免疫組化成果的分析和判斷

免疫組化成果的判斷原則

免疫組化成果的判斷原則概括起來有如下幾點(diǎn)：

⒈必須同步設(shè)對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色成果是不可信的。⒉抗原體現(xiàn)必須在特定部位。如LCA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi)；PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)；等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。

3.盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性體現(xiàn)，尤其是酶免疫標(biāo)識。由于此類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為原因所致。

4.對免疫組化標(biāo)識成果的意義不能絕對化，應(yīng)結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及試驗(yàn)成果綜合分析。對照染色設(shè)計(jì)

(一）對照染色的目的設(shè)對照的目的是為了排除假陰性和假陽性。假陰性的原因重要有三：①組織處理不妥，抗原丟失過多或被遮蔽；②抗體失活、效價(jià)過低或稀釋度不合適（重要指一抗，即特異性抗體）；③染色環(huán)節(jié)遺漏及差錯(cuò)，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強(qiáng)度不妥等。假陽性均系由多種原因?qū)е碌姆翘禺愔?，原因重要有：①自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；②抗體試劑不純(尤其是一抗）；③操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不妥等。（二）對照的種類及其選用目的對照染色大體可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和自身對照四大類：⒈陽性組織對照指用已證明具有靶抗原的同源及不一樣源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢試驗(yàn)切片同步作同樣處理和免疫染色的組織對照。對的的成果應(yīng)展現(xiàn)陽性，目的是為了證明所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的也許。⒉陰性組織對照指用已證明不含靶抗原的同步處理和免疫標(biāo)識染色的組織對照。對的的成果應(yīng)為陰性，目的是除外假陽性。⒊陰性試劑對照是指用于證明在免疫組化染色中所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設(shè)置的同步免疫染色對照，包括有：空白對照；替代對照；吸取試驗(yàn)和克制試驗(yàn)等等。目的在于除外假陽性和證明所用免疫組化試劑及其技術(shù)措施的有效性和待檢試驗(yàn)切片免疫標(biāo)識陽性成果的可靠性。空白對照指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（重要的，必要時(shí)還可做第二抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對照染色，成果應(yīng)為陰性。⒋自身對照是指在同一標(biāo)識切片上的自身組織成分的陰性背景對照。即與靶抗原陽性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景構(gòu)造的顯色，成果應(yīng)為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對比。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽性和因抗原彌散移位導(dǎo)致的錯(cuò)誤成果。非特異染色

非特異染色是指免疫組化染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色成果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴(yán)重干擾免疫組化染色成果的對的判斷，應(yīng)竭力防止或減輕。其原因波及免疫組化染色流程的各個(gè)環(huán)節(jié)，可來自：①內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；②試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng)等等)；③組織處理不妥(組織固定不及時(shí)或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充足所導(dǎo)致的游離試劑殘留等)。陽性標(biāo)識的形態(tài)特性和判斷免疫組化標(biāo)識具有一定形態(tài)特點(diǎn)，若能純熟掌握則有助于對免疫組化標(biāo)識成果的對的判斷。特點(diǎn)包括定性、定位和定量三方面。免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，實(shí)際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)合的措施綜合計(jì)量，與抗原含量有關(guān)；陽性細(xì)胞的著色形態(tài)及組織分布特點(diǎn)重要是定位指標(biāo)，與功能有關(guān)。一、陽性標(biāo)識免疫特性：分"弱(+)、中(++)、強(qiáng)(+++)"三級。免疫熒光法（FITC為例）體現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光；免疫酶標(biāo)識（HRP-DAB/H2O2）則體現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。一般圖片照像，原則上多取強(qiáng)陽性區(qū)域。二、陽性標(biāo)識細(xì)胞學(xué)特性（以HRP-DAB/H2O2為例）可分為:①胞膜型；②胞核型；③胞質(zhì)(漿)型；④復(fù)合型等四種陽性細(xì)胞類型。這與抗原所在部位有關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復(fù)合型圖像。三、陽性標(biāo)識組織學(xué)特性（以HRP-DAB/H2O2為例）免疫組化染色陽性細(xì)胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：①局灶型；②彌漫型；③片塊型；④網(wǎng)狀型；⑤腺管型；⑥腔緣型和⑦菊團(tuán)型，等。這重要取決于抗原抗體復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽性細(xì)胞在組織內(nèi)的群體分布特點(diǎn)。四、陽性標(biāo)識強(qiáng)度特性根據(jù)細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）┅1分；中等陽性（++）┅2分；強(qiáng)陽性（+++）┅3分。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量，可分為：弱陽性（+，指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%如下）；中等陽性（++,指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%—49%)；強(qiáng)陽性（+++，指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上)。KAIl在宮頸鱗癌中的體現(xiàn)及臨床意義

免疫組化成果鑒定：光學(xué)顯微鏡下觀測組織切片的顯色反應(yīng)：以已知陽性組織切片作陽性對照，PBS液替代一抗作為每次染色的陰性(空白)對照。以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽性細(xì)胞。高倍鏡下取5個(gè)不一樣視野各計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)不不小于10％為KAI1體現(xiàn)陰性，不小于10％為KAI1體現(xiàn)陽性。KAIl在宮頸鱗癌中的體現(xiàn)及臨床意義免疫組化染色成果：在92例宮頸癌組織切片中，KAIl的陽性體現(xiàn)分別為47例(51．08％)。50例正常宮頸組織和60例CIN組織切片中，KAIl體現(xiàn)陽性分別為48例和53例(96．00％，88．33％)。陽性體現(xiàn)可見正常宮頸表面上皮呈持續(xù)的細(xì)顆粒樣線狀分布，染色較均勻，而宮頸癌組KAIl蛋白在胞膜和胞漿中的體現(xiàn)減少或缺失。染色失敗的也許原因免疫組化染色的基本規(guī)定有二：①試驗(yàn)切片的陽性抗原定位精確，呈色鮮明，背景著色淺或無；②對照染色的成果應(yīng)附合規(guī)定。否則，所得試驗(yàn)成果都是錯(cuò)誤的，或?yàn)榧訇栃曰驗(yàn)榧訇幮?。染色失敗的體現(xiàn)： 均為陰性 均為弱陽性（除陰性對照） 背景染色過深 陽性對照好，待檢標(biāo)本弱陽性 陽性對照無背景，待檢標(biāo)本背景深對照成果判斷：表中1～5結(jié)果無效，6、7結(jié)果可靠（＋）（＋）（＋）（－）（＋）（＋）（－）檢測標(biāo)本含抗體，結(jié)果可靠（＋）（－）（－）檢測標(biāo)本不含抗體結(jié)合可靠（－）（－）（－）非特異染色（＋）（＋）（－）陽性對照不含定位抗原（＋）（－）（－）陰性對照內(nèi)含定位抗原(＋)(－)（－）（＋）非特異性染色（＋）（＋）（＋）抗體失活，操作有誤（－）（－）（－）結(jié)果判斷檢測結(jié)果替代對照陰性對照陽性對照識別假陰性抗原丟失或減弱 抗體失活 操作不妥識別假陽性抗原彌散 抗原異位體現(xiàn) 瘤細(xì)胞吞噬 病變中正常組織殘留 抗體交叉反應(yīng) 內(nèi)源性物質(zhì)著色原因解決辦法抗體的濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時(shí)間:室溫1小時(shí)或4℃過夜孵育溫度過高，孵育溫度超過37℃一般室溫20-28℃DAB顯色時(shí)間過長或DAB濃度過高顯色時(shí)間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)染色過強(qiáng)原因解決辦法抗體濃度過低，孵育時(shí)間過短提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘試劑超過有效使用期及時(shí)更換試劑操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）室溫太低，低于15℃若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過夜）蛋白封閉過度封閉時(shí)間不要超過20分鐘染色弱原因解決辦法操作步驟錯(cuò)誤重新試驗(yàn)，設(shè)立陽性對