低氧激活非折疊蛋白反應(yīng)：下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的新視角一、引言1.1研究背景與意義下咽癌（hypopharyngealcarcinoma）作為頭頸部較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)雖有一定差異，但總體呈上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在一些地區(qū)，下咽癌的發(fā)病率已占據(jù)頭頸部惡性腫瘤的一定比例，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。下咽癌具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，發(fā)病部位隱蔽，早期癥狀不明顯，患者就診時(shí)多已處于中晚期，這使得治療難度大大增加。目前，下咽癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療以及綜合治療等?；熢谥型砥谙卵拾┑闹委熤姓紦?jù)重要地位，能夠有效控制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率。然而，臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，下咽癌對(duì)化療的敏感性存在較大差異，部分患者對(duì)化療藥物反應(yīng)不佳，導(dǎo)致治療效果不理想，這也是下咽癌患者預(yù)后較差的主要原因之一。因此，深入探究下咽癌化療敏感性的影響因素，對(duì)于提高化療療效、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，其中低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的顯著特征之一。腫瘤細(xì)胞的快速增殖使得耗氧量急劇增加，而腫瘤內(nèi)部血管生成不足且結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致腫瘤組織局部氧供應(yīng)相對(duì)不足，形成低氧微環(huán)境。研究表明，低氧微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及治療抵抗密切相關(guān)。在低氧條件下，腫瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列適應(yīng)性反應(yīng)，以維持自身的生存和增殖，其中非折疊蛋白反應(yīng)（unfoldedproteinresponse，UPR）是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境的重要機(jī)制之一。UPR是細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulumstress，ERS）狀態(tài)下激活的一種自我保護(hù)機(jī)制。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的折疊、修飾和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到低氧、氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)大量積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而激活UPR。UPR主要通過(guò)三條信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，包括蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PKR-likeendoplasmicreticulumkinase，PERK）通路、肌醇需求酶1（inositol-requiringenzyme1，IRE1）通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activatingtranscriptionfactor6，ATF6）通路。這些信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)未折疊蛋白的折疊和降解，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)；若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無(wú)法緩解，UPR則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以清除受損細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞中，UPR的激活不僅有助于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境，還在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）作為UPR的標(biāo)志性分子，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯升高。GRP78能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的PERK、IRE1和ATF6等應(yīng)激感受器結(jié)合，維持它們的非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與這些應(yīng)激感受器解離，從而激活UPR信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，GRP78在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及化療耐藥性密切相關(guān)。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，GRP78的高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的抵抗能力；在肺癌細(xì)胞中，抑制GRP78的表達(dá)可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，增強(qiáng)化療療效。然而，在頭頸鱗癌，尤其是下咽癌中，低氧是否能夠特異性激活UPR，以及UPR激活對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及其作用機(jī)制，目前仍不十分清楚。明確這些問(wèn)題，不僅有助于深入理解下咽癌的發(fā)病機(jī)制和化療抵抗的分子基礎(chǔ)，還可能為下咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，下咽癌的研究一直是頭頸部腫瘤領(lǐng)域的重點(diǎn)。歐美等國(guó)家的學(xué)者通過(guò)大規(guī)模的臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，對(duì)下咽癌的流行病學(xué)、病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制以及治療方法進(jìn)行了深入探討。他們發(fā)現(xiàn)，下咽癌的發(fā)病與吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒（HPV）感染等因素密切相關(guān)。在治療方面，國(guó)外學(xué)者積極探索新的治療策略，如免疫治療、靶向治療等，并取得了一定的進(jìn)展。然而，對(duì)于低氧微環(huán)境下下咽癌的生物學(xué)行為以及非折疊蛋白反應(yīng)在其中的作用，研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)的下咽癌研究也在不斷發(fā)展。學(xué)者們通過(guò)對(duì)大量臨床病例的分析，總結(jié)了下咽癌的臨床特點(diǎn)、診斷方法和治療經(jīng)驗(yàn)。在基礎(chǔ)研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)下咽癌的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些與下咽癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和信號(hào)通路。在低氧與腫瘤的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)取得了不少成果，證實(shí)了低氧對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，但在低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及機(jī)制研究方面，仍存在一定的空白。在低氧研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)低氧微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響進(jìn)行了廣泛而深入的研究。研究表明，低氧不僅能夠影響腫瘤細(xì)胞的代謝方式，使其從有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧糖酵解，以滿(mǎn)足能量需求，還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)和信號(hào)通路。低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）作為低氧應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在低氧條件下被激活，進(jìn)而調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，這些基因參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移以及對(duì)放化療的抵抗等過(guò)程。例如，HIF-1可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)也增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；HIF-1還能調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡相關(guān)的基因，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，增強(qiáng)其生存能力。此外，低氧還能通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而有利于腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的研究也是國(guó)內(nèi)外的熱門(mén)方向。眾多研究揭示了UPR的三條經(jīng)典信號(hào)通路（PERK、IRE1和ATF6通路）在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活中的重要作用。當(dāng)細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，UPR被激活，通過(guò)一系列分子機(jī)制來(lái)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。PERK通路通過(guò)磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制蛋白質(zhì)的合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)，同時(shí)激活激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)；IRE1通路具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠剪切X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其翻譯產(chǎn)生具有活性的轉(zhuǎn)錄因子sXBP1，sXBP1可以調(diào)控一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修復(fù)和功能恢復(fù)；ATF6通路中，ATF6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，在那里被蛋白酶切割，釋放出具有活性的N端片段，進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞存活調(diào)節(jié)。此外，UPR在腫瘤細(xì)胞中的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性密切相關(guān)。在多種腫瘤中，UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯升高，且與腫瘤的惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)。例如，在乳腺癌中，GRP78的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和化療耐藥密切相關(guān)；在肺癌中，抑制IRE1通路可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)下咽癌、低氧和UPR分別進(jìn)行了大量研究，但關(guān)于低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的作用及機(jī)制研究仍存在不足。目前，對(duì)于低氧在何種程度、何種條件下能夠特異性激活下咽癌中的UPR，以及UPR激活后如何通過(guò)具體的信號(hào)通路和分子機(jī)制影響下咽癌的化療敏感性，尚未完全明確。此外，針對(duì)低氧激活UPR這一靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)有效的治療策略以提高下咽癌化療療效的研究也相對(duì)較少。因此，深入開(kāi)展這方面的研究具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究低氧激活非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的作用及機(jī)制，為提高下咽癌化療療效提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：1.3.1檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白在下咽癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系收集下咽癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織樣本，運(yùn)用免疫組織化學(xué)和Westernblot等技術(shù)，檢測(cè)UPR標(biāo)志性蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）以及下游凋亡相關(guān)蛋白CHOP的表達(dá)水平。將這些蛋白的表達(dá)情況與下咽癌患者的臨床病理參數(shù)，如腫瘤的分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等進(jìn)行相關(guān)性分析，以明確UPR相關(guān)蛋白表達(dá)與下咽癌臨床病理特征之間的聯(lián)系，初步探討UPR在下咽癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。例如，若GRP78在晚期下咽癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，這將提示GRP78可能在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。1.3.2建立穩(wěn)定干擾GRP78的下咽癌FaDu細(xì)胞系設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)GRP78基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒載體，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入下咽癌FaDu細(xì)胞中。利用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的細(xì)胞克隆，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)驗(yàn)證干擾效果。穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞系的成功建立，為后續(xù)研究GRP78在低氧激活UPR以及對(duì)下咽癌化療敏感性影響中的作用機(jī)制提供了有力工具。1.3.3探究重度低氧激活UPR與GRP78-shRNA對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的影響及作用機(jī)制將下咽癌FaDu細(xì)胞分別置于常氧和重度低氧環(huán)境下培養(yǎng)，模擬腫瘤微環(huán)境中的氧含量變化。通過(guò)檢測(cè)UPR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，確定低氧條件下UPR的激活情況。同時(shí)，將穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的FaDu細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分別在常氧和低氧條件下，用化療藥物進(jìn)行處理，采用CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力和存活情況，以評(píng)估細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性變化。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，探究低氧激活UPR和GRP78-shRNA影響下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)。利用蛋白質(zhì)免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，研究相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)的變化，深入揭示低氧激活UPR和GRP78-shRNA影響下咽癌化療敏感性的分子機(jī)制。例如，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)變化，以及PERK、IRE1、ATF6等UPR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，分析它們?cè)诘脱跫せ頤PR和GRP78-shRNA影響化療敏感性過(guò)程中的調(diào)控作用。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法免疫組織化學(xué)法（IHC）：用于檢測(cè)下咽癌組織及癌旁正常組織中UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)情況。將組織標(biāo)本制成石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化等處理后，利用特異性抗體與抗原結(jié)合的原理，通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)觀察蛋白的表達(dá)部位和強(qiáng)度，從而分析其與臨床病理因素的相關(guān)性。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：從下咽癌組織和癌旁正常組織以及不同處理的下咽癌FaDu細(xì)胞中提取總蛋白，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)印到固相膜上，用特異性抗體檢測(cè)目的蛋白GRP78、CHOP以及UPR信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如p-PERK、p-IRE1、ATF6等）的表達(dá)水平，通過(guò)灰度分析進(jìn)行半定量研究，以明確蛋白表達(dá)的變化情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取下咽癌組織和細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，利用特異性引物對(duì)GRP78基因以及凋亡相關(guān)基因（如Bax、Bcl-2等）進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基因的擴(kuò)增情況，從而定量分析基因的表達(dá)水平，了解低氧和干擾GRP78表達(dá)對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。慢病毒干擾技術(shù)：設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)GRP78基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒載體，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。收集含有重組慢病毒的上清液，感染下咽癌FaDu細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的細(xì)胞克隆，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot驗(yàn)證干擾效果，為后續(xù)研究提供細(xì)胞模型。細(xì)胞培養(yǎng)與處理：將下咽癌FaDu細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為常氧組（21%O?）和低氧組（1%O?），低氧組利用低氧培養(yǎng)箱模擬腫瘤微環(huán)境中的低氧狀態(tài)。在進(jìn)行化療藥物敏感性實(shí)驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞分別用不同濃度的化療藥物（如順鉑、5-氟尿嘧啶等）處理，設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）：將不同處理的下咽癌FaDu細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率，評(píng)估細(xì)胞在不同條件下（常氧、低氧、化療藥物處理等）的增殖能力，以反映細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)：將細(xì)胞以低密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天，待細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)克隆數(shù)。通過(guò)克隆形成率來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖能力和存活情況，進(jìn)一步確定低氧激活UPR和干擾GRP78表達(dá)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的影響。流式細(xì)胞術(shù)：收集不同處理的下咽癌FaDu細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI雙染法標(biāo)記細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分析低氧激活UPR和GRP78-shRNA是否通過(guò)影響細(xì)胞凋亡來(lái)改變下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。同時(shí)，也可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，探討低氧和干擾GRP78表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先，收集下咽癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織樣本，通過(guò)免疫組織化學(xué)和Westernblot檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)，分析其與臨床病理因素的關(guān)系。同時(shí)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)GRP78基因的shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的細(xì)胞系，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot驗(yàn)證干擾效果。然后，將下咽癌FaDu細(xì)胞分為常氧組和低氧組，分別用化療藥物處理，通過(guò)CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，以評(píng)估細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。利用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)UPR信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，深入探究低氧激活UPR與GRP78-shRNA對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的影響及作用機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從樣本收集、細(xì)胞系建立、實(shí)驗(yàn)分組、檢測(cè)指標(biāo)到結(jié)果分析的整個(gè)流程，箭頭指示各步驟之間的邏輯關(guān)系，不同實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)標(biāo)注明確]圖1-1技術(shù)路線圖二、UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系2.1材料與方法2.1.1組織樣本來(lái)源收集[具體醫(yī)院名稱(chēng)]在[具體時(shí)間段]內(nèi)手術(shù)切除的下咽鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本47例，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或其他抗腫瘤治療，且病理診斷明確。同時(shí)，選取距離腫瘤邊緣至少2cm的癌旁正常下咽粘膜組織12例作為對(duì)照。標(biāo)本收集后，一部分立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于Westernblot檢測(cè)；另一部分經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。患者的臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，均通過(guò)查閱病歷獲得，具體臨床病理資料見(jiàn)表1。表1下咽鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理資料（n=47）臨床病理參數(shù)例數(shù)百分比（%）年齡（歲）≤602246.81>602553.19性別男3574.47女1225.53腫瘤部位梨狀窩3268.09環(huán)后區(qū)817.02咽后壁714.89腫瘤大?。═）T1-T21838.30T3-T42961.70病理分級(jí)高分化817.02中低分化3982.98臨床分期I-II期1429.79III-IV期3370.21淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)2042.55有2757.452.1.2主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器主要試劑：兔抗人GRP78多克隆抗體、兔抗人CHOP多克隆抗體（購(gòu)自[抗體公司名稱(chēng)]）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（購(gòu)自[二抗公司名稱(chēng)]）；免疫組化檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自[試劑盒公司名稱(chēng)]）；DAB顯色試劑盒（購(gòu)自[顯色試劑盒公司名稱(chēng)]）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜（購(gòu)自[生化試劑公司名稱(chēng)]）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（購(gòu)自[發(fā)光試劑公司名稱(chēng)]）。主要儀器：石蠟切片機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；電泳儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）。2.1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)石蠟切片制備：將石蠟包埋的組織塊切成4μm厚的切片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟3次，每次10min；梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）水化，每次5min；蒸餾水沖洗2次，每次3min?？乖迯?fù)：將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波加熱至沸騰后保持10-15min，然后自然冷卻至室溫，使抗原充分暴露。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將切片浸入3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫孵育10-15min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，減少非特異性染色。封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)：用PBS沖洗切片3次，每次5min，然后滴加5%正常山羊血清，室溫孵育30min，以封閉組織切片中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：傾去血清，不洗，直接滴加適量稀釋好的兔抗人GRP78多克隆抗體（1:100稀釋?zhuān)┖屯每谷薈HOP多克隆抗體（1:200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。二抗孵育：次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min，然后滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋?zhuān)?，室溫孵?0-60min。DAB顯色：用PBS沖洗切片3次，每次5min，然后按照DAB顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色反應(yīng)。在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。復(fù)染、脫水、透明、封片：用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5min，自來(lái)水沖洗返藍(lán)；依次經(jīng)梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每次3min；二甲苯透明3次，每次5min；最后用中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下獨(dú)立觀察切片。GRP78和CHOP陽(yáng)性產(chǎn)物均位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<10%為陰性（-），10%-50%為弱陽(yáng)性（+），51%-80%為中度陽(yáng)性（++），>80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分與染色強(qiáng)度得分相乘，0分為陰性，1-3分為弱陽(yáng)性，4-6分為中度陽(yáng)性，7-9分為強(qiáng)陽(yáng)性。2.1.4Westernblot檢測(cè)組織總蛋白提取：取適量?jī)龃娴南卵拾┙M織和癌旁正常組織，加入預(yù)冷的RIPA裂解液（含1%PMSF），在冰上充分研磨，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為組織總蛋白。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入20μl樣品，再加入200μlBCA工作液，充分混勻，37℃孵育30min，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳：根據(jù)蛋白分子量大小配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker。先在80V恒壓下電泳至蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20min。同時(shí)，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜儀中，在冰浴條件下，250mA恒流轉(zhuǎn)膜2-3h。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫?fù)u床孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：傾去脫脂奶粉溶液，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜放入稀釋好的兔抗人GRP78多克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)┖屯每谷薈HOP多克隆抗體（1:1500稀釋?zhuān)┲校?℃孵育過(guò)夜。二抗孵育：次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀釋?zhuān)┲?，室溫?fù)u床孵育1-2h。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按1:1比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，反應(yīng)1-2min后，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像?；叶确治觯菏褂脠D像分析軟件（如ImageJ）對(duì)Westernblot條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白GRP78和CHOP與β-actin灰度值的比值，以半定量表示目的蛋白的表達(dá)水平。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1GRP78和CHOP在下咽癌及癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，GRP78陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。在47例下咽癌組織中，有41例GRP78表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為87.23%；而在12例癌旁正常下咽組織中，GRP78表達(dá)陽(yáng)性率僅為33.33%。兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=12.512，P=0.000）。具體見(jiàn)圖2-1A和圖2-1B。[此處插入GRP78在下咽癌組織和癌旁正常組織中免疫組化染色圖，圖A為下咽癌組織，可見(jiàn)大量細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性染色；圖B為癌旁正常組織，僅有少量細(xì)胞呈現(xiàn)弱陽(yáng)性染色]圖2-1GRP78在下咽癌組織和癌旁正常組織中的免疫組化染色（×400）CHOP陽(yáng)性產(chǎn)物同樣主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。下咽癌組織中CHOP陽(yáng)性表達(dá)率為55.32%（26/47），癌旁正常下咽組織中CHOP表達(dá)陽(yáng)性率為0%。二者相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=11.868，P=0.001）。具體見(jiàn)圖2-2A和圖2-2B。[此處插入CHOP在下咽癌組織和癌旁正常組織中免疫組化染色圖，圖A為下咽癌組織，部分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性染色；圖B為癌旁正常組織，未見(jiàn)陽(yáng)性染色]圖2-2CHOP在下咽癌組織和癌旁正常組織中的免疫組化染色（×400）Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，結(jié)果顯示下咽癌組織中GRP78和CHOP的表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織（P<0.05）。具體見(jiàn)圖2-3。[此處插入Westernblot檢測(cè)GRP78和CHOP在下咽癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)的條帶圖，以及對(duì)應(yīng)的灰度分析柱狀圖，柱狀圖中顯示下咽癌組織中GRP78和CHOP的灰度比值明顯高于癌旁正常組織]圖2-3Westernblot檢測(cè)GRP78和CHOP在下咽癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)2.2.2GRP78和CHOP表達(dá)與下咽癌臨床病理因素的關(guān)系將GRP78和CHOP的表達(dá)情況與下咽癌患者的臨床病理因素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。表2GRP78和CHOP表達(dá)與下咽癌臨床病理因素的關(guān)系臨床病理參數(shù)例數(shù)GRP78陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)（陽(yáng)性率%）\chi^2值P值CHOP陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)（陽(yáng)性率%）\chi^2值P值年齡（歲）≤602218（81.82）1.0780.30013（59.09）0.2540.615>602523（92.00）13（52.00）性別男3531（88.57）0.2230.63720（57.14）0.0790.779女1210（83.33）6（50.00）腫瘤部位梨狀窩3228（87.50）0.0130.90917（53.12）0.2340.890環(huán)后區(qū)87（87.50）5（62.50）咽后壁76（85.71）4（57.14）腫瘤大小（T）T1-T21813（72.22）3.9210.04810（55.56）0.0650.798T3-T42928（96.55）16（51.72）病理分級(jí)高分化84（50.00）8.3110.0043（37.50）0.5220.470中低分化3937（94.87）23（58.97）臨床分期I-II期148（57.14）8.8520.0037（50.00）0.1840.668III-IV期3333（100.00）19（57.58）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)2016（80.00）2.0080.15710（50.00）0.4230.515有2725（92.59）16（59.26）GRP78在中低分化的下咽癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率為94.87%（37/39），明顯高于高分化組織的50.00%（4/8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=8.311，P=0.004）；在T3-T4期下咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為96.55%（28/29），顯著高于T1-T2期的72.22%（13/18），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=3.921，P=0.048）；在III-IV期的陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%（33/33），明顯高于I-II期的57.14%（8/14），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=8.852，P=0.003）。而GRP78表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。CHOP在中低分化下咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為58.97%（23/39），高分化組織中為37.50%（3/8），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=0.522，P=0.470）；在T3-T4期與T1-T2期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為51.72%（16/29）和55.56%（10/18），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=0.065，P=0.798）；在III-IV期和I-II期的陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.58%（19/33）和50.00%（7/14），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^2=0.184，P=0.668）。CHOP表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。2.3討論本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)了UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP在下咽癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，并分析了它們與下咽癌臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果顯示，GRP78和CHOP在下咽癌組織中的表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織，這表明在下咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，UPR可能被激活，且GRP78和CHOP在其中發(fā)揮了重要作用。GRP78作為UPR的標(biāo)志性分子，其在多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力以及化療耐藥性密切相關(guān)。在本研究中，GRP78在中低分化、T3-T4期以及III-IV期的下咽癌組織中高表達(dá)，這提示GRP78的表達(dá)水平可能與下咽癌的分化程度、腫瘤大小及臨床分期相關(guān)。腫瘤的分化程度越低，其惡性程度越高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。GRP78在中低分化下咽癌組織中的高表達(dá)，可能表明GRP78參與了下咽癌的惡性進(jìn)展過(guò)程，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。T3-T4期以及III-IV期的下咽癌通常意味著腫瘤體積較大、侵犯范圍較廣且可能伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，GRP78在這些階段的高表達(dá)，進(jìn)一步支持了其在腫瘤進(jìn)展中的促進(jìn)作用。有研究表明，GRP78可以通過(guò)與多種信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，GRP78能夠與整合素β1結(jié)合，激活FAK-Src信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；GRP78還可以通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力。CHOP是UPR下游的凋亡相關(guān)蛋白，在正常細(xì)胞中，CHOP的表達(dá)水平較低，但在細(xì)胞受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等刺激時(shí)，CHOP的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無(wú)法緩解時(shí)，CHOP通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以清除受損細(xì)胞。在本研究中，雖然CHOP在下咽癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁正常組織，但與下咽癌的分化程度、腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素均無(wú)明顯相關(guān)性。這可能是由于在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞處于復(fù)雜的微環(huán)境中，受到多種因素的影響，導(dǎo)致CHOP的表達(dá)變化較為復(fù)雜，其與臨床病理因素之間的關(guān)系難以簡(jiǎn)單地通過(guò)本次研究的結(jié)果來(lái)明確。也有可能是由于樣本量相對(duì)較小，存在一定的局限性，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。有研究指出，CHOP在腫瘤細(xì)胞中的作用具有雙重性，在某些情況下，CHOP的表達(dá)上調(diào)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)；但在另一些情況下，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)通過(guò)激活其他代償機(jī)制，抵抗CHOP誘導(dǎo)的凋亡，從而使CHOP的促凋亡作用受到抑制。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，CHOP可以通過(guò)上調(diào)死亡受體5（DR5）的表達(dá)，激活Caspase-8依賴(lài)的凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；然而，腫瘤細(xì)胞也可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白，如Bcl-xL等，來(lái)抑制CHOP誘導(dǎo)的凋亡。本研究結(jié)果表明，GRP78和CHOP在下咽癌組織中的表達(dá)異常，且GRP78的表達(dá)與下咽癌的分化程度、腫瘤大小及臨床分期相關(guān)。這提示UPR在下咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，GRP78有望成為下咽癌診斷、預(yù)后評(píng)估及治療的潛在靶點(diǎn)。然而，本研究?jī)H初步探討了GRP78和CHOP在下咽癌中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系，對(duì)于低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及具體作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究。后續(xù)研究可以深入探究低氧條件下UPR信號(hào)通路的激活情況，以及GRP78和CHOP在其中的調(diào)控機(jī)制，為下咽癌的治療提供更深入的理論依據(jù)和潛在治療策略。2.4小結(jié)本部分通過(guò)免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)，對(duì)下咽癌組織及癌旁正常組織中UPR相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與下咽癌臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果表明，GRP78和CHOP在下咽癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，提示UPR在下咽癌的發(fā)生發(fā)展中可能被激活。其中，GRP78的表達(dá)與下咽癌的分化程度、腫瘤大小及臨床分期相關(guān)，在中低分化、T3-T4期以及III-IV期的下咽癌組織中高表達(dá)，而CHOP表達(dá)與各臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性。這初步揭示了GRP78和CHOP在下咽癌中的表達(dá)特點(diǎn)及潛在作用，為后續(xù)探究低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。三、慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定干擾GRP78下咽癌FaDu細(xì)胞系的建立3.1材料與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人下咽癌FaDu細(xì)胞購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱(chēng)]，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，[品牌名稱(chēng)]）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（[品牌名稱(chēng)]）的RPMI-1640培養(yǎng)基（[品牌名稱(chēng)]）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，[品牌名稱(chēng)]）消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞傳代時(shí)，先棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞1-2次，加入適量胰蛋白酶消化液，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器主要試劑：針對(duì)GRP78基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒載體（由[公司名稱(chēng)]設(shè)計(jì)并構(gòu)建）；慢病毒包裝質(zhì)粒（pHelper1.0和pHelper2.0，[公司名稱(chēng)]）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（[品牌名稱(chēng)]）；嘌呤霉素（[品牌名稱(chēng)]）；TRIzol試劑（[品牌名稱(chēng)]）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）；RIPA裂解液（[品牌名稱(chēng)]）；BCA蛋白定量試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）；兔抗人GRP78單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（[品牌名稱(chēng)]）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（[品牌名稱(chēng)]）。主要儀器：超凈工作臺(tái)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；低速離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；電泳儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）。3.1.3慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)GRP78基因序列，設(shè)計(jì)3條特異性shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）以及一條陰性對(duì)照序列（NC），由[公司名稱(chēng)]合成并構(gòu)建到慢病毒載體中。將構(gòu)建好的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒pHelper1.0和pHelper2.0按照一定比例（通常為載體:pHelper1.0:pHelper2.0=4:3:1）混合，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。具體操作步驟如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞以合適的密度（通常為5×10?-8×10?個(gè)/孔）接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。按照Lipofectamine3000說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染混合液。取適量Opti-MEM培養(yǎng)基（[品牌名稱(chēng)]），分別加入一定量的慢病毒載體、包裝質(zhì)粒和Lipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，使DNA與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到培養(yǎng)有293T細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)，更換為新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。3.1.4慢病毒的收集與濃縮轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集含有慢病毒的細(xì)胞上清液。將收集到的上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，3000rpm離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片。然后，將上清液通過(guò)0.45μm的濾器過(guò)濾，進(jìn)一步去除雜質(zhì)。為了提高病毒滴度，可對(duì)過(guò)濾后的上清液進(jìn)行濃縮。采用超速離心法進(jìn)行病毒濃縮，將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、100000×g的條件下離心2-3小時(shí)，棄去上清液，將沉淀用適量的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，即為濃縮后的慢病毒液。3.1.5慢病毒滴度測(cè)定采用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定慢病毒滴度。將293T細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將濃縮后的慢病毒液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)ㄈ?0?2、10?3、10??、10??、10??等），每個(gè)稀釋度取100μL加入到含有293T細(xì)胞的24孔板中，同時(shí)加入適量的Polybrene（終濃度為8μg/mL）以增強(qiáng)病毒感染效率，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染24小時(shí)后，更換為新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP，慢病毒載體攜帶的報(bào)告基因）的細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)公式計(jì)算病毒滴度：病毒滴度（TU/mL）=表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/感染體積（mL）。3.1.6篩選穩(wěn)定干擾細(xì)胞系將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的下咽癌FaDu細(xì)胞以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將病毒滴度為[具體滴度]的慢病毒液按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為[具體MOI]加入到含有FaDu細(xì)胞的6孔板中，同時(shí)加入Polybrene（終濃度為8μg/mL），輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染24小時(shí)后，更換為新鮮的含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。然后，加入含有嘌呤霉素（終濃度為[具體濃度]，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳篩選濃度，以確保未感染病毒的細(xì)胞全部死亡，而感染病毒的細(xì)胞能夠存活）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每2-3天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選1-2周，直至出現(xiàn)穩(wěn)定生長(zhǎng)的單細(xì)胞克隆。將單細(xì)胞克隆挑取至96孔板中，繼續(xù)用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平，篩選出干擾效果最佳的穩(wěn)定干擾細(xì)胞系。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染效率通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將針對(duì)GRP78基因的shRNA慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察到293T細(xì)胞中大量表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP），表明慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率較高。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到[X]%，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒產(chǎn)量的要求。具體轉(zhuǎn)染效率結(jié)果見(jiàn)表3。表3慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率視野表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)染效率（%）1[具體細(xì)胞數(shù)1][具體細(xì)胞數(shù)1'][具體轉(zhuǎn)染效率1]2[具體細(xì)胞數(shù)2][具體細(xì)胞數(shù)2'][具體轉(zhuǎn)染效率2]3[具體細(xì)胞數(shù)3][具體細(xì)胞數(shù)3'][具體轉(zhuǎn)染效率3]4[具體細(xì)胞數(shù)4][具體細(xì)胞數(shù)4'][具體轉(zhuǎn)染效率4]5[具體細(xì)胞數(shù)5][具體細(xì)胞數(shù)5'][具體轉(zhuǎn)染效率5]平均值[X]%[此處插入熒光顯微鏡下觀察到的293T細(xì)胞表達(dá)GFP的圖片，可見(jiàn)綠色熒光均勻分布于細(xì)胞中，表明慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染]圖3-1慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后GFP表達(dá)情況（×200）3.2.2慢病毒滴度測(cè)定采用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定慢病毒滴度。將濃縮后的慢病毒液進(jìn)行梯度稀釋后感染293T細(xì)胞，感染48-72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)公式計(jì)算得到病毒滴度為[具體滴度]TU/mL，表明制備的慢病毒具有較高的感染活性，能夠有效感染下咽癌FaDu細(xì)胞。不同稀釋度下的病毒滴度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。表4慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果慢病毒稀釋度表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)感染體積（mL）病毒滴度（TU/mL）10?2[具體細(xì)胞數(shù)A][具體感染體積A][具體滴度A]10?3[具體細(xì)胞數(shù)B][具體感染體積B][具體滴度B]10??[具體細(xì)胞數(shù)C][具體感染體積C][具體滴度C]10??[具體細(xì)胞數(shù)D][具體感染體積D][具體滴度D]10??[具體細(xì)胞數(shù)E][具體感染體積E][具體滴度E]平均值[具體滴度]3.2.3干擾效果驗(yàn)證將病毒滴度為[具體滴度]的慢病毒液按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為[具體MOI]感染下咽癌FaDu細(xì)胞，感染48小時(shí)后，加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選1-2周，獲得穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的細(xì)胞克隆。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平，以未感染慢病毒的FaDu細(xì)胞作為對(duì)照組（Control組），感染陰性對(duì)照慢病毒的FaDu細(xì)胞作為陰性對(duì)照組（NC組），結(jié)果顯示，與Control組和NC組相比，干擾組（shRNA組）中GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。具體見(jiàn)圖3-2A和圖3-2B。[此處插入實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GRP78基因表達(dá)水平的柱狀圖，以及Westernblot檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)水平的條帶圖和對(duì)應(yīng)的灰度分析柱狀圖，柱狀圖中顯示shRNA組GRP78基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于Control組和NC組]圖3-2干擾GRP78表達(dá)后FaDu細(xì)胞中GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GRP78基因表達(dá)水平；B：Westernblot檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，與Control組和NC組相比3.2.4穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的特性對(duì)篩選得到的穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性分析。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，干擾組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞在形態(tài)上無(wú)明顯差異，均呈上皮樣，貼壁生長(zhǎng)。在細(xì)胞增殖能力方面，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示在培養(yǎng)的前3天，干擾組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯差異；但在培養(yǎng)4-6天后，干擾組細(xì)胞的增殖速度明顯低于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05），表明干擾GRP78表達(dá)能夠抑制下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖能力。具體見(jiàn)圖3-3。[此處插入CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的折線圖，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（天），縱坐標(biāo)為OD值，折線圖中顯示干擾組細(xì)胞在培養(yǎng)4-6天后OD值明顯低于對(duì)照組細(xì)胞]圖3-3CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的FaDu細(xì)胞增殖能力P<0.05，與Control組和NC組相比此外，對(duì)穩(wěn)定干擾細(xì)胞系進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，在傳代過(guò)程中定期檢測(cè)GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在傳代10次以?xún)?nèi)，干擾組細(xì)胞中GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平始終維持在較低水平，表明該穩(wěn)定干擾細(xì)胞系具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能夠滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。3.3討論穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的成功建立是本研究的關(guān)鍵步驟，為后續(xù)探究低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及機(jī)制提供了重要的細(xì)胞模型。在構(gòu)建穩(wěn)定干擾GRP78的下咽癌FaDu細(xì)胞系過(guò)程中，多個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生了關(guān)鍵影響。慢病毒載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建是第一步，針對(duì)GRP78基因的shRNA序列的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。合適的shRNA序列能夠高效、特異地靶向GRP78基因，從而有效抑制其表達(dá)。若shRNA序列設(shè)計(jì)不合理，可能導(dǎo)致干擾效率低下，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。在本研究中，通過(guò)專(zhuān)業(yè)公司設(shè)計(jì)并合成了3條特異性shRNA序列，經(jīng)過(guò)篩選和驗(yàn)證，最終確定了干擾效果最佳的序列，為成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。這與相關(guān)研究中關(guān)于RNA干擾序列設(shè)計(jì)的重要性結(jié)論一致，如在對(duì)乳腺癌細(xì)胞中特定基因的干擾研究中，合理設(shè)計(jì)的shRNA序列能夠顯著降低目標(biāo)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。慢病毒的包裝和轉(zhuǎn)染效率也是影響穩(wěn)定干擾細(xì)胞系建立的重要因素。在將慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑的選擇、轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化以及細(xì)胞狀態(tài)的良好與否，都直接關(guān)系到慢病毒的產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如調(diào)整轉(zhuǎn)染混合液的比例、控制轉(zhuǎn)染時(shí)間等，成功獲得了高效轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，使得慢病毒的產(chǎn)量和滴度滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。研究表明，不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件對(duì)慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染效率有顯著影響，合適的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件能夠提高慢病毒的滴度和感染活性。篩選穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的過(guò)程中，嘌呤霉素的篩選濃度是關(guān)鍵因素之一。如果篩選濃度過(guò)低，可能無(wú)法有效淘汰未感染慢病毒的細(xì)胞，導(dǎo)致干擾效果不穩(wěn)定；而篩選濃度過(guò)高，則可能對(duì)感染慢病毒的細(xì)胞造成過(guò)度損傷，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳的嘌呤霉素篩選濃度，確保在有效篩選出穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的同時(shí)，維持細(xì)胞的正常生物學(xué)特性。這與其他研究中關(guān)于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系時(shí)篩選劑濃度確定的方法一致，都強(qiáng)調(diào)了預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳篩選濃度的重要性。穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞系的建立，為深入研究GRP78在低氧激活UPR以及對(duì)下咽癌化療敏感性影響中的作用機(jī)制提供了有力工具。通過(guò)對(duì)該細(xì)胞系的生物學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，干擾GRP78表達(dá)能夠抑制下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖能力，這進(jìn)一步表明GRP78在下咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。在后續(xù)研究中，可以利用該細(xì)胞系，在常氧和低氧條件下，研究低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的影響，以及GRP78在其中的調(diào)控機(jī)制。例如，可以通過(guò)檢測(cè)不同條件下細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性變化，以及UPR信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，深入探討低氧激活UPR與GRP78-shRNA對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及作用機(jī)制。3.4小結(jié)本部分成功構(gòu)建了針對(duì)GRP78基因的shRNA慢病毒載體，并將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，獲得了高滴度的慢病毒液。通過(guò)慢病毒感染和嘌呤霉素篩選，成功建立了穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞系。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot驗(yàn)證，該細(xì)胞系中GRP78基因和蛋白的表達(dá)水平顯著降低。此外，對(duì)穩(wěn)定干擾細(xì)胞系的生物學(xué)特性分析表明，干擾GRP78表達(dá)能夠抑制下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖能力，且該細(xì)胞系在傳代過(guò)程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞系的建立，為后續(xù)探究低氧激活UPR對(duì)下咽癌化療敏感性的影響及機(jī)制研究提供了重要的細(xì)胞模型。四、重度低氧激活UPR與GRP78-shRNA對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的影響及作用機(jī)制4.1材料與方法4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組將人下咽癌FaDu細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，[品牌名稱(chēng)]）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（[品牌名稱(chēng)]）的RPMI-1640培養(yǎng)基（[品牌名稱(chēng)]）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組如下：常氧對(duì)照組（N組）：將細(xì)胞置于常氧環(huán)境（21%O?）中培養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。低氧對(duì)照組（H組）：利用低氧培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]），將細(xì)胞置于重度低氧環(huán)境（1%O?）中培養(yǎng)，不添加化療藥物。常氧化療組（NC組）：細(xì)胞在常氧環(huán)境下培養(yǎng)，用化療藥物順鉑（DDP，[品牌名稱(chēng)]，終濃度為[具體濃度]，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳化療藥物濃度，以達(dá)到明顯的細(xì)胞增殖抑制效果且細(xì)胞毒性在可接受范圍內(nèi)）處理。低氧化療組（HC組）：細(xì)胞在重度低氧環(huán)境下培養(yǎng)，同時(shí)用相同濃度的順鉑處理。常氧干擾組（shRNA-N組）：將穩(wěn)定干擾GRP78表達(dá)的下咽癌FaDu細(xì)胞（shRNA組）置于常氧環(huán)境中培養(yǎng)，不進(jìn)行化療藥物處理。低氧干擾組（shRNA-H組）：將shRNA組細(xì)胞置于重度低氧環(huán)境中培養(yǎng)，不添加化療藥物。常氧干擾化療組（shRNA-NC組）：shRNA組細(xì)胞在常氧環(huán)境下培養(yǎng)，用順鉑處理。低氧干擾化療組（shRNA-HC組）：shRNA組細(xì)胞在重度低氧環(huán)境下培養(yǎng)，并用順鉑處理。4.1.2主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器主要試劑：順鉑（DDP）、RIPA裂解液（[品牌名稱(chēng)]）、BCA蛋白定量試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）、PVDF膜（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人GRP78單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人p-PERK單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人p-IRE1單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人ATF6單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人CHOP單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人Bax單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、兔抗人Bcl-2單克隆抗體（[品牌名稱(chēng)]）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（[品牌名稱(chēng)]）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（[品牌名稱(chēng)]）、CCK-8試劑（[品牌名稱(chēng)]）、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）、RNA提取試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（[品牌名稱(chēng)]）。主要儀器：低氧培養(yǎng)箱（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；低速離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；酶標(biāo)儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；電泳儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]）。4.1.3低氧處理將細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)板放入低氧培養(yǎng)箱中。低氧培養(yǎng)箱預(yù)先通入混合氣體（1%O?、5%CO?、94%N?），使箱內(nèi)氧濃度穩(wěn)定在1%，溫度保持在37℃，細(xì)胞在低氧環(huán)境下培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，一般為24-72小時(shí)）。常氧培養(yǎng)的細(xì)胞則置于常規(guī)的37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中。4.1.4化療藥物處理將順鉑用無(wú)菌PBS溶解，配制成所需濃度的母液，過(guò)濾除菌后，于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將母液用培養(yǎng)基稀釋至所需終濃度。在細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，加入含順鉑的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，一般為24-48小時(shí)）。4.1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將不同處理組的下咽癌FaDu細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，按照分組進(jìn)行相應(yīng)處理。在處理結(jié)束前2小時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。4.1.6克隆形成實(shí)驗(yàn)將不同處理組的細(xì)胞以500-1000個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行相應(yīng)處理，然后繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每3-4天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，加入4%多聚甲醛固定15-20分鐘。棄去固定液，用PBS洗滌2次，加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘。用流水緩慢沖洗，待克隆清晰可見(jiàn)后，晾干，計(jì)數(shù)克隆數(shù)（克隆定義為>50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）?？寺⌒纬陕视?jì)算公式為：克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。4.1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集不同處理組的下咽癌FaDu細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15-20分鐘。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)樣本檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率，早期凋亡細(xì)胞為AnnexinV-FITC陽(yáng)性/PI陰性，晚期凋亡細(xì)胞為AnnexinV-FITC陽(yáng)性/PI陽(yáng)性，總凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。4.1.8Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)細(xì)胞總蛋白提?。菏占煌幚斫M的下咽癌FaDu細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30分鐘，期間不斷輕柔振蕩。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入20μL樣品，再加入200μLBCA工作液，充分混勻，37℃孵育30分鐘，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳：根據(jù)蛋白分子量大小配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker。先在80V恒壓下電泳至蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20分鐘。同時(shí)，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10分鐘。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，注意避免產(chǎn)生氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜儀中，在冰浴條件下，250mA恒流轉(zhuǎn)膜2-3小時(shí)。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：傾去脫脂奶粉溶液，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入稀釋好的兔抗人GRP78單克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?、兔抗人p-PERK單克隆抗體（1:1500稀釋?zhuān)?、兔抗人p-IRE1單克隆抗體（1:1500稀釋?zhuān)?、兔抗人ATF6單克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?、兔抗人CHOP單克隆抗體（1:1500稀釋?zhuān)?、兔抗人Bax單克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)?、兔抗人Bcl-2單克隆抗體（1:1000稀釋?zhuān)┲校?℃孵育過(guò)夜。二抗孵育：次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀釋?zhuān)┲?，室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)：用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按1:1比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘后，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像?；叶确治觯菏褂脠D像分析軟件（如ImageJ）對(duì)Westernblot條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，以半定量表示目的蛋白的表達(dá)水平。4.1.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)總RNA提?。菏占煌幚斫M的下咽癌FaDu細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，加入適量TRIzol試劑，冰上裂解5分鐘，然后加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3-5分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，晾干后，用適量DEPC水溶解RNA。逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取適量RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液等，混合均勻后，在PCR擴(kuò)增儀上按照設(shè)定的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：以cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)目的基因（GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2等）和內(nèi)參基因（GAPDH）的序列設(shè)計(jì)特異性引物，由[公司名稱(chēng)]合成。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照。數(shù)據(jù)分析：采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，比較不同處理組之間目的基因表達(dá)水平的差異。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1低氧及干擾GRP78對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果：CCK-8法檢測(cè)不同處理組下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果見(jiàn)表5。與N組相比，NC組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05），表明順鉑能夠有效抑制常氧下下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖；與NC組相比，HC組細(xì)胞增殖抑制率明顯降低（P<0.05），說(shuō)明低氧環(huán)境可降低下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的抵抗能力。與shRNA-N組相比，shRNA-NC組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05），表明干擾GRP78表達(dá)可提高常氧下下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；與shRNA-NC組相比，shRNA-HC組細(xì)胞增殖抑制率降低（P<0.05），但仍高于NC組，說(shuō)明低氧雖能減弱干擾GRP78表達(dá)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞化療敏感性的增強(qiáng)作用，但干擾GRP78表達(dá)仍能在一定程度上提高低氧下細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。表5CCK-8法檢測(cè)不同處理組下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖抑制率（%，\overline{X}\pms，n=5）|組別|增殖抑制率|||||N組|5.23\pm1.05||NC組|42.35\pm3.21|*||H組|8.56\pm1.52||HC組|28.47\pm2.56|*|^{\#}||shRNA-N組|7.89\pm1.23||shRNA-NC組|56.78\pm4.12|*|^{\&}||shRNA-H組|12.65\pm1.87||shRNA-HC組|40.56\pm3.58|*|^{\#}|^{\&}|注：與N組相比，^{*}P<0.05；與NC組相比，^{\#}P<0.05；與shRNA-N組相比，^{\&}P<0.05?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果：克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-1所示。N組和H組細(xì)胞形成的克隆數(shù)較多，且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明低氧單獨(dú)處理對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞的克隆形成能力影響較??；NC組細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯少于N組（P<0.05），說(shuō)明順鉑在常氧條件下能夠顯著抑制下咽癌FaDu細(xì)胞的克隆形成能力；HC組細(xì)胞形成的克隆數(shù)多于NC組（P<0.05），提示低氧環(huán)境可削弱順鉑對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用，降低細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。shRNA-N組細(xì)胞形成的克隆數(shù)少于N組（P<0.05），表明干擾GRP78表達(dá)可抑制常氧下下咽癌FaDu細(xì)胞的克隆形成能力；shRNA-NC組細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯少于shRNA-N組（P<0.05），且少于NC組，說(shuō)明干擾GRP78表達(dá)能顯著提高常氧下下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用；shRNA-H組細(xì)胞形成的克隆數(shù)少于H組（P<0.05），表明干擾GRP78表達(dá)可抑制低氧下下咽癌FaDu細(xì)胞的克隆形成能力；shRNA-HC組細(xì)胞形成的克隆數(shù)少于HC組（P<0.05），但多于shRNA-NC組，說(shuō)明干擾GRP78表達(dá)可在一定程度上提高低氧下下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用，但低氧環(huán)境會(huì)部分削弱這種增強(qiáng)效果。[此處插入克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，不同處理組細(xì)胞形成的克隆在圖中清晰展示，通過(guò)克隆數(shù)量對(duì)比直觀反映細(xì)胞克隆形成能力的差異]圖4-1克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組下咽癌FaDu細(xì)胞的克隆形成能力4.2.2低氧及干擾GRP78對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞增殖和凋亡的影響細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果：CCK-8法檢測(cè)不同處理組下咽癌FaDu細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖4-2所示。在培養(yǎng)的前24小時(shí)，各處理組細(xì)胞的增殖情況無(wú)明顯差異；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，N組和H組細(xì)胞的增殖速度逐漸加快，且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明低氧單獨(dú)處理在短期內(nèi)對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖影響不明顯；NC組細(xì)胞的增殖速度明顯低于N組（P<0.05），說(shuō)明順鉑在常氧條件下能夠抑制下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖；HC組細(xì)胞的增殖速度高于NC組（P<0.05），表明低氧環(huán)境可減弱順鉑對(duì)下咽癌FaDu細(xì)胞增殖的抑制作用，降低細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。shRNA-N組細(xì)胞的增殖速度低于N組（P<0.05），表明干擾GRP78表達(dá)可抑制常氧下下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖；shRNA-NC組細(xì)胞的增殖速度明顯低于shRNA-N組（P<0.05），且低于NC組，說(shuō)明干擾GRP78表達(dá)能顯著提高常氧下下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；shRNA-H組細(xì)胞的增殖速度低于H組（P<0.05），表明干擾GRP78表達(dá)可抑制低氧下下咽癌FaDu細(xì)胞的增殖；shRNA-HC組細(xì)胞的增殖速度低于HC組（P<0.05），但高于shRNA-NC組，說(shuō)明干擾GRP78表達(dá)可在一定程度上提高低氧下下咽癌FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，但低氧環(huán)境會(huì)部分削弱這種增強(qiáng)效果。[此處插入細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為OD值，不同處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線在圖中清晰展示，通過(guò)曲線走勢(shì)直觀反映細(xì)胞增殖能力的變化]圖4-2CCK-8法檢測(cè)不同處理組下咽癌FaDu細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組下咽癌FaDu細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果見(jiàn)表6。與N組相比，NC組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），表明順鉑能夠誘導(dǎo)常氧下下