人副流感病毒核酸檢測技術指南2025-04-23實施2025-04-23實施I 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14縮略語 15病毒核酸檢測 1附錄A(資料性)痰液標本預處理 4附錄B(資料性)引物和探針序列及RT-PCR反應體系組成 5參考文獻 6本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提出。本文件由中國疫苗行業(yè)協(xié)會歸口。本文件起草單位：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所、巨吉眾合生物科技有限公司、首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院、北京市疾病預防控制中心、北京市首都兒科研究所、河南省疾病預防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病預防控制中心、江西省疾病預防控制中心、廣州市婦女兒童醫(yī)療中心。本文件主要起草人：毛乃穎、朱貞、張燕、姬奕昕、崔愛利、曹蕾、江潔、劉瑩、謝正德、陳萌、趙林清、徐瑾、田曉靈、李健雄、朱冰。人副流感病毒是引發(fā)嬰幼兒及青少年急性呼吸道感染的重要病原體。國內(nèi)外流行病學監(jiān)測數(shù)據(jù)顯吸道合胞病毒。目前，人副流感病毒已被列為我國急性呼吸道傳染病哨點監(jiān)測的重要病原體之一。及疾病防控具有關鍵作用。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應因其高靈敏度與特異性，成為人副流1僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本W(wǎng)S233病原微生物實驗室生物安全通用準則HPIV1和HPIV3屬于呼吸道病毒屬，HPIV2和HPIV4屬于腮Ct值：熒光信號超過背景閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)transcriptionpolymerasRNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RNaseP:核糖核酸酶P(ribonucleaseP)5.1.1呼吸道標本(含鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子、支氣管肺泡灌洗液、鼻咽吸取物及氣采集后無需預處理，可直接進行病毒RNA提取。5.1.2痰液標本需經(jīng)蛋白酶K消化或痰液消化液預處理(見附錄A)后進行病毒RNA提取。5.1.3標本采集后24h內(nèi)檢測，需于2℃~8℃保存；若無法在24h內(nèi)完成檢測，應于-60℃~-80℃病毒RNA提取應嚴格遵循試劑盒或全自動核酸提取儀操作說明執(zhí)行，若計劃在24h內(nèi)使用，需于2℃~8℃保存；如需長期保存，應于-60℃~-80℃超低溫環(huán)境保存，避免反復凍融。2合成四種血清型HPIV的特異性引物和探針，探針分別標記不同的熒光報告基團，用于不同血清型HPIV的核酸檢測(見附錄B.1)。配制HPIV四種血清型單通道核酸檢測Real-timeRT-PCR反應體系，包含預混反應聚合酶混合液、血清型特異性引物(終濃度400nM)、TaqMan探針(終濃度200nM)、RNase-free水等5.5.1第一階段，反轉(zhuǎn)錄45℃、5min。5.5.2第二階段，預變性95℃、5min。5.5.3第三階段，95℃、15s,57℃、34s,40個循環(huán)，在第三階段每個循環(huán)的退火延伸時收集熒光。熒光檢測模式為FAM熒光(HPIV1)、VIC熒光(HPIV2)、CY5熒光(HPIV3)、TexasRed熒光 5.6.1Ct值<35.0,出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，有明顯的指數(shù)增長期，判定為陽性。5.6.2Ct值>38.0或無數(shù)值，擴增曲線無指數(shù)增長期，判定為陰性。5.7.1設立陰性對照、陽性對照和提取對照監(jiān)測核酸檢測有效性；設立RNaseP對照監(jiān)測采集的標本a)陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。b)陽性對照Ct值<35.0,并且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線。c)提取對照無Ct值并且無擴增曲線。d)RNaseP對照檢測結(jié)果陽性代表采集的標本質(zhì)量符合要求。在HPIV核酸檢測結(jié)果判定為陰性5.7.2定期校準和維護熒光定量PCR儀、核酸提取儀、移液5.7.3定期對標本處理、核酸提取和檢測等實驗場所進行消毒和效果驗證，避免核酸污染。5.8.2檢測信息：檢測項目、檢測人員、檢測日期、檢測依據(jù)、檢測方法、試劑名稱、試劑批號、試5.8.3實驗室信息：檢測場所、儀器設備編號、儀器校準日期和使用狀態(tài)。5.9.1根據(jù)《人間傳染的病原微生物目錄》(2023版)的規(guī)定，HPIV核酸檢測應在生物安全二級實驗35.9.2實驗室應遵循GB19489和WS235.9.3個人防護和實驗過程中產(chǎn)生的所有廢棄物應遵循GB19489的相關4(資料性)痰液標本中加入等體積蛋白酶K磷酸鹽緩沖液(推薦工作濃度為2mg/mL),55℃條件下震蕩消化30min～60min,待痰痰液充分消化后，進行病毒RNA提取。痰液消化液的儲存液配制見表A.1,質(zhì)量/體積氯化鈉氯化磷磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀去離子水PH值(25℃)5(資料性)引物和探針序列及RT-PCR反應體系組成B.1引物和探針序列引物探針序列見表B.1。表B.1HPIV核酸檢測引物和探針序列序列(5’→3')上游引物下游引物FAM-TATCTRCACATCCTTGAG上游引物下游引物VIC-CTCCKATCATTGAGGCTC上游引物ATCTCTCATACCTTYAACATAA下游引物CY5-CATGYTCTCTAGCACT上游引物下游引物TexasRed-TATCATCATCTGCCAa探針兩端標記了不同的熒光信號基團和淬滅基團。B.2RT-PCR反應體系組成RT