內皮細胞中MIR-15B-5P介導ICAM-1調控FAK表達的機制與功能研究一、引言1.1研究背景炎癥作為機體抵抗微生物病原體入侵的重要免疫防御反應，是一種為應對組織損傷而啟動多因子化學信號，并持續(xù)作用于患病組織的宿主反應。在這一過程中，白細胞從靜脈系統(tǒng)定向遷移至損傷部位，這一跨內皮遷移現(xiàn)象是炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)。白細胞跨內皮遷移涉及多個復雜步驟，包括白細胞與內皮細胞的初始接觸、滾動、緊密黏附以及最終穿越內皮屏障進入組織間隙。在這一過程中，細胞間粘附分子1（ICAM-1）和黏著斑激酶（FAK）發(fā)揮著至關重要的作用。ICAM-1，又稱為CD54，屬于免疫球蛋白超家族成員。在靜息狀態(tài)下，血管內皮細胞上的ICAM-1呈低水平表達；而在炎癥刺激時，其表達會顯著上調。ICAM-1通過與活化白細胞上的配體，如淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）和巨噬細胞-1抗原（Mac-1）等相互作用，激活內皮細胞，從而介導白細胞與內皮細胞的黏附，為白細胞的跨內皮遷移奠定基礎。大量研究表明，ICAM-1在多種炎癥相關疾病中表達異常升高，如動脈粥樣硬化、類風濕性關節(jié)炎等，且其表達水平與疾病的嚴重程度密切相關，抑制ICAM-1的功能可顯著減輕炎癥反應和組織損傷，凸顯了其在炎癥反應中的關鍵地位。FAK是一種非受體型酪氨酸激酶，主要定位于細胞與細胞外基質相互作用的黏著斑部位。在白細胞跨內皮遷移過程中，F(xiàn)AK通過調節(jié)黏著斑的組裝和解聚，即黏著斑的翻轉過程，來影響細胞的遷移能力。當FAK被激活后，它可以磷酸化一系列下游底物，進而激活相關信號通路，促進細胞骨架的重組和黏著斑的動態(tài)變化，使得白細胞能夠順利穿越內皮細胞層。此外，F(xiàn)AK還參與細胞的增殖、存活和分化等多種生物學過程，在腫瘤細胞的侵襲和轉移中也發(fā)揮著重要作用。盡管ICAM-1和FAK在白細胞跨內皮遷移過程中各自發(fā)揮著重要作用，但內皮細胞中ICAM-1與FAK之間如何協(xié)調以精確調控這一過程，目前尚不完全清楚。本實驗室前期研究結果已表明ICAM-1能夠通過miR-15b-5p調控FAK的表達，然而其中具體的通路機制仍有待深入探究。微小RNA（miRNA）是一類內源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，在轉錄后水平調控基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥等多種生物學過程。miR-15b-5p作為眾多miRNA中的一員，其在ICAM-1調控FAK表達過程中的作用機制研究，對于深入理解炎癥反應中白細胞跨內皮遷移的分子調控機制具有重要意義。因此，深入研究ICAM-1通過miR-15b-5p調控FAK表達的機制，不僅有助于揭示炎癥反應中白細胞跨內皮遷移的精細調控網(wǎng)絡，還可能為炎癥相關疾病的治療提供新的靶點和理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討miR-15b-5p在內皮細胞中介導ICAM-1調控FAK表達的具體機制，明確該調控通路對內皮細胞功能的影響，如對白細胞跨內皮遷移能力的改變，以及在炎癥相關疾病發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。從理論意義上看，目前對于內皮細胞中ICAM-1與FAK之間如何協(xié)調以調控白細胞跨內皮遷移的具體分子機制尚未完全明晰，本研究將有助于填補這一領域在miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達機制方面的空白，進一步完善炎癥反應中白細胞跨內皮遷移的分子調控網(wǎng)絡理論體系，加深我們對細胞間相互作用和信號傳導過程的理解，為后續(xù)研究炎癥相關的生理和病理過程提供堅實的理論基礎。在實踐意義方面，炎癥相關疾病嚴重威脅人類健康，如動脈粥樣硬化、類風濕性關節(jié)炎、哮喘等，這些疾病的發(fā)病過程均涉及炎癥反應中白細胞的異?？鐑绕みw移。通過揭示miR-15b-5p介導的ICAM-1對FAK表達的調控機制，有望發(fā)現(xiàn)全新的治療靶點。例如，若能夠明確該調控通路中關鍵的作用節(jié)點，就可以開發(fā)針對這些節(jié)點的干預措施，如設計特異性的miR-15b-5p模擬物或抑制劑，以調節(jié)FAK的表達水平，進而影響白細胞的跨內皮遷移，達到減輕炎癥反應、治療相關疾病的目的。這對于提高炎癥相關疾病的治療效果、改善患者預后具有重要的潛在應用價值，為臨床治療提供新的思路和策略，具有廣闊的臨床轉化前景。二、相關理論基礎2.1ICAM-1的分子結構與功能ICAM-1，全稱細胞間黏附分子1（IntercellularAdhesionMolecule1），又被稱為CD54，屬于免疫球蛋白超家族中的重要成員。從分子結構來看，人ICAM-1基因定位于染色體19p13.3-13.2區(qū)，其編碼產(chǎn)生的蛋白相對分子質量在80000-100000之間。ICAM-1存在兩種形式，分別是sICAM-1（可溶型）和mICAM-1（膜型）。mICAM-1是跨膜糖蛋白，其細胞外結構由5個免疫球蛋白樣結構域組成，這些結構域是ICAM-1發(fā)揮黏附作用及信號轉導的關鍵結構。而sICAM-1則是由mICAM-1經(jīng)蛋白酶裂解，使細胞外成分脫落進入血液后形成的，通過檢測血清中sICAM-1水平，能夠在一定程度上反映局部ICAM-1的表達狀況。在生理功能方面，ICAM-1發(fā)揮著極為重要的作用。首先，它主要介導細胞間的粘附過程。在炎癥反應發(fā)生時，白細胞需要從血液循環(huán)中遷移到炎癥部位，此時ICAM-1就扮演著關鍵角色。它可以與白細胞表面的整合素分子，如淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）和巨噬細胞-1抗原（Mac-1）等特異性結合。這種特異性結合能夠促進白細胞與內皮細胞的粘附，使得白細胞能夠順利從血液循環(huán)中穿出，遷移到炎癥部位，從而參與免疫防御和炎癥反應。例如，在感染性炎癥中，病原體入侵機體后，炎癥部位的內皮細胞會受到刺激而上調ICAM-1的表達，隨后白細胞表面的LFA-1與內皮細胞表面上調表達的ICAM-1結合，引導白細胞向炎癥部位聚集，啟動免疫防御機制。其次，ICAM-1參與免疫識別和激活過程。在免疫應答過程中，抗原呈遞細胞與T淋巴細胞之間的相互作用離不開ICAM-1。它與T細胞表面的共刺激分子結合，為T細胞激活提供共刺激信號，這對于增強T細胞對抗原的識別能力以及啟動和調節(jié)適應性免疫反應具有不可或缺的作用。當抗原呈遞細胞攝取抗原后，會將抗原肽呈遞給T細胞，同時抗原呈遞細胞表面的ICAM-1與T細胞表面的相應受體結合，協(xié)同刺激T細胞活化，使其增殖分化為效應T細胞，從而發(fā)揮免疫效應。此外，在維持組織穩(wěn)態(tài)方面，ICAM-1也發(fā)揮著重要作用。在正常組織中，ICAM-1有助于維持細胞之間的正常連接以及組織的完整性。它參與上皮細胞之間、內皮細胞之間以及細胞與細胞外基質之間的粘附，對于組織的形態(tài)發(fā)生、發(fā)育和修復過程起著重要的支持作用。在胚胎發(fā)育過程中，ICAM-1參與細胞間的相互作用，引導細胞的遷移和分化，確保組織和器官的正常形成。然而，當機體處于病理狀態(tài)時，ICAM-1的表達往往會出現(xiàn)異常，并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在炎癥性疾病中，如類風濕關節(jié)炎，患者體內的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等大量釋放，這些炎癥因子會激活相關信號通路，促進ICAM-1基因的轉錄和表達，導致ICAM-1在關節(jié)滑膜組織的內皮細胞和炎癥細胞表面高表達。高表達的ICAM-1介導白細胞向關節(jié)炎癥部位募集，加重炎癥反應，導致關節(jié)軟骨和骨質的破壞。在炎癥性腸病中，腸道黏膜的內皮細胞和免疫細胞表面的ICAM-1表達也顯著增加，介導白細胞的黏附和浸潤，引發(fā)腸道炎癥和組織損傷。在心血管疾病方面，以動脈粥樣硬化為例，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，血管內皮細胞受到多種危險因素的刺激，如高血脂、高血壓、氧化應激等，導致ICAM-1表達上調。上調表達的ICAM-1促進單核細胞和淋巴細胞粘附到血管內皮，這些細胞隨后遷移到血管壁內，攝取脂質，逐漸形成泡沫細胞，進而參與脂質條紋和斑塊的形成，最終導致動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定，增加心血管事件的發(fā)生風險。ICAM-1還與心肌梗死、腦卒中等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在心肌梗死發(fā)生時，受損心肌組織周圍的血管內皮細胞ICAM-1表達升高，介導炎癥細胞的聚集，進一步加重心肌損傷。在腫瘤領域，一些腫瘤細胞可表達ICAM-1。一方面，ICAM-1有助于腫瘤細胞之間的粘附和聚集，促進腫瘤細胞形成團塊，增強腫瘤細胞的生存能力；另一方面，它可能參與腫瘤細胞與血管內皮細胞的粘附，使腫瘤細胞更容易進入血液循環(huán)，從而促進腫瘤細胞的血行轉移。黑色素瘤細胞表面表達的ICAM-1可以與血管內皮細胞表面的受體結合，幫助黑色素瘤細胞突破血管屏障，進入血液循環(huán)，進而發(fā)生遠處轉移。ICAM-1在腫瘤免疫逃逸中也發(fā)揮一定作用，它通過與免疫細胞表面的配體結合，抑制免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，使得腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視。2.2FAK分子結構和生物學功能黏著斑激酶（FAK），全稱FocalAdhesionKinase，是一種非受體型酪氨酸激酶，在細胞內信號傳導以及多種生物學過程中發(fā)揮著關鍵作用。從分子結構來看，F(xiàn)AK蛋白分子質量約為125kDa，其結構主要包含三個重要區(qū)域。N端是4.1-埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白（FERM）結構域，該結構域介導FAK與整合素和生長因子受體等蛋白的直接相互作用。它如同一個“分子開關”，通過與位于中心的激酶結構域直接結合，阻止底物與催化結構域的結合，進而保護FAK免受肉瘤蛋白激酶（Src）磷酸化的激活，對FAK的活性調控起著重要的起始作用。位于中心的激酶結構域是FAK發(fā)揮酶催化功能的核心區(qū)域，它能夠催化底物蛋白質上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而激活下游一系列信號通路，引發(fā)細胞內的級聯(lián)反應，調控細胞的多種生物學行為。C端包含2個富含脯氨酸的基序，即富含脯氨酸基序1（PR1）和PR2，以及黏著斑定位區(qū)FAT結構域。其中，F(xiàn)AT結構域包含多種蛋白-蛋白相互作用的結合位點，它就像一個“定位導航儀”，引導FAK準確地定位于各種細胞的黏著斑復合物中，使FAK能夠在細胞與細胞外基質相互作用的關鍵部位發(fā)揮其生物學功能，同時，C端的這些結構域還參與調節(jié)FAK與其他信號分子的相互作用，進一步拓展FAK的信號傳導網(wǎng)絡。FAK的生物學功能廣泛且重要，對細胞的正常生理活動以及多種病理過程都有著深遠影響。在細胞粘附與遷移方面，F(xiàn)AK起著核心調節(jié)作用。細胞遷移是一個復雜的過程，包括細胞前端的伸展、與細胞外基質的粘附、細胞體的收縮以及后端與基質的脫離。FAK在這一過程中，通過調節(jié)黏著斑的動態(tài)變化，即黏著斑的組裝和解聚（也稱為黏著斑的翻轉過程），來影響細胞的遷移能力。當細胞受到遷移信號刺激時，整合素與細胞外基質結合，激活FAK。活化的FAK通過磷酸化其底物，如樁蛋白（paxillin）、踝蛋白（talin）等，招募其他信號分子到黏著斑部位，促進黏著斑的組裝，增強細胞與細胞外基質的粘附力，為細胞遷移提供穩(wěn)定的支撐點。隨著細胞遷移的進行，F(xiàn)AK又通過調節(jié)相關信號通路，促使黏著斑解聚，使細胞能夠脫離原有的粘附位點，向前遷移。在傷口愈合過程中，皮膚成纖維細胞會通過FAK介導的信號通路，感知細胞外基質的變化，調節(jié)自身的粘附和遷移行為，向傷口部位遷移，參與傷口的修復。在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞同樣利用FAK來增強自身的遷移和侵襲能力，突破基底膜，進入血液循環(huán)并在遠處器官定植。在細胞增殖與存活方面，F(xiàn)AK也扮演著關鍵角色。FAK可以通過激活PI3K/Akt和Ras/MAPK等信號通路，調節(jié)細胞周期進程和細胞凋亡相關蛋白的表達，從而促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。在PI3K/Akt信號通路中，F(xiàn)AK磷酸化后能夠激活PI3K，PI3K進一步將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活Akt蛋白激酶。Akt被激活后，可以磷酸化下游的多種底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、叉頭框蛋白O（FoxO）家族轉錄因子等，抑制細胞凋亡，促進細胞存活和增殖。在Ras/MAPK信號通路中，F(xiàn)AK與Src家族激酶相互作用，激活Ras蛋白。Ras激活后，依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，ERK進入細胞核，磷酸化一系列轉錄因子，如Elk-1、c-Fos等，促進細胞周期相關基因的表達，推動細胞從G1期進入S期，促進細胞增殖。在胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)AK對于細胞的增殖和存活至關重要，它確保了胚胎細胞的正常分裂和分化，保證了胚胎的正常發(fā)育。在腫瘤細胞中，F(xiàn)AK的過度激活常常導致細胞的異常增殖和抗凋亡能力增強，使得腫瘤細胞能夠逃避機體的正常調控機制，不斷生長和擴散。FAK在炎癥反應中也發(fā)揮著重要作用，特別是在白細胞跨內皮遷移過程中。炎癥發(fā)生時，白細胞需要從血液循環(huán)中遷移到炎癥部位，參與免疫防御和炎癥反應。這一過程中，F(xiàn)AK通過調節(jié)內皮細胞和白細胞之間的相互作用，以及白細胞自身的遷移能力，來促進白細胞跨內皮遷移。當炎癥刺激時，內皮細胞表面的ICAM-1等黏附分子表達上調，與白細胞表面的整合素分子結合，激活白細胞內的FAK?；罨腇AK通過調節(jié)黏著斑的翻轉和細胞骨架的重組，使白細胞能夠在內皮細胞表面滾動、黏附，并最終穿越內皮細胞層，進入炎癥組織。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內皮細胞受到炎癥因子、氧化應激等刺激，F(xiàn)AK被激活，促進白細胞黏附到血管內皮并遷移進入內膜下，引發(fā)炎癥反應和脂質沉積，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。在類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病中，F(xiàn)AK同樣參與白細胞向關節(jié)炎癥部位的遷移過程，加重炎癥反應和組織損傷。2.3miR-15b-5p的特性與作用miR-15b-5p是一種內源性非編碼小分子RNA，屬于微小RNA（miRNA）家族的重要成員。其長度約為22個核苷酸，由基因組上特定的非編碼基因轉錄產(chǎn)生。在細胞核內，初級轉錄本（pri-miRNA）首先被RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成，隨后在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8的作用下，被切割成約70-100個核苷酸長度的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA通過轉運蛋白Exportin-5被轉運至細胞質中，再由核酸酶Dicer進一步切割，形成成熟的miR-15b-5p雙鏈結構。雙鏈中的一條鏈會被優(yōu)先選擇并整合到RNA誘導沉默復合體（RISC）中，而另一條鏈則被降解。miR-15b-5p在基因表達調控中發(fā)揮著關鍵作用，其主要作用方式是通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，在轉錄后水平調控基因的表達。當miR-15b-5p與靶mRNA的3'UTR完全互補配對時，RISC中的核酸酶會直接切割靶mRNA，導致其降解，從而使相應基因的表達無法進行；當miR-15b-5p與靶mRNA的3'UTR不完全互補配對時，RISC則會抑制靶mRNA的翻譯過程，使mRNA無法順利翻譯成蛋白質，最終降低相應基因產(chǎn)物的表達水平。這種調控方式具有高度的特異性和精細性，能夠對細胞內眾多基因的表達進行精確調控，從而影響細胞的各種生物學過程。miR-15b-5p與內皮細胞的生理病理過程密切相關。在生理狀態(tài)下，miR-15b-5p參與維持內皮細胞的正常功能。它可以通過調控相關基因的表達，影響內皮細胞的增殖、遷移和血管生成等過程。研究表明，miR-15b-5p能夠靶向調節(jié)某些生長因子及其受體的表達，如血管內皮生長因子（VEGF）及其受體，從而在血管生成過程中發(fā)揮重要作用。適當水平的miR-15b-5p可以促進內皮細胞的增殖和遷移，有利于血管的正常發(fā)育和修復。在胚胎發(fā)育過程中，miR-15b-5p對于血管系統(tǒng)的形成和完善起著不可或缺的作用，它確保了內皮細胞的正常分化和血管網(wǎng)絡的有序構建。在病理狀態(tài)下，miR-15b-5p的表達失調往往與多種內皮細胞相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在炎癥相關疾病中，如動脈粥樣硬化，炎癥刺激會導致內皮細胞中miR-15b-5p的表達發(fā)生改變。異常表達的miR-15b-5p通過調控其下游靶基因，如ICAM-1和FAK等，影響白細胞與內皮細胞的黏附以及內皮細胞的功能，進而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中，內皮細胞的miR-15b-5p表達水平與正常血管內皮細胞相比明顯降低，導致其對靶基因的調控失衡，ICAM-1和FAK等表達異常升高，促進了白細胞的黏附和炎癥反應的加劇，加速了動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。在腫瘤血管生成方面，miR-15b-5p也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞分泌的各種因子可以影響腫瘤相關內皮細胞中miR-15b-5p的表達，進而調節(jié)內皮細胞的增殖、遷移和血管生成能力，為腫瘤的生長和轉移提供必要的血管支持。一些研究表明，在某些腫瘤中，上調miR-15b-5p的表達可以抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。這可能是因為miR-15b-5p通過靶向抑制與血管生成相關的基因，如某些促血管生成因子及其受體，減少了腫瘤血管的生成，切斷了腫瘤的營養(yǎng)供應，從而達到抑制腫瘤生長的目的。三、研究材料與方法3.1實驗材料3.1.1動物選用6-8周齡、體重約20-25g的SPF級雄性C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗前，小鼠適應性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，符合實驗要求。同時準備ICAM-1基因敲除小鼠，由南京大學模式動物研究所構建并提供。該基因敲除小鼠通過基因打靶技術，將ICAM-1基因的關鍵外顯子區(qū)域進行敲除，使其無法正常表達ICAM-1蛋白。對基因敲除小鼠的基因型進行嚴格鑒定，采用PCR方法擴增小鼠基因組DNA中ICAM-1基因的特定片段，通過電泳分析條帶大小，確定小鼠的基因型。野生型小鼠擴增出的條帶為正常大小，而ICAM-1基因敲除小鼠則擴增出缺失關鍵外顯子后的特異性條帶，以此確保實驗中所用基因敲除小鼠的準確性。3.1.2細胞系小鼠腦微血管內皮細胞系（b.End.3）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。該細胞系具有典型的內皮細胞形態(tài)和功能特征，如呈鋪路石樣排列，表達內皮細胞特異性標志物，如CD31、vonWillebrandfactor（vWF）等。b.End.3細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，待細胞變圓、脫壁后，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞，使其分散成單細胞懸液，按1:3-1:5的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.3主要儀器設備主要儀器設備包括CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，美國），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%）環(huán)境，確保細胞在適宜的條件下生長和增殖；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，提供無菌的操作環(huán)境，防止細胞污染；倒置顯微鏡（Olympus，日本），用于實時觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況；高速冷凍離心機（Eppendorf，德國），能夠在低溫條件下對樣品進行高速離心，用于細胞、蛋白質和核酸等的分離和提取；酶標儀（Bio-Tek，美國），可檢測吸光度值，用于CCK-8法檢測細胞活力、ELISA檢測蛋白含量等實驗；熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems，美國），用于對特定基因的表達水平進行精確的定量分析；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），能夠對DNA、RNA和蛋白質凝膠電泳結果進行成像和分析，直觀展示實驗結果。3.1.4主要試劑主要試劑包括高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），是b.End.3細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，含有豐富的營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖類等，滿足細胞生長和代謝的需求；胎牛血清（FBS，Gibco，美國），為細胞提供生長因子、激素和營養(yǎng)物質，促進細胞的生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Beyotime，中國），用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液（Beyotime，中國），用于消化貼壁細胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于傳代和實驗操作；TRIzol試劑（Invitrogen，美國），用于從細胞和組織中提取總RNA，其主要成分苯酚能夠有效裂解細胞，使RNA釋放出來，并保持RNA的完整性；逆轉錄試劑盒（TaKaRa，日本），包含逆轉錄酶、引物、緩沖液等成分，可將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，以便后續(xù)進行PCR擴增；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本），利用SYBRGreen染料與雙鏈DNA結合后熒光信號增強的特性，對PCR擴增產(chǎn)物進行實時監(jiān)測和定量分析；CCK-8試劑盒（Dojindo，日本），用于檢測細胞活力，其原理是細胞內的脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的WST-8還原為橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，甲瓚的生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值來定量細胞活力；蛋白裂解液（Beyotime，中國），能夠裂解細胞，使細胞內的蛋白質釋放出來，用于蛋白質的提?。籅CA蛋白定量試劑盒（Beyotime，中國），基于BCA法原理，通過蛋白質與銅離子絡合，再與BCA試劑反應生成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，用于測定蛋白質樣品的濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime，中國），包含配制SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑，如丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液等，用于蛋白質的分離和電泳分析；PVDF膜（Millipore，美國），具有良好的蛋白質吸附性能，用于蛋白質免疫印跡實驗中蛋白質的轉膜；一抗（anti-FAK、anti-ICAM-1、anti-β-actin，CellSignalingTechnology，美國），能夠特異性識別并結合目標蛋白，用于蛋白質免疫印跡實驗中檢測FAK、ICAM-1和內參蛋白β-actin的表達水平；二抗（HRP-conjugatedgoatanti-rabbitIgG，CellSignalingTechnology，美國），與一抗結合，通過辣根過氧化物酶（HRP）催化底物發(fā)光，實現(xiàn)對目標蛋白的檢測；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega，美國），用于檢測雙熒光素酶報告基因的活性，分析miR-15b-5p與FAK3'UTR之間的相互作用。3.1.5引物序列根據(jù)GenBank中小鼠FAK、ICAM-1和內參基因GAPDH的mRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。具體引物序列如下：基因引物序列（5'-3'）FAK-FATGGTGGTGAAGAAGATGACFAK-RTCACTTGTGGTGATGGTGACICAM-1-FCCAGAGCTGGTGATGTTGACICAM-1-RTGGAGTTGGTGTTGGTGATGGAPDH-FGAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPDH-RGAAGATGGTGATGGGATTTC3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與處理將小鼠腦微血管內皮細胞系（b.End.3）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化傳代。為模擬炎癥刺激，進行如下操作：使用Poly（I:C）模擬病毒刺激，將Poly（I:C）溶解于無菌PBS中，配制成不同濃度的溶液，如10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL等。將對數(shù)生長期的b.End.3細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入含不同濃度Poly（I:C）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h、24h等不同時間，設置未加Poly（I:C）的正常培養(yǎng)細胞作為對照組。使用LPS模擬細菌刺激，將LPS用無菌PBS配制成不同濃度梯度，如1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL等。同樣將貼壁生長的b.End.3細胞接種于6孔板，更換為含不同濃度LPS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)不同時間，對照組加入等量PBS。刺激結束后，收集細胞，用于后續(xù)實驗，如RNA提取、蛋白提取等，以檢測相關基因和蛋白的表達變化。3.2.2基因敲除與干擾技術構建ICAM-1基因敲除小鼠模型采用基因打靶技術。具體步驟如下：設計針對ICAM-1基因的打靶載體，該載體包含與ICAM-1基因同源的特定DNA片段，以及用于篩選的標記基因（如neo基因）。通過電穿孔法將打靶載體導入小鼠胚胎干細胞（ES細胞）中，使外源DNA與ES細胞基因組中ICAM-1基因的相應部分發(fā)生同源重組。使用含G418的選擇性培養(yǎng)基篩選發(fā)生同源重組的ES細胞克隆，經(jīng)PCR和Southernblot等方法鑒定陽性克隆。將鑒定正確的陽性ES細胞克隆注射到小鼠囊胚中，再將囊胚移植到假孕母鼠的子宮內，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。通過嵌合體小鼠與野生型小鼠交配，獲得F1代雜合子小鼠，進一步繁殖篩選，最終得到ICAM-1基因敲除純合子小鼠。對獲得的基因敲除小鼠進行基因型鑒定，采用PCR方法擴增小鼠基因組DNA中ICAM-1基因的特定片段，通過電泳分析條帶大小，確定小鼠的基因型。使用siRNA轉染技術敲低內皮細胞中ICAM-1的表達。首先，根據(jù)小鼠ICAM-1基因序列，設計并合成特異性的siRNA序列。將b.End.3細胞接種于24孔板中，待細胞生長至50%-60%融合時，進行轉染操作。按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書，將siRNA與轉染試劑混合，形成siRNA-轉染試劑復合物。將復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染48h后，收集細胞，提取RNA和蛋白，通過實時熒光定量PCR和Westernblot檢測ICAM-1的表達水平，以驗證敲低效果。同時設置陰性對照siRNA轉染組和未轉染的空白對照組。3.2.3RNA和蛋白的提取與檢測總RNA提取采用TRIzol試劑法。具體步驟為：收集細胞或組織樣本，對于細胞樣本，先棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌細胞2次，然后每5-10?個細胞加入1mlTRIzol試劑，反復用槍吹打或劇烈震蕩以裂解細胞；對于組織樣本，取50-100mg新鮮組織，加入1mlTRIzol試劑，用組織勻漿器勻漿至充分裂解。將裂解液轉移至EP管中，室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全解離。按照每1mlTRIzol加0.2ml氯仿的比例加入氯仿，蓋緊EP管蓋子，用力震蕩15秒，室溫放置2-3分鐘后，12000g（2-8℃）離心15分鐘。此時溶液分為三層，上層為無色水相，RNA主要存在于該層；中層為白色蛋白層；下層為紅色有機相。小心吸取上層水相轉移至新的EP管中，按照每1mlTRIzol加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，使RNA沉淀。12000g（2-8℃）離心10分鐘，棄上清，沉淀即為RNA。按照每1mlTRIzol加1ml75%乙醇的比例洗滌RNA沉淀，渦旋混合，7500g（2-8℃）離心5分鐘，棄上清。讓沉淀的RNA在室溫自然干燥，但注意不要過度干燥，以免影響RNA的溶解。最后用RNase-freewater溶解RNA沉淀，取少量RNA樣品，通過紫外分光光度計測定其濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.2之間，OD???/OD???比值大于2，以確保RNA質量良好。RNA逆轉錄為cDNA使用逆轉錄試劑盒（TaKaRa，日本）。在冰上配制逆轉錄反應體系，體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Random6mers、OligodTPrimer、總RNA和RNase-freewater，總體積一般為20μl。輕輕混勻反應體系，短暫離心后，置于PCR儀中進行逆轉錄反應，反應條件為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。反應結束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR擴增實驗?？偟鞍滋崛r，收集細胞或組織樣本，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌細胞3次。向細胞中加入適量的蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃，使細胞充分裂解。將裂解液轉移至EP管中，4℃，12000g離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作如下：配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液，如0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml等。將標準品溶液和待測蛋白樣品各取20μl加入到96孔板中，每孔再加入200μlBCA工作液（由A液和B液按50:1混合而成），輕輕混勻。37℃孵育30分鐘，冷卻至室溫后，用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)標準品的吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。免疫印跡試驗（Westernblot）檢測蛋白表達：根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。配制10%-12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，使蛋白分離，電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，采用半干轉或濕轉法均可，轉膜條件根據(jù)蛋白分子量大小進行調整。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶（用TBST配制）中，室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，將PVDF膜與一抗（anti-FAK、anti-ICAM-1、anti-β-actin等）孵育，一抗用5%BSA（用TBST配制）稀釋至適當濃度，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以洗去未結合的一抗。然后將PVDF膜與二抗（HRP-conjugatedgoatanti-rabbitIgG）孵育，二抗用5%脫脂牛奶稀釋至適當濃度，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，洗去未結合的二抗。最后，使用化學發(fā)光底物（如ECL試劑）孵育PVDF膜，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。3.2.4載體構建與雙熒光素酶實驗構建FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體。首先，根據(jù)小鼠FAK基因的3’UTR序列，設計并合成包含F(xiàn)AK3’UTR全長或部分片段的引物，引物兩端引入合適的酶切位點。以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到FAK3’UTR目的片段。將擴增得到的目的片段和雙熒光素酶報告載體（如pGL3-basic）分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切，酶切體系包括DNA、限制性內切酶、10×Buffer和ddH?O，37℃孵育2-3小時。酶切結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收目的片段和線性化的載體。將回收的目的片段和載體用T4DNA連接酶進行連接，連接體系包括目的片段、載體、T4DNA連接酶、10×T4DNALigaseBuffer和ddH?O，16℃孵育過夜。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，將轉化后的感受態(tài)細胞涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，篩選出陽性克隆，提取質粒，即為構建好的FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體。雙熒光素酶實驗驗證miR-15b-5p與FAK3’UTR靶向關系的原理是：將構建好的FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體與miR-15b-5pmimics或mimicsnegativecontrol共轉染至細胞中，若miR-15b-5p與FAK3’UTR存在靶向關系，則miR-15b-5p會與FAK3’UTR結合，抑制熒光素酶的表達，導致熒光素酶活性降低。具體操作步驟如下：將b.End.3細胞接種于24孔板中，待細胞生長至50%-60%融合時，進行轉染操作。按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書，將FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體、miR-15b-5pmimics或mimicsnegativecontrol以及內參載體（如pRL-TK）混合，形成轉染復合物。將轉染復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染48h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次。每孔加入100μl1×PassiveLysisBuffer，室溫孵育15分鐘，期間輕輕搖晃，使細胞充分裂解。將裂解液轉移至EP管中，4℃，12000g離心5分鐘，取上清液。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega，美國）說明書，將上清液與檢測試劑混合，依次測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性作為內參，對螢火蟲熒光素酶活性進行歸一化處理，計算相對熒光素酶活性，比較miR-15b-5pmimics組與mimicsnegativecontrol組的相對熒光素酶活性，若miR-15b-5pmimics組的相對熒光素酶活性顯著降低，則說明miR-15b-5p與FAK3’UTR存在靶向關系。3.2.5細胞功能檢測采用CCK-8法檢測內皮細胞增殖能力。將b.End.3細胞消化計數(shù)后，以每孔1000-5000個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基。設置空白組（只加培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不含細胞）、對照組（正常培養(yǎng)的細胞）和實驗組（根據(jù)實驗設計進行處理的細胞，如轉染miR-15b-5pmimics或inhibitor等），每組設置5-6個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。根據(jù)實驗目的，對實驗組進行相應處理，如加入不同濃度的藥物、轉染不同的核酸等，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h或72h。在培養(yǎng)結束前1-4小時，每孔加入10μlCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，直至顯色穩(wěn)定，一般肉眼可見橙黃色。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算細胞增殖率，細胞增殖率=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。采用Transwell小室實驗檢測內皮細胞遷移能力。Transwell小室分為上室和下室，上室為聚碳酸酯膜（孔徑一般為8μm），下室為24孔板。將Matrigel基質膠用無血清培養(yǎng)基稀釋后，加入到Transwell小室的上室中，每孔50-100μl，37℃孵育1-2小時，使基質膠凝固，形成人工基底膜。將b.End.3細胞消化計數(shù)后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為1×10?-5×10?個/ml。取200μl細胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μl含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。設置對照組和實驗組，每組設置3-4個復孔。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用0.1%結晶紫染色10-15分鐘。用PBS沖洗Transwell小室3次，去除多余的染料。在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)遷移到下室膜表面的細胞數(shù)量，計算平均細胞遷移數(shù)，比較對照組和實驗組的細胞遷移能力。3.3統(tǒng)計學分析方法本研究采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對于兩組之間的數(shù)據(jù)比較，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用獨立樣本t檢驗；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則使用非參數(shù)檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗。在多組數(shù)據(jù)比較時，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，運用單因素方差分析（One-wayANOVA），然后進行Tukey事后多重比較；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，之后進行Dunn's多重比較。在所有統(tǒng)計分析中，以P值作為判斷差異顯著性的標準。當P>0.05時，認為差異無統(tǒng)計學意義；當P≤0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義；當P≤0.01時，認為差異具有高度統(tǒng)計學意義；當P≤0.001時，認為差異具有極其高度統(tǒng)計學意義。通過嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學分析，確保研究結果的準確性和可靠性，為深入探討miR-15b-5p在內皮細胞中介導ICAM-1調控FAK表達的機制提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、實驗結果4.1炎癥環(huán)境下FAK的表達變化使用Poly（I:C）模擬病毒刺激小鼠腦微血管內皮細胞（b.End.3），以探究炎癥環(huán)境下FAK的表達變化。將b.End.3細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0μg/mL（對照組）、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的Poly（I:C）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。實驗結束后，提取細胞總蛋白，通過Westernblot檢測FAK的表達水平。結果如圖1所示，與對照組相比，隨著Poly（I:C）濃度的增加，F(xiàn)AK蛋白的表達量呈逐漸上升趨勢。當Poly（I:C）濃度為10μg/mL時，F(xiàn)AK表達量略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；當濃度達到50μg/mL時，F(xiàn)AK表達量顯著增加（P<0.05）；100μg/mL時，F(xiàn)AK表達量進一步升高（P<0.01）。這表明在病毒模擬的炎癥刺激下，F(xiàn)AK的表達受到上調，且上調程度與刺激強度相關。<此處插入圖1：Poly（I:C）刺激b.End.3細胞后FAK的表達變化><此處插入圖1：Poly（I:C）刺激b.End.3細胞后FAK的表達變化>為了進一步驗證炎癥刺激對FAK表達的影響，采用LPS模擬細菌刺激小鼠腦微血管內皮細胞（b.End.3）。將對數(shù)生長期的b.End.3細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，更換為含有不同濃度LPS（0μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后收集細胞。提取細胞總蛋白，進行Westernblot檢測FAK的表達。結果顯示，隨著LPS濃度的升高，F(xiàn)AK蛋白表達水平逐漸增加（圖2）。與對照組相比，1μg/mLLPS刺激組FAK表達無明顯變化（P>0.05）；5μg/mLLPS刺激組FAK表達顯著升高（P<0.05）；10μg/mLLPS刺激組FAK表達升高更為明顯（P<0.01）。這進一步證明在細菌模擬的炎癥環(huán)境下，F(xiàn)AK表達上調，且與LPS濃度呈正相關。<此處插入圖2：LPS刺激b.End.3細胞后FAK的表達變化><此處插入圖2：LPS刺激b.End.3細胞后FAK的表達變化>為了在體內驗證炎癥對FAK表達的影響，對小鼠進行腹腔注射LPS實驗。將30只C57BL/6小鼠隨機分為5組，每組6只，分別為對照組（注射等量生理鹽水）、LPS低劑量組（5mg/kg）、LPS中劑量組（10mg/kg）、LPS高劑量組（20mg/kg）以及LPS高劑量+抑制劑組（20mg/kgLPS+FAK抑制劑）。注射后6h，處死小鼠，取肺組織。提取肺組織總蛋白，通過Westernblot檢測FAK的表達水平。結果如圖3所示，與對照組相比，LPS低劑量組肺組織中FAK表達略有升高，但差異不顯著（P>0.05）；LPS中劑量組和高劑量組FAK表達顯著升高（P<0.05和P<0.01）。而在LPS高劑量+抑制劑組中，F(xiàn)AK表達水平明顯低于LPS高劑量組（P<0.05），表明FAK抑制劑能夠有效抑制LPS誘導的FAK表達升高。這說明在體內炎癥環(huán)境下，肺組織中的FAK表達同樣會升高，且這種升高可被FAK抑制劑所抑制。<此處插入圖3：小鼠腹腔注射LPS后肺組織中FAK的表達變化><此處插入圖3：小鼠腹腔注射LPS后肺組織中FAK的表達變化>為了研究在實際感染情況下FAK的表達變化，檢測了感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的豬肺組織中FAK的表達。選取10頭健康仔豬，隨機分為兩組，實驗組5頭接種PRRSV，對照組5頭接種等量生理鹽水。感染后7天，處死所有仔豬，采集肺組織樣本。提取肺組織總RNA，逆轉錄為cDNA后，通過實時熒光定量PCR檢測FAKmRNA的表達水平；同時提取總蛋白，用Westernblot檢測FAK蛋白的表達。結果顯示，感染PRRSV的豬肺組織中，F(xiàn)AKmRNA和蛋白的表達水平均顯著高于對照組（圖4）。mRNA水平上，感染組FAKmRNA相對表達量是對照組的2.5倍（P<0.01）；蛋白水平上，感染組FAK蛋白條帶灰度值明顯高于對照組（P<0.01）。這表明在PRRSV感染導致的炎癥環(huán)境下，豬肺組織中的FAK表達顯著上調，進一步支持了炎癥刺激可誘導FAK表達升高的結論。<此處插入圖4：感染PRRSV的豬肺組織中FAK的表達變化><此處插入圖4：感染PRRSV的豬肺組織中FAK的表達變化>4.2ICAM-1基因敲除對FAK表達的影響為研究ICAM-1基因敲除對FAK表達的影響，首先將ICAM-1siRNA轉染至b.End.3細胞中。將b.End.3細胞接種于6孔板，待細胞生長至50%-60%融合時，按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書，將ICAM-1siRNA與轉染試劑混合后轉染至細胞中，設置陰性對照siRNA轉染組和未轉染的空白對照組。轉染48h后，收集細胞，提取總蛋白，通過Westernblot檢測FAK的表達水平。結果如圖5所示，與空白對照組和陰性對照siRNA轉染組相比，ICAM-1siRNA轉染組中ICAM-1蛋白表達顯著降低（P<0.01），同時FAK蛋白表達也明顯下降（P<0.05）。這表明敲低ICAM-1的表達能夠抑制FAK的表達。<此處插入圖5：ICAM-1siRNA轉染b.End.3細胞后FAK的表達變化><此處插入圖5：ICAM-1siRNA轉染b.End.3細胞后FAK的表達變化>為了在體內進一步驗證ICAM-1基因敲除對FAK表達的影響，選取ICAM-1基因敲除小鼠和野生型小鼠。將兩組小鼠分別飼養(yǎng)至8周齡，然后處死小鼠，取肺組織。提取肺組織總蛋白，通過Westernblot檢測FAK的表達水平。結果如圖6所示，與野生型小鼠相比，ICAM-1基因敲除小鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達幾乎檢測不到，F(xiàn)AK蛋白表達也顯著降低（P<0.01）。這進一步證實了在體內ICAM-1基因敲除會導致FAK表達下降，表明ICAM-1在調控FAK表達中起著重要作用。<此處插入圖6：ICAM-1基因敲除小鼠肺組織中FAK的表達變化><此處插入圖6：ICAM-1基因敲除小鼠肺組織中FAK的表達變化>4.3ICAM-1通過miR-15b-5p調控FAK表達的驗證為探究ICAM-1是否通過miR-15b-5p調控FAK表達，對ICAM-1敲除小鼠肺組織以及轉染ICAM-1siRNA的b.End.3細胞中miR-15b-5p的表達進行檢測。選取8周齡的ICAM-1基因敲除小鼠和野生型小鼠，每組各6只，處死后取肺組織，提取總RNA，通過實時熒光定量PCR檢測miR-15b-5p的表達水平。結果如圖7A所示，與野生型小鼠相比，ICAM-1基因敲除小鼠肺組織中miR-15b-5p的表達顯著上調（P<0.01）。將ICAM-1siRNA轉染至b.End.3細胞，同時設置陰性對照siRNA轉染組和未轉染的空白對照組。轉染48h后，收集細胞，提取總RNA，進行實時熒光定量PCR檢測。結果如圖7B所示，與空白對照組和陰性對照siRNA轉染組相比，ICAM-1siRNA轉染組中miR-15b-5p的表達明顯升高（P<0.05）。這表明敲除ICAM-1可促進miR-15b-5p的表達。<此處插入圖7：ICAM-1敲除小鼠肺組織以及轉染ICAM-1siRNA的b.End.3細胞中miR-15b-5p的表達><此處插入圖7：ICAM-1敲除小鼠肺組織以及轉染ICAM-1siRNA的b.End.3細胞中miR-15b-5p的表達>為進一步驗證miR-15b-5p與FAK的靶向關系，構建FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體。根據(jù)小鼠FAK基因的3’UTR序列，設計并合成引物，以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到FAK3’UTR目的片段。將目的片段和雙熒光素酶報告載體pGL3-basic分別用限制性內切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段和線性化的載體。將回收的目的片段和載體用T4DNA連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，結果顯示測序所得序列與預期的FAK3’UTR序列完全一致，表明FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體構建成功（圖8）。<此處插入圖8：FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體構建成功的鑒定結果（PCR鑒定和測序驗證圖）><此處插入圖8：FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體構建成功的鑒定結果（PCR鑒定和測序驗證圖）>將構建好的FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體與miR-15b-5pmimics或mimicsnegativecontrol共轉染至b.End.3細胞中，同時設置只轉染報告載體的對照組。轉染48h后，進行雙熒光素酶實驗檢測。結果如圖9所示，與mimicsnegativecontrol組和對照組相比，miR-15b-5pmimics組的相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），表明miR-15b-5p能夠靶向結合FAK3’UTR區(qū)，抑制熒光素酶的表達，從而驗證了miR-15b-5p與FAK3’UTR存在靶向關系。<此處插入圖9：miR-15b-5p靶向FAK3’UTR區(qū)的雙熒光素酶實驗驗證><此處插入圖9：miR-15b-5p靶向FAK3’UTR區(qū)的雙熒光素酶實驗驗證>為研究miR-15b-5p對FAK表達的影響，分別將miR-15b-5pinhibitor和mimics轉染至b.End.3細胞中，同時設置inhibitornegativecontrol組和mimicsnegativecontrol組。轉染48h后，收集細胞，提取總蛋白，通過Westernblot檢測FAK的表達水平。結果如圖10所示，與inhibitornegativecontrol組相比，miR-15b-5pinhibitor轉染組中FAK蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與mimicsnegativecontrol組相比，miR-15b-5pmimics轉染組中FAK蛋白表達明顯降低（P<0.01）。這表明抑制miR-15b-5p的表達可促進FAK的表達，而過表達miR-15b-5p則抑制FAK的表達。<此處插入圖10：分別轉染miR-15b-5pinhibitor和mimics至b.End.3細胞，檢測FAK表達變化><此處插入圖10：分別轉染miR-15b-5pinhibitor和mimics至b.End.3細胞，檢測FAK表達變化>4.4miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞功能的影響為探究miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞增殖能力的影響，采用CCK-8法進行檢測。將b.End.3細胞分為四組：對照組、ICAM-1siRNA轉染組、ICAM-1siRNA+miR-15b-5pinhibitor轉染組以及ICAM-1siRNA+miR-15b-5pmimics轉染組。轉染48h后，向每組細胞中加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，計算細胞增殖率。結果如圖11所示，與對照組相比，ICAM-1siRNA轉染組細胞增殖率顯著降低（P<0.01），表明敲低ICAM-1抑制了內皮細胞的增殖。在ICAM-1siRNA+miR-15b-5pinhibitor轉染組中，細胞增殖率較ICAM-1siRNA轉染組顯著升高（P<0.05），說明抑制miR-15b-5p表達可部分恢復因敲低ICAM-1導致的內皮細胞增殖抑制。而ICAM-1siRNA+miR-15b-5pmimics轉染組細胞增殖率進一步降低（P<0.01），表明過表達miR-15b-5p加劇了敲低ICAM-1對內皮細胞增殖的抑制作用。這表明miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞增殖能力有顯著影響，ICAM-1通過miR-15b-5p-FAK軸參與調節(jié)內皮細胞的增殖。<此處插入圖11：miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞增殖能力的影響（CCK-8法檢測結果）><此處插入圖11：miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞增殖能力的影響（CCK-8法檢測結果）>為研究miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞遷移能力的作用，采用Transwell小室實驗進行檢測。同樣將b.End.3細胞分為上述四組，將細胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24h后，固定并染色遷移到下室膜表面的細胞，在顯微鏡下計數(shù)。結果如圖12所示，與對照組相比，ICAM-1siRNA轉染組遷移到下室的細胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），說明敲低ICAM-1抑制了內皮細胞的遷移。ICAM-1siRNA+miR-15b-5pinhibitor轉染組遷移細胞數(shù)量較ICAM-1siRNA轉染組顯著增加（P<0.05），表明抑制miR-15b-5p表達可部分逆轉因敲低ICAM-1導致的內皮細胞遷移抑制。而ICAM-1siRNA+miR-15b-5pmimics轉染組遷移細胞數(shù)量進一步減少（P<0.01），表明過表達miR-15b-5p進一步抑制了敲低ICAM-1后的內皮細胞遷移能力。這表明miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞遷移能力有重要影響，ICAM-1通過miR-15b-5p-FAK軸調節(jié)內皮細胞的遷移過程。<此處插入圖12：miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞遷移能力的影響（Transwell小室實驗結果）><此處插入圖12：miR-15b-5p介導ICAM-1調控FAK表達對內皮細胞遷移能力的影響（Transwell小室實驗結果）>五、分析與討論5.1炎癥環(huán)境下FAK表達變化的原因探討在炎癥反應中，機體受到病毒、細菌等病原體刺激時，會啟動一系列復雜的免疫應答機制，其中FAK表達的變化在這一過程中扮演著重要角色。本研究通過多種實驗手段，包括使用Poly（I:C）模擬病毒刺激小鼠腦微血管內皮細胞（b.End.3）、LPS模擬細菌刺激b.End.3細胞、小鼠腹腔注射LPS以及檢測感染PRRSV的豬肺組織中FAK的表達，均發(fā)現(xiàn)炎癥刺激能夠導致FAK表達上調。從炎癥相關信號通路的角度來看，當內皮細胞受到炎癥刺激時，Toll樣受體（TLRs）作為一類重要的模式識別受體，能夠識別病原體相關分子模式（PAMPs），如Poly（I:C）模擬的病毒雙鏈RNA和LPS模擬的細菌脂多糖。以TLR4為例，當它識別LPS后，會招募髓樣分化因子88（MyD88），進而激活IL-1受體相關激酶（IRAKs），隨后激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6激活后，可通過兩條主要途徑影響FAK的表達。一方面，它激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，NF-κB進入細胞核后，結合到相關基因啟動子區(qū)域，促進一系列炎癥相關基因的轉錄，其中可能包括調控FAK表達的相關因子，從而間接影響FAK的表達。研究表明，NF-κB的激活能夠上調一些生長因子和細胞因子的表達，這些因子可能通過旁分泌或自分泌的方式作用于內皮細胞，促進FAK的表達。另一方面，TRAF6激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，如p38MAPK、細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等。p38MAPK被激活后，可磷酸化一系列轉錄因子，如ATF-2、CREB等，這些轉錄因子進入細胞核后，可能直接或間接調節(jié)FAK基因的轉錄，導致FAK表達上調。ERK信號通路的激活也能夠通過調節(jié)相關轉錄因子，促進FAK的表達。在病毒感染引起的炎癥反應中，TLR3識別Poly（I:C）后，通過TRIF依賴的信號通路，同樣可以激活NF-κB和MAPK信號通路，進而影響FAK的表達。FAK表達變化在炎癥反應中具有重要的生物學意義。從白細胞跨內皮遷移的角度來看，炎癥發(fā)生時，白細胞需要從血液循環(huán)遷移到炎癥部位發(fā)揮免疫防御作用。FAK在這一過程中起著關鍵調節(jié)作用，它通過調節(jié)黏著斑的動態(tài)變化，即黏著斑的組裝和解聚過程，影響白細胞與內皮細胞的黏附以及白細胞自身的遷移能力。當FAK表達上調時，能夠促進黏著斑的組裝，增強白細胞與內皮細胞的黏附力，使得白細胞能夠穩(wěn)定地附著在內皮細胞表面。隨后，F(xiàn)AK通過調節(jié)相關信號通路，促使黏著斑解聚，使白細胞能夠脫離原有的粘附位點，穿越內皮細胞層，進入炎癥組織。在炎癥反應中，F(xiàn)AK表達上調可以促進白細胞向炎癥部位的遷移，增強機體的免疫防御能力，有助于清除病原體和修復受損組織。然而，如果FAK表達異常升高或持續(xù)時間過長，可能導致白細胞過度遷移和炎癥反應失控，引發(fā)組織損傷和炎癥相關疾病的發(fā)生發(fā)展。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內皮細胞受到炎癥刺激，F(xiàn)AK表達上調，導致白細胞過度黏附和遷移進入血管內膜下，引發(fā)炎癥反應和脂質沉積，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。5.2ICAM-1基因敲除影響FAK表達的機制分析ICAM-1基因敲除對FAK表達產(chǎn)生顯著影響，從分子相互作用層面深入分析，這一影響主要通過miR-15b-5p介導，同時涉及多條信號通路的調控。本研究結果顯示，無論是在體外實驗中對b.End.3細胞轉染ICAM-1siRNA，還是在體內實驗中使用ICAM-1基因敲除小鼠，均發(fā)現(xiàn)ICAM-1表達缺失后，F(xiàn)AK表達明顯下降。這表明ICAM-1在FAK表達調控中起著正向調節(jié)作用。從miR-15b-5p的角度來看，ICAM-1基因敲除可促進miR-15b-5p的表達。在ICAM-1基因敲除小鼠肺組織以及轉染ICAM-1siRNA的b.End.3細胞中，miR-15b-5p的表達顯著上調。這提示ICAM-1可能對miR-15b-5p的表達具有抑制作用。進一步探究其機制，ICAM-1可能通過與miR-15b-5p啟動子區(qū)域結合，抑制miR-15b-5p的轉錄，從而維持FAK的表達水平。當ICAM-1基因敲除后，這種抑制作用消失，miR-15b-5p轉錄增加，表達上調。已有研究表明，一些轉錄因子可通過與miR-15b-5p啟動子區(qū)域結合，調控其表達。ICAM-1可能與這些轉錄因子相互作用，間接影響miR-15b-5p的轉錄過程。例如，NF-κB作為一種重要的轉錄因子，在炎癥反應中被激活后，可結合到多種基因的啟動子區(qū)域，調節(jié)基因表達。ICAM-1可能通過與NF-κB相互作用，影響其與miR-15b-5p啟動子區(qū)域的結合，進而調控miR-15b-5p的表達。當ICAM-1基因敲除后，可能改變了NF-κB與miR-15b-5p啟動子區(qū)域的結合模式，導致miR-15b-5p表達上調。miR-15b-5p通過與FAK的3’UTR區(qū)靶向結合，抑制FAK的表達。本研究通過構建FAK3’UTR雙熒光素酶報告載體，并進行雙熒光素酶實驗驗證，證實了miR-15b-5p與FAK3’UTR存在靶向關系。當miR-15b-5p與FAK3’UTR結合后，可抑制FAKmRNA的翻譯過程，使FAK蛋白表達下降。這種靶向調控作用在細胞水平也得到了驗證，轉染miR-15b-5pmimics可抑制FAK的表達，而轉染miR-15b-5pinhibitor則促進FAK的表達。ICAM-1基因敲除還可能通過影響其他信號通路，間接調控FAK的表達。如PI3K/Akt信號通路，在細胞增殖、存活和遷移等過程中發(fā)揮重要作用。ICAM-1可能通過與整合素等細胞表面分子相互作用，激活PI3K/Akt信號通路，進而調節(jié)FAK的表達。當ICAM-1基因敲除后，可能影響了PI3K/Akt信號通路的激活，從而間接影響FAK的表達。研究表明，整合素與細胞外基質結合后，可招募FAK和PI3K等分子到黏著斑部位，激活PI3K/Akt信號通路。ICAM-1可能通過與整合素的相互作用，調節(jié)這一過程，當ICAM-1缺失時，可能破壞了整合素與FAK、PI3K等分子的相互作用，影響了PI3K/Akt信號通路對FAK表達的調節(jié)。ICAM-1基因敲除影響FAK表達是一個復雜的過程，主要通過miR-15b-5p介導，同時涉及與其他轉錄因子的相互作用以及多條信號通路的調控。深入研究這一機制，對于理解炎癥反應中白細胞跨內皮遷移的分子調控網(wǎng)絡具有重要意義，也為炎癥相關疾病的治療提供了新的理論依據(jù)。5.3ICAM-1通過miR-15b-5p調控FAK表達的機制解析ICAM-1對miR-15b-5p表達的抑制作用存在復雜的分子機制。ICAM-1作為一種跨膜糖蛋白，其表達變化可通過多種信號轉導途徑影響miR-15b-5p的轉錄過程。在炎癥刺激下，ICAM-1表達上調，可能通過與細胞內的一些轉錄因子相互作用，間接調控miR-15b-5p的表達。NF-κB是一種在炎癥反