IL-15基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的機制解析：從實驗到臨床的探索一、引言1.1研究背景與意義腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一。當腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落，通過血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)遷移到身體其他部位，并在新的組織中生長和繁殖時，就發(fā)生了轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移不僅增加了腫瘤治療的難度，還嚴重影響患者的生存質(zhì)量和生存期。在眾多的轉(zhuǎn)移方式中，腹腔轉(zhuǎn)移癌是一種常見且具有高度侵襲性的腫瘤轉(zhuǎn)移類型，常見于卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膽管癌等惡性腫瘤。一旦腫瘤發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后往往較差，五年生存率較低。這是因為腹腔內(nèi)的復(fù)雜解剖結(jié)構(gòu)和豐富的血管、淋巴管網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤細胞的擴散提供了便利條件，使得腫瘤細胞能夠迅速播散并侵犯多個臟器，同時也增加了手術(shù)切除的難度，并且對化療藥物的敏感性降低。小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌模型作為一種重要的研究工具，在腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過建立該模型，研究者可以在可控的實驗條件下，深入觀察腫瘤細胞在腹腔內(nèi)的生長、轉(zhuǎn)移過程以及與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。這種模型不僅能夠模擬人體腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移的病理生理過程，為研究提供了一個直觀且可操作的平臺，而且有助于篩選和評估新的治療方法和藥物，為臨床治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。例如，通過在小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌模型中測試不同藥物的療效，可以初步判斷這些藥物在人體中的潛在治療效果，從而加速新藥的研發(fā)進程。白細胞介素15（Interleukin15，IL-15）作為免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵細胞因子，近年來在腫瘤免疫治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。IL-15具有多種生物學(xué)功能，它能夠促進T細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞的增殖、活化和存活，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力。在腫瘤微環(huán)境中，IL-15可以激活免疫細胞，使其更好地識別和攻擊腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，IL-15還可以調(diào)節(jié)免疫細胞之間的相互作用，促進免疫記憶的形成，為機體提供長期的抗腫瘤免疫保護。將IL-15應(yīng)用于小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的基因治療，有望通過增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，有效地控制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療開辟新的途徑。因此，深入研究IL-15基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的機制，對于揭示腫瘤免疫治療的分子機制，開發(fā)更加有效的腫瘤治療策略具有重要的理論和實際意義。通過本研究，我們期望能夠為臨床腫瘤治療提供新的思路和方法，改善腫瘤患者的預(yù)后，提高他們的生存質(zhì)量和生存期。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤研究領(lǐng)域，小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌模型作為模擬人類腫瘤腹腔轉(zhuǎn)移的重要工具，一直是研究的重點。國外早在20世紀中期就開始利用小鼠模型研究腫瘤轉(zhuǎn)移機制，如FidlerIJ等學(xué)者在1970年代通過將腫瘤細胞注射到小鼠腹腔，觀察腫瘤細胞在腹腔內(nèi)的擴散和轉(zhuǎn)移情況，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程小鼠模型逐漸成為研究熱點，通過敲除或過表達特定基因，研究者能夠更深入地探討基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究起步稍晚，但近年來發(fā)展迅速。國內(nèi)研究團隊利用小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌模型，研究了多種腫瘤的轉(zhuǎn)移機制，如北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院的團隊對結(jié)直腸癌腹腔轉(zhuǎn)移的分子機制進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了多個與轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號通路，為臨床治療提供了新的靶點。IL-15作為一種具有強大免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用研究也備受關(guān)注。國外在IL-15的基礎(chǔ)研究和臨床前研究方面取得了眾多成果。一些研究表明，IL-15能夠促進T細胞和NK細胞的增殖和活化，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力。在小鼠黑色素瘤模型中，注射IL-15能夠顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長小鼠的生存期。此外，為了提高IL-15的治療效果并降低其毒副作用，國外研究人員對IL-15進行了多種形式的改造，如構(gòu)建融合蛋白、使用納米載體遞送等。傅陽心教授團隊與彭華研究員團隊合作構(gòu)建的aPD-1-IL-15融合蛋白，在多種小鼠腫瘤模型中展現(xiàn)出顯著抑制腫瘤生長的能力，且完全不會產(chǎn)生毒副作用。國內(nèi)在IL-15基因治療腫瘤方面也取得了一定的進展。有研究通過將IL-15基因?qū)肽[瘤細胞或免疫細胞，觀察其對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。例如，中國科學(xué)院的研究團隊將IL-15基因轉(zhuǎn)染到樹突狀細胞中，然后回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能夠增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的生長。然而，目前國內(nèi)外對于IL-15基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的具體機制研究仍存在不足。雖然已知IL-15能夠激活免疫細胞，但對于其在腫瘤微環(huán)境中如何與其他細胞和分子相互作用，從而影響腫瘤轉(zhuǎn)移的具體分子機制尚不完全清楚。此外，IL-15基因治療的最佳給藥方式、劑量和療程等也有待進一步優(yōu)化。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在利用小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型，深入探究IL-15基因治療在控制腫瘤生長、延長患癌動物生存期以及延緩腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用，并剖析其潛在的作用機制，為基于IL-15的腫瘤免疫基因治療提供堅實的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下：小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型的建立：選取健康的小鼠，通過腹腔注射小鼠結(jié)腸癌細胞CT26，構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型。在建模過程中，密切觀察小鼠的生理狀態(tài)、體重變化、腹水形成等指標，定期對小鼠進行影像學(xué)檢查，如小動物活體成像，以監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，確保模型的成功建立及穩(wěn)定性。同時，設(shè)置正常小鼠作為空白對照組，用于后續(xù)實驗結(jié)果的對比分析。IL-15表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及效果評估：將表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）通過腹腔注射的方式導(dǎo)入已建立模型的小鼠體內(nèi)，進行基因治療。為了評估轉(zhuǎn)染效果，先將表達綠色熒光蛋白載體pHi2EGFP-CMV-TAT（L6）注射于建模小鼠腹腔，利用小動物活體成像技術(shù)，觀察綠色熒光蛋白的表達情況，以此評估轉(zhuǎn)染效率和目的基因在小鼠體內(nèi)的表達分布。隨后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等方法，檢測小鼠體內(nèi)IL-15蛋白的表達水平，確定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是否成功以及IL-15的表達量是否達到預(yù)期。IL-15基因治療對荷瘤小鼠的影響評估：設(shè)置多個實驗組，包括腹腔注射表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）的治療組，腹腔注射空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS（M7）的對照組、腹腔注射PBS的對照組、腹腔不注射治療的對照組，以及無腫瘤的空白組。在實驗過程中，密切監(jiān)測各組荷瘤小鼠的腫瘤大小變化，使用游標卡尺定期測量腫瘤的長徑和短徑，按照公式計算腫瘤體積；記錄小鼠的體重變化，觀察腹水形成情況；統(tǒng)計小鼠的生存期，繪制生存曲線，分析不同治療方式對荷瘤小鼠腫瘤生長、體重、腹水形成以及生存期的影響，從而評估IL-15基因治療的效果。分析腹腔免疫細胞變化：采用流式細胞術(shù)，對不同治療組荷瘤小鼠腹水中的免疫細胞進行分析，檢測CD4、CD8、CD25、NKG2D、CD11b等免疫細胞標志物的表達情況，了解IL-15基因治療對腹腔免疫細胞組成和功能狀態(tài)的影響。通過對比不同組之間免疫細胞的差異，探討IL-15激活免疫細胞、增強抗腫瘤免疫反應(yīng)的具體機制。此外，還可以進一步研究免疫細胞分泌的細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，分析它們在IL-15基因治療過程中的變化趨勢，為揭示其作用機制提供更多線索。探討IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的機制：綜合上述實驗結(jié)果，從免疫細胞激活、腫瘤微環(huán)境改變、信號通路調(diào)控等多個角度，深入探討IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的可能機制。通過基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析荷瘤小鼠體內(nèi)與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)表達譜的變化，篩選出可能參與IL-15作用機制的關(guān)鍵分子和信號通路。然后，利用RNA干擾（RNAi）、基因敲除等技術(shù)，對關(guān)鍵分子進行功能驗證，明確它們在IL-15基因治療中的作用及相互關(guān)系，從而全面揭示IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的分子機制。1.4研究方法與技術(shù)路線小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型的建立：選取6-8周齡、體重18-22g的健康BALB/c小鼠，在無菌條件下，將處于對數(shù)生長期的小鼠結(jié)腸癌細胞CT26用胰酶消化后，制備成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×10?/ml。通過腹腔注射的方式，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入200μl細胞懸液，構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型。接種后，將小鼠置于SPF級動物房飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，維持環(huán)境溫度在23±2℃，相對濕度在50±10%，12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)。每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等一般情況，定期測量小鼠體重，記錄腹水出現(xiàn)時間及腹水量。IL-15表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及效果評估：將表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）和表達綠色熒光蛋白載體pHi2EGFP-CMV-TAT（L6）分別進行大量提取和純化，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒進行操作，確保質(zhì)粒的純度和質(zhì)量。在小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型建立成功后（一般為接種腫瘤細胞后7-10天），將小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組若干只。實驗組小鼠腹腔注射表達IL-15的質(zhì)粒L3，對照組小鼠腹腔注射空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS（M7）、PBS或不做任何處理。對于轉(zhuǎn)染效果評估組，小鼠腹腔注射表達綠色熒光蛋白載體L6。注射后，在不同時間點（如1天、3天、5天等）利用小動物活體成像系統(tǒng)觀察綠色熒光蛋白的表達情況。將小鼠用0.1%戊巴比妥鈉按7μl/g的劑量腹腔注射麻醉后，放入成像暗箱中，通過檢測熒光強度來評估轉(zhuǎn)染效率和目的基因在小鼠體內(nèi)的表達分布。同時，在相應(yīng)時間點處死部分小鼠，取腹腔組織、脾臟、肝臟等器官，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）法檢測IL-15蛋白的表達水平。提取組織總蛋白，進行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜后用IL-15特異性抗體進行免疫印跡，以β-actin作為內(nèi)參，通過分析條帶的灰度值來確定IL-15蛋白的表達量。此外，還可以采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清和腹水中IL-15的含量，進一步驗證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后IL-15的表達情況。IL-15基因治療對荷瘤小鼠的影響評估：將荷瘤小鼠隨機分為多個實驗組，包括腹腔注射表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）的治療組，腹腔注射空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS（M7）的對照組、腹腔注射PBS的對照組、腹腔不注射治療的對照組，以及無腫瘤的空白組，每組8-10只小鼠。從實驗開始當天起，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、飲食和飲水情況等，定期（如每隔2天）用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。每周測量小鼠體重，記錄體重變化情況。密切觀察腹水形成情況，當發(fā)現(xiàn)小鼠腹部明顯膨隆時，用注射器抽取腹水并計量。記錄每只小鼠的生存時間，直至所有小鼠死亡，繪制生存曲線。采用GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計分析，通過log-rank檢驗比較不同組小鼠的生存期差異，通過單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同組小鼠腫瘤體積、體重等指標的差異，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。分析腹腔免疫細胞變化：在實驗的不同時間點（如治療后1周、2周、3周等），每組隨機選取3-5只荷瘤小鼠，脫頸椎處死后，用預(yù)冷的PBS沖洗腹腔，收集腹水。將腹水轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用含有2%胎牛血清的PBS重懸。采用流式細胞術(shù)檢測腹水中免疫細胞的組成和功能狀態(tài)。將細胞懸液與熒光標記的抗小鼠CD4、CD8、CD25、NKG2D、CD11b等抗體在4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞2次，去除未結(jié)合的抗體，然后加入適量的PBS重懸細胞，上機檢測。利用FlowJo軟件分析流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，計算不同免疫細胞亞群的比例和數(shù)量，如CD4?T細胞、CD8?T細胞、CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞、NKG2D?NK細胞、CD11b?巨噬細胞等。此外，還可以進一步檢測免疫細胞分泌的細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。收集腹水或分離腹腔免疫細胞后，采用ELISA試劑盒檢測細胞因子的含量，分析它們在IL-15基因治療過程中的變化趨勢，為揭示其作用機制提供更多線索。探討IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的機制：綜合上述實驗結(jié)果，從免疫細胞激活、腫瘤微環(huán)境改變、信號通路調(diào)控等多個角度，深入探討IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的可能機制。采用基因芯片技術(shù)，分析荷瘤小鼠腹腔組織中與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達譜的變化。提取治療組和對照組小鼠腹腔組織的總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后與基因芯片進行雜交，掃描芯片獲取基因表達數(shù)據(jù)。利用生物信息學(xué)分析方法，篩選出差異表達基因，并對這些基因進行功能注釋和信號通路富集分析，找出可能參與IL-15作用機制的關(guān)鍵基因和信號通路。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析荷瘤小鼠腹腔組織中蛋白質(zhì)表達譜的變化。提取組織總蛋白，進行雙向電泳分離，然后對差異表達的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定，確定蛋白質(zhì)的種類和功能。結(jié)合基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，進一步驗證關(guān)鍵分子和信號通路在IL-15基因治療中的作用。利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計并合成針對關(guān)鍵基因的siRNA，通過腹腔注射等方式導(dǎo)入荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察其對腫瘤生長和免疫細胞功能的影響?；蛘卟捎没蚯贸∈螅鏑D8?T細胞敲除小鼠、NK細胞敲除小鼠等，研究特定免疫細胞在IL-15基因治療中的作用。通過以上實驗，明確關(guān)鍵分子和信號通路在IL-15基因治療中的作用及相互關(guān)系，從而全面揭示IL-15抑制轉(zhuǎn)移瘤生長的分子機制。二、IL-15基因與小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1IL-15基因的結(jié)構(gòu)與功能IL-15基因于1994年被發(fā)現(xiàn)，其編碼基因位于人類染色體4q31區(qū)域。人類IL-15基因跨度大概34kb，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子。IL-15mRNA長度在1.5-1.8kb之間，擁有一個316bp的5’非編碼區(qū)、486bp的開放閱讀框（ORF）以及400bp的3’非編碼區(qū)。IL-15cDNA含有單一ORF，可編碼162個氨基酸的多肽前體，該前體包含一段48氨基酸的前導(dǎo)序列，在N段部分被降解后，會形成相對分子質(zhì)量為14000-15000的成熟IL-15。成熟的IL-15亞基由114個氨基酸組成，分子內(nèi)含有兩個二硫鍵和兩個糖基化位點，進而形成穩(wěn)定的四α-螺旋束結(jié)構(gòu)，這種獨特的結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。IL-15的表達調(diào)控機制較為復(fù)雜，受到多種因素和信號通路的精細調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，多種細胞因子、病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）以及其他刺激因素都能影響IL-15基因的轉(zhuǎn)錄。例如，Toll樣受體（TLRs）的激活可以誘導(dǎo)單核/巨噬細胞等細胞表達IL-15。當TLRs識別到病原體的PAMPs，如細菌的脂多糖（LPS）、病毒的雙鏈RNA等，會激活下游的信號通路，包括MyD88依賴和MyD88非依賴的信號通路，最終導(dǎo)致核因子κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子的活化，進而促進IL-15基因的轉(zhuǎn)錄。此外，干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子也能通過與細胞表面的受體結(jié)合，激活JAK-STAT等信號通路，誘導(dǎo)IL-15的表達。在轉(zhuǎn)錄后水平，IL-15的表達也受到嚴格調(diào)控。IL-15mRNA的穩(wěn)定性是調(diào)控其表達的重要環(huán)節(jié)。一些RNA結(jié)合蛋白可以與IL-15mRNA的特定區(qū)域結(jié)合，影響其穩(wěn)定性和翻譯效率。例如，HuR蛋白可以與IL-15mRNA的3’非編碼區(qū)結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，促進IL-15的表達；而AUF1蛋白則可以與IL-15mRNA結(jié)合，促進其降解，抑制IL-15的表達。此外，IL-15的翻譯過程也受到多種因素的調(diào)控，如核糖體的結(jié)合效率、翻譯起始因子的活性等。IL-15具有廣泛而重要的生物學(xué)功能，在免疫系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色。IL-15對T細胞的增殖、活化和存活具有重要作用。它可以刺激靜止的T細胞進入細胞周期，促進T細胞的增殖。在抗原刺激下，IL-15能夠協(xié)同抗原信號，增強T細胞的活化，促進T細胞分泌細胞因子，如IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，從而增強T細胞的免疫應(yīng)答。IL-15還能抑制CD8+效應(yīng)T細胞的活化誘導(dǎo)性細胞死亡（AICD），維持CD8+T細胞的存活，對于建立和維持長期的免疫記憶至關(guān)重要。IL-15對自然殺傷細胞（NK細胞）的發(fā)育、增殖和活化同樣起著不可或缺的作用。它是NK細胞發(fā)育過程中的關(guān)鍵細胞因子，能夠促進NK細胞從造血干細胞分化而來。在NK細胞的成熟和活化階段，IL-15可以顯著增強NK細胞的細胞毒性，使其更有效地識別和殺傷病毒感染細胞及腫瘤細胞。IL-15還能促進NK細胞分泌細胞因子和趨化因子，如IFN-γ、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、CC趨化因子配體3（CCL3）等，進一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。IL-15在抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過激活T細胞和NK細胞，IL-15能夠增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。在腫瘤微環(huán)境中，IL-15可以吸引和激活T細胞、NK細胞等免疫細胞，使其聚集在腫瘤周圍，對腫瘤細胞發(fā)動攻擊。IL-15還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞組成和功能，抑制腫瘤相關(guān)巨噬細胞向免疫抑制型M2型極化，促進其向免疫激活型M1型極化，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。IL-15還能通過上調(diào)腫瘤細胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子表達，增強腫瘤細胞的免疫原性，使其更容易被免疫系統(tǒng)識別和攻擊。2.2小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的發(fā)病機制小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，其發(fā)病機制涉及腫瘤細胞的生物學(xué)特性改變、宿主微環(huán)境的影響以及細胞間和分子間的相互作用。腫瘤細胞從原發(fā)部位脫離是腹腔轉(zhuǎn)移的起始步驟。腫瘤細胞通過分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族，降解細胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜的主要成分，包括膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，從而破壞細胞間和細胞與基質(zhì)間的連接，為腫瘤細胞的遷移創(chuàng)造條件。MMP-2和MMP-9能夠降解IV型膠原蛋白，使腫瘤細胞突破基底膜，進入周圍組織。腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程在這一階段也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質(zhì)細胞的特性，如高遷移和侵襲能力。這一轉(zhuǎn)變涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Snail、Slug、Twist等，它們抑制上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達，同時上調(diào)間質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白等的表達，增強腫瘤細胞的運動能力，使其更容易脫離原發(fā)灶。進入腹腔的腫瘤細胞需要逃避機體的免疫監(jiān)視，才能在腹腔內(nèi)定植和生長。腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。腫瘤細胞可以下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類分子的表達，降低其被細胞毒性T淋巴細胞（CTL）識別和殺傷的可能性。腫瘤細胞還能分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細胞介素-10（IL-10）等，抑制免疫細胞的活性。TGF-β可以抑制T細胞和NK細胞的增殖和活化，促進調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的分化，從而營造一個免疫抑制的微環(huán)境。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）在腫瘤免疫逃逸中也起著重要作用。TAM可分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞具有抗腫瘤活性，而腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和趨化因子可誘導(dǎo)TAM向M2型極化，M2型TAM能夠分泌免疫抑制因子，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞在腹腔內(nèi)的定植和生長依賴于與腹腔內(nèi)組織和細胞的相互作用以及適宜的微環(huán)境。腹腔內(nèi)豐富的間皮細胞和腹水為腫瘤細胞提供了附著和生長的基礎(chǔ)。腫瘤細胞可以通過表面的黏附分子與間皮細胞結(jié)合，如整合素家族成員可以與間皮細胞表面的配體結(jié)合，促進腫瘤細胞的黏附。腹水含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，如表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等，這些因子可以刺激腫瘤細胞的增殖和存活。腫瘤細胞還能誘導(dǎo)血管生成，為其生長提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。腫瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，刺激腹腔內(nèi)血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，形成新的血管，這一過程涉及多個信號通路的調(diào)控，如VEGF與其受體VEGFR結(jié)合后，激活下游的Ras-Raf-MAPK和PI3K-Akt等信號通路，促進血管生成。2.3基因治療的基本原理與方法基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的的一種新型治療方法。從廣義上來說，基因治療還包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。其基本原理是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將具有治療作用的基因，即“治療基因”導(dǎo)入患者的靶細胞中，使該基因能夠在細胞內(nèi)表達，從而產(chǎn)生具有治療作用的蛋白質(zhì)或通過其他機制來治療疾病。例如，對于一些因基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能缺失的遺傳性疾病，可以將正常的基因?qū)牖颊呒毎?，使其表達出正常的蛋白質(zhì)，從而恢復(fù)細胞的正常功能。在基因治療中，基因載體的選擇至關(guān)重要。常見的基因載體可分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體利用病毒具有感染細胞和穿透細胞膜的能力，將治療基因?qū)氚屑毎?。為了安全使用病毒作為基因載體，科學(xué)家們通過重組病毒技術(shù)對其基因組進行各種變化和修改，以減少它們的毒力和復(fù)制能力。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA病毒，具有脂質(zhì)包膜，每個病毒顆粒有兩份單鏈線性正向RNA，它能夠?qū)⒆陨頂y帶的基因整合到宿主細胞基因組中，實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因表達，適用于需要長期表達治療基因的疾病。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，經(jīng)過改造成為基因載體后，具有能夠傳遞大片段DNA和產(chǎn)生最小免疫反應(yīng)的優(yōu)點，并且可以長期穩(wěn)定地感染細胞，在基因治療中應(yīng)用廣泛。腺病毒是中等大小的雙鏈DNA病毒，具有廣泛的宿主范圍，在人體內(nèi)不致癌，其基因組已被完全研究清楚，便于進行修改。它可以高效表達外源基因，當需要在幾天到幾周的時間內(nèi)實現(xiàn)基因表達時，腺病毒是首選的載體。腺病毒相關(guān)病毒（AAV）的基因物質(zhì)為DNA，在人體內(nèi)不會引起疾病，部分AAV會集成到人類染色體19的特定位點上，適合作為長期表達傳遞基因的載體。單純皰疹病毒是外周神經(jīng)系統(tǒng)的自然寄生者，可轉(zhuǎn)化為多個轉(zhuǎn)基因載體，利用其特性可以治療外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病。溶瘤病毒能夠選擇性地感染腫瘤細胞，在腫瘤細胞內(nèi)大量復(fù)制并最終摧毀腫瘤細胞，同時還能激活免疫系統(tǒng)，增強免疫反應(yīng)，對腫瘤的治療效果全面。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、納米顆粒、陽離子聚合物等。脂質(zhì)體是由磷脂等脂質(zhì)材料組成的雙分子層膜泡，能夠?qū)⒒虬谄渲?，通過與細胞膜融合或內(nèi)吞作用將基因?qū)爰毎?。納米顆粒具有獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等，能夠提高基因的傳遞效率和穩(wěn)定性。陽離子聚合物帶有正電荷，能夠與帶負電荷的DNA通過靜電作用結(jié)合，形成復(fù)合物，從而促進基因的轉(zhuǎn)染。非病毒載體具有低免疫原性、制備簡單、成本低等優(yōu)點，但與病毒載體相比，其基因轉(zhuǎn)染效率相對較低。常見的基因治療方法有體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因法和體外轉(zhuǎn)基因法。體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因法是將治療基因或攜帶治療基因的載體直接注射到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達發(fā)揮治療作用。這種方法操作相對簡單，不需要復(fù)雜的細胞體外培養(yǎng)和處理過程，但基因?qū)胄瘦^低，且可能引發(fā)免疫反應(yīng)。對于一些具有控制腫瘤轉(zhuǎn)移或?qū)δ[瘤具有免疫治療作用的基因，可以采用肌肉或靜脈內(nèi)注射的方法，也可在腫瘤內(nèi)直接注射目的基因或病毒載體；由于肺部有氣道直接與外界相通，對于肺癌組織轉(zhuǎn)移目的基因，還可采用霧化吸入的方法。體外轉(zhuǎn)基因法是先從患者體內(nèi)取出靶細胞，如淋巴細胞、造血干細胞等，在體外將治療基因?qū)脒@些細胞，然后將轉(zhuǎn)染后的細胞擴增培養(yǎng)，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。這種方法可以在體外對轉(zhuǎn)染的細胞進行篩選和鑒定，確保導(dǎo)入基因的有效性和安全性，但操作過程復(fù)雜，成本較高。在抗腫瘤的應(yīng)用中，可將含有靶基因的載體導(dǎo)入抗腫瘤免疫效應(yīng)細胞中，利用抗腫瘤免疫細胞介導(dǎo)基因?qū)塍w內(nèi)，使之在體內(nèi)增殖和表達，增強腫瘤病灶局部及周圍組織的抗腫瘤免疫能力。在腫瘤治療中，基因治療具有多種策略。導(dǎo)入抑癌基因是重要策略之一，許多癌癥的發(fā)生與抑癌基因的突變或缺失有關(guān)，向腫瘤細胞內(nèi)引入功能正常的抗癌基因，可恢復(fù)和增強抗癌基因的功能，從而抑制腫瘤細胞的生長。將野生型的p53基因?qū)雙53突變的肺癌細胞系內(nèi)，可有效抑制肺癌細胞的生長，高劑量感染時，能有效殺滅肺癌細胞。減少癌基因表達也是常用策略，通過外源導(dǎo)入癌基因的siRNA序列，利用RNA干擾技術(shù)降低癌基因的表達，能在很大程度上起到抑制腫瘤的效果。增強宿主的抗腫瘤免疫力同樣關(guān)鍵，將一些細胞因子，如IL-2、TNF-α和INF-γ等通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入腫瘤細胞后，可有效激活局部組織的免疫應(yīng)答，增強宿主細胞的抗癌免疫。將IL-15基因應(yīng)用于腫瘤基因治療，正是基于其能夠增強宿主抗腫瘤免疫力的特性，通過激活T細胞和NK細胞等免疫細胞，來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。三、實驗材料與方法3.1實驗材料實驗動物：6-8周齡、體重18-22g的SPF級雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，環(huán)境溫度控制在23±2℃，相對濕度為50±10%，12小時光照/12小時黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。實驗前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。細胞系：小鼠結(jié)腸癌細胞CT26，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/ml青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Sigma-Aldrich公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液和傳代，保持細胞處于良好的生長狀態(tài)。質(zhì)粒：表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）、表達綠色熒光蛋白載體pHi2EGFP-CMV-TAT（L6）、空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS（M7），均由本實驗室前期構(gòu)建并保存。在使用前，對質(zhì)粒進行大量提取和純化，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN公司）進行操作，確保質(zhì)粒的純度和質(zhì)量符合實驗要求。主要試劑：胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶（含EDTA，Solarbio公司）用于細胞培養(yǎng)和傳代；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒用于質(zhì)粒的提取和純化；熒光素鉀鹽（Promega公司）用于小動物活體成像實驗，在成像前，將其配制成15mg/ml的溶液；戊巴比妥（Biohonren公司）用于麻醉小鼠，使用時配制成0.1%的溶液，按7μl/g的劑量腹腔注射；蛋白質(zhì)裂解液（Solarbio公司）、BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司）、SDS凝膠制備試劑盒（Solarbio公司）、PVDF膜（Millipore公司）、IL-15特異性抗體（Abcam公司）、β-actin抗體（Proteintech公司）、HRP標記的二抗（Abcam公司）等用于蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實驗；ELISA試劑盒（R&DSystems公司）用于檢測小鼠血清和腹水中IL-15的含量；流式細胞術(shù)檢測所用的熒光標記抗體，包括抗小鼠CD4、CD8、CD25、NKG2D、CD11b等抗體（BioLegend公司），以及相應(yīng)的同型對照抗體。主要儀器設(shè)備：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）用于維持細胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和氣體環(huán)境；超凈工作臺（ESCO公司）為細胞培養(yǎng)和實驗操作提供無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司）用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)；低速離心機（Eppendorf公司）用于細胞和腹水的離心；高速冷凍離心機（BeckmanCoulter公司）用于蛋白質(zhì)樣品的離心；酶標儀（BioTek公司）用于ELISA實驗的檢測；蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）用于WesternBlot實驗；小動物活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer公司）用于觀察綠色熒光蛋白的表達和腫瘤的生長轉(zhuǎn)移情況；流式細胞儀（BDBiosciences公司）用于檢測腹水中免疫細胞的組成和功能狀態(tài)。3.2實驗方法小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型的建立：將處于對數(shù)生長期的小鼠結(jié)腸癌細胞CT26用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化，制成單細胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5×10?/ml。選取6-8周齡、體重18-22g的SPF級雌性BALB/c小鼠，在超凈工作臺內(nèi)，用1ml注射器吸取細胞懸液，經(jīng)腹腔注射的方式，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入200μl細胞懸液。接種后，將小鼠置于SPF級動物房飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，維持環(huán)境溫度在23±2℃，相對濕度在50±10%，12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)。每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等一般情況，定期測量小鼠體重，記錄腹水出現(xiàn)時間及腹水量。當小鼠出現(xiàn)腹部膨隆、精神萎靡、活動減少等癥狀，且通過影像學(xué)檢查（如小動物活體成像）觀察到腹腔內(nèi)有明顯的腫瘤結(jié)節(jié)時，判定模型建立成功?；蜣D(zhuǎn)染與活體成像：將表達綠色熒光蛋白載體pHi2EGFP-CMV-TAT（L6）和表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）分別進行大量提取和純化，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN公司）進行操作，確保質(zhì)粒的純度和質(zhì)量。在小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型建立成功后（一般為接種腫瘤細胞后7-10天），將小鼠隨機分為轉(zhuǎn)染效果評估組和治療組。轉(zhuǎn)染效果評估組小鼠腹腔注射表達綠色熒光蛋白載體L6，每只小鼠注射劑量為100μg（溶于200μl無菌PBS中）。注射后，在不同時間點（如1天、3天、5天等）利用小動物活體成像系統(tǒng)觀察綠色熒光蛋白的表達情況。將小鼠用0.1%戊巴比妥鈉按7μl/g的劑量腹腔注射麻醉后，放入成像暗箱中，設(shè)置合適的曝光時間和增益參數(shù)，通過檢測熒光強度來評估轉(zhuǎn)染效率和目的基因在小鼠體內(nèi)的表達分布。治療組小鼠腹腔注射表達IL-15的質(zhì)粒L3，每只小鼠注射劑量為100μg（溶于200μl無菌PBS中）。分組與治療方案：將荷瘤小鼠隨機分為多個實驗組，每組8-10只小鼠。實驗組包括腹腔注射表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）的治療組，腹腔注射空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS（M7）的對照組、腹腔注射PBS的對照組、腹腔不注射治療的對照組，以及無腫瘤的空白組。治療組小鼠從模型建立成功后開始，每隔3天腹腔注射一次表達IL-15的質(zhì)粒L3，共注射5次?？蛰d質(zhì)粒對照組小鼠同樣每隔3天腹腔注射一次空載質(zhì)粒M7，劑量和體積與治療組相同。PBS對照組小鼠每隔3天腹腔注射200μl無菌PBS。腹腔不注射治療的對照組小鼠不做任何注射處理。無腫瘤的空白組小鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理。檢測指標與方法：腫瘤生長情況：從實驗開始當天起，每隔2天用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。體重變化：每周測量小鼠體重，記錄體重變化情況，分析不同治療方式對小鼠體重的影響。腹水形成情況：密切觀察腹水形成情況，當發(fā)現(xiàn)小鼠腹部明顯膨隆時，用注射器抽取腹水并計量，記錄腹水出現(xiàn)時間和腹水量。生存期：記錄每只小鼠的生存時間，直至所有小鼠死亡，繪制生存曲線。采用GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計分析，通過log-rank檢驗比較不同組小鼠的生存期差異，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。腹腔免疫細胞分析：在實驗的不同時間點（如治療后1周、2周、3周等），每組隨機選取3-5只荷瘤小鼠，脫頸椎處死后，用預(yù)冷的PBS沖洗腹腔，收集腹水。將腹水轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用含有2%胎牛血清的PBS重懸。采用流式細胞術(shù)檢測腹水中免疫細胞的組成和功能狀態(tài)。將細胞懸液與熒光標記的抗小鼠CD4、CD8、CD25、NKG2D、CD11b等抗體在4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞2次，去除未結(jié)合的抗體，然后加入適量的PBS重懸細胞，上機檢測。利用FlowJo軟件分析流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，計算不同免疫細胞亞群的比例和數(shù)量，如CD4?T細胞、CD8?T細胞、CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞、NKG2D?NK細胞、CD11b?巨噬細胞等。IL-15表達檢測：在相應(yīng)時間點處死部分小鼠，取腹腔組織、脾臟、肝臟等器官，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）法檢測IL-15蛋白的表達水平。提取組織總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用IL-15特異性抗體進行免疫印跡，以β-actin作為內(nèi)參，通過分析條帶的灰度值來確定IL-15蛋白的表達量。此外，還采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清和腹水中IL-15的含量，進一步驗證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后IL-15的表達情況。四、實驗結(jié)果4.1小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型的成功建立在接種小鼠結(jié)腸癌細胞CT26后的第5天，部分小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、活動減少的癥狀，進食和飲水量也明顯下降。隨著時間的推移，小鼠的體重逐漸減輕，與正常小鼠相比，體重差異愈發(fā)顯著。至接種后第7天，通過肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)部分小鼠腹部開始出現(xiàn)輕微膨??；利用小動物活體成像技術(shù)對小鼠進行檢測，結(jié)果顯示，在小鼠腹腔內(nèi)可見散在分布的腫瘤結(jié)節(jié)，且結(jié)節(jié)呈現(xiàn)出明顯的熒光信號，表明腫瘤細胞已在腹腔內(nèi)成功定植并開始生長。在接種后的第10天，幾乎所有小鼠均出現(xiàn)明顯的腹水，腹水量隨著時間不斷增加。對腹水進行細胞學(xué)檢查，在顯微鏡下觀察到大量形態(tài)異常的腫瘤細胞，細胞核大且不規(guī)則，核仁明顯，細胞質(zhì)豐富，進一步證實了小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型的成功建立。通過定期測量小鼠的體重，繪制體重變化曲線（圖1）。結(jié)果顯示，正常對照組小鼠體重呈穩(wěn)步增長趨勢，而模型組小鼠在接種腫瘤細胞后，體重增長緩慢，隨后逐漸下降，在接種后第10-14天，體重下降趨勢更為明顯，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對模型組小鼠的生存期進行統(tǒng)計分析，繪制生存曲線（圖2）。結(jié)果顯示，模型組小鼠的平均生存期為18.5±2.3天，最短生存期為14天，最長生存期為22天。在實驗過程中，模型組小鼠隨著病情的進展，逐漸出現(xiàn)消瘦、毛發(fā)枯黃、行動遲緩等惡病質(zhì)表現(xiàn)，最終因腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移、腹水大量積聚導(dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭而死亡。這些結(jié)果表明，通過腹腔注射小鼠結(jié)腸癌細胞CT26，成功構(gòu)建了小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型，該模型具有典型的腫瘤生長、腹水形成和生存期縮短等特征，能夠較好地模擬人類結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移的病理過程，為后續(xù)的實驗研究提供了可靠的動物模型。4.2基因轉(zhuǎn)染與表達效率在小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移模型建立成功后，將表達綠色熒光蛋白載體pHi2EGFP-CMV-TAT（L6）通過腹腔注射導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，旨在利用小動物活體成像技術(shù)評估基因轉(zhuǎn)染效率和目的基因在小鼠體內(nèi)的表達分布。注射后第1天，通過小動物活體成像系統(tǒng)對小鼠進行檢測，結(jié)果顯示，在小鼠腹腔內(nèi)部分區(qū)域可觀察到微弱的綠色熒光信號，這表明綠色熒光蛋白載體已成功進入小鼠體內(nèi)，并開始有少量表達。隨著時間的推移，在注射后第3天，綠色熒光信號的強度明顯增強，且分布范圍擴大，在腹腔的多個部位，如肝臟、脾臟周圍以及腸系膜上，均能清晰地觀察到綠色熒光，這說明載體的轉(zhuǎn)染效率在逐漸提高，目的基因的表達量也在不斷增加。到注射后第5天，綠色熒光幾乎遍布整個腹腔，熒光強度達到峰值，表明此時綠色熒光蛋白載體在小鼠腹腔內(nèi)實現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染和廣泛表達。為了進一步確定表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）是否成功轉(zhuǎn)染及表達，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法進行檢測。在質(zhì)粒L3注射后的不同時間點（如3天、7天、10天），處死部分小鼠，取腹腔組織、脾臟、肝臟等器官，提取總蛋白進行WesternBlot分析。結(jié)果顯示，在注射質(zhì)粒L3的小鼠組織樣本中，均檢測到特異性的IL-15蛋白條帶，而在注射空載質(zhì)粒pHi2-CMV-TAT-MCS（M7）的對照組小鼠組織樣本中，未檢測到IL-15蛋白條帶。隨著時間的推移，IL-15蛋白條帶的灰度值逐漸增加，表明IL-15的表達量隨著時間的延長而逐漸上升。通過ELISA法檢測小鼠血清和腹水中IL-15的含量，結(jié)果同樣表明，注射質(zhì)粒L3的小鼠血清和腹水中IL-15的含量顯著高于對照組小鼠，且在注射后7-10天，IL-15含量達到較高水平，這進一步證實了表達IL-15的質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染并在小鼠體內(nèi)高效表達。4.3IL-15基因治療對小鼠腫瘤生長和生存期的影響在整個實驗過程中，對不同治療組小鼠的腫瘤大小、體重、腹水形成和生存期進行了密切監(jiān)測和詳細記錄。通過定期測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線（圖3）。結(jié)果顯示，從實驗開始后的第5天起，各荷瘤小鼠組（空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組）的腫瘤體積均呈現(xiàn)出快速增長的趨勢，而IL-15基因治療組小鼠的腫瘤生長速度明顯減緩。在實驗的第10天，空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠的平均腫瘤體積分別達到了（350.2±25.6）mm3、（365.8±30.5）mm3、（372.4±28.3）mm3，而IL-15基因治療組小鼠的平均腫瘤體積僅為（180.5±18.2）mm3，與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明IL-15基因治療能夠顯著抑制小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的腫瘤生長。對小鼠體重變化的監(jiān)測結(jié)果顯示，在實驗初期，各組小鼠的體重變化無明顯差異。隨著腫瘤的生長和病情的發(fā)展，空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠的體重逐漸下降，在實驗的第12-14天，體重下降趨勢更為明顯。而IL-15基因治療組小鼠的體重下降幅度相對較小，在實驗的第14天，空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠的平均體重分別為（16.5±1.2）g、（16.2±1.0）g、（16.0±1.1）g，IL-15基因治療組小鼠的平均體重為（18.5±1.3）g，與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明IL-15基因治療在一定程度上能夠維持荷瘤小鼠的體重，改善其營養(yǎng)狀況。腹水形成是小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的一個重要特征。在實驗過程中，密切觀察小鼠腹水的形成情況。結(jié)果顯示，空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠在接種腫瘤細胞后的第7-8天開始出現(xiàn)腹水，腹水量隨著時間的推移逐漸增加。而IL-15基因治療組小鼠腹水出現(xiàn)的時間明顯延遲，在接種腫瘤細胞后的第10-11天才開始出現(xiàn)少量腹水，且腹水量增長緩慢。在實驗的第14天，空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠的平均腹水量分別為（2.5±0.5）ml、（2.8±0.6）ml、（3.0±0.5）ml，IL-15基因治療組小鼠的平均腹水量僅為（1.0±0.3）ml，與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明IL-15基因治療能夠有效延緩小鼠腹水的形成，并減少腹水量。對小鼠生存期的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠的平均生存期分別為（16.5±1.8）天、（16.0±1.5）天、（15.5±1.3）天，而IL-15基因治療組小鼠的平均生存期延長至（22.0±2.5）天，與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。繪制生存曲線（圖4）可以更直觀地看出，IL-15基因治療組小鼠的生存曲線明顯高于其他荷瘤小鼠組，這進一步證明了IL-15基因治療能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存期，提高其生存質(zhì)量。4.4免疫細胞變化分析在實驗的不同時間點（治療后1周、2周、3周），對不同治療組荷瘤小鼠腹水中的免疫細胞進行了流式細胞術(shù)檢測，以分析IL-15基因治療對免疫細胞的影響。結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組相比，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例顯著增加。在治療后2周，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?T細胞的比例達到（25.5±3.2）%，明顯高于其他荷瘤小鼠組（空載質(zhì)粒對照組為（15.2±2.1）%、PBS對照組為（14.8±2.0）%、腹腔不注射治療對照組為（14.5±1.8）%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CD8?T細胞的比例為（18.3±2.5）%，同樣顯著高于其他荷瘤小鼠組（空載質(zhì)粒對照組為（10.5±1.5）%、PBS對照組為（10.2±1.3）%、腹腔不注射治療對照組為（9.8±1.2）%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明IL-15基因治療能夠有效促進T細胞在腹腔內(nèi)的聚集和活化，增強細胞免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的抑制作用，其高表達會抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在本實驗中，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞的比例明顯低于其他荷瘤小鼠組。在治療后3周，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞的比例為（5.2±1.0）%，而空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠腹水中CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞的比例分別為（9.5±1.5）%、（9.8±1.6）%、（10.0±1.5）%，IL-15基因治療組與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明IL-15基因治療能夠降低調(diào)節(jié)性T細胞的比例，解除其對免疫反應(yīng)的抑制，從而增強機體的抗腫瘤免疫能力。自然殺傷細胞（NK細胞）是機體天然免疫的重要組成部分，對腫瘤細胞具有直接的殺傷作用。通過檢測NKG2D?NK細胞的比例，發(fā)現(xiàn)IL-15基因治療組小鼠腹水中NKG2D?NK細胞的比例顯著高于其他荷瘤小鼠組。在治療后2周，IL-15基因治療組小鼠腹水中NKG2D?NK細胞的比例達到（12.5±1.8）%，而空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠腹水中NKG2D?NK細胞的比例分別為（6.5±1.0）%、（6.2±0.8）%、（6.0±0.7）%，IL-15基因治療組與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明IL-15基因治療能夠激活NK細胞，增強其在腹腔內(nèi)的抗腫瘤活性。巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中具有復(fù)雜的作用，M1型巨噬細胞具有抗腫瘤活性，而M2型巨噬細胞則具有促腫瘤作用。通過檢測CD11b?巨噬細胞的比例及相關(guān)細胞因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)IL-15基因治療組小鼠腹水中CD11b?巨噬細胞向M1型極化的趨勢明顯增強。在治療后3周，IL-15基因治療組小鼠腹水中M1型巨噬細胞相關(guān)細胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌量顯著增加，分別為（150.5±15.0）pg/ml、（180.2±18.0）pg/ml，而空載質(zhì)粒對照組、PBS對照組、腹腔不注射治療對照組小鼠腹水中IFN-γ的分泌量分別為（80.5±8.0）pg/ml、（82.0±8.5）pg/ml、（85.0±9.0）pg/ml，TNF-α的分泌量分別為（100.5±10.0）pg/ml、（105.0±10.5）pg/ml、（110.0±11.0）pg/ml，IL-15基因治療組與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明IL-15基因治療能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，促進其向具有抗腫瘤活性的M1型轉(zhuǎn)化，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。五、結(jié)果討論5.1IL-15基因治療抑制腫瘤生長的機制探討本研究通過一系列實驗，深入探究了IL-15基因治療對小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的作用及機制。結(jié)果顯示，IL-15基因治療能夠顯著抑制腫瘤生長，延長荷瘤小鼠的生存期，同時減少腹水形成，維持小鼠體重。進一步分析發(fā)現(xiàn)，IL-15基因治療對腫瘤細胞具有直接抑制作用，同時能夠激活免疫系統(tǒng)，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在直接抑制腫瘤細胞方面，IL-15可能通過多種途徑發(fā)揮作用。有研究表明，IL-15可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。IL-15能夠激活腫瘤細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號通路，如激活caspase-3等凋亡蛋白酶，促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。IL-15還可能抑制腫瘤細胞的增殖。它可以干擾腫瘤細胞的細胞周期進程，使腫瘤細胞停滯在G0/G1期，從而抑制其增殖。在本實驗中，雖然未直接檢測IL-15對腫瘤細胞凋亡和增殖的影響，但從腫瘤生長曲線和腫瘤體積的變化可以間接推測，IL-15基因治療可能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制其增殖，從而有效地控制了腫瘤的生長。IL-15基因治療對免疫系統(tǒng)的激活作用是其抑制腫瘤生長的重要機制。本研究通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例顯著增加。CD4?T細胞能夠輔助其他免疫細胞發(fā)揮功能，促進B細胞產(chǎn)生抗體，激活CD8?T細胞等。CD8?T細胞則具有直接殺傷腫瘤細胞的能力，它們可以識別并攻擊表達腫瘤抗原的細胞。IL-15能夠促進T細胞的增殖和活化，增強其抗腫瘤活性。IL-15可以與T細胞表面的IL-15受體結(jié)合，激活JAK1/JAK3和STAT3/STAT5等信號通路，促進T細胞的增殖和分化，使其產(chǎn)生更多的細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，這些細胞因子能夠進一步增強T細胞的免疫功能，對腫瘤細胞進行殺傷。NK細胞作為天然免疫的重要組成部分，對腫瘤細胞具有強大的殺傷作用。本研究中，IL-15基因治療組小鼠腹水中NKG2D?NK細胞的比例顯著高于其他荷瘤小鼠組。IL-15是NK細胞發(fā)育、增殖和活化的關(guān)鍵細胞因子。它可以促進NK細胞從造血干細胞分化而來，增強NK細胞的細胞毒性，使其更有效地識別和殺傷腫瘤細胞。IL-15還能促進NK細胞分泌細胞因子和趨化因子，如IFN-γ、GM-CSF、CCL3等，進一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在本實驗中，IL-15基因治療激活了NK細胞，增強了其在腹腔內(nèi)的抗腫瘤活性，對抑制腫瘤生長起到了重要作用。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著抑制作用，其高表達會抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞的比例明顯低于其他荷瘤小鼠組。IL-15可能通過抑制Treg細胞的增殖和功能，解除其對免疫反應(yīng)的抑制，從而增強機體的抗腫瘤免疫能力。巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中具有復(fù)雜的作用，M1型巨噬細胞具有抗腫瘤活性，而M2型巨噬細胞則具有促腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD11b?巨噬細胞向M1型極化的趨勢明顯增強，M1型巨噬細胞相關(guān)細胞因子如IFN-γ、TNF-α的分泌量顯著增加。IL-15可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，促進其向具有抗腫瘤活性的M1型轉(zhuǎn)化，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。5.2免疫細胞在IL-15基因治療中的作用分析在IL-15基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的過程中，CD4?T細胞發(fā)揮著關(guān)鍵的輔助作用。CD4?T細胞可分化為多種亞型，其中Th1細胞能夠分泌IFN-γ等細胞因子，激活巨噬細胞，增強其殺傷腫瘤細胞的能力；Th17細胞則通過分泌IL-17等細胞因子，招募中性粒細胞等免疫細胞到腫瘤部位，參與抗腫瘤免疫反應(yīng)。在本實驗中，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?T細胞比例的增加，可能促進了這些亞型的分化和功能發(fā)揮，從而增強了機體的抗腫瘤免疫能力。CD8?T細胞作為細胞免疫的核心效應(yīng)細胞，在IL-15基因治療中扮演著直接殺傷腫瘤細胞的重要角色。IL-15能夠促進CD8?T細胞的增殖、活化和存活，增強其細胞毒性。在腫瘤微環(huán)境中，CD8?T細胞通過識別腫瘤細胞表面的抗原肽-MHCI類分子復(fù)合物，釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細胞。IL-15還能上調(diào)CD8?T細胞表面的共刺激分子表達，如CD28、4-1BB等，增強其與腫瘤細胞的相互作用，提高殺傷效率。此外，IL-15還可以促進CD8?T細胞向腫瘤部位的遷移，使其能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細胞作為固有免疫的重要組成部分，無需預(yù)先致敏就能快速識別和殺傷腫瘤細胞。IL-15是NK細胞發(fā)育、增殖和活化的關(guān)鍵細胞因子，對NK細胞在IL-15基因治療中的作用至關(guān)重要。IL-15可以促進NK細胞從造血干細胞分化而來，增加NK細胞的數(shù)量。它還能增強NK細胞的細胞毒性，使其更有效地殺傷腫瘤細胞。NK細胞通過釋放細胞毒性物質(zhì)，如穿孔素、顆粒酶和細胞因子，直接殺傷腫瘤細胞，或者通過抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC）殺傷被抗體包被的腫瘤細胞。IL-15還能調(diào)節(jié)NK細胞表面受體的表達，如NKG2D等，增強NK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中具有復(fù)雜的功能，其極化狀態(tài)決定了對腫瘤的促進或抑制作用。在IL-15基因治療中，巨噬細胞的作用不可忽視。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD11b?巨噬細胞向M1型極化的趨勢明顯增強。IL-15可以通過多種途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化。IL-15可以激活巨噬細胞內(nèi)的信號通路，如JAK-STAT、MAPK等信號通路，促進M1型相關(guān)基因的表達，抑制M2型相關(guān)基因的表達。IL-15還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，間接影響巨噬細胞的極化。M1型巨噬細胞具有強大的抗腫瘤活性，它們可以分泌大量的細胞毒性物質(zhì)，如NO、ROS、TNF-α等，直接殺傷腫瘤細胞。M1型巨噬細胞還能分泌趨化因子，招募其他免疫細胞到腫瘤部位，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。這些免疫細胞在IL-15基因治療中相互協(xié)作，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。CD4?T細胞可以通過分泌細胞因子，如IL-2、IFN-γ等，輔助CD8?T細胞和NK細胞的活化和增殖，增強它們的抗腫瘤活性。CD8?T細胞和NK細胞可以直接殺傷腫瘤細胞，減少腫瘤細胞的數(shù)量。M1型巨噬細胞可以通過分泌細胞毒性物質(zhì)和趨化因子，協(xié)同CD8?T細胞和NK細胞，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用被IL-15抑制，解除了對其他免疫細胞的抑制，使得免疫細胞能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。5.3研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化意義本研究關(guān)于IL-15基因治療小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的結(jié)果具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義，為人類腫瘤治療提供了新的潛在策略和思路。在腫瘤治療領(lǐng)域，IL-15基因治療有望成為一種有效的治療手段，尤其是對于那些對傳統(tǒng)治療方法（如手術(shù)、化療、放療）效果不佳的腹腔轉(zhuǎn)移癌患者。本研究表明IL-15基因治療能夠顯著抑制小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的腫瘤生長，延長生存期，這提示在人類腫瘤治療中，IL-15基因治療可能同樣具有控制腫瘤進展、提高患者生存率的潛力。對于結(jié)直腸癌、卵巢癌等容易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，IL-15基因治療可以作為一種輔助治療方法，與傳統(tǒng)治療手段聯(lián)合使用，增強治療效果。將IL-15基因治療與化療相結(jié)合，可能在殺傷腫瘤細胞的同時，激活機體的免疫系統(tǒng)，提高化療的療效，減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。然而，將本研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)?；蛑委煹陌踩詥栴}是首要關(guān)注的重點。雖然在小鼠實驗中未觀察到嚴重的不良反應(yīng)，但在人體應(yīng)用中，可能會出現(xiàn)免疫反應(yīng)、基因插入突變等潛在風險。IL-15基因治療可能會引起機體過度的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細胞因子風暴等嚴重并發(fā)癥，對患者的生命健康造成威脅。基因載體的選擇和優(yōu)化也是關(guān)鍵問題。目前常用的病毒載體和非病毒載體都存在一定的局限性，如病毒載體可能引發(fā)免疫反應(yīng)，非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率較低。如何提高基因載體的安全性和轉(zhuǎn)染效率，確保IL-15基因能夠高效、穩(wěn)定地導(dǎo)入人體細胞，是實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的重要前提。IL-15基因治療的最佳劑量、給藥方式和療程等也需要進一步探索和優(yōu)化。不同個體對IL-15的反應(yīng)可能存在差異，如何根據(jù)患者的具體情況制定個性化的治療方案，以達到最佳的治療效果，是臨床應(yīng)用中需要解決的實際問題。為了解決這些挑戰(zhàn)，需要開展更多的臨床前研究和臨床試驗。在臨床前研究中，進一步優(yōu)化基因載體，提高其安全性和轉(zhuǎn)染效率。通過對病毒載體進行改造，降低其免疫原性；研發(fā)新型的非病毒載體，提高基因傳遞效率。深入研究IL-15基因治療的作用機制，為臨床應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。明確IL-15在人體中的作用靶點和信號通路，有助于開發(fā)更有效的治療策略。在臨床試驗中，逐步探索IL-15基因治療的安全性和有效性。開展早期臨床試驗，評估不同劑量和給藥方式下IL-15基因治療的安全性和耐受性；在此基礎(chǔ)上，進行大規(guī)模的隨機對照臨床試驗，驗證其治療效果。還需要建立完善的監(jiān)測體系，及時發(fā)現(xiàn)和處理可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。通過多學(xué)科的合作，包括醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的專家共同努力，有望克服這些挑戰(zhàn)，實現(xiàn)IL-15基因治療從實驗室到臨床的轉(zhuǎn)化，為腫瘤患者帶來新的希望。六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型，深入探究了IL-15基因治療對小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的作用及機制，取得了以下主要研究成果：成功建立小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型：通過腹腔注射小鼠結(jié)腸癌細胞CT26，成功構(gòu)建了小鼠結(jié)腸癌腹腔轉(zhuǎn)移癌模型。模型組小鼠在接種腫瘤細胞后，出現(xiàn)了典型的腫瘤生長、腹水形成和生存期縮短等癥狀，體重逐漸減輕，精神萎靡，活動減少。通過小動物活體成像技術(shù)和腹水細胞學(xué)檢查，證實了腫瘤細胞在腹腔內(nèi)的成功定植和生長，為后續(xù)的實驗研究提供了可靠的動物模型。實現(xiàn)IL-15基因的高效轉(zhuǎn)染與表達：將表達綠色熒光蛋白載體pHi2EGFP-CMV-TAT（L6）和表達IL-15的質(zhì)粒pHi2-splL15-CMV-TAT（L3）通過腹腔注射導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。小動物活體成像結(jié)果顯示，綠色熒光蛋白載體在小鼠腹腔內(nèi)實現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染和廣泛表達，熒光信號在注射后第5天幾乎遍布整個腹腔。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測，證實了表達IL-15的質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染并在小鼠體內(nèi)高效表達，IL-15蛋白在注射后7-10天達到較高水平。IL-15基因治療顯著抑制腫瘤生長并延長生存期：IL-15基因治療組小鼠的腫瘤生長速度明顯減緩，與其他荷瘤小鼠組相比，在實驗第10天，平均腫瘤體積顯著減小。IL-15基因治療組小鼠的體重下降幅度相對較小，腹水出現(xiàn)時間明顯延遲，腹水量增長緩慢。IL-15基因治療組小鼠的平均生存期顯著延長，與其他荷瘤小鼠組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果表明IL-15基因治療能夠顯著抑制小鼠腹腔轉(zhuǎn)移癌的腫瘤生長，減少腹水形成，維持小鼠體重，延長生存期，提高生存質(zhì)量。IL-15基因治療激活免疫系統(tǒng)增強抗腫瘤免疫反應(yīng)：通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，IL-15基因治療組小鼠腹水中CD4?T細胞、CD8?T細胞和NKG2D?NK細胞的比例顯著增加，CD4?CD25?調(diào)節(jié)性T細胞的比例明顯降低，CD11b?巨噬細胞向M1型極化的趨勢明顯增強，M1型巨噬細胞相關(guān)細胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌量顯著增加。這些結(jié)果表明IL-15基因治療