熒光光譜法的理論基礎(chǔ)概述目錄TOC\o"1-3"\h\u22477熒光光譜法的理論基礎(chǔ)概述 1110391.1熒光產(chǎn)生原理 1149941.2熒光光譜法 220961.3熒光的發(fā)光方法 289291.3.1直接發(fā)光法 386721.4熒光光譜分類及同步熒光光譜法 3272981.5熒光光譜基本參數(shù) 4261891.5.1激發(fā)光譜 4153401.5.2發(fā)射光譜 5168601.6外部環(huán)境影響因素 51.1熒光產(chǎn)生原理熒光是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象，其本質(zhì)是光線。當(dāng)使用紫外波段至紅外波段的光對物質(zhì)進(jìn)行照射，物質(zhì)會產(chǎn)一些光線，當(dāng)停止照射時，光線就消失不見，這種光線我們稱為熒光。在進(jìn)行抗生素的檢測中常常使用熒光技術(shù)，此類技術(shù)是非常不錯的手段，有突出的優(yōu)點和特點，圖1.1為熒光的產(chǎn)生過程。其原理是大部分的物質(zhì)，在不受外界干擾下分子是處于單重態(tài)的，此時當(dāng)光線對分子進(jìn)行照射，那么處于單重態(tài)的分子通過吸收能量而轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)單重態(tài)。處在激發(fā)單重態(tài)的分子在結(jié)構(gòu)上容易發(fā)生變化，因此轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)單重態(tài)后，分子將會通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換的輻射躍遷或衰變而返回基態(tài)，在從激發(fā)單重態(tài)跳到基態(tài)的時就會伴隨熒光的出現(xiàn)[19]。在此時對熒光信號進(jìn)行捕捉，進(jìn)行針對性的分析，這就是熒光光譜法。圖1.1熒光的產(chǎn)生1.2熒光光譜法熒光光譜的原理是，光波在振動周期內(nèi)傳播的距離存在差異，熒光光譜就是這個不同距離的相對強度，當(dāng)光波的長度和強度處于不同狀態(tài)時，就可以繪制出形狀不同的光譜。當(dāng)波在一個振動周期內(nèi)傳播的距離以及強弱程度保持不變的情況下，能夠通過光源發(fā)出的光分離成所需要的單色光的器件來檢測不同的熒光強弱程度，繪制的曲線就稱為熒光光譜。熒光光譜法其特點眾多，優(yōu)點更是突出：靈敏度高——熒光光譜法由于其技術(shù)本身的特點，在測試過程中具有很強的針對性，也就是＂靈敏度＂高。這是由于其在入射光的90度方向進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，送就形成了一個暗背景操作，所以相比于紫外分光光度法等技術(shù)就相對的提高了所要光的強度。選擇性強——傳統(tǒng)的熒光光譜法、同步熒光光譜法和其它通用熒光光譜法等只能得到熒光光譜和激發(fā)光譜。熒光光譜可以同時掃描波長和發(fā)射波長，并且可以獲得更多的樣品差異信息，利用差分特征可以方便、準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別。（3）樣品用量少——在一些其他測試方法中往往用大量的實驗樣品進(jìn)行實驗，但熒光光譜法針對性強且靈敏度高，所以避免了此類缺點，只需少量樣品即可得到同樣的效果。這種好處是更容易對于稀缺樣品或者數(shù)量不多的的情況進(jìn)行檢測。（4）信息量豐富——因為熒光光譜法其自身包含多種物理參量，這些物理參量能準(zhǔn)確的代表分子的關(guān)鍵信息，所以熒光法可提供多種多樣的樣品信息。（5）方便，快速——在一些常規(guī)檢測方法中，常會對復(fù)雜的成分進(jìn)行分離、萃取、提純等復(fù)雜的預(yù)處理，利用熒光光譜檢測只需要稀釋、澄清等操作便可。再有其掃描速度比其他方法快很多，大大縮短了檢測時間。此外，實驗儀器內(nèi)部運轉(zhuǎn)原理及程序設(shè)置往往復(fù)雜難懂，但實驗儀器操作簡單，上手容易，可根據(jù)使用說明書便可完成實驗操作。（6）環(huán)?！捎谄錁悠酚昧可偾覜]有需要加入有機溶劑等才能進(jìn)行的復(fù)雜前處理，所以不會帶來環(huán)境污染[20]。1.3熒光的發(fā)光方法抗生素檢測中的熒光發(fā)光方法主要根據(jù)物質(zhì)本身產(chǎn)生熒光能力的大小或者熒光量子產(chǎn)率能力的高低來決定，一般情況下有直接發(fā)光法和間接發(fā)光法兩種。1.3.1直接發(fā)光法抗生素的直接發(fā)光法需要抗生素本身能發(fā)出大量光線，并且熒光量子能被儀器檢測到。喹諾酮類抗生素能直接產(chǎn)生較強的熒光，因為此類分子中具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)，這類抗生素一般可用來直接發(fā)光法測定。所以此類方法對抗生素發(fā)射熒光的能力有一定的要求。1.3.2間接發(fā)光法若抗生素達(dá)不到直接發(fā)光法的情況下，這類抗生素就需要采用間接發(fā)光法進(jìn)行檢測。在抗生素檢測中，間接發(fā)光法主要有三類，分別是熒光衍生法、熒光猝滅法、敏化熒光法等[21]。1.4熒光光譜分類及同步熒光光譜法目前，熒光光譜技術(shù)主要有六類：（1）常規(guī)熒光光譜技術(shù)常規(guī)熒光分析法只要被測物質(zhì)自身可以產(chǎn)生熒光，即可通過測量熒光強度來反演出被測物質(zhì)的濃度?？梢援a(chǎn)生熒光的物質(zhì)均有特殊的能級與其相對應(yīng)，即擁有屬于該物質(zhì)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。不同物質(zhì)可以根據(jù)這一特性進(jìn)行準(zhǔn)確的定性。（2）三維熒光光譜技術(shù)近幾年科技不斷發(fā)展，熒光技術(shù)不斷完善，一些研究人員發(fā)明了一種三維的新型熒光分析方法。三維光譜一般由三個軸組成一個立體的圖像，與二維光譜圖的技術(shù)特點相似，不同的變量是增加了波長變化時熒光強度的變化情況。（3）同步熒光光譜技術(shù)同步熒光光譜有很多分類，同步熒光分析法的技術(shù)特點是對激發(fā)波長和發(fā)射波長同時進(jìn)行掃描并繪制成光譜]。與常規(guī)熒光光譜法相比，某些光譜法可能由激發(fā)光譜決定，某些用發(fā)射光譜決定，但同步法師二者共同決定。激發(fā)波長和發(fā)射波長間保持恒定的波長間隔Δλ（Δλ＝Δλeｍ－Δλex）,并同時對被測物質(zhì)的吸收特性和發(fā)射特性加以利用，進(jìn)一步改善了熒光光譜的選擇性[22]。（4）導(dǎo)數(shù)熒光光譜技術(shù)導(dǎo)數(shù)熒光光譜二維圖的橫坐標(biāo)是以熒光強度對熒光波長求導(dǎo)所得，橫坐標(biāo)是熒光波長。可求一階、二階等不等階數(shù)的熒光光譜[23]。（5）時間分辨熒光光譜技術(shù)理論上，根據(jù)“熒光壽命”特定波長在不同時間段的熒光強度為縱軸，波長為水平軸，獲得二維圖形是時間分辨熒光光譜。當(dāng)激發(fā)波長執(zhí)行相同的操作，可以得到激發(fā)波長時間分辨熒光光譜。（6）空間分辨熒光光譜技術(shù)空間分辨熒光光譜實現(xiàn)原理更為復(fù)雜，研究方向也更加深入。主要是對三維立體空間的某一特定點進(jìn)行取樣確定，讀取出光譜信息。本實驗采用恒波長同步熒光光譜技術(shù)。為了不影響信號形狀和強度，前期需要測得合適的發(fā)射波長和激發(fā)波長。為了得出理想的同步熒光光譜，需要在熒光材料上進(jìn)行大量的初步實驗。初步試驗是為了對不同差值的進(jìn)行比較，當(dāng)接近于斯托克斯位移的波長差時，半峰寬度最小，對后續(xù)實驗影響最小，同步熒光信號最強，效果最好，當(dāng)存在雜質(zhì)會導(dǎo)致出現(xiàn)瑞利散射和拉曼散射，這將導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)巨大誤差，但選擇合適的差值會減小干擾和誤差。綜上對于成分復(fù)雜的熒光物質(zhì)，利用同步熒光光譜高靈敏度和選擇性強的特點進(jìn)行操作，會帶來極大的便利。每種抗生素的分子結(jié)構(gòu)存在大大小小的差異，這種分子結(jié)構(gòu)不確定的因素就導(dǎo)致其吸收光和發(fā)射光的波長存在不同。利用同步熒光光譜法是針對他的特點測出物質(zhì)間的不同。同一物質(zhì)濃度的高低導(dǎo)致結(jié)果也不相同，由于分子密度增加所發(fā)射出的熒光強度也就越強；當(dāng)密度不夠大，所得到的結(jié)果十分微小，分析起來非常困難。1.5熒光光譜基本參數(shù)1.5.1激發(fā)光譜當(dāng)單位面積上所接受可見光的光通量在一個合適的狀態(tài)，物質(zhì)中的帶負(fù)電的亞原子粒子處于電子被激發(fā)到較高能級但尚未電離的狀態(tài)，回落到電子在離核最近的軌道上，產(chǎn)生一定波長的物質(zhì)。熒光物質(zhì)處在紅外光線到紫外光線的狀態(tài)時，能被測出的熒光強度就是激發(fā)光譜。激發(fā)光譜的波長也就是處于某一波長的相對激發(fā)效率。1.5.2發(fā)射光譜發(fā)射光譜是指光源所發(fā)出的光譜，發(fā)射光譜的內(nèi)部原理是波在一個振動周期內(nèi)傳播的距離為某一定值時，發(fā)射熒光的光的強度在一定區(qū)域內(nèi)的變化情況，也就是不同波長所有頻譜的電磁輻射的相對強度。而要繪制發(fā)射光譜，則就需要以λex為激發(fā)光源,然后對其所發(fā)射的光譜進(jìn)行相應(yīng)的掃描，在此基礎(chǔ)上完成各波長的熒光強度的檢測。待檢測完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄，再以熒光強度F對發(fā)射波長λ作圖，最后得到的就是發(fā)射光譜。1.6外部環(huán)境影響因素（1）散射光的影響一般拉曼散射和瑞利散射為主要影響因素，當(dāng)物質(zhì)產(chǎn)生的熒光強度較弱或者樣品未經(jīng)預(yù)處理后導(dǎo)致顆粒較大時的情況。（2）溫度的影響溫度會影響樣品分子的內(nèi)部運動，同時光路中存在水蒸氣，水蒸氣的含量也會受溫度的影響，當(dāng)水蒸氣含量過大時光源無法對物質(zhì)進(jìn)行百分百的照射，就導(dǎo)致能量分配不均。所以實驗過程中要保持溫度一致。（3）光源的影響當(dāng)光源強度發(fā)生變化時，對光譜