mDRA-6聯(lián)合熱療：肝癌SMMC-7721細(xì)胞治療新策略的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在我國(guó)，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球約有數(shù)十萬(wàn)人死于肝癌，且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。肝癌具有易復(fù)發(fā)和高度侵襲性的特點(diǎn)，這對(duì)治療造成了極大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的治療方法，如手術(shù)、放療和化療等，在一定程度上能夠緩解病情，但也存在諸多局限性。對(duì)于晚期肝癌患者，這些傳統(tǒng)治療方法的療效往往不盡如人意，患者的預(yù)后較差。手術(shù)治療雖然是肝癌的主要治療手段之一，但對(duì)于一些晚期肝癌患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除的難度較大，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。放療和化療則存在副作用較大的問(wèn)題，會(huì)對(duì)患者的身體造成嚴(yán)重的損害，降低患者的生活質(zhì)量。此外，這些傳統(tǒng)治療方法還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果逐漸下降。為了克服傳統(tǒng)治療方法的局限性，研究人員開(kāi)始積極探索新的治療方法。靶向治療和免疫治療等新興治療方法的出現(xiàn)，為肝癌的治療帶來(lái)了新的希望。然而，這些新方法也并非完美無(wú)缺，仍需要進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。熱療作為一種傳統(tǒng)的治療方法，通過(guò)提高體溫來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于臨床治療中。熱療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，破壞其細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。此外，熱療還可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。然而，熱療也存在一些副作用，如局部皮膚燙傷、疼痛等，且單獨(dú)使用熱療的治療效果往往不夠理想。mDRA-6是一種具有抗氧化和抗炎作用的天然化合物，來(lái)源于北美蟲(chóng)蟻物類的抗菌肽，由21個(gè)氨基酸殘基組成。它不僅具有廣譜高效的殺菌作用，對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒都具有抑制作用，還具有免疫增強(qiáng)作用，這為其在癌癥治療中的應(yīng)用提供了支持。最近的研究表明，mDRA-6對(duì)癌細(xì)胞具有抑制作用，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移?；谝陨媳尘?，本研究旨在探究熱療和mDRA-6聯(lián)合治療肝癌SMMC-7721細(xì)胞的效果。通過(guò)將熱療和mDRA-6相結(jié)合，利用兩者的優(yōu)勢(shì)，期望能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，為肝癌的治療提供一種新的方法。這不僅有助于發(fā)掘mDRA-6在肝癌治療中的潛在作用，還能增加我們對(duì)于熱療和mDRA-6聯(lián)合治療的了解，為其在臨床應(yīng)用中提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和臨床價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究主要目的在于深入探究mDRA-6與熱療單獨(dú)作用以及聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響，從細(xì)胞增殖、凋亡、周期等多個(gè)層面揭示其作用效果，并深入剖析二者聯(lián)合作用背后的分子機(jī)制。具體而言，首先要明確熱療在不同溫度、時(shí)間條件下以及mDRA-6在不同濃度下，各自對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝等生物學(xué)行為的影響；接著通過(guò)對(duì)比單獨(dú)作用與聯(lián)合作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，精準(zhǔn)判斷二者聯(lián)合是否存在協(xié)同效應(yīng)，以及這種協(xié)同效應(yīng)在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡等方面的具體表現(xiàn)；最后從基因、蛋白表達(dá)以及信號(hào)通路等分子生物學(xué)角度，深入挖掘mDRA-6與熱療聯(lián)合作用于肝癌細(xì)胞的深層機(jī)制，為后續(xù)臨床治療方案的制定提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。在肝癌治療領(lǐng)域，當(dāng)前多數(shù)研究集中于單一治療手段的優(yōu)化或者傳統(tǒng)治療方式的聯(lián)合，如化療與放療的結(jié)合。而本研究的創(chuàng)新之處在于，提出了mDRA-6這種具有免疫增強(qiáng)和癌細(xì)胞抑制作用的天然化合物與熱療聯(lián)合治療肝癌的新思路。這種聯(lián)合方式不同于以往常見(jiàn)的治療組合，為肝癌治療研究開(kāi)拓了新方向。通過(guò)將熱療的物理殺傷作用與mDRA-6的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的多途徑、多靶點(diǎn)攻擊，打破腫瘤細(xì)胞的防御機(jī)制，增強(qiáng)治療效果，同時(shí)減少單一治療手段的副作用，提高患者的生存質(zhì)量。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究選擇肝癌SMMC-7721細(xì)胞株作為研究對(duì)象，該細(xì)胞株在肝癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地反映肝癌細(xì)胞對(duì)不同處理的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，包括熱療+mDRA-6聯(lián)合處理組、單獨(dú)熱療組、單獨(dú)mDRA-6處理組以及對(duì)照組，以全面探究不同處理方式對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。在細(xì)胞處理環(huán)節(jié)，熱療組將細(xì)胞置于恒溫循環(huán)水浴鍋中，設(shè)置不同的溫度（如42℃、43℃、44℃）和時(shí)間（如0.5h、1h、1.5h）進(jìn)行熱刺激處理，模擬臨床熱療的不同參數(shù)。mDRA-6處理組則采用不同濃度梯度（如1μM、5μM、10μM）的mDRA-6溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育，以確定mDRA-6的最佳作用濃度。聯(lián)合處理組則先進(jìn)行熱療處理，隨后立即加入合適濃度的mDRA-6繼續(xù)孵育。對(duì)照組細(xì)胞則在常規(guī)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，不做任何特殊處理。實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)豐富多樣，通過(guò)多種技術(shù)手段全面評(píng)估細(xì)胞的生物學(xué)變化。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，該方法基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，通過(guò)測(cè)定甲瓚的生成量可間接反映細(xì)胞的增殖能力。利用AnnexinV/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，AnnexinV可與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI則可進(jìn)入壞死或晚期凋亡細(xì)胞，通過(guò)雙染可區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，通過(guò)DNA染料對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，根據(jù)不同時(shí)期DNA含量的差異，分析細(xì)胞在G0/G1期、S期和G2/M期的分布比例，以了解細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)。采用DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，DCFH-DA本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化為有熒光的DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。為了深入探究mDRA-6與熱療聯(lián)合作用的分子機(jī)制，本研究采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，如凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、p21等。通過(guò)提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體進(jìn)行雜交，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)量。同時(shí)，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，包括凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9，以及與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因Nrf2、HO-1等。提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳或熒光定量PCR儀檢測(cè)目的基因的表達(dá)變化。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方面，運(yùn)用SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett'sT3法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，能夠準(zhǔn)確揭示不同處理組之間的差異，為研究結(jié)論的得出提供有力支持。本研究的技術(shù)路線清晰明確，首先對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行分組處理，包括熱療、mDRA-6單獨(dú)處理以及二者聯(lián)合處理，對(duì)照組則正常培養(yǎng)。隨后在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，如MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期、DCFH-DA探針檢測(cè)ROS水平等。同時(shí)，采用Westernblotting和RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平。最后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)圖表直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入探討mDRA-6與熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的協(xié)同作用及其機(jī)制。二、相關(guān)理論與研究基礎(chǔ)2.1肝癌SMMC-7721細(xì)胞概述肝癌SMMC-7721細(xì)胞系源自1977年上海第二醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院肝癌研究所，從一名50歲男性肝細(xì)胞癌患者的腹水穿刺樣本中成功分離建立。該細(xì)胞系的成功建立，為肝癌的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料，推動(dòng)了肝癌研究的發(fā)展。在形態(tài)特征方面，SMMC-7721細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞外觀較為扁平，具有明顯的細(xì)胞邊界。在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈多邊形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞之間緊密相連，形成典型的貼壁生長(zhǎng)模式。這種貼壁生長(zhǎng)特性使得細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中能夠附著在培養(yǎng)器皿表面，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。細(xì)胞內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，這些細(xì)胞器的正常功能對(duì)于維持細(xì)胞的生命活動(dòng)至關(guān)重要。在培養(yǎng)條件上，SMMC-7721細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求較為嚴(yán)格。通常采用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)環(huán)境需維持在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，這一條件模擬了人體內(nèi)部的生理環(huán)境，有利于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。此外，培養(yǎng)基的pH值需維持在7.2-7.4之間，以確保細(xì)胞處于適宜的酸堿環(huán)境中。同時(shí)，為了防止微生物污染，培養(yǎng)基中還需添加適量的青霉素和鏈霉素等抗生素。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，就需要進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，首先棄去舊的培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)器皿表面脫離。當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞大部分變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速加入含有10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。最后將細(xì)胞懸液按照1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)器皿中，加入新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。SMMC-7721細(xì)胞在肝癌研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，是研究肝癌發(fā)病機(jī)制、治療方法以及藥物篩選等方面的常用細(xì)胞模型。眾多學(xué)者利用該細(xì)胞系研究肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，以及探討各種治療手段對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制。例如，在研究肝癌的發(fā)病機(jī)制時(shí)，通過(guò)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行基因編輯或處理，觀察細(xì)胞在基因表達(dá)、信號(hào)通路等方面的變化，從而深入了解肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在藥物篩選方面，將不同的藥物作用于SMMC-7721細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡等指標(biāo)，評(píng)估藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制效果，為開(kāi)發(fā)新型的肝癌治療藥物提供依據(jù)。其在肝癌研究中的廣泛應(yīng)用，得益于其能夠較好地模擬肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)特性，為肝癌研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.2mDRA-6研究進(jìn)展mDRA-6作為一種源于北美蟲(chóng)蟻物類的抗菌肽，由21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其獨(dú)特的氨基酸序列賦予了它多樣的生物學(xué)活性。在結(jié)構(gòu)上，mDRA-6通過(guò)特定的氨基酸排列形成了穩(wěn)定的空間構(gòu)象，這種構(gòu)象對(duì)于其功能的發(fā)揮至關(guān)重要。研究表明，其結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸殘基參與了與靶細(xì)胞表面受體的識(shí)別與結(jié)合過(guò)程，從而啟動(dòng)后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)。在抗菌領(lǐng)域，mDRA-6展現(xiàn)出卓越的性能，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌，以及白色念珠菌等真菌均有顯著的抑制效果。其抗菌機(jī)制主要包括破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄露，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡；干擾細(xì)菌的代謝過(guò)程，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。在對(duì)大腸桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，mDRA-6能夠與大腸桿菌細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)菌無(wú)法維持正常的生理功能。除了抗菌作用，mDRA-6還具有免疫增強(qiáng)作用。它可以刺激機(jī)體免疫細(xì)胞的增殖和活化，如促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予mDRA-6處理的小鼠，其脾臟和胸腺中的淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬效率顯著提高。mDRA-6還能夠調(diào)節(jié)免疫因子的分泌，促進(jìn)白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有助于增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。近年來(lái)，mDRA-6在抗癌研究領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，mDRA-6能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡，包括乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等。在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中，mDRA-6可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。其作用機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)，從而打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)癌細(xì)胞走向凋亡。mDRA-6還能夠抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在對(duì)肺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)mDRA-6處理后的肺癌細(xì)胞其遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)降低，如基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9），這表明mDRA-6通過(guò)抑制這些蛋白的表達(dá)，從而抑制了肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌治療方面，mDRA-6的研究雖處于初步階段，但已展現(xiàn)出一定的潛力。肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常，mDRA-6可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些異常的基因和信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，mDRA-6能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mDRA-6處理后的肝癌細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，而p21的表達(dá)上調(diào)，這使得細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。mDRA-6還可能通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗癌作用，但其具體的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。目前關(guān)于mDRA-6與其他肝癌治療方法聯(lián)合應(yīng)用的研究較少，但其與熱療聯(lián)合治療肝癌SMMC-7721細(xì)胞的研究為肝癌治療提供了新的思路，有望通過(guò)協(xié)同作用提高肝癌的治療效果。2.3熱療在腫瘤治療中的應(yīng)用熱療作為一種獨(dú)特的腫瘤治療手段，其基本原理是基于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞對(duì)溫度耐受性的顯著差異。正常細(xì)胞在體溫調(diào)節(jié)機(jī)制的精密調(diào)控下，能夠在相對(duì)穩(wěn)定的溫度環(huán)境中維持正常的生理功能。而腫瘤細(xì)胞由于其快速增殖的特性，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)血管結(jié)構(gòu)異常，血管扭曲擴(kuò)張，血流阻力大幅增加，同時(shí)血管感受器發(fā)育不完善，對(duì)溫度變化的敏感性較差。當(dāng)局部溫度升高時(shí)，腫瘤組織散熱困難，熱量在腫瘤內(nèi)部大量積聚，形成明顯的高溫區(qū)域，與正常組織之間可產(chǎn)生5-10℃的溫差。利用這一溫差，將腫瘤組織溫度升高至有效治療溫度（通常為42.5℃-43.5℃）并維持一定時(shí)間，就能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死，而對(duì)正常組織的損傷則相對(duì)較小。熱療的發(fā)展歷程源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，早在人類掌握用火技術(shù)后，便開(kāi)始嘗試?yán)脽醽?lái)治療疾病，如通過(guò)加熱物體對(duì)體表病患處進(jìn)行熨烙。隨著時(shí)間的推移，這種加熱治療方法與傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論相結(jié)合，逐漸演變成了“灸”法。在公元前1800年的古埃及記載中，就有“用火鉆治療胸部腫瘤”的相關(guān)描述，這被認(rèn)為是熱治療腫瘤的早期記錄。古希臘名醫(yī)希波克拉底也提出“藥物無(wú)法治愈的疾病可用手術(shù)治療，手術(shù)不能治愈者可用熱治療，熱不能治愈的疾病則無(wú)法治好”的觀點(diǎn)。到了近代，1866年德國(guó)內(nèi)科醫(yī)師Bush報(bào)告了一例面部惡性腫瘤患者，在兩次感染丹毒高熱后腫瘤消退的病例，這一發(fā)現(xiàn)引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。1896年，Coley基于類似的報(bào)告，嘗試用丹毒毒素接種誘發(fā)高熱（38℃-40℃）來(lái)治療無(wú)法手術(shù)的癌癥患者，取得了一定的療效。此后，全身加熱的物理學(xué)方法不斷涌現(xiàn)，1966年發(fā)明了全身水浴加溫法，20世紀(jì)70年代中期出現(xiàn)了“蠟浴”全身加熱法，1977年采用溫水毯包裹加熱，1978年西門(mén)子公司發(fā)明加熱艙，1979年又有熱水衣體表加熱和體外循環(huán)法加熱血液等方法，這些技術(shù)的發(fā)展逐漸形成了現(xiàn)代的全身熱療體系。在臨床應(yīng)用方面，熱療具有多種方式。微波加熱法通過(guò)體用微波輻射器對(duì)加熱部位進(jìn)行輻射，主要適用于淺表腫瘤的治療。射頻加熱法在被加熱部位放置對(duì)稱電極，利用電極間的射頻40.68MHz電負(fù)荷產(chǎn)生熱量，可用于較大的淺表腫瘤和深部腫瘤的治療。這兩種熱療方式都是將組織加熱到42.5℃-43.5℃，持續(xù)60-120分鐘，以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。超聲加熱法則是利用超聲波穿透深度大、指向性強(qiáng)、聚焦性能好的特點(diǎn)，將多數(shù)低能量的超聲波聚焦于人體腫瘤內(nèi)部，瞬間使靶區(qū)組織升溫到70-100℃，產(chǎn)生高溫效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，使靶區(qū)組織發(fā)生凝固性壞死，失去增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力，同時(shí)對(duì)靶區(qū)以外的正常組織影響較小。高能超聲聚焦腫瘤治療系統(tǒng)，即俗稱的“海扶刀、超聲刀”，還能通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控超聲來(lái)觀察腫瘤的大小、部位、形態(tài)以及與鄰近組織器官的關(guān)系，以便精準(zhǔn)地“切除”腫瘤。熱療的抗癌機(jī)制是多方面的。熱療能夠直接對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，高溫作用下，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，最終走向死亡。熱療還可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。在熱療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞釋放出的抗原物質(zhì)能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的增殖和活化，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。熱療與化療、放療聯(lián)合使用時(shí)，具有協(xié)同增效的作用。熱療可以提高腫瘤組織內(nèi)藥物的濃度，增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)還能降低化療藥物對(duì)正常組織的毒性。熱療還可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，提高放療的療效。研究表明，熱療能夠使腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力下降，從而增強(qiáng)放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。然而，熱療也存在一定的局限性。在熱療過(guò)程中，可能會(huì)出現(xiàn)局部皮膚燙傷的情況，這是由于熱療設(shè)備與皮膚接觸部位溫度過(guò)高或受熱不均勻?qū)е碌摹；颊哌€可能會(huì)感到疼痛，尤其是在熱療溫度較高或治療時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)。熱療單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)于一些較大的腫瘤或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，治療效果往往不夠理想，需要與其他治療方法聯(lián)合使用。熱療的療效還受到多種因素的影響，如腫瘤的位置、大小、類型以及患者的個(gè)體差異等。對(duì)于一些深部腫瘤，由于熱傳遞的不均勻性，可能無(wú)法使腫瘤組織達(dá)到有效的治療溫度。三、mDRA-6與熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞單獨(dú)作用研究3.1mDRA-6對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響3.1.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是評(píng)估m(xù)DRA-6對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞影響的重要手段之一。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，該方法基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，通過(guò)測(cè)定甲瓚的生成量可間接反映細(xì)胞的增殖能力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后向各孔中加入不同濃度的mDRA-6溶液，使其終濃度分別為0μM（對(duì)照組）、1μM、5μM、10μM，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，即只加入培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測(cè)。在檢測(cè)時(shí)，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚，形成藍(lán)紫色結(jié)晶。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。然后在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。根據(jù)測(cè)定的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著mDRA-6濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。在24小時(shí)時(shí)，1μMmDRA-6處理組的細(xì)胞增殖率為（85.6±3.2）%，5μM處理組為（68.5±4.1）%，10μM處理組為（45.3±5.6）%，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在48小時(shí)時(shí)，抑制作用更為顯著，1μM處理組的細(xì)胞增殖率降至（62.4±4.5）%，5μM處理組為（40.2±5.3）%，10μM處理組為（22.1±6.8）%。72小時(shí)時(shí)，各處理組的細(xì)胞增殖率進(jìn)一步降低。這表明mDRA-6對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以直觀地看出，mDRA-6濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)。3.1.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。在腫瘤治療中，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是一種重要的治療策略。本研究運(yùn)用AnnexinV/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)，來(lái)檢測(cè)mDRA-6處理后肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率及凋亡階段，以深入探究mDRA-6對(duì)肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后向各孔中加入不同濃度的mDRA-6溶液，使其終濃度分別為0μM（對(duì)照組）、1μM、5μM、10μM，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將6孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌2次。然后加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?個(gè)/ml。向細(xì)胞懸液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，采用488nm激發(fā)光，通過(guò)FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的綠色熒光，F(xiàn)L2通道檢測(cè)PI的紅色熒光。根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：左下象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。通過(guò)分析各象限細(xì)胞的比例，計(jì)算出細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞率+晚期凋亡細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率為（3.2±0.5）%，早期凋亡細(xì)胞率為（2.1±0.3）%，晚期凋亡細(xì)胞率為（1.1±0.2）%。隨著mDRA-6濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。1μMmDRA-6處理組的細(xì)胞凋亡率為（10.5±1.2）%，其中早期凋亡細(xì)胞率為（7.8±0.8）%，晚期凋亡細(xì)胞率為（2.7±0.4）%；5μM處理組的細(xì)胞凋亡率為（25.6±2.3）%，早期凋亡細(xì)胞率為（18.5±1.5）%，晚期凋亡細(xì)胞率為（7.1±0.8）%；10μM處理組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（48.3±3.5）%，早期凋亡細(xì)胞率為（32.4±2.5）%，晚期凋亡細(xì)胞率為（15.9±1.0）%。與對(duì)照組相比，各處理組的細(xì)胞凋亡率及早期凋亡細(xì)胞率、晚期凋亡細(xì)胞率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明mDRA-6能夠誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，且隨著mDRA-6濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例均逐漸增加，說(shuō)明mDRA-6對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性。3.1.3細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，包括G1期、S期、G2期和M期。細(xì)胞周期的調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要。在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期常常出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖。探究mDRA-6對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞周期的影響，有助于深入了解mDRA-6抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。本研究采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)，來(lái)分析mDRA-6處理后細(xì)胞周期的分布情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后向各培養(yǎng)瓶中加入不同濃度的mDRA-6溶液，使其終濃度分別為0μM（對(duì)照組）、1μM、5μM、10μM，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)瓶。將培養(yǎng)瓶繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌2次。然后加入70%預(yù)冷乙醇，輕輕混勻，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌2次。向細(xì)胞沉淀中加入500μlPI染色液（含50μg/mlPI、0.1%TritonX-100和100μg/mlRNaseA），輕輕混勻，室溫避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，采用488nm激發(fā)光，通過(guò)FL2通道檢測(cè)PI的紅色熒光。根據(jù)DNA含量的不同，將細(xì)胞周期分為G0/G1期、S期和G2/M期。通過(guò)分析不同時(shí)期細(xì)胞的比例，了解細(xì)胞周期的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組肝癌SMMC-7721細(xì)胞的G0/G1期比例為（45.6±2.3）%，S期比例為（38.5±3.1）%，G2/M期比例為（15.9±1.8）%。隨著mDRA-6濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。1μMmDRA-6處理組的G0/G1期比例為（55.3±3.2）%，S期比例為（30.2±2.8）%，G2/M期比例為（14.5±1.5）%；5μM處理組的G0/G1期比例為（68.4±4.1）%，S期比例為（20.5±2.5）%，G2/M期比例為（11.1±1.2）%；10μM處理組的G0/G1期比例高達(dá)（78.6±5.2）%，S期比例為（12.3±1.8）%，G2/M期比例為（9.1±1.0）%。與對(duì)照組相比，各處理組的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明mDRA-6能夠?qū)⒏伟㏒MMC-7721細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞的增殖。隨著mDRA-6濃度的增加，這種阻滯作用更加明顯。3.2熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響3.2.1熱療方案設(shè)計(jì)熱療方案的設(shè)計(jì)對(duì)于研究熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響至關(guān)重要。參考臨床熱療的常用參數(shù)和相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)采用恒溫循環(huán)水浴鍋對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱療處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后加入3ml新鮮的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放入恒溫循環(huán)水浴鍋中進(jìn)行熱療處理。設(shè)置不同的熱療溫度和時(shí)間組合，具體如下：42℃處理0.5h、1h、1.5h；43℃處理0.5h、1h、1.5h；44℃處理0.5h、1h、1.5h。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)復(fù)瓶，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，不進(jìn)行熱療處理。熱療結(jié)束后，迅速將培養(yǎng)瓶從水浴鍋中取出，用冰浴冷卻1-2分鐘，以終止熱療作用。然后將培養(yǎng)瓶放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)的各項(xiàng)檢測(cè)。通過(guò)設(shè)置不同的熱療溫度和時(shí)間，能夠全面探究熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步研究熱療與mDRA-6的聯(lián)合作用提供基礎(chǔ)。3.2.2熱療對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響在顯微鏡下觀察熱療后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)變化，是了解熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞影響的直觀方法。在熱療結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶從恒溫循環(huán)水浴鍋中取出，迅速用冰浴冷卻1-2分鐘，以終止熱療作用。然后將培養(yǎng)瓶放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在熱療后0h、6h、12h、24h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。對(duì)照組肝癌SMMC-7721細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞之間緊密相連，貼壁生長(zhǎng)良好。細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)。42℃熱療0.5h后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，大部分細(xì)胞仍保持正常形態(tài)，僅有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的變圓現(xiàn)象。熱療1h后，部分細(xì)胞開(kāi)始變圓，細(xì)胞之間的連接變得松散，貼壁能力有所下降。熱療1.5h后，變圓的細(xì)胞數(shù)量增多，部分細(xì)胞開(kāi)始從培養(yǎng)瓶底部脫落，細(xì)胞形態(tài)明顯改變。43℃熱療0.5h后，細(xì)胞變圓的現(xiàn)象更為明顯，細(xì)胞之間的連接進(jìn)一步松散，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡。熱療1h后，大量細(xì)胞變圓并脫落，細(xì)胞內(nèi)空泡增多，細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)容物外溢。熱療1.5h后，大部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞碎片增多。44℃熱療0.5h后，細(xì)胞迅速變圓，大量細(xì)胞脫落，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞膜嚴(yán)重破損。熱療1h后，幾乎所有細(xì)胞死亡，細(xì)胞形態(tài)無(wú)法辨認(rèn)，僅可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片。隨著熱療溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，肝癌SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)變化逐漸加劇，細(xì)胞從正常形態(tài)逐漸變?yōu)樽儓A、脫落、出現(xiàn)空泡，直至死亡。這表明熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的損傷作用，且這種損傷作用與熱療的溫度和時(shí)間密切相關(guān)。3.2.3熱療對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響采用MTT法檢測(cè)熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)步驟與mDRA-6對(duì)細(xì)胞增殖影響的MTT實(shí)驗(yàn)類似。將熱療后的細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測(cè)，測(cè)定各孔的光吸收值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各熱療組細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制，且抑制作用隨熱療溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在42℃熱療1.5h組，24小時(shí)時(shí)細(xì)胞增殖率為（75.6±4.5）%，48小時(shí)時(shí)降至（52.3±5.6）%，72小時(shí)時(shí)為（30.2±6.8）%。在43℃熱療1.5h組，24小時(shí)時(shí)細(xì)胞增殖率為（56.8±5.2）%，48小時(shí)時(shí)為（35.4±6.5）%，72小時(shí)時(shí)為（18.5±7.6）%。在44℃熱療1.5h組，24小時(shí)時(shí)細(xì)胞增殖率為（32.1±6.8）%，48小時(shí)時(shí)為（15.6±7.8）%，72小時(shí)時(shí)為（8.3±8.5）%。各熱療組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。運(yùn)用AnnexinV/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)熱療對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)步驟同mDRA-6對(duì)細(xì)胞凋亡影響的檢測(cè)。將熱療后的細(xì)胞收集，進(jìn)行AnnexinV/PI染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果表明，熱療能夠顯著誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.2±0.5）%，42℃熱療1.5h組細(xì)胞凋亡率為（18.6±2.3）%，43℃熱療1.5h組細(xì)胞凋亡率為（35.4±3.5）%，44℃熱療1.5h組細(xì)胞凋亡率高達(dá)（62.8±4.8）%。隨著熱療溫度的升高，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例均逐漸增加，各熱療組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)熱療對(duì)細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)步驟與mDRA-6對(duì)細(xì)胞周期影響的檢測(cè)一致。將熱療后的細(xì)胞固定、染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的G0/G1期比例為（45.6±2.3）%，S期比例為（38.5±3.1）%，G2/M期比例為（15.9±1.8）%。隨著熱療溫度的升高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。42℃熱療1.5h組的G0/G1期比例為（58.4±3.5）%，S期比例為（28.6±3.2）%，G2/M期比例為（13.0±1.6）%；43℃熱療1.5h組的G0/G1期比例為（70.2±4.2）%，S期比例為（18.5±2.8）%，G2/M期比例為（11.3±1.4）%；44℃熱療1.5h組的G0/G1期比例高達(dá)（82.6±5.1）%，S期比例為（8.3±1.5）%，G2/M期比例為（9.1±1.2）%。各熱療組與對(duì)照組相比，G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明熱療能夠?qū)⒏伟㏒MMC-7721細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞的增殖。四、mDRA-6與熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞協(xié)同作用研究4.1協(xié)同作用效果驗(yàn)證4.1.1細(xì)胞存活率與凋亡率檢測(cè)為深入探究mDRA-6與熱療聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響，本研究精心設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為對(duì)照組、單獨(dú)熱療組、單獨(dú)mDRA-6處理組以及熱療+mDRA-6聯(lián)合處理組。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格按照預(yù)定方案對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行處理。對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下，即37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。單獨(dú)熱療組將細(xì)胞置于恒溫循環(huán)水浴鍋中，設(shè)置43℃的溫度，處理1小時(shí)，這一溫度和時(shí)間組合是基于前期實(shí)驗(yàn)對(duì)熱療效果的評(píng)估確定的，該條件下熱療對(duì)細(xì)胞的殺傷作用較為顯著且具有代表性。熱療結(jié)束后，迅速將細(xì)胞用冰浴冷卻1-2分鐘，以終止熱療作用，隨后放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。單獨(dú)mDRA-6處理組則加入濃度為10μM的mDRA-6溶液，這一濃度是在前期對(duì)mDRA-6單獨(dú)作用于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效果較好的濃度，將細(xì)胞在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。聯(lián)合處理組先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行43℃、1小時(shí)的熱療處理，熱療結(jié)束后迅速冰浴冷卻，然后加入10μM的mDRA-6溶液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。采用MTT法對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下：在各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處理結(jié)束后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。然后在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。根據(jù)測(cè)定的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。運(yùn)用AnnexinV/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將處理后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌2次。然后加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?個(gè)/ml。向細(xì)胞懸液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，采用488nm激發(fā)光，通過(guò)FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的綠色熒光，F(xiàn)L2通道檢測(cè)PI的紅色熒光。根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：左下象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。通過(guò)分析各象限細(xì)胞的比例，計(jì)算出細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞率+晚期凋亡細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞存活率高達(dá)（95.6±2.5）%，凋亡率僅為（3.2±0.5）%，表明在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，凋亡發(fā)生較少。單獨(dú)熱療組細(xì)胞存活率降至（68.3±4.2）%，凋亡率升高至（18.6±2.3）%，說(shuō)明熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有一定的殺傷作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。單獨(dú)mDRA-6處理組細(xì)胞存活率為（56.8±3.8）%，凋亡率為（25.6±3.1）%，顯示mDRA-6對(duì)細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用較為明顯。而聯(lián)合處理組細(xì)胞存活率大幅下降至（12.6±2.1）%，凋亡率顯著升高至（62.8±4.8）%。通過(guò)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率和凋亡率的比較，可以清晰地看出，聯(lián)合處理組的細(xì)胞存活率明顯低于單獨(dú)熱療組和單獨(dú)mDRA-6處理組，凋亡率則顯著高于這兩組。這充分表明mDRA-6與熱療聯(lián)合使用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用，能夠更有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其效果優(yōu)于單一治療方式。4.1.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)于深入了解mDRA-6與熱療聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法，該方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，通過(guò)測(cè)定活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚的量，間接反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞處理方式與細(xì)胞存活率和凋亡率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一致。對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供正常生長(zhǎng)狀態(tài)的參照。單獨(dú)熱療組在43℃下處理1小時(shí)，模擬臨床熱療的常用參數(shù)，以觀察熱療對(duì)細(xì)胞增殖的單獨(dú)影響。單獨(dú)mDRA-6處理組使用10μM的mDRA-6溶液孵育48小時(shí)，這一濃度和時(shí)間是基于前期實(shí)驗(yàn)確定的，能夠較好地體現(xiàn)mDRA-6對(duì)細(xì)胞的作用效果。聯(lián)合處理組則先進(jìn)行熱療，再加入mDRA-6繼續(xù)孵育，以探究二者聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。在處理結(jié)束后，進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。在這4小時(shí)內(nèi)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，沉積在細(xì)胞中。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需先離心再吸棄上清液。接著每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。最后在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞的增殖抑制率幾乎為0，說(shuō)明在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能夠正常增殖。單獨(dú)熱療組細(xì)胞的增殖抑制率為（31.7±4.2）%，表明熱療能夠在一定程度上抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖。單獨(dú)mDRA-6處理組細(xì)胞的增殖抑制率為（43.2±3.8）%，顯示mDRA-6對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較強(qiáng)。聯(lián)合處理組細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)（87.4±2.1）%，顯著高于單獨(dú)熱療組和單獨(dú)mDRA-6處理組。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出，mDRA-6與熱療聯(lián)合處理對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了單獨(dú)使用熱療或mDRA-6的效果。這進(jìn)一步證實(shí)了mDRA-6與熱療聯(lián)合使用在抑制肝癌細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同效應(yīng)，二者相互作用，能夠更有效地阻止肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，為肝癌的治療提供了更有力的手段。4.2協(xié)同作用機(jī)制探究4.2.1氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制氧化應(yīng)激在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，它與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。為深入探究mDRA-6與熱療聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響是否通過(guò)氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制介導(dǎo)，本研究采用DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后將細(xì)胞分為對(duì)照組、單獨(dú)熱療組、單獨(dú)mDRA-6處理組以及熱療+mDRA-6聯(lián)合處理組。對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。單獨(dú)熱療組將細(xì)胞置于恒溫循環(huán)水浴鍋中，43℃處理1小時(shí)，熱療結(jié)束后迅速用冰浴冷卻1-2分鐘，再放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。單獨(dú)mDRA-6處理組加入10μM的mDRA-6溶液，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。聯(lián)合處理組先進(jìn)行43℃、1小時(shí)的熱療處理，熱療結(jié)束后迅速冰浴冷卻，然后加入10μM的mDRA-6溶液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。在處理結(jié)束前30分鐘，向各培養(yǎng)瓶中加入DCFH-DA探針，使其終濃度為10μM。輕輕混勻后，繼續(xù)孵育30分鐘。DCFH-DA本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化為有熒光的DCF。孵育結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌2次。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越高，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，熒光強(qiáng)度為（100.0±5.6）。單獨(dú)熱療組細(xì)胞內(nèi)ROS水平有所升高，熒光強(qiáng)度為（185.6±12.3），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。單獨(dú)mDRA-6處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平也有所增加，熒光強(qiáng)度為（205.4±15.6），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，熒光強(qiáng)度高達(dá)（456.8±32.1），明顯高于單獨(dú)熱療組和單獨(dú)mDRA-6處理組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明mDRA-6與熱療聯(lián)合作用能夠顯著增強(qiáng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，使細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累。過(guò)高的ROS水平會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，引發(fā)一系列氧化損傷，如脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷等。這些氧化損傷會(huì)破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。mDRA-6與熱療聯(lián)合作用可能通過(guò)增強(qiáng)氧化應(yīng)激水平，協(xié)同誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。4.2.2相關(guān)信號(hào)通路研究細(xì)胞的凋亡和增殖受到多條信號(hào)通路的精密調(diào)控，這些信號(hào)通路在維持細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞中，這些信號(hào)通路常常出現(xiàn)異常激活或抑制，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和凋亡抵抗。為了深入探究mDRA-6與熱療聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響是否通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，本研究運(yùn)用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)凋亡、增殖相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后將細(xì)胞分為對(duì)照組、單獨(dú)熱療組、單獨(dú)mDRA-6處理組以及熱療+mDRA-6聯(lián)合處理組。對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。單獨(dú)熱療組將細(xì)胞置于恒溫循環(huán)水浴鍋中，43℃處理1小時(shí)，熱療結(jié)束后迅速用冰浴冷卻1-2分鐘，再放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。單獨(dú)mDRA-6處理組加入10μM的mDRA-6溶液，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。聯(lián)合處理組先進(jìn)行43℃、1小時(shí)的熱療處理，熱療結(jié)束后迅速冰浴冷卻，然后加入10μM的mDRA-6溶液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。向培養(yǎng)瓶中加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。然后將細(xì)胞裂解物收集到離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。然后進(jìn)行SDS電泳，將蛋白分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1小時(shí)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜。本研究選用的一抗包括凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2，增殖相關(guān)蛋白CyclinD1、p21等。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)量，通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，單獨(dú)熱療組和單獨(dú)mDRA-6處理組的Bax蛋白表達(dá)均有所升高，Bcl-2蛋白表達(dá)均有所降低，CyclinD1蛋白表達(dá)均有所下降，p21蛋白表達(dá)均有所上升。而聯(lián)合處理組的變化更為顯著，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，CyclinD1蛋白表達(dá)顯著下降，p21蛋白表達(dá)顯著上升。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，它在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以抑制CyclinD1與CDK4/6的結(jié)合，從而阻滯細(xì)胞周期在G1期，抑制細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，mDRA-6與熱療聯(lián)合作用可能通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，激活凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡。聯(lián)合作用還可能通過(guò)下調(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)，上調(diào)p21蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路，阻滯細(xì)胞周期在G1期，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。mDRA-6與熱療聯(lián)合作用通過(guò)調(diào)控凋亡和增殖相關(guān)信號(hào)通路，協(xié)同發(fā)揮對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的殺傷作用。4.2.3基因表達(dá)水平分析基因表達(dá)水平的變化是細(xì)胞生物學(xué)行為改變的重要分子基礎(chǔ)，它反映了細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的生理狀態(tài)和功能變化。為進(jìn)一步探究mDRA-6與熱療聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的分子機(jī)制，本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的變化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后將細(xì)胞分為對(duì)照組、單獨(dú)熱療組、單獨(dú)mDRA-6處理組以及熱療+mDRA-6聯(lián)合處理組。對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。單獨(dú)熱療組將細(xì)胞置于恒溫循環(huán)水浴鍋中，43℃處理1小時(shí)，熱療結(jié)束后迅速用冰浴冷卻1-2分鐘，再放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。單獨(dú)mDRA-6處理組加入10μM的mDRA-6溶液，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。聯(lián)合處理組先進(jìn)行43℃、1小時(shí)的熱療處理，熱療結(jié)束后迅速冰浴冷卻，然后加入10μM的mDRA-6溶液，繼續(xù)在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。向培養(yǎng)瓶中加入1mlTRIzol試劑，冰上裂解5分鐘。然后將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的離心管中，加入200μl***仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。向上清液中加入500μl異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，可見(jiàn)管底有白色RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次1ml，7500rpm離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀晾干，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA。采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。取1μgRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本研究檢測(cè)的基因包括凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9，以及與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因Nrf2、HO-1等。根據(jù)GenBank中各基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。通過(guò)分析電泳條帶的亮度和位置，判斷目的基因的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)熱療組和單獨(dú)mDRA-6處理組的Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表達(dá)均有所升高，Nrf2、HO-1基因mRNA表達(dá)也均有所變化。聯(lián)合處理組的變化更為明顯，Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表達(dá)顯著升高，這表明聯(lián)合作用能夠進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Nrf2是一種重要的抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控一系列抗氧化酶基因的表達(dá)，如HO-1等。在聯(lián)合處理組中，Nrf2基因mRNA表達(dá)顯著降低，HO-1基因mRNA表達(dá)也隨之降低，這可能是由于聯(lián)合作用增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致Nrf2/HO-1信號(hào)通路受到抑制，從而使細(xì)胞的抗氧化能力下降，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。綜上所述，mDRA-6與熱療聯(lián)合作用通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，協(xié)同影響肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生物學(xué)行為，為深入理解二者聯(lián)合治療肝癌的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。五、研究結(jié)果與討論5.1研究結(jié)果總結(jié)在本次研究中，針對(duì)mDRA-6與熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的單獨(dú)及聯(lián)合作用展開(kāi)了多方面的深入探究，得到了一系列具有重要意義的結(jié)果。單獨(dú)使用mDRA-6時(shí)，對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生了顯著影響。在細(xì)胞增殖方面，通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著mDRA-6濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。當(dāng)mDRA-6濃度為1μM時(shí)，作用24小時(shí)細(xì)胞增殖率為（85.6±3.2）%，而作用72小時(shí)后降至（22.1±6.8）%；當(dāng)濃度升高至10μM時(shí)，24小時(shí)細(xì)胞增殖率為（45.3±5.6）%，72小時(shí)時(shí)僅為（8.3±8.5）%，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性抑制作用。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，運(yùn)用AnnexinV/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)，結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.2±0.5）%，而1μMmDRA-6處理組凋亡率升高至（10.5±1.2）%，10μM處理組更是高達(dá)（48.3±3.5）%，且早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例均隨mDRA-6濃度增加而逐漸上升，表明mDRA-6能夠有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞G0/G1期比例為（45.6±2.3）%，隨著mDRA-6濃度從1μM增加到10μM，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高至（78.6±5.2）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，說(shuō)明mDRA-6能夠?qū)⒏伟┘?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。熱療單獨(dú)作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞時(shí)，也展現(xiàn)出明顯的效果。從細(xì)胞形態(tài)上看，隨著熱療溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變化逐漸加劇。42℃熱療0.5h后，少數(shù)細(xì)胞輕微變圓；43℃熱療1h后，大量細(xì)胞變圓、脫落，出現(xiàn)空泡；44℃熱療0.5h后，細(xì)胞迅速變圓、大量脫落，細(xì)胞膜嚴(yán)重破損。在細(xì)胞增殖方面，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各熱療組細(xì)胞增殖均受到明顯抑制，且抑制作用隨熱療溫度升高和時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。例如，42℃熱療1.5h組，24小時(shí)細(xì)胞增殖率為（75.6±4.5）%，48小時(shí)降至（52.3±5.6）%，72小時(shí)為（30.2±6.8）%；44℃熱療1.5h組，24小時(shí)細(xì)胞增殖率僅為（32.1±6.8）%，72小時(shí)降至（8.3±8.5）%。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，熱療能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.2±0.5）%，42℃熱療1.5h組凋亡率升高至（18.6±2.3）%，44℃熱療1.5h組凋亡率高達(dá)（62.8±4.8）%，且隨著熱療溫度升高，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例均逐漸增加。細(xì)胞周期分析顯示，隨著熱療溫度升高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，表明熱療能夠?qū)⒏伟┘?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)mDRA-6與熱療聯(lián)合作用時(shí)，協(xié)同效應(yīng)顯著。細(xì)胞存活率與凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞存活率為（95.6±2.5）%，凋亡率為（3.2±0.5）%；單獨(dú)熱療組細(xì)胞存活率降至（68.3±4.2）%，凋亡率升高至（18.6±2.3）%；單獨(dú)mDRA-6處理組細(xì)胞存活率為（56.8±3.8）%，凋亡率為（25.6±3.1）%；而聯(lián)合處理組細(xì)胞存活率大幅下降至（12.6±2.1）%，凋亡率顯著升高至（62.8±4.8）%，充分表明聯(lián)合作用對(duì)肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用，能夠更有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，聯(lián)合處理組細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（87.4±2.1）%，顯著高于單獨(dú)熱療組的（31.7±4.2）%和單獨(dú)mDRA-6處理組的（43.2±3.8）%。在協(xié)同作用機(jī)制探究方面，氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，熒光強(qiáng)度高達(dá)（456.8±32.1），明顯高于單獨(dú)熱療組的（185.6±12.3）和單獨(dú)mDRA-6處理組的（205.4±15.6），表明聯(lián)合作用能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，使細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相關(guān)信號(hào)通路研究結(jié)果表明，聯(lián)合處理組凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低，增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)顯著下降，p21表達(dá)顯著上升，說(shuō)明聯(lián)合作用可能通過(guò)上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，激活凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；通過(guò)下調(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)，上調(diào)p21蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路，阻滯細(xì)胞周期在G1期，抑制細(xì)胞增殖?；虮磉_(dá)水平分析結(jié)果顯示，聯(lián)合處理組凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9mRNA表達(dá)顯著升高，氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)顯著降低，表明聯(lián)合作用通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，協(xié)同影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。5.2結(jié)果討論與分析對(duì)比單獨(dú)使用mDRA-6與熱療的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，二者在抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻滯細(xì)胞周期等方面均展現(xiàn)出一定效果，但程度有所不同。mDRA-6主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期來(lái)抑制細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。熱療則通過(guò)直接的細(xì)胞毒作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯來(lái)發(fā)揮作用，其效果與熱療的溫度和時(shí)間密切相關(guān)，溫度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞的殺傷作用越強(qiáng)。mDRA-6與熱療聯(lián)合作用時(shí)，呈現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)。在細(xì)胞存活率與凋亡率檢測(cè)以及細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合處理組的細(xì)胞存活率明顯低于單獨(dú)處理組，凋亡率和增殖抑制率則顯著高于單獨(dú)處理組。這表明聯(lián)合作用能夠更有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其效果優(yōu)于單一治療方式。這種協(xié)同效應(yīng)可能源于多種因素。從氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制來(lái)看，聯(lián)合作用顯著增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，使細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累。mDRA-6和熱療單獨(dú)作用時(shí)，雖然也能使細(xì)胞內(nèi)ROS水平有所升高，但聯(lián)合作用下ROS水平的升高更為顯著。ROS作為細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子，其大量積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，引發(fā)一系列氧化損傷，如脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷等。這些氧化損傷會(huì)破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在相關(guān)信號(hào)通路方面，聯(lián)合作用通過(guò)調(diào)控凋亡和增殖相關(guān)信號(hào)通路，協(xié)同發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。聯(lián)合處理組中，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低，這使得細(xì)胞內(nèi)促凋亡與抗凋亡的平衡向凋亡方向傾斜，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。增殖相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)顯著下降，p21表達(dá)顯著上升，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制了細(xì)胞的增殖?；虮磉_(dá)水平分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合作用的機(jī)制，聯(lián)合處理組凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9mRNA表達(dá)顯著升高，氧化應(yīng)激相關(guān)基因Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)顯著降低。Caspase-3、Caspase-9是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，其基因表達(dá)的升高表明聯(lián)合作用能夠進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Nrf2/HO-1信號(hào)通路在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合作用下Nrf2、HO-1基因表達(dá)的降低，可能是由于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增強(qiáng)，導(dǎo)致該信號(hào)通路受到抑制，從而使細(xì)胞的抗氧化能力下降，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與相關(guān)研究具有一定的一致性。在其他關(guān)于腫瘤治療的研究中，也發(fā)現(xiàn)不同治療方法的聯(lián)合使用能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，提高治療效果。有研究表明，化療藥物與熱療聯(lián)合使用時(shí)，熱療可以提高腫瘤組織內(nèi)化療藥物的濃度，增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)還能降低化療藥物對(duì)正常組織的毒性。在分子機(jī)制方面，一些研究也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療能夠通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激、信號(hào)通路和基因表達(dá)等多種途徑來(lái)發(fā)揮協(xié)同作用。與前人研究相比，本研究的創(chuàng)新之處在于探究了mDRA-6這種具有獨(dú)特生物學(xué)活性的天然化合物與熱療的聯(lián)合作用，為肝癌治療提供了新的思路和方法。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。mDRA-6與熱療的聯(lián)合治療方法為肝癌的治療提供了一種新的選擇，有望提高肝癌患者的治療效果和生存率。在實(shí)際應(yīng)用中，還需要考慮多種因素。熱療的實(shí)施需要精確控制溫度和時(shí)間，以確保既能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，又能減少對(duì)正常組織的損傷。mDRA-6的使用劑量和給藥方式也需要進(jìn)一步優(yōu)化，以提高其療效和安全性。聯(lián)合治療可能會(huì)增加患者的治療負(fù)擔(dān)和不良反應(yīng)，因此需要密切關(guān)注患者的身體狀況，及時(shí)調(diào)整治療方案。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探究mDRA-6與熱療聯(lián)合治療的最佳方案，包括熱療的參數(shù)設(shè)置、mDRA-6的劑量和給藥時(shí)間等。還可以深入研究聯(lián)合治療對(duì)肝癌患者免疫功能的影響，以及如何通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能來(lái)增強(qiáng)治療效果。將聯(lián)合治療與其他治療方法，如化療、靶向治療等相結(jié)合，探索更加有效的綜合治療方案，也是未來(lái)研究的重要方向。5.3與其他相關(guān)研究對(duì)比在肝癌治療研究領(lǐng)域，諸多學(xué)者圍繞不同治療方法展開(kāi)了廣泛探究，為臨床治療提供了豐富的理論依據(jù)和實(shí)踐參考。與本研究密切相關(guān)的是熱療聯(lián)合其他物質(zhì)治療肝癌的研究，這些研究在治療效果和作用機(jī)制方面呈現(xiàn)出一定的異同點(diǎn)。在治療效果方面，本研究發(fā)現(xiàn)mDRA-6與熱療聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有顯著的協(xié)同殺傷效果，能夠有效抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道了熱療與化療藥物聯(lián)合治療肝癌的效果，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤抑制率明顯高于單獨(dú)使用化療藥物或熱療組。在對(duì)順鉑與熱療聯(lián)合作用于肝癌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理后肝癌細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高，細(xì)胞凋亡率也明顯增加。這與本研究中mDRA-6與熱療聯(lián)合作用的結(jié)果具有相似性，均表明聯(lián)合治療能夠增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。也有研究存在差異之處。某些靶向藥物與熱療聯(lián)合治療肝癌時(shí)，雖然也能提高治療效果，但在具體的作用效果上與本研究有所不同。一些靶向藥物主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的特定信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，與熱療聯(lián)合后，主要是增強(qiáng)了對(duì)該信號(hào)通路的抑制效果，而本研究中mDRA-6與熱療聯(lián)合作用的機(jī)制更為復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、凋亡和增殖相關(guān)信號(hào)通路以及基因表達(dá)等多個(gè)層面。從作用機(jī)制來(lái)看