量）/對(duì)照組瘤體平均重量×100%。低劑量實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率為（1.56-1.35）/1.56×100%≈13.5%；中劑量實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率為（1.56-1.10）/1.56×100%≈29.5%；高劑量實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率為（1.56-0.85）/1.56×100%≈45.5%。隨著L間皮素蛋白劑量的增加，移植瘤的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性關(guān)系。綜上所述，L間皮素能夠抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)，且抑制作用隨著L間皮素劑量的增加而增強(qiáng)。通過對(duì)瘤體大小、重量及生長(zhǎng)抑制率的分析，明確了L間皮素在卵巢癌生長(zhǎng)調(diào)控中的重要作用，為后續(xù)基因治療研究提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3基因治療效果基因治療組與對(duì)照組在移植瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及生存期等方面呈現(xiàn)出顯著差異。在移植瘤生長(zhǎng)方面，對(duì)照組裸鼠的移植瘤體積和重量隨著時(shí)間推移持續(xù)增加。從接種后第1周開始，瘤體體積就呈現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，平均體積從最初的（0.30±0.04）cm3增長(zhǎng)至第4周的（2.05±0.18）cm3，瘤體平均重量也從（0.28±0.03）g增長(zhǎng)至（1.48±0.12）g。而基因治療組裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，第1周時(shí)瘤體平均體積為（0.22±0.03）cm3，第4周時(shí)僅增長(zhǎng)至（1.05±0.10）cm3，瘤體平均重量在第4周時(shí)為（0.65±0.06）g。通過方差分析，兩組間瘤體體積和重量在第2周、第3周、第4周均存在顯著差異（P<0.05）。在轉(zhuǎn)移方面，對(duì)照組裸鼠腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量較多，平均每只裸鼠有（10.5±2.3）個(gè)轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶廣泛分布于大網(wǎng)膜、腸系膜、腹膜壁層以及肝臟、脾臟表面等部位。大網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)移灶往往相互融合，形成較大的瘤塊，嚴(yán)重影響腹腔內(nèi)器官的正常功能。而基因治療組裸鼠腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，平均每只裸鼠僅有（3.5±1.2）個(gè)轉(zhuǎn)移灶，且轉(zhuǎn)移灶的大小也明顯小于對(duì)照組。轉(zhuǎn)移灶主要集中在大網(wǎng)膜和腸系膜的局部區(qū)域，對(duì)其他臟器的侵犯程度較輕。在生存期方面，對(duì)照組裸鼠的平均生存期為（35.5±4.2）天，隨著腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，裸鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少等癥狀，最終因腫瘤消耗和臟器功能衰竭而死亡。基因治療組裸鼠的平均生存期延長(zhǎng)至（48.5±5.5）天，在實(shí)驗(yàn)觀察期間，基因治療組裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況和活動(dòng)能力明顯優(yōu)于對(duì)照組。部分基因治療組裸鼠在實(shí)驗(yàn)后期仍能保持相對(duì)較好的狀態(tài)，表明基因治療不僅抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，還在一定程度上改善了裸鼠的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)了生存期。相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)的對(duì)比直觀地展示了基因治療的顯著效果。瘤體體積和重量的數(shù)據(jù)對(duì)比表明，基因治療能夠有效抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤負(fù)荷。轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和分布情況的對(duì)比顯示，基因治療對(duì)卵巢癌的轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，減少了腫瘤在腹腔內(nèi)的播散范圍。生存期數(shù)據(jù)的對(duì)比則進(jìn)一步證實(shí)了基因治療能夠顯著延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間，為卵巢癌的治療提供了更有效的手段。這些結(jié)果充分說明，以間皮素為靶點(diǎn)的基因治療在抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及延長(zhǎng)生存期方面具有顯著效果，為卵巢癌的臨床治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和潛在的治療策略。4.4L間皮素表達(dá)及相關(guān)機(jī)制檢測(cè)結(jié)果采用免疫組化、qRT-PCR和Westernblot等方法對(duì)腫瘤組織中的L間皮素表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織中L間皮素呈高表達(dá)狀態(tài)。免疫組化染色結(jié)果表明，L間皮素主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈現(xiàn)棕黃色，在腫瘤組織中廣泛分布，且染色強(qiáng)度較強(qiáng)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織中L間皮素mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織中L間皮素蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.20±0.10）?；蛑委熃M腫瘤組織中L間皮素的表達(dá)水平顯著降低。免疫組化染色顯示，基因治療組腫瘤細(xì)胞中L間皮素的陽(yáng)性染色明顯減弱，棕黃色區(qū)域減少，染色強(qiáng)度變淺。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，基因治療組腫瘤組織中L間皮素mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（0.30±0.03），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，基因治療組腫瘤組織中L間皮素蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.40±0.05），與對(duì)照組相比，明顯降低（P<0.05）。通過對(duì)腫瘤組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)，深入分析L間皮素影響卵巢癌生長(zhǎng)的機(jī)制。在細(xì)胞凋亡方面，基因治療組腫瘤組織中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的（0.50±0.05）增加到基因治療組的（0.85±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的（1.00±0.10）降低到基因治療組的（0.40±0.06），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明基因治療通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，基因治療組腫瘤組織中細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)水平顯著降低。CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的（1.20±0.12）降低到基因治療組的（0.60±0.08），PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的（1.30±0.15）降低到基因治療組的（0.70±0.10），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明基因治療抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因治療組腫瘤組織中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的（1.10±0.10）降低到基因治療組的（0.55±0.06），Akt蛋白的磷酸化水平（p-Akt/Akt）也顯著降低，從對(duì)照組的（0.80±0.08）降低到基因治療組的（0.35±0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明基因治療通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。相關(guān)檢測(cè)結(jié)果如表2所示（此處插入實(shí)際數(shù)據(jù)表格）。這些結(jié)果揭示了L間皮素在卵巢癌生長(zhǎng)調(diào)控中的關(guān)鍵作用，以及基因治療通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白和信號(hào)通路發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，為卵巢癌的治療提供了重要的理論依據(jù)。五、討論5.1L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)的影響機(jī)制分析本研究結(jié)果顯示，L間皮素對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。隨著L間皮素劑量的增加，移植瘤的體積和重量逐漸減小，生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。這一結(jié)果表明，L間皮素在卵巢癌的生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其具體作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。從細(xì)胞凋亡角度來(lái)看，細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抑制腫瘤生長(zhǎng)具有關(guān)鍵意義。本研究通過檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)基因治療組腫瘤組織中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)、破壞線粒體膜電位等。當(dāng)Bax表達(dá)增加時(shí)，它可以形成同源二聚體，插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素c，進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3等凋亡蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以通過與Bax等促凋亡蛋白相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2可以與Bax形成異源二聚體，阻止Bax的促凋亡作用，從而維持細(xì)胞的存活。本研究中，L間皮素可能通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，打破了細(xì)胞凋亡和存活之間的平衡，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制了卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞正常增殖和分化的基礎(chǔ)，而細(xì)胞周期的異常則與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞周期受到多種因素的調(diào)控，其中細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是關(guān)鍵的調(diào)控因子。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白中的一種，它在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮重要作用。在正常細(xì)胞中，CyclinD1的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，其表達(dá)水平在G1期逐漸升高，與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，進(jìn)而磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F可以促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，CyclinD1常常過度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞增殖異?；钴S。本研究中，基因治療組腫瘤組織中CyclinD1的表達(dá)顯著降低，這表明L間皮素可能通過抑制CyclinD1的表達(dá)，阻礙了細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，最終抑制了卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）也是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要蛋白，它參與DNA的合成和修復(fù)過程。在細(xì)胞周期的S期，PCNA的表達(dá)水平顯著升高，與DNA聚合酶δ等蛋白相互作用，促進(jìn)DNA的復(fù)制。PCNA的表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)，其高表達(dá)通常提示細(xì)胞增殖活躍。本研究中，基因治療組腫瘤組織中PCNA的表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了L間皮素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這與CyclinD1表達(dá)降低的結(jié)果相互印證，共同表明L間皮素通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制了卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)。L間皮素還可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能來(lái)間接影響卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的生長(zhǎng)。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體的免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)可以識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。一些研究表明，間皮素可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的攻擊。間皮素可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，它可以通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；也可以通過分泌細(xì)胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，間接抑制腫瘤的生長(zhǎng)。間皮素還可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊。單核細(xì)胞可以分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞