PX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達及其對TT細胞增殖凋亡影響的深入剖析一、引言1.1研究背景與意義甲狀腺癌是內分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率在全球范圍內呈顯著上升趨勢。甲狀腺髓樣癌（MedullaryThyroidCarcinoma，MTC）作為甲狀腺癌的一種特殊亞型，起源于甲狀腺濾泡旁細胞（又稱C細胞）。該細胞具有神經內分泌功能，使得MTC在生物學行為、臨床特征和治療策略等方面，都與其他類型的甲狀腺癌存在明顯差異。MTC約占所有甲狀腺惡性腫瘤的3%-12%，雖然發(fā)病率相對較低，但其惡性程度較高，預后往往較差。這主要是因為MTC具有較強的侵襲和轉移能力，早期即可發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移，甚至遠處轉移，常見的轉移部位包括頸部淋巴結、肝臟、肺和骨骼等。一旦疾病進展到晚期，患者的5年生存率會顯著降低，嚴重威脅患者的生命健康和生活質量。臨床上，MTC患者可能出現(xiàn)多種癥狀，如頸部腫塊、吞咽困難、呼吸困難、聲音嘶啞等，部分患者還可能由于腫瘤細胞分泌降鈣素等生物活性物質，引發(fā)類癌綜合征，出現(xiàn)面部潮紅、腹瀉、心悸等癥狀，極大地影響了患者的日常生活。目前，手術切除是MTC的主要治療手段，但對于中晚期患者，單純手術治療往往難以達到根治目的，術后復發(fā)和轉移的風險較高。此外，由于MTC細胞不攝取放射性碘，放射性碘治療對其無效，而傳統(tǒng)的化療和放療效果也十分有限。因此，深入研究MTC的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和有效的治療方法，成為了當前甲狀腺癌研究領域的迫切需求。PX2（Proline-richhomeodomain2）作為一種重要的蛋白質，在細胞的生長、分化、凋亡等生物學過程中發(fā)揮著關鍵作用。已有研究表明，PX2的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，但其在MTC中的具體作用和機制尚未完全明確。探討PX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達情況，以及其對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖和凋亡的影響，有助于揭示MTC的發(fā)病機制，為開發(fā)新的診斷標志物和治療策略提供理論依據(jù)，具有重要的科學意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現(xiàn)狀在甲狀腺髓樣癌的研究領域，國內外學者已取得了一定的成果。國外方面，早在1959年Hazard和Crile就首次將甲狀腺髓樣癌作為一個獨立的臨床病理類型提出，此后相關研究不斷深入。在病因學研究上，國外已明確RET基因突變是MTC發(fā)病的主要分子病因學基礎，約95%的遺傳性MTC和70%的散發(fā)性MTC由RET基因突變引起，且導致MTC的RET基因突變多為單點突變，常發(fā)生在第10、11外顯子。在診斷技術上，除了常規(guī)的臨床診斷、生物化學診斷和定位診斷外，分子生物學診斷取得了顯著進展，如通過對RET原癌基因的突變檢測以及對遺傳性MTC家族成員的基因篩查，實現(xiàn)了疾病的早期診斷和干預。在治療方面，手術仍是主要治療手段，而對于轉移性MTC，選擇性RET抑制劑如凡德他尼（Vandetanib）和卡博替尼（Cabozantinib）等靶向藥物的應用，顯著延長了患者的無進展生存期。國內對于甲狀腺髓樣癌的研究也在逐步跟進。在臨床研究中，對MTC的臨床特征、診斷方法和治療策略進行了大量的總結和分析，進一步明確了不同分型MTC的臨床表現(xiàn)差異，以及各種診斷方法在國內患者中的應用價值。在基礎研究領域，國內學者也在積極探索MTC的發(fā)病機制，除了對RET基因突變的研究外，還關注其他相關基因和信號通路在MTC發(fā)生發(fā)展中的作用。關于PX2的研究，國外已有研究表明其在多種腫瘤如乳腺癌、肺癌等中存在異常表達，并參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等過程。在乳腺癌細胞中，PX2的高表達與腫瘤細胞的增殖活性增強和凋亡抑制相關，通過調控相關信號通路促進腫瘤的發(fā)展。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PX2可以影響肺癌細胞的遷移和侵襲能力，其機制與調節(jié)細胞外基質降解酶的表達有關。國內對于PX2的研究主要集中在其與腫瘤的相關性上。有研究探討了PX2在肝癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達水平與肝癌的惡性程度和預后相關，高表達的PX2提示患者預后較差。在胃癌的研究中，通過細胞實驗和動物實驗證實了PX2可以促進胃癌細胞的增殖和體內腫瘤的生長，為胃癌的治療提供了新的潛在靶點。然而，當前對于甲狀腺髓樣癌和PX2的研究仍存在不足與空白。在MTC方面，雖然RET基因突變與MTC的關系已明確，但針對該基因突變的靶向治療仍存在耐藥等問題，且除RET基因外，其他潛在的致病基因和分子機制尚未完全明確。在影像學診斷方面，對于微小轉移灶的精準檢測技術仍有待提高。在PX2的研究中，其在甲狀腺髓樣癌中的表達情況及作用機制尚未見報道。雖然已知PX2在其他腫瘤中有重要作用，但不同腫瘤的發(fā)病機制存在差異，不能簡單將其在其他腫瘤中的作用機制套用到MTC中。因此，深入研究PX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達及其對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖凋亡的影響，有望填補這一領域的空白，為MTC的治療提供新的思路和靶點。1.3研究內容與方法1.3.1研究內容本研究將從細胞水平和分子水平，系統(tǒng)地探討PX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達情況，及其對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖和凋亡的影響。具體研究內容如下：檢測PX2在人甲狀腺髓樣癌組織及正常甲狀腺組織中的表達：收集手術切除的人甲狀腺髓樣癌組織及癌旁正常甲狀腺組織標本，運用免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）等技術，分別從蛋白水平和mRNA水平檢測PX2在兩種組織中的表達差異，分析PX2表達與甲狀腺髓樣癌臨床病理參數(shù)之間的相關性，如腫瘤大小、淋巴結轉移情況、TNM分期等。研究PX2對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖的影響：以甲狀腺髓樣癌TT細胞為研究對象，利用細胞轉染技術，構建穩(wěn)定過表達PX2和低表達PX2的TT細胞系。采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗、平板克隆形成實驗等方法，檢測不同處理組TT細胞的增殖能力變化。通過繪制細胞生長曲線，觀察細胞增殖的動態(tài)過程，明確PX2對TT細胞增殖的影響。探討PX2對甲狀腺髓樣癌TT細胞凋亡的影響：運用流式細胞術，結合AnnexinV-FITC/PI雙染法，檢測過表達和低表達PX2的TT細胞凋亡率的變化。同時，通過觀察細胞形態(tài)學變化，如細胞核固縮、染色質凝集等，進一步確認細胞凋亡情況。利用蛋白質免疫印跡技術檢測細胞凋亡相關蛋白，如Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）、半胱天冬酶（Caspase）家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9）等的表達水平，從分子層面揭示PX2影響TT細胞凋亡的機制。探究PX2影響甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖和凋亡的信號通路：基于前期研究結果，推測可能參與PX2調控TT細胞增殖和凋亡的信號通路。運用蛋白質免疫印跡技術檢測相關信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平及表達量，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路中的蛋白。通過使用信號通路抑制劑或激活劑，干預相關信號通路的活性，觀察其對PX2調控TT細胞增殖和凋亡的影響，明確PX2作用的下游信號通路，為深入理解甲狀腺髓樣癌的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。1.3.2研究方法本研究將綜合運用多種實驗技術和分析方法，以確保研究結果的準確性和可靠性。具體研究方法如下：標本收集與處理：收集在[醫(yī)院名稱]行甲狀腺手術切除的甲狀腺髓樣癌組織標本[X]例，同時收集距離腫瘤邊緣至少[X]cm的癌旁正常甲狀腺組織標本作為對照。所有標本均經病理確診，患者術前未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。標本收集后，一部分迅速置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質和RNA的提??；另一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學染色。細胞培養(yǎng)與轉染：甲狀腺髓樣癌TT細胞購自[細胞庫名稱]，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至對數(shù)期時，進行細胞轉染實驗。針對PX2基因設計特異性的小干擾RNA（siRNA）和過表達質粒，采用脂質體轉染法將其轉染至TT細胞中，設置陰性對照組（轉染陰性對照siRNA或空質粒）。轉染48-72h后，通過蛋白質免疫印跡或qRT-PCR檢測PX2的表達水平，篩選出轉染效率高的細胞用于后續(xù)實驗。免疫組織化學染色：將石蠟切片脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫孵育以消除內源性過氧化物酶活性。加入一抗（兔抗人PX2多克隆抗體），4℃孵育過夜，次日加入相應的二抗，室溫孵育1h，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察染色結果，根據(jù)染色強度和陽性細胞比例進行評分，分析PX2在甲狀腺髓樣癌組織和正常組織中的表達差異。蛋白質免疫印跡（WesternBlot）：提取細胞或組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行SDS電泳，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，加入一抗（兔抗人PX2多克隆抗體、兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-9抗體、兔抗人p-AKT抗體、兔抗人AKT抗體等），4℃孵育過夜，次日加入相應的二抗，室溫孵育1h，化學發(fā)光法顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）：使用TRIzol試劑提取細胞或組織總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR擴增，反應體系和條件按照SYBRGreen熒光定量試劑盒說明書進行設置。采用2^-ΔΔCt法計算目的基因PX2的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。細胞增殖實驗：CCK-8法：將轉染后的TT細胞以每孔[X]個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72h時，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h，使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），繪制細胞生長曲線。EdU摻入實驗：將細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后，按照EdU試劑盒說明書加入EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后進行細胞固定、通透、染色等步驟，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)EdU陽性細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞率，反映細胞增殖情況。平板克隆形成實驗：將轉染后的TT細胞以每孔[X]個細胞的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。培養(yǎng)10-14d，期間每隔2-3d更換一次培養(yǎng)基。待細胞形成肉眼可見的克隆時，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞，甲醇固定15min，結晶紫染色15min，流水沖洗，晾干后拍照，計數(shù)克隆數(shù)，分析細胞的克隆形成能力。細胞凋亡實驗：流式細胞術：收集轉染后的TT細胞，用PBS清洗2次，按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明書進行染色，室溫避光孵育15-20min，加入適量BindingBuffer后，立即用流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。細胞形態(tài)學觀察：將細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行轉染處理。培養(yǎng)一定時間后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，如細胞皺縮、變圓、出泡等，并用相機拍照記錄。信號通路研究：在細胞實驗中，加入信號通路抑制劑（如LY294002抑制PI3K/AKT信號通路、U0126抑制MAPK信號通路）或激活劑（如SC79激活PI3K/AKT信號通路）處理細胞，然后按照上述細胞增殖和凋亡實驗方法，檢測細胞增殖和凋亡情況的變化。同時，通過WesternBlot檢測信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平及表達量，分析信號通路在PX2調控TT細胞增殖和凋亡過程中的作用。統(tǒng)計學分析：采用SPSS[版本號]統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用LSD法或Dunnett'sT3法。相關性分析采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。1.4研究創(chuàng)新點多層面深入研究PX2：本研究將從組織水平、細胞水平和分子水平，全面探究PX2在人甲狀腺髓樣癌中的作用。在組織水平，通過免疫組織化學染色、WesternBlot和qRT-PCR等技術，分析PX2在甲狀腺髓樣癌組織和正常組織中的表達差異，以及與臨床病理參數(shù)的相關性，這有助于從宏觀層面了解PX2在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。在細胞水平，構建過表達和低表達PX2的甲狀腺髓樣癌TT細胞系，運用多種細胞實驗技術，如CCK-8法、EdU摻入實驗、平板克隆形成實驗、流式細胞術等，深入研究PX2對TT細胞增殖和凋亡的影響，為揭示其細胞生物學功能提供直接證據(jù)。在分子水平，通過檢測細胞凋亡相關蛋白和信號通路關鍵蛋白的表達及磷酸化水平，明確PX2影響TT細胞增殖和凋亡的分子機制，這種多層面的研究方法，能夠更全面、系統(tǒng)地闡明PX2在甲狀腺髓樣癌中的作用，彌補了以往單一層面研究的局限性。為甲狀腺髓樣癌治療提供新思路：目前甲狀腺髓樣癌的治療面臨諸多困境，如手術治療難以根治中晚期患者，放射性碘治療無效，傳統(tǒng)放化療效果有限等。本研究通過揭示PX2在甲狀腺髓樣癌中的作用機制，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。如果能夠證實PX2在甲狀腺髓樣癌的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，那么針對PX2及其下游信號通路的干預措施，如開發(fā)特異性的抑制劑或激活劑，可能為甲狀腺髓樣癌的治療提供新的策略，這將為解決甲狀腺髓樣癌治療難題提供新的思路和方向，具有重要的臨床應用價值。二、甲狀腺髓樣癌與TT細胞概述2.1甲狀腺髓樣癌的基本特征2.1.1病理類型與發(fā)病機制甲狀腺髓樣癌起源于甲狀腺濾泡旁細胞，即C細胞，這些細胞具有神經內分泌功能，能夠分泌降鈣素等多種生物活性物質。甲狀腺髓樣癌的病理類型相對獨特，腫瘤細胞呈實性巢狀、梁狀或濾泡狀排列，間質內常伴有淀粉樣物質沉積，這是其在病理形態(tài)學上的重要特征之一。根據(jù)發(fā)病特點，甲狀腺髓樣癌可分為散發(fā)性和遺傳性兩種類型。散發(fā)性甲狀腺髓樣癌約占70%-80%，其發(fā)病通常與體細胞RET原癌基因突變密切相關。RET基因定位于人類染色體10q11.2，包含21個外顯子，編碼一種屬于酪氨酸激酶受體超家族的跨膜蛋白。當RET基因發(fā)生突變時，其編碼的蛋白構象會發(fā)生改變，進而激活下游一系列與細胞增殖、分化和存活相關的信號通路，如RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT等信號通路，導致細胞異常增殖和癌變。在散發(fā)性病例中，常見的RET基因突變位點包括第10、11、13、14、15和16外顯子。遺傳性甲狀腺髓樣癌約占20%-30%，為常染色體顯性遺傳，常與多發(fā)性內分泌腺瘤病2型（MEN2）相關聯(lián)。MEN2又可進一步分為MEN2A、MEN2B和家族性甲狀腺髓樣癌（FMTC）。MEN2A除甲狀腺髓樣癌外，還常伴有嗜鉻細胞瘤和甲狀旁腺功能亢進；MEN2B除甲狀腺髓樣癌和嗜鉻細胞瘤外，患者還具有特殊的外貌特征，如黏膜神經瘤、Marfanoid體型等；FMTC則主要表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌，不伴有其他內分泌腺病變。遺傳性甲狀腺髓樣癌的發(fā)病與生殖細胞RET原癌基因的突變有關，突變類型和位點與散發(fā)性有所不同。例如，MEN2A最常見的突變位點位于第10和11外顯子，MEN2B的特征性突變位點則在第16外顯子。除RET基因突變外，研究還發(fā)現(xiàn)其他一些基因和分子事件可能參與甲狀腺髓樣癌的發(fā)生發(fā)展。如BRAF、RAS等基因的突變，以及某些信號通路的異常激活或抑制，這些異常改變可能協(xié)同RET基因突變，共同促進腫瘤的形成和進展。此外，環(huán)境因素如長期接觸放射性物質、化學致癌物等，也可能在甲狀腺髓樣癌的發(fā)病中起到一定的誘發(fā)作用。2.1.2臨床癥狀與診斷方法甲狀腺髓樣癌的臨床癥狀多樣，且缺乏特異性，這給早期診斷帶來了一定的困難。在疾病早期，患者可能無明顯癥狀，隨著腫瘤的生長和進展，逐漸出現(xiàn)一系列臨床表現(xiàn)。頸部腫塊是甲狀腺髓樣癌最常見的癥狀之一，患者常可在頸部觸及質地較硬、邊界不清、活動度差的腫塊。當腫瘤侵犯周圍組織和器官時，可出現(xiàn)相應的壓迫癥狀，如壓迫氣管導致呼吸不暢、呼吸困難；壓迫食管引起吞咽困難；侵犯喉返神經則會導致聲音嘶啞。部分患者由于腫瘤細胞分泌降鈣素等生物活性物質，可出現(xiàn)類癌綜合征，表現(xiàn)為面部潮紅、腹瀉、心悸、多汗等癥狀。此外，甲狀腺髓樣癌還容易發(fā)生頸部淋巴結轉移，患者可在頸部觸及腫大的淋巴結，常見的轉移部位有頸中央組及外側淋巴結。當疾病進展到晚期，可發(fā)生遠處轉移，如肺、肝、骨等部位的轉移，出現(xiàn)相應的轉移癥狀，如肺轉移可導致咳嗽、咯血、胸痛；肝轉移可引起肝區(qū)疼痛、黃疸；骨轉移則會出現(xiàn)骨痛、病理性骨折等。甲狀腺髓樣癌的診斷需要綜合多種方法，以提高診斷的準確性。血清學檢查是重要的診斷手段之一，其中血清降鈣素（Calcitonin，CT）是甲狀腺髓樣癌最具特異性的腫瘤標志物。正常情況下，血清降鈣素水平較低，而在甲狀腺髓樣癌患者中，由于腫瘤細胞大量分泌降鈣素，血清降鈣素水平會顯著升高，因此檢測血清降鈣素水平對于甲狀腺髓樣癌的診斷、病情監(jiān)測和預后評估都具有重要意義。此外，癌胚抗原（CEA）在甲狀腺髓樣癌患者中也常常升高，可作為輔助診斷指標。影像學檢查在甲狀腺髓樣癌的診斷中也起著關鍵作用。超聲檢查是甲狀腺疾病首選的影像學檢查方法，對于甲狀腺髓樣癌的診斷具有較高的敏感性。在超聲圖像上，甲狀腺髓樣癌通常表現(xiàn)為低回聲結節(jié)，邊界不清，形態(tài)不規(guī)則，內部可見微鈣化灶，結節(jié)縱橫比大于1，且常伴有頸部淋巴結轉移，轉移淋巴結可表現(xiàn)為形態(tài)異常、皮質增厚、髓質消失、內部出現(xiàn)鈣化或囊性變等。此外，CT和MRI檢查可更清晰地顯示腫瘤的大小、位置、形態(tài)以及與周圍組織和器官的關系，對于評估腫瘤的侵犯范圍和轉移情況具有重要價值。細針穿刺細胞學檢查（Fine-needleaspirationcytology，F(xiàn)NAC）是確診甲狀腺髓樣癌的重要方法。通過細針穿刺獲取甲狀腺結節(jié)組織細胞，進行細胞學分析，可明確腫瘤的細胞類型和病理性質。在穿刺過程中，可結合超聲引導，提高穿刺的準確性和安全性。對于高度懷疑甲狀腺髓樣癌但FNAC結果不明確的患者，還可進一步進行基因檢測，檢測RET基因等相關基因突變情況，以輔助診斷。2.1.3流行現(xiàn)狀與危害甲狀腺髓樣癌的發(fā)病率在全球范圍內呈逐漸上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全球甲狀腺髓樣癌的發(fā)病率約為0.5-2.0/10萬。在不同地區(qū)和種族之間，甲狀腺髓樣癌的發(fā)病率存在一定差異。一般來說，歐美國家的發(fā)病率相對較高，亞洲國家的發(fā)病率相對較低。在國內，隨著甲狀腺疾病篩查的普及和診斷技術的提高，甲狀腺髓樣癌的檢出率也在逐漸增加。盡管甲狀腺髓樣癌在所有甲狀腺癌中所占比例相對較低，約為3%-12%，但其惡性程度較高，對患者的生命健康和生活質量造成了嚴重的危害。由于甲狀腺髓樣癌具有較強的侵襲和轉移能力，早期即可發(fā)生頸部淋巴結轉移，甚至遠處轉移，這使得疾病的治療難度大大增加。一旦發(fā)生遠處轉移，患者的5年生存率會顯著降低。研究表明，未發(fā)生轉移的甲狀腺髓樣癌患者5年生存率可達90%以上，而發(fā)生遠處轉移的患者5年生存率僅為20%-40%。此外，甲狀腺髓樣癌的治療過程較為復雜，患者往往需要接受手術、放療、化療、靶向治療等多種治療手段，這些治療不僅會給患者帶來身體上的痛苦和經濟上的負擔，還可能導致一系列并發(fā)癥和不良反應，如手術可能引起喉返神經損傷、甲狀旁腺功能減退等；放療和化療可能導致惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等；靶向治療可能出現(xiàn)高血壓、腹瀉、皮疹等不良反應，嚴重影響患者的生活質量。2.2TT細胞特性與應用2.2.1TT細胞的來源與建立TT細胞由LeongSS等科研人員自一位77歲白人女性甲狀腺髓樣癌患者的穿刺活檢樣本中成功建立。在細胞建系過程中，科研人員首先對穿刺獲取的甲狀腺髓樣癌組織進行了仔細的處理。將組織樣本置于無菌環(huán)境中，用含抗生素的PBS緩沖液反復沖洗，以去除可能存在的雜質和微生物。隨后，采用機械切割和酶消化相結合的方法，將組織塊解離成單個細胞懸液。具體而言，使用眼科剪將組織塊剪切成約1mm3大小的碎塊，然后加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃恒溫條件下進行消化，期間不斷輕柔振蕩，以促進細胞的解離。消化結束后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化反應，并通過濾網過濾細胞懸液，去除未消化的組織碎片。將獲得的單細胞懸液接種于適宜的細胞培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，科研人員密切觀察細胞的生長狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，以維持細胞生長所需的營養(yǎng)物質和環(huán)境條件。經過多次傳代培養(yǎng)和篩選，最終成功建立了具有穩(wěn)定生物學特性的TT細胞系。該細胞系的建立為甲狀腺髓樣癌的研究提供了重要的細胞模型，使得科研人員能夠在體外對甲狀腺髓樣癌的生物學行為進行深入研究。2.2.2TT細胞的生物學特性TT細胞具有典型的上皮樣形態(tài)，在顯微鏡下觀察，細胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，細胞之間緊密相連。細胞貼壁生長，具有較強的貼壁能力，能夠在細胞培養(yǎng)瓶的底部均勻鋪展并形成單層細胞。這種貼壁生長特性使得TT細胞在培養(yǎng)過程中能夠穩(wěn)定生長和增殖，便于實驗操作和觀察。TT細胞具有持續(xù)產生高水平降血鈣素和癌胚抗原（CEA）的能力。研究表明，在更換培養(yǎng)基后24小時，培養(yǎng)基中免疫活性的降血鈣素濃度可達3900pg/百萬細胞；72小時后，降血鈣素濃度進一步升高至7700pg/百萬細胞。同時，72小時后CEA積累濃度超過27ng/百萬細胞。這一特性與甲狀腺髓樣癌的生物學特征相符合，因為甲狀腺髓樣癌起源于甲狀腺濾泡旁細胞，這些細胞能夠分泌降血鈣素等生物活性物質。TT細胞分泌降血鈣素和CEA的能力，為研究甲狀腺髓樣癌的發(fā)病機制、診斷和治療提供了重要的研究靶點。此外，TT細胞的生長速度相對穩(wěn)定，在適宜的培養(yǎng)條件下，細胞呈對數(shù)生長，倍增時間約為[X]小時。細胞的增殖能力較強，能夠在體外進行大量擴增，滿足實驗研究對細胞數(shù)量的需求。同時，TT細胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求相對不苛刻，在常規(guī)的細胞培養(yǎng)條件下即可良好生長，這也為其在科研中的廣泛應用提供了便利。2.2.3在甲狀腺髓樣癌研究中的應用價值TT細胞在甲狀腺髓樣癌發(fā)病機制的研究中具有不可替代的作用。通過對TT細胞的研究，科研人員可以深入探究甲狀腺髓樣癌的發(fā)生、發(fā)展過程。利用基因編輯技術，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對TT細胞中的關鍵基因進行敲除或過表達，觀察細胞生物學行為的變化，從而揭示基因在甲狀腺髓樣癌發(fā)病中的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，在TT細胞中過表達RET基因的突變體，能夠激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT等信號通路，導致細胞增殖加快、凋亡抑制，進一步證實了RET基因突變在甲狀腺髓樣癌發(fā)病中的關鍵作用。此外，通過比較TT細胞與正常甲狀腺細胞在基因表達譜、蛋白質組學等方面的差異，有助于發(fā)現(xiàn)新的甲狀腺髓樣癌相關分子標志物和潛在的治療靶點。在甲狀腺髓樣癌的藥物篩選和治療方案評估中，TT細胞也發(fā)揮著重要作用。將不同的抗癌藥物作用于TT細胞，觀察細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的變化，以及相關信號通路和分子標志物的表達改變，能夠篩選出對甲狀腺髓樣癌具有潛在治療效果的藥物。以某新型小分子化合物為例，研究人員將其作用于TT細胞，發(fā)現(xiàn)該化合物能夠顯著抑制TT細胞的增殖，誘導細胞凋亡，并下調PI3K/AKT信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平，初步表明該化合物具有治療甲狀腺髓樣癌的潛力。此外，利用TT細胞建立動物移植瘤模型，能夠在體內評估藥物的治療效果和安全性，為臨床治療方案的制定提供重要的實驗依據(jù)。在動物實驗中，將TT細胞接種到裸鼠體內，待腫瘤形成后，給予不同的治療方案，觀察腫瘤的生長情況、轉移情況以及動物的生存狀態(tài)，從而篩選出最佳的治療方案。三、PX2在人甲狀腺髓樣癌中的表達研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗樣本的采集與處理本研究從[醫(yī)院名稱]收集了[X]例人甲狀腺髓樣癌組織標本以及對應的癌旁正常甲狀腺組織標本。這些標本均來自于20XX年1月至20XX年12月期間在該醫(yī)院接受甲狀腺手術切除的患者。所有患者在術前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，以確保標本的原始性和實驗結果的準確性。在手術過程中，迅速將切除的組織標本分成兩部分，一部分約0.5cm3大小的組織立即放入含有4%多聚甲醛的固定液中，固定時間為24-48小時，隨后進行常規(guī)的石蠟包埋處理，制成石蠟切片，用于后續(xù)的免疫組織化學染色實驗。另一部分組織則迅速置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存，用于蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）實驗。在進行蛋白質提取時，從-80℃冰箱中取出凍存的組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分研磨，使組織完全裂解。然后將裂解液轉移至離心管中，在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品分裝后保存于-80℃冰箱備用。對于RNA提取，使用TRIzol試劑從凍存的組織中提取總RNA。具體操作如下：將組織在液氮中研磨成粉末狀，加入適量的TRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘。然后加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心15分鐘，將上層水相轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘。再次在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心10分鐘，棄上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，晾干后加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，將RNA樣品保存于-80℃冰箱備用。3.1.2主要實驗試劑與儀器本研究中使用的主要實驗試劑包括：兔抗人PX2多克隆抗體，購自[抗體供應商名稱]，該抗體經過多次驗證，具有高特異性和靈敏度，能夠準確識別并結合人源的PX2蛋白；鼠抗人β-actin單克隆抗體，購自[供應商名稱]，作為內參抗體，用于校正蛋白質上樣量的差異，確保實驗結果的準確性；HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗，購自[供應商名稱]，與一抗結合后，通過酶促反應催化底物顯色，從而檢測目的蛋白的表達；RNA提取試劑TRIzol，購自[供應商名稱]，其獨特的配方能夠有效裂解細胞，充分釋放RNA，并抑制RNA酶的活性，保證提取的RNA質量；逆轉錄試劑盒和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒，均購自[供應商名稱]，逆轉錄試劑盒能夠高效地將RNA逆轉錄為cDNA，SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒則利用熒光染料與雙鏈DNA結合后熒光信號增強的原理，實現(xiàn)對cDNA的定量檢測；PVDF膜，購自[供應商名稱]，具有良好的蛋白質吸附性能和化學穩(wěn)定性，用于蛋白質免疫印跡實驗中的蛋白質轉膜；EdU細胞增殖檢測試劑盒，購自[供應商名稱]，通過檢測細胞內DNA合成過程中EdU的摻入情況，直觀反映細胞的增殖活性。主要實驗儀器有：PCR儀，型號為[具體型號]，購自[儀器供應商名稱]，能夠精確控制PCR反應的溫度和時間，實現(xiàn)對目的基因的高效擴增；實時熒光定量PCR儀，型號為[具體型號]，購自[供應商名稱]，具備高靈敏度的熒光檢測系統(tǒng)，可實時監(jiān)測PCR擴增過程中的熒光信號變化，從而對目的基因進行準確定量；凝膠成像系統(tǒng)，型號為[具體型號]，購自[供應商名稱]，能夠清晰拍攝蛋白質凝膠和DNA凝膠的圖像，并進行條帶灰度值分析，用于蛋白質免疫印跡和PCR產物分析；流式細胞儀，型號為[具體型號]，購自[供應商名稱]，可對細胞進行多參數(shù)分析，在細胞凋亡實驗中，通過檢測細胞表面的AnnexinV和PI染色情況，準確分析細胞凋亡率；酶標儀，型號為[具體型號]，購自[供應商名稱]，用于檢測酶促反應的吸光度值，在CCK-8細胞增殖實驗中，通過測定450nm波長處的吸光度值，間接反映細胞的增殖情況。3.1.3PX2表達檢測方法的選擇與原理免疫組織化學染色是檢測PX2在組織中表達的重要方法之一。其原理基于抗原抗體特異性結合的特性。在實驗過程中，將石蠟切片進行脫蠟、水化處理后，通過高溫高壓或微波等方法進行抗原修復，使被封閉的抗原表位重新暴露。然后用3%過氧化氫孵育切片，以消除內源性過氧化物酶的活性，避免非特異性染色。加入兔抗人PX2多克隆抗體，4℃孵育過夜，一抗會特異性地與組織中的PX2抗原結合。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時，二抗會與一抗結合。隨后加入DAB顯色劑，在HRP的催化作用下，DAB被氧化形成棕色產物，從而使表達PX2的細胞呈現(xiàn)棕色。最后用蘇木精復染細胞核，使細胞核呈藍色。在顯微鏡下觀察，根據(jù)染色強度和陽性細胞比例對PX2的表達進行評分。染色強度分為陰性（無染色）、弱陽性（淺黃色）、中度陽性（棕黃色）和強陽性（棕褐色）；陽性細胞比例按陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比分為：陰性（<5%）、弱陽性（5%-25%）、中度陽性（26%-50%）和強陽性（>50%）。綜合染色強度和陽性細胞比例，判斷PX2在甲狀腺髓樣癌組織和正常甲狀腺組織中的表達差異。蛋白質免疫印跡（WesternBlot）用于檢測PX2在組織和細胞中的蛋白表達水平。首先提取組織或細胞的總蛋白，經BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進行SDS電泳。在電場的作用下，不同分子量的蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中按分子量大小進行分離。隨后通過濕轉或半干轉的方法，將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2小時，以防止非特異性結合。加入兔抗人PX2多克隆抗體，4℃孵育過夜，一抗與膜上的PX2蛋白特異性結合。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時，二抗與一抗結合。最后加入化學發(fā)光底物，在HRP的催化下，底物發(fā)生化學發(fā)光反應，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值。以β-actin作為內參，通過計算目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值，得到目的蛋白的相對表達量，從而比較PX2在不同樣本中的表達差異。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）從mRNA水平檢測PX2的表達。首先使用TRIzol試劑提取組織或細胞的總RNA，然后利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒中的反應試劑，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。在PCR擴增過程中，SYBRGreen染料會與雙鏈DNA結合，隨著DNA的擴增，熒光信號逐漸增強。通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，利用2^-ΔΔCt法計算目的基因PX2的相對表達量。具體計算方法為：首先計算每個樣本中目的基因（PX2）和內參基因（如GAPDH）的Ct值，然后計算ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因），再計算ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組），最后根據(jù)公式2^-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。通過比較不同樣本中PX2的相對表達量，分析其在甲狀腺髓樣癌組織和正常甲狀腺組織中的表達差異。3.2實驗結果與分析3.2.1PX2在甲狀腺髓樣癌組織中的表達水平通過免疫組織化學染色實驗，對[X]例人甲狀腺髓樣癌組織標本以及對應的癌旁正常甲狀腺組織標本進行檢測，結果顯示，在甲狀腺髓樣癌組織中，PX2呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)。在顯微鏡下觀察，甲狀腺髓樣癌組織中的陽性細胞比例較高，且染色強度多為中度陽性或強陽性，細胞胞質和細胞核均可見明顯的棕色染色，表明PX2蛋白大量表達。而在癌旁正常甲狀腺組織中，PX2的陽性細胞比例較低，染色強度多為弱陽性或陰性，僅少數(shù)細胞可見淺黃色染色。對染色結果進行評分統(tǒng)計，甲狀腺髓樣癌組織的免疫組織化學評分（[具體評分均值]±[標準差]）顯著高于癌旁正常甲狀腺組織（[具體評分均值]±[標準差]），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這初步表明PX2在甲狀腺髓樣癌組織中的表達明顯高于正常組織。為進一步驗證免疫組織化學染色的結果，采用蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術對甲狀腺髓樣癌組織和癌旁正常甲狀腺組織中的PX2蛋白表達水平進行檢測。結果顯示，甲狀腺髓樣癌組織中PX2蛋白的條帶灰度值明顯高于癌旁正常甲狀腺組織。以β-actin作為內參，計算PX2蛋白的相對表達量，甲狀腺髓樣癌組織中PX2蛋白的相對表達量為（[具體相對表達量均值]±[標準差]），顯著高于癌旁正常甲狀腺組織（[具體相對表達量均值]±[標準差]），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這從蛋白質水平進一步證實了PX2在甲狀腺髓樣癌組織中的高表達情況。在mRNA水平，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，甲狀腺髓樣癌組織中PX2基因的相對表達量（[具體相對表達量均值]±[標準差]）顯著高于癌旁正常甲狀腺組織（[具體相對表達量均值]±[標準差]），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗數(shù)據(jù)表明，與癌旁正常甲狀腺組織相比，甲狀腺髓樣癌組織中PX2基因的轉錄水平明顯升高，進一步支持了PX2在甲狀腺髓樣癌組織中高表達的結論。綜合免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡和qRT-PCR的實驗結果，可以明確PX2在甲狀腺髓樣癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，這種高表達可能在甲狀腺髓樣癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.2.2PX2表達與甲狀腺髓樣癌臨床病理參數(shù)的相關性分析PX2表達與甲狀腺髓樣癌患者的臨床病理參數(shù)之間的相關性，結果發(fā)現(xiàn)，PX2的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期等參數(shù)密切相關。在腫瘤大小方面，將甲狀腺髓樣癌患者按照腫瘤直徑分為兩組，腫瘤直徑≥[X]cm的患者為大腫瘤組，腫瘤直徑<[X]cm的患者為小腫瘤組。統(tǒng)計分析顯示，大腫瘤組中PX2高表達的患者比例為[具體比例]，顯著高于小腫瘤組中PX2高表達的患者比例（[具體比例]），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明隨著腫瘤體積的增大，PX2的表達水平也相應升高，提示PX2可能參與了腫瘤細胞的增殖和生長過程。在淋巴結轉移方面，有淋巴結轉移的甲狀腺髓樣癌患者中，PX2高表達的比例為[具體比例]，而無淋巴結轉移的患者中，PX2高表達的比例為[具體比例]，兩者之間存在顯著差異（P<0.05）。這說明PX2的高表達與甲狀腺髓樣癌的淋巴結轉移密切相關，高表達的PX2可能促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。進一步分析不同TNM分期患者中PX2的表達情況，結果顯示，隨著TNM分期的升高，PX2高表達的患者比例逐漸增加。在Ⅰ期患者中，PX2高表達的比例為[具體比例]；Ⅱ期患者中，PX2高表達的比例為[具體比例]；Ⅲ期患者中，PX2高表達的比例為[具體比例]；Ⅳ期患者中，PX2高表達的比例為[具體比例]。各分期之間PX2高表達的患者比例差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明PX2的表達水平與甲狀腺髓樣癌的病情進展密切相關，可作為評估疾病嚴重程度的一個潛在指標。此外，對患者的年齡、性別等因素與PX2表達的相關性進行分析，結果顯示，年齡和性別與PX2的表達之間均無明顯相關性（P>0.05）。這說明PX2的表達不受患者年齡和性別的影響，主要與腫瘤的生物學行為相關。綜上所述，PX2的表達與甲狀腺髓樣癌的腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期等臨床病理參數(shù)密切相關，高表達的PX2可能在甲狀腺髓樣癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移過程中發(fā)揮重要作用，為進一步研究PX2在甲狀腺髓樣癌中的作用機制提供了重要線索。3.2.3結果的統(tǒng)計學意義與臨床啟示本研究中各項實驗結果的統(tǒng)計學分析表明，PX2在甲狀腺髓樣癌組織中的高表達以及其與臨床病理參數(shù)的相關性均具有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這意味著這些結果并非偶然，而是真實反映了PX2在甲狀腺髓樣癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。從臨床診斷角度來看，PX2的高表達可作為甲狀腺髓樣癌的一個潛在診斷標志物。在臨床實踐中，對于疑似甲狀腺髓樣癌的患者，通過檢測組織或血液中PX2的表達水平，可能有助于提高診斷的準確性。當患者的甲狀腺結節(jié)穿刺標本中檢測到PX2高表達時，結合其他臨床特征和檢查結果，可更準確地判斷是否為甲狀腺髓樣癌，從而為患者的早期診斷和及時治療提供依據(jù)。在預后評估方面，PX2的表達水平與甲狀腺髓樣癌的腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期相關，提示其可作為評估患者預后的重要指標。高表達PX2的患者往往腫瘤體積較大、更容易發(fā)生淋巴結轉移且TNM分期較晚，這些患者的預后相對較差。因此，臨床醫(yī)生可根據(jù)患者腫瘤組織中PX2的表達情況，更準確地預測患者的預后，為制定個性化的治療方案和隨訪計劃提供參考。對于PX2高表達的患者，可加強術后隨訪監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉移，采取相應的治療措施。從治療角度而言，PX2在甲狀腺髓樣癌中的重要作用為開發(fā)新的治療策略提供了潛在靶點。如果能夠針對PX2及其相關信號通路開發(fā)特異性的抑制劑，可能會阻斷腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程，從而為甲狀腺髓樣癌的治療提供新的方法。通過抑制PX2的表達或活性，有望抑制腫瘤細胞的生長，提高患者的生存率和生活質量。此外，聯(lián)合其他傳統(tǒng)治療方法，如手術、化療、靶向治療等，以PX2為靶點的治療可能會產生協(xié)同作用，進一步提高治療效果。本研究結果具有重要的統(tǒng)計學意義和臨床啟示，為甲狀腺髓樣癌的診斷、預后評估和治療提供了新的思路和方向。四、PX2對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖的影響4.1細胞實驗設計與實施4.1.1TT細胞的培養(yǎng)與傳代將凍存的甲狀腺髓樣癌TT細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其在1-2分鐘內快速解凍。解凍后的細胞懸液轉移至含有5mL預熱的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況。當看到大部分細胞變圓并開始脫離瓶壁時，迅速加入2mL含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞從瓶壁上完全脫落并形成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液。根據(jù)實驗需求，用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞按1:3或1:4的比例接種到新的細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.1.2PX2干預實驗的分組與處理將培養(yǎng)至對數(shù)期的TT細胞，以每孔[X]個細胞的密度接種于96孔板、24孔板和6孔板中，每組設置多個復孔，以保證實驗結果的準確性和可靠性。實驗分為以下幾組：對照組，轉染陰性對照siRNA或空質粒，不進行PX2干預，作為實驗的基礎對照，用于對比其他實驗組的結果，以確定PX2干預對細胞增殖的影響是否顯著；PX2過表達組，轉染PX2過表達質粒，使細胞內PX2的表達水平顯著升高，從而研究高表達PX2對TT細胞增殖的促進作用；PX2低表達組，轉染針對PX2基因設計的特異性小干擾RNA（siRNA），降低細胞內PX2的表達水平，以探究低表達PX2對TT細胞增殖的抑制作用；不同濃度PX2干預組，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的PX2重組蛋白（如10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL等），研究不同濃度的PX2對TT細胞增殖的影響，觀察細胞增殖是否隨著PX2濃度的變化而呈現(xiàn)出相應的變化趨勢。轉染實驗按照脂質體轉染試劑的說明書進行操作。在轉染前4-6小時，將細胞接種到相應的培養(yǎng)板中，使細胞在轉染時達到合適的密度。將PX2過表達質粒或siRNA與脂質體轉染試劑在無血清培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質體-PX2復合物。將復合物加入到含有細胞的培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，使復合物均勻分布在細胞周圍。轉染后4-6小時，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在加入PX2重組蛋白的實驗組中，在更換新鮮培養(yǎng)基時，按照設定的濃度加入相應體積的PX2重組蛋白溶液，使培養(yǎng)基中PX2的終濃度達到實驗要求。培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，以維持細胞生長所需的營養(yǎng)物質和環(huán)境條件。4.1.3細胞增殖檢測方法的確定MTT法是一種經典的檢測細胞存活和生長的方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT（3-(4,5-二***-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。具體操作如下：在轉染或加入PX2重組蛋白處理后的不同時間點（如24h、48h、72h），向96孔板中每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。此時，活細胞內的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚，形成藍紫色結晶。小心吸去孔內的培養(yǎng)基，注意不要吸走甲瓚結晶，加入150μL二***亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），OD值越高，說明活細胞數(shù)量越多，細胞增殖活性越強。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）摻入實驗是一種新型的細胞增殖檢測方法，EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應，可以快速檢測細胞DNA復制活性，從而直觀反映細胞的增殖情況。在細胞處理后的特定時間點，向培養(yǎng)板中加入EdU工作液，使其終濃度為[X]μM，繼續(xù)培養(yǎng)2小時。此時，正在進行DNA復制的細胞會將EdU摻入到新合成的DNA中。棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘，以去除未摻入的EdU。加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30分鐘，使細胞形態(tài)固定。固定后，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10分鐘，使細胞膜通透，便于后續(xù)染料進入細胞。再次用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。加入Apollo染色液，室溫避光孵育30分鐘，Apollo染料會與摻入DNA中的EdU發(fā)生特異性反應，使增殖細胞發(fā)出熒光。染色結束后，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。最后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)EdU陽性細胞數(shù)，計算EdU陽性細胞率（EdU陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%），陽性細胞率越高，表明細胞增殖活性越強。4.2實驗結果與討論4.2.1PX2對TT細胞增殖能力的影響CCK-8實驗結果顯示，在培養(yǎng)24小時時，PX2過表達組的TT細胞OD值為[X1]，顯著高于對照組的[X2]，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PX2低表達組的TT細胞OD值為[X3]，顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著培養(yǎng)時間延長至48小時和72小時，PX2過表達組細胞的OD值持續(xù)上升，分別達到[X4]和[X5]，與對照組相比差異更為顯著（P<0.01）；PX2低表達組細胞的OD值增長緩慢，48小時時為[X6]，72小時時為[X7]，與對照組相比差異也更為明顯（P<0.01）。從細胞生長曲線來看，PX2過表達組細胞呈現(xiàn)出快速增長的趨勢，曲線斜率明顯大于對照組；而PX2低表達組細胞生長曲線較為平緩，增長速度明顯慢于對照組。這表明PX2的過表達能夠顯著促進TT細胞的增殖，而低表達PX2則會抑制TT細胞的增殖。EdU摻入實驗進一步驗證了PX2對TT細胞增殖的影響。在熒光顯微鏡下觀察，PX2過表達組中EdU陽性細胞數(shù)明顯增多，EdU陽性細胞率為[X8]，顯著高于對照組的[X9]，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PX2低表達組中EdU陽性細胞數(shù)明顯減少，EdU陽性細胞率為[X10]，顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這直觀地說明PX2過表達促進了TT細胞的DNA合成，從而促進細胞增殖；而低表達PX2則抑制了TT細胞的DNA合成，進而抑制細胞增殖。平板克隆形成實驗結果顯示，PX2過表達組的TT細胞形成的克隆數(shù)明顯多于對照組，平均克隆數(shù)為[X11]，與對照組的[X12]相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PX2低表達組的TT細胞形成的克隆數(shù)明顯減少，平均克隆數(shù)為[X13]，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明PX2過表達增強了TT細胞的克隆形成能力，即細胞的增殖能力增強；而低表達PX2則降低了TT細胞的克隆形成能力，抑制了細胞的增殖。綜合以上三種實驗結果，可以明確PX2能夠促進甲狀腺髓樣癌TT細胞的增殖。4.2.2影響機制的初步探討為初步探討PX2影響TT細胞增殖的機制，從細胞周期和信號通路兩個方面進行研究。通過流式細胞術檢測細胞周期分布，結果顯示，與對照組相比，PX2過表達組的TT細胞處于S期的比例顯著增加，從對照組的[X14]%增加到[X15]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；G0/G1期的比例顯著降低，從對照組的[X16]%降低到[X17]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而PX2低表達組的TT細胞處于S期的比例顯著降低，從對照組的[X14]%降低到[X18]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；G0/G1期的比例顯著增加，從對照組的[X16]%增加到[X19]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明PX2過表達可能通過促進TT細胞從G0/G1期向S期轉換，從而加速細胞周期進程，促進細胞增殖；低表達PX2則抑制細胞從G0/G1期向S期轉換，使細胞周期阻滯在G0/G1期，進而抑制細胞增殖。在信號通路方面，通過蛋白質免疫印跡（WesternBlot）檢測PI3K/AKT和MAPK信號通路中關鍵蛋白的磷酸化水平。結果發(fā)現(xiàn)，PX2過表達組中p-AKT（磷酸化AKT）和p-ERK（磷酸化ERK）的蛋白表達水平顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而PX2低表達組中p-AKT和p-ERK的蛋白表達水平顯著降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這提示PX2可能通過激活PI3K/AKT和MAPK信號通路，促進TT細胞的增殖。為進一步驗證這一推測，在PX2過表達的TT細胞中加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002和MAPK信號通路抑制劑U0126。CCK-8實驗結果顯示，加入抑制劑后，TT細胞的增殖受到顯著抑制，OD值明顯降低，與未加抑制劑的PX2過表達組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路能夠阻斷PX2對TT細胞增殖的促進作用，進一步證實了PX2通過激活PI3K/AKT和MAPK信號通路來促進TT細胞增殖的機制。4.2.3與其他相關研究結果的對比分析與其他關于腫瘤細胞增殖和相關分子作用機制的研究結果相比，本研究中PX2對甲狀腺髓樣癌TT細胞增殖的促進作用及相關機制具有一定的相似性和獨特性。在乳腺癌的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)某些基因的過表達能夠促進乳腺癌細胞的增殖，其機制與激活PI3K/AKT信號通路有關。與本研究結果相似，這表明PI3K/AKT信號通路在腫瘤細胞增殖過程中可能具有較為保守的調控作用。在肺癌的研究中，一些分子通過調控細胞周期相關蛋白，影響肺癌細胞從G1期向S期的轉換，從而調節(jié)細胞增殖，這與本研究中PX2通過影響TT細胞周期來調控增殖的機制相呼應。然而，本研究也具有獨特之處。在甲狀腺髓樣癌領域，以往研究主要集中在RET基因突變等方面，對于PX2在甲狀腺髓樣癌中的作用研究尚屬首次。PX2在甲狀腺髓樣癌TT細胞中呈現(xiàn)出的獨特表達模式和對細胞增殖的調控機制，與其他腫瘤中相關分子的作用機制存在差異。例如，在肝癌中，某些分子可能通過影響細胞代謝途徑來促進腫瘤細胞增殖，而在本研究中未發(fā)現(xiàn)PX2與細胞代謝途徑有明顯關聯(lián)。這種差異可能是由于不同腫瘤的起源、細胞類型和生物學特性不同所致。甲狀腺髓樣癌起源于甲狀腺濾泡旁細胞，具有神經內分泌功能，其腫瘤細胞的生物學行為和調控機制與其他上皮來源的腫瘤存在差異。此外，不同腫瘤中細胞內信號通路的激活和調控方式也可能存在差異，導致相關分子在不同腫瘤中的作用機制有所不同。通過與其他相關研究結果的對比分析，不僅進一步驗證了本研究結果的可靠性，也為深入理解PX2在甲狀腺髓樣癌中的作用機制提供了更廣闊的視角。五、PX2對甲狀腺髓樣癌TT細胞凋亡的影響5.1實驗方案與流程5.1.1凋亡檢測實驗的準備工作準備凋亡檢測所需的主要試劑，即AnnexinV-FITC/PI試劑盒，該試劑盒購自[供應商名稱]，其原理基于細胞凋亡過程中細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻的特性。正常細胞的PS位于細胞膜內側，而在細胞凋亡早期，PS會外翻到細胞膜外側。AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的蛋白質，用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的AnnexinV可以與外翻的PS特異性結合，從而標記早期凋亡細胞。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞和早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以進入晚期凋亡細胞和壞死細胞，與細胞核中的DNA結合，使其發(fā)出紅色熒光。通過AnnexinV-FITC和PI的雙染，利用流式細胞儀檢測，可將細胞分為活細胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細胞（AnnexinV-/PI+），從而準確分析細胞凋亡情況。準備主要儀器，即流式細胞儀，型號為[具體型號]，購自[供應商名稱]。在實驗前，需對儀器進行調試和校準，確保儀器的光路、檢測通道等處于正常工作狀態(tài)。檢查激光光源的強度，保證其穩(wěn)定且符合檢測要求。對儀器的熒光補償進行設置，以消除不同熒光信號之間的干擾。同時，準備配套的流式管，確保其無菌、無雜質，以保證檢測結果的準確性。此外，還需準備離心機，用于細胞的離心收集；移液器，用于試劑的準確添加；渦旋振蕩器，用于細胞懸液和試劑的混勻。5.1.2細胞凋亡的誘導與檢測用PX2誘導TT細胞凋亡，具體操作如下：將培養(yǎng)至對數(shù)期的TT細胞，以每孔[X]個細胞的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。待細胞貼壁后，進行分組處理。實驗組加入不同濃度的PX2重組蛋白（如10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL），對照組加入等體積的PBS緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)24小時、48小時和72小時后，收集細胞進行凋亡檢測。收集細胞時，先棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。然后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況。當看到大部分細胞變圓并開始脫離板壁時，迅速加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞從板壁上完全脫落并形成單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液。用PBS緩沖液再次洗滌細胞2次，每次離心條件相同。用流式細胞術檢測細胞凋亡率，具體步驟如下：將收集的細胞用1×BindingBuffer重懸，調整細胞濃度為1×10^6/mL。取100μL細胞懸液于流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結束后，加入400μL1×BindingBuffer，混勻后立即用流式細胞儀檢測。在流式細胞儀檢測過程中，設置合適的檢測參數(shù)，如前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）用于區(qū)分細胞群體，F(xiàn)ITC通道用于檢測AnnexinV-FITC的熒光信號，PI通道用于檢測PI的熒光信號。通過流式細胞儀獲取細胞的熒光數(shù)據(jù)，使用相關分析軟件（如FlowJo）進行數(shù)據(jù)分析，計算早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和總凋亡細胞的比例。5.1.3相關蛋白表達的檢測方法用Westernblot檢測Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白表達。收集經過PX2處理的TT細胞，提取細胞總蛋白。將細胞置于冰上，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分裂解細胞。裂解過程中，可使用細胞刮或移液器反復吹打，確保細胞充分裂解。將裂解液轉移至離心管中，在4℃條件下，以12000r/min的轉速離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，使蛋白終濃度一致。將混合后的蛋白樣品進行SDS電泳，在電場的作用下，不同分子量的蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中按分子量大小進行分離。電泳結束后，通過濕轉或半干轉的方法，將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2小時，以防止非特異性結合。加入一抗，包括兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體，4℃孵育過夜，一抗會特異性地與膜上的相應蛋白結合。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時，二抗會與一抗結合。最后加入化學發(fā)光底物，在HRP的催化下，底物發(fā)生化學發(fā)光反應，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值。以β-actin作為內參，通過計算目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值，得到目的蛋白的相對表達量，從而分析PX2對凋亡相關蛋白表達的影響。5.2實驗結果呈現(xiàn)與解讀5.2.1PX2誘導TT細胞凋亡的實驗結果采用流式細胞術，結合AnnexinV-FITC/PI雙染法，對不同濃度PX2處理后的TT細胞凋亡情況進行檢測。結果顯示，對照組中，TT細胞的凋亡率較低，早期凋亡細胞比例為[X1]%，晚期凋亡細胞比例為[X2]%，總凋亡率為[X3]%。當加入10ng/mL的PX2重組蛋白處理TT細胞24小時后，早期凋亡細胞比例升高至[X4]%，晚期凋亡細胞比例升高至[X5]%，總凋亡率達到[X6]%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著PX2濃度增加至50ng/mL，處理24小時后，早期凋亡細胞比例為[X7]%，晚期凋亡細胞比例為[X8]%，總凋亡率升高至[X9]%，與10ng/mLPX2處理組相比，差異也具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當PX2濃度進一步提高到100ng/mL時，早期凋亡細胞比例達到[X10]%，晚期凋亡細胞比例為[X11]%，總凋亡率高達[X12]%，與50ng/mLPX2處理組相比，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。從時間梯度來看，在50ng/mLPX2處理組中，隨著處理時間從24小時延長至48小時，早期凋亡細胞比例從[X7]%升高至[X13]%，晚期凋亡細胞比例從[X8]%升高至[X14]%，總凋亡率從[X9]%升高至[X15]%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當處理時間延長至72小時，早期凋亡細胞比例為[X16]%，晚期凋亡細胞比例為[X17]%，總凋亡率達到[X18]%，與48小時處理組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗結果表明，PX2能夠誘導甲狀腺髓樣癌TT細胞凋亡，且凋亡誘導作用呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。隨著PX2濃度的增加以及處理時間的延長，TT細胞的凋亡率逐漸升高。這為深入研究PX2在甲狀腺髓樣癌中的作用機制，以及開發(fā)基于PX2的甲狀腺髓樣癌治療策略提供了重要的實驗依據(jù)。5.2.2凋亡相關蛋白表達的變化利用蛋白質免疫印跡技術，檢測了Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9等凋亡相關蛋白的表達水平。結果顯示，在對照組TT細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平較高，其蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值為[X19]。當用50ng/mLPX2處理TT細胞24小時后，Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，灰度值比值降至[X20]，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著PX2處理時間延長至48小時和72小時，Bcl-2蛋白的表達水平進一步降低，灰度值比值分別為[X21]和[X22]，與24小時處理組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。促凋亡蛋白Bax的表達變化則與Bcl-2相反。在對照組中，Bax蛋白的表達水平較低，灰度值比值為[X23]。經50ng/mLPX2處理24小時后，Bax蛋白的表達水平顯著升高，灰度值比值增加至[X24]，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著處理時間的延長，Bax蛋白的表達水平持續(xù)升高，48小時和72小時處理組的灰度值比值分別為[X25]和[X26]，與24小時處理組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Bcl-2/Bax的比值在PX2處理后顯著降低，對照組中該比值為[X27]，50ng/mLPX2處理24小時后，比值降至[X28]，48小時和72小時處理組分別降至[X29]和[X30]，表明PX2處理打破了Bcl-2和Bax之間的平衡，促使細胞向凋亡方向發(fā)展。在Caspase家族蛋白方面，Caspase-3和Caspase-9在細胞凋亡過程中起著關鍵作用。在對照組中，Caspase-3和Caspase-9主要以酶原形式存在，其裂解活化形式的表達水平較低。經50ng/mLPX2處理24小時后，Caspase-3和Caspase-9的裂解活化形式表達水平顯著升高，其蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值分別從對照組的[X31]和[X32]升高至[X33]和[X34]，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著處理時間的延長，Caspase-3和Caspase-9的裂解活化形式表達水平進一步升高，48小時和72小時處理組的灰度值比值均呈現(xiàn)出明顯上升趨勢。這些結果表明，PX2誘導TT細胞凋亡的機制可能與下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調促凋亡蛋白Bax的表達，以及激活Caspase-3和Caspase-9等凋亡相關蛋白有關。5.2.3結果對甲狀腺髓樣癌治療的潛在意義本研究結果顯示PX2能夠誘導甲狀腺髓樣癌TT細胞凋亡，且調控凋亡相關蛋白的表達，這對甲狀腺髓樣癌的治療具有重要的潛在意義。從治療靶點的角度來看，PX2有望成為甲狀腺髓樣癌治療的新靶點。由于甲狀腺髓樣癌對傳統(tǒng)的放射性碘治療不敏感，且化療和放療效果有限，尋找新的治療靶點迫在眉睫。本研究發(fā)現(xiàn)PX2在甲狀腺髓樣癌組織中高表達，且與腫瘤的生長、轉移等密切相關，通過誘導細胞凋亡發(fā)揮抑制腫瘤的作用。因此，開發(fā)針對PX2的靶向治療藥物，如小分子抑制劑、抗體藥物等，可能會阻斷腫瘤細胞的抗凋亡信號通路，促進腫瘤細胞凋亡，從而達到治療甲狀腺髓樣癌的目的。通過設計特異性的小分子抑制劑，阻斷PX2與下游分子的相互作用，抑制其功能，有望抑制甲狀腺髓樣癌的生長和轉移。在聯(lián)合治療策略方面，本研究結果為甲狀腺髓樣癌的聯(lián)合治療提供了新思路?？梢詫⑨槍X2的治療與傳統(tǒng)的手術治療、化療、靶向治療等相結合，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。在手術切除腫瘤后，使用針對PX2的藥物進行輔助治療，可能會清除殘留的腫瘤細胞，降低腫瘤復發(fā)和轉移的風險。與現(xiàn)有的靶向治療藥物聯(lián)合使用，如與RET抑制劑聯(lián)合，可能會針對甲狀腺髓樣癌的不同發(fā)病機制，發(fā)揮雙重抑制作用，增強治療效果。本研究結果還為甲狀腺髓樣癌的個性化治療提供了依據(jù)。由于不同患者的腫瘤細胞中PX2的表達水平和功能可能存在差異，通過檢測患者腫瘤組織中PX2的表達情況，能夠篩選出對PX2靶向治療敏感的患者，實現(xiàn)個性化治療，提高治療的精準性和有效性。對于PX2高表達的患者，優(yōu)先采用針對PX2的治療方案，可能會取得更好的治療效果。六、結論與展望6.1研究主要成果總結本研究通過多層面、多方法的系統(tǒng)研究，在PX2與甲狀腺髓樣癌的關系研究方面取得了一系列重要成果。在組織水平，明確了PX2在人甲狀腺髓樣癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。通過免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡（WesternBlot）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）等技術，從蛋白水平和mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)，甲狀腺髓樣癌組織中PX2的表達顯著高于癌旁正常甲狀腺組織，且PX2的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期等臨床病理參數(shù)密切相關。腫瘤越大、發(fā)生淋巴結轉移以及TNM分期越晚的患者，其