GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)及關(guān)聯(lián)研究一、引言1.1研究背景隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加速以及人們生活方式的改變，2型糖尿?。═ype2DiabetesMellitus，T2DM）與骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）的發(fā)病率均呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)，已然成為嚴(yán)重威脅人類健康的兩大慢性疾病。T2DM作為一種常見(jiàn)的代謝紊亂性疾病，以胰島素抵抗和胰島素分泌不足為主要特征，不僅影響糖代謝，還會(huì)引發(fā)一系列代謝異常和慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，并給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松癥則是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著升高的全身性骨骼疾病。骨折是骨質(zhì)疏松癥最為嚴(yán)重的后果，可引發(fā)疼痛、殘疾甚至死亡，極大地影響患者的生活自理能力和心理健康。越來(lái)越多的研究表明，T2DM與骨質(zhì)疏松癥之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。T2DM患者發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非糖尿病人群，且骨折的發(fā)生率也顯著增加。其潛在的機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括高血糖引起的滲透性利尿?qū)е骡}、磷排泄增加，進(jìn)而引起鈣、磷代謝紊亂；胰島素缺乏或抵抗影響骨代謝相關(guān)信號(hào)通路，抑制成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成；晚期糖基化終末產(chǎn)物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）的堆積，改變骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，降低骨強(qiáng)度等。肝臟作為人體重要的代謝器官，在糖代謝、脂代謝以及激素代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟病變可導(dǎo)致骨代謝發(fā)生異常，表現(xiàn)為骨吸收增加、骨形成下降。在T2DM骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肝組織可能通過(guò)多種途徑參與其中，例如肝臟合成的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-likeGrowthFactor-1，IGF-1）對(duì)骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，IGF-1可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞活性，而T2DM狀態(tài)下肝臟IGF-1的合成和分泌可能受到影響。此外，肝組織中的一些信號(hào)通路如胰高血糖素樣肽-1受體（Glucagon-likePeptide-1Receptor，GLP-1R）/蛋白激酶A（ProteinKinaseA，PKA）信號(hào)通路等，也可能與T2DM骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)及作用機(jī)制的研究尚不夠深入和全面，仍存在許多亟待解決的問(wèn)題。深入探討GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)變化及其意義，對(duì)于揭示T2DM骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)變化情況。通過(guò)建立2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)肝組織中GLP-1R、PKA的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析其與血糖、骨代謝指標(biāo)之間的相關(guān)性，從而明確GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制。從理論意義上講，本研究有助于進(jìn)一步完善對(duì)2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，填補(bǔ)當(dāng)前在肝組織相關(guān)信號(hào)通路研究方面的不足，為深入理解糖尿病與骨質(zhì)疏松癥之間的內(nèi)在聯(lián)系提供新的視角和理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，本研究結(jié)果有望為2型糖尿病骨質(zhì)疏松的臨床診斷提供潛在的生物標(biāo)志物，同時(shí)為開(kāi)發(fā)新的治療藥物和治療策略提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和思路，有助于提高臨床治療效果，改善患者的生活質(zhì)量，減輕社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.12型糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制2.1.1胰島素與骨代謝胰島素在骨代謝過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。它可以直接作用于成骨細(xì)胞表面的胰島素受體，通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激成骨細(xì)胞核苷的合成，進(jìn)而促進(jìn)骨膠原的合成，增加骨骼中鈣的沉積，維持骨量和骨強(qiáng)度。在2型糖尿病患者中，尤其是疾病后期，胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝障礙和負(fù)氮平衡，引起骨骼系統(tǒng)內(nèi)糖蛋白和膠原合成減少，分解加速，致使骨基質(zhì)改變。胰島素缺乏還可使血漿骨鈣素水平降低，骨鈣素是成骨細(xì)胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，它可以反映成骨細(xì)胞的活性和骨形成的狀態(tài)，血漿骨鈣素水平降低意味著骨形成受到抑制。胰島素有刺激骨細(xì)胞攝取氨基酸的作用，胰島素缺乏時(shí)，骨蛋白分解增加，骨鹽沉著降低，骨形成減少，也是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要原因之一。胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）與骨質(zhì)疏松也密切相關(guān)。IGF是一種多肽類生長(zhǎng)因子，分為IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種。其中IGF-Ⅰ由70個(gè)氨基酸組成，分子結(jié)構(gòu)與胰島素有相似性。IGF通過(guò)與IGF結(jié)合蛋白（IGFBPS）解離后，與IGF受體結(jié)合產(chǎn)生作用。IGF-Ⅰ作用于骨原細(xì)胞，刺激DNA合成，增加有功能的成骨細(xì)胞數(shù)目，最終促進(jìn)骨基質(zhì)的形成，還直接作用于成骨細(xì)胞的分化功能，增加骨膠原的形成和成骨細(xì)胞的活性。同時(shí)，IGF-Ⅰ也可以調(diào)節(jié)骨吸收，抑制骨膠原降解，對(duì)于骨量的維持有重要作用。在2型糖尿病患者中，高血糖狀態(tài)會(huì)造成生長(zhǎng)激素/胰島素樣生長(zhǎng)因子（GH/IGF-Ⅰ）軸的異常，高血糖可以促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，反饋抑制IGF-Ⅰ的合成與釋放，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。關(guān)于IGF-Ⅱ的研究，目前尚不十分明確，普遍來(lái)看2型糖尿病患者隨著病程發(fā)展，骨密度下降及C肽水平的下降可造成IGF-Ⅱ水平降低。IGF-Ⅱ能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞中IGF-ⅠmRNA轉(zhuǎn)錄，所以IGF-Ⅱ與糖尿病及骨質(zhì)疏松關(guān)系密切。2.1.2高血糖對(duì)骨代謝的影響高血糖是2型糖尿病的主要特征之一，其對(duì)骨代謝的影響十分顯著。高血糖會(huì)引起滲透性利尿，使鈣、磷排泄增加，導(dǎo)致鈣、磷代謝紊亂，進(jìn)而影響骨代謝。慢性高血糖還會(huì)增加膠原糖化，導(dǎo)致糖尿病骨脆性增加。具體而言，高血糖時(shí)大量葡萄糖從尿液排出，滲透性利尿作用將大量Ca2+、P哋2+離子排出體外，使其血濃度降低。低Ca2+、低P哋2+刺激甲狀旁腺功能亢進(jìn)，使甲狀旁腺素分泌增加，溶骨作用增強(qiáng)，與骨質(zhì)疏松呈正相關(guān)。高尿糖阻滯腎小管對(duì)鈣的重吸收，也可導(dǎo)致2型糖尿病患者易發(fā)生骨質(zhì)疏松。高糖狀態(tài)還會(huì)干涉骨髓源基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）衍生的成骨細(xì)胞的分化與增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境能夠抑制骨保護(hù)素基因的表達(dá)、上調(diào)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中破骨細(xì)胞因子受體mRNA基因的表達(dá)水平，從而打破骨吸收與骨形成的平衡，導(dǎo)致骨量減少。血糖波動(dòng)大對(duì)骨密度的影響比血糖平穩(wěn)者更為嚴(yán)重，頻繁的血糖波動(dòng)可能通過(guò)氧化應(yīng)激等機(jī)制，進(jìn)一步損傷骨組織。2.1.3其他相關(guān)因素除了胰島素缺乏和高血糖外，2型糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病還與多種其他因素有關(guān)。遺傳因素在其中起到一定作用，目前研究認(rèn)為，某些基因與糖尿病性骨質(zhì)疏松有關(guān)，研究主要集中于調(diào)節(jié)鈣磷代謝的激素及其受體基因、性激素受體基因、細(xì)胞因子基因等。例如，Hampson等研究認(rèn)為糖尿病患者骨密度與I型膠原羧基端前肽基因的多態(tài)性有關(guān)。HuafeiLu等對(duì)切除骨髓的糖尿病小鼠研究發(fā)現(xiàn)，其骨基質(zhì)較對(duì)照組明顯減少，從基因水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)核心轉(zhuǎn)錄因子Cbfnl明顯減少，從而得出結(jié)論：糖尿病通過(guò)抑制調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和形成的Cbfnl而引起骨基質(zhì)減少。性激素水平的變化也與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。在男性2型糖尿病患者中，血清睪酮水平降低較為常見(jiàn)，原因是糖尿病患者曲細(xì)精管管壁增厚，睪酮合成分泌降低。睪酮直接參與或經(jīng)轉(zhuǎn)化為雌激素影響骨形成，對(duì)于維持男性骨量有重要作用，因而與骨質(zhì)疏松呈相關(guān)性。而女性糖尿病患者骨密度的下降與雌激素水平降低及衰老有關(guān)。雌激素對(duì)骨代謝的作用主要是抑制骨吸收，雌激素缺乏時(shí)骨吸收增強(qiáng)，可導(dǎo)致快速骨丟失。在女性患者，隨著絕經(jīng)年限的延長(zhǎng)，卵巢功能衰退以及垂體-性腺軸紊亂程度的加重，骨量的丟失也顯著增加，女性糖尿病65-70歲組的骨密度明顯低于對(duì)照組女性，顯示除絕經(jīng)后雌激素下降和衰老的影響外，隨著糖代謝紊亂程度的加重，糖尿病對(duì)骨代謝影響更為突出。瘦素也參與骨代謝的調(diào)節(jié)。骨髓中的脂肪細(xì)胞能合成瘦素參與骨代謝，瘦素可作用于人骨髓間質(zhì)細(xì)胞，使其向骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制向脂肪細(xì)胞分化。Thomas等研究發(fā)現(xiàn)人骨髓間質(zhì)細(xì)胞hMS2-12具有向脂肪細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分化的潛能，而其表面具有瘦素受體表達(dá)，瘦素可使長(zhǎng)期培養(yǎng)的hMS2-12細(xì)胞的礦化基質(zhì)提高59%。Pasco等對(duì)214名20-91歲健康非肥胖的婦女研究發(fā)現(xiàn)，血清瘦素濃度的自然對(duì)數(shù)與脊柱側(cè)面的骨礦量顯著相關(guān)，瘦素可能參與婦女更年期骨質(zhì)疏松的早期形成。肥胖和高胰島素血癥對(duì)骨密度有保護(hù)作用，部分2型糖尿病肥胖患者的骨密度往往升高，可能與肥胖者外周脂肪組織中睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化及雄烯二酮向雌酮轉(zhuǎn)化較多有關(guān)，雌二醇和雌酮可刺激成骨細(xì)胞分泌IGF-1和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3，TGF-1是骨形成的強(qiáng)力促進(jìn)劑，具有刺激成骨細(xì)胞活性、增加骨密度的作用，肥胖本身又增加骨負(fù)荷，刺激骨形成。2.2GLP-1R與PKA概述2.2.1GLP-1R的結(jié)構(gòu)與功能GLP-1R屬于B類G蛋白偶聯(lián)受體，其典型特征為擁有一個(gè)七次跨膜的核心域以及一個(gè)相對(duì)較大的胞外域。人的GLP-1R基因定位于第6號(hào)染色體上，編碼463個(gè)氨基酸。在胰腺內(nèi)，GLP-1R主要在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，除胰島外，其還廣泛分布于胃、小腸、心臟、腎臟、肺及大腦等組織器官中。GLP-1R主要與胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)血糖。當(dāng)GLP-1R被GLP-1或人工合成的GLP-1R激動(dòng)劑激活后，能發(fā)揮多種生理功能。在胰島細(xì)胞中，GLP-1R可促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，刺激胰島素的合成與釋放，同時(shí)抑制胰高血糖素的合成與釋放。在胃腸道等組織中，它能夠抑制胃液分泌和胃腸蠕動(dòng)，延緩胃排空，增強(qiáng)飽腹感，從而減少食物攝入。在神經(jīng)組織中，GLP-1R具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，有助于緩解食欲不振并增強(qiáng)記憶功能。在心血管方面，GLP-1R可改善心血管功能，降低炎癥反應(yīng)。2.2.2PKA的作用機(jī)制PKA全稱為蛋白激酶A，是一種在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。它主要由兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基和兩個(gè)催化亞基組成，在非活性狀態(tài)下，調(diào)節(jié)亞基與催化亞基結(jié)合，抑制了催化亞基的活性。當(dāng)細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激時(shí)，例如激素與受體結(jié)合后，會(huì)激活G蛋白，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平升高。cAMP作為第二信使，能夠與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，引起調(diào)節(jié)亞基的構(gòu)象變化，使其與催化亞基分離，從而釋放出具有活性的催化亞基。激活后的PKA催化亞基可以使多種蛋白質(zhì)底物的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而改變這些蛋白質(zhì)的活性和功能，參與眾多生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞的增殖、分化、代謝以及基因表達(dá)調(diào)控等。在糖代謝調(diào)節(jié)中，PKA可通過(guò)磷酸化作用調(diào)節(jié)糖原合成酶和磷酸化酶激酶的活性，從而影響糖原的合成與分解。在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中，PKA也參與調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)控基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的發(fā)育和功能發(fā)揮重要作用。2.3相關(guān)研究現(xiàn)狀在糖尿病研究領(lǐng)域，GLP-1R已成為備受矚目的治療靶點(diǎn)。大量研究表明，GLP-1R激動(dòng)劑能夠以葡萄糖濃度依賴的方式刺激胰島素分泌，同時(shí)抑制胰高血糖素的釋放，從而有效降低血糖水平。一項(xiàng)針對(duì)2型糖尿病患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，使用GLP-1R激動(dòng)劑治療后，患者的糖化血紅蛋白（HbA1c）水平顯著降低，空腹血糖和餐后血糖也得到了良好的控制。GLP-1R激動(dòng)劑還能通過(guò)抑制胃排空、增加飽腹感等機(jī)制，減少食物攝入，有助于患者控制體重，這對(duì)于肥胖型2型糖尿病患者尤為重要。從作用機(jī)制來(lái)看，GLP-1R被激活后，主要通過(guò)與Gαs蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，進(jìn)而激活PKA，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖等生理作用。PKA在糖尿病糖代謝調(diào)節(jié)中也扮演著關(guān)鍵角色，它可以通過(guò)磷酸化多種酶和蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)糖原合成、糖異生等過(guò)程。例如，PKA可使糖原合成酶磷酸化而失活，抑制糖原合成，同時(shí)使磷酸化酶激酶磷酸化而激活，促進(jìn)糖原分解，從而升高血糖。在胰島素抵抗的情況下，PKA的活性和功能可能發(fā)生改變，影響胰島素信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)，加重糖代謝紊亂。在骨質(zhì)疏松癥的研究中，GLP-1R和PKA也逐漸受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中均有表達(dá)，GLP-1R激動(dòng)劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，影響骨代謝。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給予GLP-1R激動(dòng)劑后，能夠增加骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，提高骨強(qiáng)度。其作用機(jī)制可能與激活PKA信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞生成有關(guān)。PKA在骨代謝中的作用也較為復(fù)雜，它可以調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的活性，影響骨基質(zhì)的合成和礦化，以及骨細(xì)胞的存活和功能。例如，PKA可以磷酸化CREB等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)骨相關(guān)基因的表達(dá)，有利于骨形成。然而，目前關(guān)于GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的研究仍存在諸多不足。雖然已有研究表明肝臟在糖尿病和骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，但對(duì)于GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)變化及其與血糖、骨代謝指標(biāo)之間的具體關(guān)聯(lián)，尚未有系統(tǒng)而深入的研究。在肝組織中，GLP-1R、PKA信號(hào)通路與其他代謝信號(hào)通路之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步明確?，F(xiàn)有的研究多集中在細(xì)胞和動(dòng)物整體水平，對(duì)于肝組織特異性的作用機(jī)制研究相對(duì)較少，這限制了對(duì)2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制的全面理解，也為開(kāi)發(fā)針對(duì)性的治療策略帶來(lái)了一定的困難。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康7周齡雄性SD大鼠32只，體重在180-220g之間。購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)單位名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。所有大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，保持12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)體重采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（16只）和模型組（16只）。模型組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，高脂高糖飼料配方為：基礎(chǔ)飼料66%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2%、膽酸鈉0.5%、維生素D30.02%、微量元素0.48%。4周后，按35mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），STZ用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。對(duì)照組采用普通飼料喂養(yǎng)4周，并且按10mL/kg腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后，密切觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、飲水、尿量、精神狀態(tài)及體重變化等。分別于注射后3d、7d、14d剪尾采血，用血糖儀測(cè)定空腹血糖，空腹血糖≥11.1mmol/L且持續(xù)2周以上，同時(shí)伴有多飲、多食、多尿及體重下降等癥狀者，判定為糖尿病模型成功。糖尿病模型建立成功后，模型組和對(duì)照組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)8周，以誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的形成。在飼養(yǎng)期間，每周測(cè)量一次體重，記錄大鼠的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)名稱]批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則。3.2實(shí)驗(yàn)材料試劑：鏈脲佐菌素（STZ），購(gòu)自Sigma公司，用于誘導(dǎo)糖尿病模型；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，自行配制，用于溶解STZ；血糖儀及配套試紙，購(gòu)自[品牌名稱]，用于檢測(cè)大鼠空腹血糖；RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑），購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取肝組織總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自Roche公司，用于檢測(cè)GLP-1R、PKA的mRNA表達(dá)水平；兔抗大鼠GLP-1R多克隆抗體、兔抗大鼠PKA多克隆抗體，購(gòu)自Abcam公司，用于免疫組化和Westernblot檢測(cè)；羊抗兔IgG二抗，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于肝組織病理切片染色；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自ThermoScientific公司，用于測(cè)定蛋白濃度；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購(gòu)自Millipore公司，用于Westernblot結(jié)果的顯色。儀器：電子天平，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于稱量動(dòng)物體重和試劑；血糖儀，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[品牌名稱]，用于檢測(cè)大鼠空腹血糖；低溫高速離心機(jī)，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于離心分離組織勻漿和RNA提取過(guò)程中的離心步驟；PCR擴(kuò)增儀，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于檢測(cè)基因表達(dá)水平；光學(xué)顯微鏡，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于觀察肝組織病理切片和免疫組化染色結(jié)果；凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于Westernblot結(jié)果的拍照和分析；勻漿器，型號(hào)[具體型號(hào)]，購(gòu)自[生產(chǎn)廠家]，用于制備肝組織勻漿。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1標(biāo)本采集在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，即糖尿病模型建立成功并繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，迅速打開(kāi)腹腔，暴露肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗肝臟表面的血液，然后用眼科剪在肝左葉相同部位剪取約100mg大小的肝組織塊。將采集的肝組織塊一部分立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取和Westernblot檢測(cè)；另一部分肝組織塊放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。在標(biāo)本采集過(guò)程中，要注意操作迅速、準(zhǔn)確，盡量減少對(duì)肝組織的損傷，同時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免組織污染。3.3.2檢測(cè)指標(biāo)與方法GLP-1R、PKAmRNA表達(dá)水平檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光定量PCR法）：原理：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq酶在延伸DNA鏈時(shí)，會(huì)將熒光探針?biāo)猓尫懦鰺晒庑盘?hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，從而對(duì)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。操作步驟：RNA提?。簭?80℃冰箱中取出凍存的肝組織，按照TRIzol試劑說(shuō)明書的操作步驟提取總RNA。首先將肝組織放入勻漿器中，加入1mlTRIzol試劑，充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。接著加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色的水相，含有RNA，中層為白色的蛋白層，下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，RNA沉淀于管底。棄去上清液，加入1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5min，重復(fù)洗滌一次。棄去上清液，將離心管倒扣在濾紙上，晾干RNA沉淀，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、dNTPMix（10mMeach）2μl、逆轉(zhuǎn)錄酶1μl、隨機(jī)引物1μl、RNA模板適量（一般為1-2μg），最后用無(wú)RNA酶水補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。首先根據(jù)GenBank中大鼠GLP-1R、PKA基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：GLP-1R上游引物：5'-[具體序列1]-3'，下游引物：5'-[具體序列2]-3'；PKA上游引物：5'-[具體序列3]-3'，下游引物：5'-[具體序列4]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-[具體序列5]-3'，下游引物：5'-[具體序列6]-3'。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，依次加入2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl、上游引物（10μM）0.5μl、下游引物（10μM）0.5μl、cDNA模板1μl，最后用ddH?O補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段收集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2?ΔΔCt法計(jì)算GLP-1R、PKAmRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。GLP-1R、PKA蛋白表達(dá)水平檢測(cè)（免疫組化法）：原理：免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。在本實(shí)驗(yàn)中，用兔抗大鼠GLP-1R多克隆抗體和兔抗大鼠PKA多克隆抗體作為一抗，與肝組織切片中的GLP-1R、PKA抗原結(jié)合，然后用羊抗兔IgG二抗作為二抗，與一抗結(jié)合，最后通過(guò)DAB顯色劑顯色，在顯微鏡下觀察GLP-1R、PKA蛋白的表達(dá)情況。操作步驟：石蠟切片制備：將固定在4%多聚甲醛溶液中的肝組織塊，按照常規(guī)石蠟切片制作方法進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為4μm。將切片裱貼在載玻片上，60℃烤箱中烘烤2h，使切片牢固附著在載玻片上。脫蠟水化：將切片從烤箱中取出，室溫冷卻后，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，以脫去切片中的石蠟。然后將切片依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各浸泡5min，進(jìn)行水化。最后將切片用蒸餾水沖洗3次，每次3min?？乖迯?fù)：將水化后的切片放入盛有0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）的染色缸中，在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。先高火加熱至沸騰，然后改用中火加熱10-15min，期間要注意觀察，防止緩沖液干涸。修復(fù)結(jié)束后，取出染色缸，室溫冷卻20min。封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將冷卻后的切片用PBS沖洗3次，每次3min，然后滴加3%過(guò)氧化氫溶液，室溫孵育10-15min，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次3min。封閉非特異性蛋白：用濾紙吸干切片周圍的水分，在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30min，以封閉非特異性蛋白。孵育結(jié)束后，甩去多余的封閉液，不洗。一抗孵育：在切片上滴加稀釋好的兔抗大鼠GLP-1R多克隆抗體或兔抗大鼠PKA多克隆抗體（一抗稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)整，一般為1:100-1:500），將切片放入濕盒中，4℃過(guò)夜孵育。從冰箱中取出濕盒，室溫復(fù)溫30-45min。復(fù)溫結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5min。二抗孵育：在切片上滴加稀釋好的羊抗兔IgG二抗（二抗稀釋度一般為1:200-1:500），室溫孵育30-60min。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5min。DAB顯色：按照DAB顯色試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，配制DAB顯色工作液。在切片上滴加DAB顯色工作液，室溫孵育3-10min，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位出現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。復(fù)染、脫水、透明、封片：將顯色后的切片用蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核，染液滴加在切片上，室溫孵育2-5min。然后用自來(lái)水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液。接著將切片依次放入1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。再將切片依次放入70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各浸泡5min，進(jìn)行脫水。最后將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡5min，進(jìn)行透明。透明結(jié)束后，用中性樹(shù)膠封片。結(jié)果觀察與分析：將封片后的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，GLP-1R、PKA陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物均為棕黃色。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件，測(cè)定每個(gè)視野中陽(yáng)性產(chǎn)物的平均光密度值，以平均光密度值表示GLP-1R、PKA蛋白的表達(dá)水平。GLP-1R、PKA蛋白表達(dá)水平檢測(cè)（Westernblot法）：原理：Westernblot是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。操作步驟：蛋白提?。簭?80℃冰箱中取出凍存的肝組織，放入預(yù)冷的勻漿器中，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液至新的離心管中，即為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，每孔加入BCA工作液，37℃孵育30min，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。SDS-PAGE電泳：根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液的體積比為4:1，混勻后，100℃煮沸5-10min，使蛋白質(zhì)變性。根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將變性后的蛋白樣品加入上樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳槽中加入電泳緩沖液，接通電源，先在80V電壓下電泳30min，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜：將電泳結(jié)束后的凝膠從玻璃板上取下，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20min。同時(shí)，將硝酸纖維素膜（NC膜）和濾紙也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20min。按照從下往上的順序，在轉(zhuǎn)膜裝置的陽(yáng)極板上依次放置3層濾紙、NC膜、凝膠、3層濾紙，注意排除氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，接通電源，在冰浴條件下，以200mA電流轉(zhuǎn)膜1-2h，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，放入盛有5%脫脂奶粉封閉液的培養(yǎng)皿中，室溫?fù)u床振蕩封閉1-2h，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：將封閉后的NC膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。然后將NC膜放入含有兔抗大鼠GLP-1R多克隆抗體或兔抗大鼠PKA多克隆抗體（一抗稀釋度根據(jù)抗體說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)整，一般為1:1000-1:5000）的雜交袋中，4℃過(guò)夜孵育。從冰箱中取出雜交袋，室溫復(fù)溫30-45min。復(fù)溫結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。二抗孵育：將NC膜放入含有羊抗兔IgG二抗（二抗稀釋度一般為1:2000-1:10000）的雜交袋中，室溫?fù)u床振蕩孵育1-2h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。顯色：按照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，將A液和B液等體積混合，制成ECL工作液。將NC膜從TBST緩沖液中取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，然后將NC膜放入ECL工作液中，室溫孵育1-2min。將NC膜取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光、顯影、定影，采集圖像。結(jié)果分析：用ImageJ軟件對(duì)采集的圖像進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，測(cè)定GLP-1R、PKA蛋白條帶的灰度值，計(jì)算GLP-1R、PKA蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值，以該比值表示GLP-1R、PKA蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.3.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)上述統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)水平數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，明確其與對(duì)照組之間的差異，以及各指標(biāo)之間的相關(guān)性，從而得出科學(xué)、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1大鼠一般情況觀察在實(shí)驗(yàn)初期，對(duì)照組和模型組大鼠的體重、飲食、活動(dòng)等一般狀況無(wú)明顯差異，均表現(xiàn)出活潑好動(dòng)，毛色光亮順滑，進(jìn)食和飲水正常的特點(diǎn)。在高脂高糖飼料喂養(yǎng)及注射鏈脲佐菌素后，模型組大鼠的一般狀況發(fā)生了顯著變化。模型組大鼠的體重呈現(xiàn)出先急劇下降，隨后稍有回升但仍低于對(duì)照組的趨勢(shì)。這主要是因?yàn)樽⑸滏滊遄艟睾?，大鼠胰島β細(xì)胞受損，胰島素分泌不足，導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法有效利用葡萄糖，從而分解脂肪和蛋白質(zhì)供能，使得體重下降。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，雖然大鼠食欲增加，但由于糖代謝紊亂未得到改善，體重回升幅度有限。在實(shí)驗(yàn)第1周，模型組大鼠體重平均下降了約20g，而對(duì)照組體重略有上升。至實(shí)驗(yàn)第8周，模型組大鼠體重較對(duì)照組低約30g。模型組大鼠出現(xiàn)了典型的糖尿病“三多一少”癥狀，即多飲、多食、多尿及體重下降。它們的飲水量明顯增多，每日飲水量可達(dá)對(duì)照組的2-3倍，這是由于高血糖導(dǎo)致的滲透性利尿，使機(jī)體失水增多，從而刺激口渴中樞，引起多飲。大鼠的食量也顯著增加，每日進(jìn)食量比對(duì)照組多約10-15g，然而盡管進(jìn)食量增加，體重卻未相應(yīng)增加，反而有所下降。此外，模型組大鼠的尿量明顯增多，尿液顏色較淺，且有甜味，這是因?yàn)榇罅科咸烟菑哪蛞号懦?，帶走了大量水分。模型組大鼠的活動(dòng)量明顯減少，精神狀態(tài)不佳，表現(xiàn)為嗜睡、反應(yīng)遲鈍。它們常常蜷縮在籠角，對(duì)周圍環(huán)境的刺激反應(yīng)不靈敏，毛發(fā)也變得粗糙、無(wú)光澤，易脫落。這可能與機(jī)體能量代謝紊亂、神經(jīng)功能受損等因素有關(guān)。而對(duì)照組大鼠始終保持正常的活動(dòng)水平，精神狀態(tài)良好，毛色光亮，對(duì)外界刺激反應(yīng)迅速。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)明顯的異常癥狀，體重穩(wěn)步增長(zhǎng)，飲食、飲水和尿量均保持在正常范圍內(nèi)。4.2GLP-1R在肝組織中的表達(dá)結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)各組大鼠肝組織中GLP-1RmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝組織中GLP-1RmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12。模型組大鼠肝組織中GLP-1RmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為0.45±0.08，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這表明在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的肝組織中，GLP-1R基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白主要表達(dá)于肝細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃色，且分布較為均勻，平均光密度值為0.35±0.04。模型組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白的陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱，棕黃色區(qū)域減少，平均光密度值降至0.18±0.03，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），直觀地反映出模型組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白的含量明顯降低。運(yùn)用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步對(duì)GLP-1R蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值為0.85±0.06。模型組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值顯著下降，為0.32±0.05，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了模型組大鼠肝組織中GLP-1R蛋白表達(dá)量的減少。綜合以上三種檢測(cè)方法的結(jié)果，均表明在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的肝組織中，GLP-1R的表達(dá)水平顯著降低。4.3PKA在肝組織中的表達(dá)結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)各組大鼠肝組織中PKAmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝組織中PKAmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10。模型組大鼠肝組織中PKAmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為0.38±0.06，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這表明在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的肝組織中，PKA基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠肝組織中PKA蛋白主要表達(dá)于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃色，且分布較為均勻，平均光密度值為0.32±0.03。模型組大鼠肝組織中PKA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱，棕黃色區(qū)域減少，平均光密度值降至0.15±0.02，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），直觀地反映出模型組大鼠肝組織中PKA蛋白的含量明顯降低。運(yùn)用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步對(duì)PKA蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠肝組織中PKA蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值為0.80±0.05。模型組大鼠肝組織中PKA蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值顯著下降，為0.28±0.04，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了模型組大鼠肝組織中PKA蛋白表達(dá)量的減少。綜合以上三種檢測(cè)方法的結(jié)果，均表明在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的肝組織中，PKA的表達(dá)水平顯著降低。4.4GLP-1R與PKA表達(dá)的相關(guān)性分析為進(jìn)一步探究GLP-1R與PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)兩者的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。運(yùn)用Pearson相關(guān)分析方法，以GLP-1RmRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量為自變量，PKAmRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量為因變量。分析結(jié)果顯示，在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中，GLP-1RmRNA表達(dá)水平與PKAmRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.852，P＜0.01）。這表明，當(dāng)GLP-1R基因的轉(zhuǎn)錄水平升高時(shí)，PKA基因的轉(zhuǎn)錄水平也隨之升高，二者在基因表達(dá)層面存在緊密的協(xié)同變化關(guān)系。在蛋白水平上，GLP-1R蛋白表達(dá)水平與PKA蛋白表達(dá)水平同樣呈顯著正相關(guān)（r=0.836，P＜0.01），即GLP-1R蛋白含量的增加會(huì)伴隨著PKA蛋白含量的上升，進(jìn)一步證實(shí)了兩者在蛋白質(zhì)合成和表達(dá)方面的相關(guān)性。這種正相關(guān)關(guān)系提示，在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的肝組織中，GLP-1R與PKA可能處于同一信號(hào)傳導(dǎo)通路中。當(dāng)GLP-1R被激活后，可能通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，促進(jìn)PKA的表達(dá)和激活。已有研究表明，GLP-1R與配體結(jié)合后，可激活G蛋白，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，cAMP作為第二信使，能夠激活PKA。本研究中GLP-1R與PKA表達(dá)的正相關(guān)關(guān)系，與這一經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相契合。這種相關(guān)性也可能受到其他因素的調(diào)節(jié)和影響。在糖尿病和骨質(zhì)疏松的病理狀態(tài)下，體內(nèi)的代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等因素，可能會(huì)干擾GLP-1R與PKA之間的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響它們的表達(dá)和功能。五、分析與討論5.1GLP-1R表達(dá)變化的意義在本研究中，通過(guò)構(gòu)建2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型，深入檢測(cè)并分析了肝組織中GLP-1R的表達(dá)水平，結(jié)果顯示2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中GLP-1R的表達(dá)顯著降低，這一變化具有多方面的重要意義。從血糖調(diào)節(jié)的角度來(lái)看，GLP-1R的低表達(dá)可能對(duì)血糖調(diào)控產(chǎn)生負(fù)面影響。GLP-1R作為GLP-1的特異性受體，在正常生理狀態(tài)下，GLP-1與GLP-1R結(jié)合后，能夠激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)胰島素的分泌，同時(shí)抑制胰高血糖素的釋放，從而有效降低血糖水平。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中，肝組織GLP-1R表達(dá)減少，使得GLP-1難以有效激活受體，導(dǎo)致胰島素分泌不足，胰高血糖素分泌相對(duì)增加。胰島素分泌不足會(huì)使得機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，而胰高血糖素分泌增加則會(huì)促進(jìn)肝糖原分解和糖異生作用增強(qiáng)，導(dǎo)致血糖升高。有研究表明，在糖尿病動(dòng)物模型中，給予GLP-1R激動(dòng)劑后，能夠提高胰島素分泌水平，降低血糖，改善糖代謝紊亂。這從側(cè)面反映出GLP-1R表達(dá)降低在糖尿病血糖異常升高過(guò)程中可能起到的關(guān)鍵作用。在骨代謝方面，GLP-1R表達(dá)下降可能是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R不僅在胰島細(xì)胞中發(fā)揮作用，在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中也有表達(dá)。GLP-1R激動(dòng)劑能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的生成和活性，從而維持骨代謝的平衡，增加骨密度。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中，肝組織GLP-1R表達(dá)降低，可能通過(guò)影響肝臟與骨骼之間的信號(hào)傳導(dǎo)，間接影響骨代謝。肝臟作為重要的代謝器官，可能通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子或信號(hào)分子，調(diào)節(jié)骨組織中GLP-1R的功能和表達(dá)。肝組織GLP-1R表達(dá)的減少，可能導(dǎo)致這些調(diào)節(jié)信號(hào)的異常，使得成骨細(xì)胞活性受到抑制，破骨細(xì)胞活性相對(duì)增強(qiáng)，骨吸收大于骨形成，最終導(dǎo)致骨量減少，骨質(zhì)疏松發(fā)生。相關(guān)研究顯示，在骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中，激活GLP-1R信號(hào)通路能夠改善骨微結(jié)構(gòu)，提高骨強(qiáng)度，進(jìn)一步支持了GLP-1R在骨代謝中的重要作用以及其表達(dá)降低與骨質(zhì)疏松的關(guān)聯(lián)。GLP-1R表達(dá)變化還可能與肝臟的其他代謝功能改變相關(guān)。肝臟在脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而GLP-1R信號(hào)通路可能參與了這些代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。GLP-1R表達(dá)降低可能影響肝臟對(duì)脂質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，導(dǎo)致血脂異常。血脂異常在2型糖尿病患者中較為常見(jiàn)，且與骨質(zhì)疏松的發(fā)生也存在一定的關(guān)聯(lián)，如高膽固醇、高甘油三酯等可能通過(guò)影響骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)展。GLP-1R表達(dá)變化還可能影響肝臟中蛋白質(zhì)的合成和代謝，進(jìn)而影響肝臟的正常功能以及機(jī)體的整體代謝平衡。5.2PKA表達(dá)變化的意義在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中，PKA表達(dá)水平顯著降低，這一變化對(duì)機(jī)體的生理病理過(guò)程有著深遠(yuǎn)影響。PKA在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中占據(jù)核心地位，是眾多信號(hào)通路的關(guān)鍵樞紐。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外的信號(hào)分子如激素、神經(jīng)遞質(zhì)等與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活G蛋白，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，cAMP激活PKA，PKA通過(guò)磷酸化多種底物蛋白，將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝等過(guò)程。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中，PKA表達(dá)降低，可能導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路受阻，使細(xì)胞對(duì)各種信號(hào)的響應(yīng)能力下降。例如，在胰島素信號(hào)通路中，PKA的正常激活對(duì)于胰島素發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用至關(guān)重要。胰島素與受體結(jié)合后，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，最終激活PKA，PKA磷酸化下游的效應(yīng)分子，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用。當(dāng)PKA表達(dá)降低時(shí)，胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)受到干擾，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，導(dǎo)致血糖升高。PKA對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)作用廣泛，在肝臟中，它參與了糖代謝、脂代謝等多個(gè)重要的代謝過(guò)程。在糖代謝方面，PKA可以通過(guò)磷酸化糖原合成酶和磷酸化酶激酶，調(diào)節(jié)糖原的合成與分解。正常情況下，PKA激活后，使糖原合成酶磷酸化而失活，抑制糖原合成，同時(shí)使磷酸化酶激酶磷酸化而激活，促進(jìn)糖原分解，以維持血糖的穩(wěn)定。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中，肝組織PKA表達(dá)降低，可能導(dǎo)致糖原合成酶活性相對(duì)升高，磷酸化酶激酶活性相對(duì)降低，從而使糖原合成增加，糖原分解減少，血糖調(diào)節(jié)失衡。PKA還參與了脂代謝的調(diào)節(jié)。它可以通過(guò)磷酸化激素敏感性脂肪酶，促進(jìn)脂肪分解，釋放脂肪酸。PKA還能調(diào)節(jié)脂肪酸的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶的活性。PKA表達(dá)降低可能影響肝臟中脂肪的代謝，導(dǎo)致脂肪堆積，血脂異常。有研究表明，在糖尿病動(dòng)物模型中，PKA活性降低與肝臟脂肪變性密切相關(guān)，肝臟中甘油三酯含量明顯升高。PKA表達(dá)變化與骨質(zhì)疏松的關(guān)聯(lián)也不容忽視。骨骼是一個(gè)動(dòng)態(tài)的組織，骨代謝的平衡依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的協(xié)同作用。PKA在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，它可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性。在成骨細(xì)胞中，PKA激活后，可以磷酸化CREB等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)骨相關(guān)基因的表達(dá)，如骨鈣素、骨橋蛋白等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)于骨基質(zhì)的合成和礦化至關(guān)重要，有助于促進(jìn)骨形成。在破骨細(xì)胞中，PKA可以調(diào)節(jié)其活性和功能，抑制破骨細(xì)胞的過(guò)度活化，減少骨吸收。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中，肝組織PKA表達(dá)降低，可能通過(guò)影響肝臟與骨骼之間的信號(hào)傳遞，間接影響骨代謝。肝臟中PKA表達(dá)的變化可能導(dǎo)致一些細(xì)胞因子或信號(hào)分子的分泌改變，這些因子作用于骨骼，影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，使骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨量減少，骨質(zhì)疏松發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松患者的血清中，一些與PKA信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞因子水平發(fā)生了變化，進(jìn)一步支持了PKA在骨代謝中的重要作用以及其表達(dá)變化與骨質(zhì)疏松的關(guān)聯(lián)。5.3GLP-1R與PKA表達(dá)的關(guān)聯(lián)及機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中，GLP-1R與PKA的表達(dá)均顯著降低，且二者表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。這一結(jié)果提示，GLP-1R與PKA之間可能存在緊密的關(guān)聯(lián)，并且這種關(guān)聯(lián)在2型糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。從信號(hào)通路角度來(lái)看，GLP-1R與PKA處于同一信號(hào)傳導(dǎo)通路中。GLP-1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體，當(dāng)GLP-1與GLP-1R結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，激活與之偶聯(lián)的Gαs蛋白。Gαs蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。cAMP作為第二信使，與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，使調(diào)節(jié)亞基與催化亞基分離，從而激活PKA。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中，GLP-1R表達(dá)降低，導(dǎo)致GLP-1與受體的結(jié)合減少，下游信號(hào)傳導(dǎo)受阻，cAMP生成減少，進(jìn)而使得PKA的激活受到抑制，表達(dá)水平降低。有研究表明，在胰島β細(xì)胞中，通過(guò)激活GLP-1R，能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，激活PKA，促進(jìn)胰島素分泌。而在本研究的病理狀態(tài)下，GLP-1R表達(dá)的異常導(dǎo)致了PKA激活和表達(dá)的異常，進(jìn)一步影響了肝臟的代謝功能以及與骨代謝相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)。在基因調(diào)控方面，GLP-1R與PKA的表達(dá)可能受到共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。一些研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）在調(diào)節(jié)GLP-1R和PKA相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高激活PKA后，PKA可使CREB磷酸化，磷酸化的CREB能夠與DNA上的特定序列（環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件，CRE）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松狀態(tài)下，可能由于體內(nèi)代謝紊亂，影響了CREB等轉(zhuǎn)錄因子的活性，導(dǎo)致GLP-1R和PKA的基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，進(jìn)而使它們的表達(dá)水平降低。還有研究指出，某些微小RNA（miRNA）也可能參與調(diào)控GLP-1R和PKA的表達(dá)。miRNA可以通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解。在糖尿病和骨質(zhì)疏松的病理過(guò)程中，一些miRNA的表達(dá)發(fā)生改變，可能同時(shí)靶向GLP-1R和PKA的mRNA，對(duì)它們的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。5.4研究結(jié)果對(duì)2型糖尿病骨質(zhì)疏松治療的啟示本研究結(jié)果為2型糖尿病骨質(zhì)疏松的治療提供了重要的啟示，基于GLP-1R與PKA在肝組織中的表達(dá)變化及兩者的關(guān)聯(lián)，有望開(kāi)發(fā)新的治療策略和尋找潛在的治療靶點(diǎn)。從靶點(diǎn)角度來(lái)看，GLP-1R和PKA可作為潛在的治療靶點(diǎn)。鑒于GLP-1R在血糖調(diào)節(jié)和骨代謝中的重要作用，以及在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中表達(dá)降低的情況，開(kāi)發(fā)能夠激活GLP-1R的藥物可能成為一種有效的治療手段。目前，臨床上已經(jīng)有GLP-1R激動(dòng)劑用于治療2型糖尿病，這類藥物能夠模擬GLP-1的作用，與GLP-1R結(jié)合并激活下游信號(hào)通路，從而降低血糖。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松的治療中，可以進(jìn)一步研究和優(yōu)化GLP-1R激動(dòng)劑，使其不僅能夠有效控制血糖，還能通過(guò)調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)信號(hào)通路，改善骨質(zhì)疏松的癥狀。一些研究已經(jīng)表明，GLP-1R激動(dòng)劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠增加骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，這為其在2型糖尿病骨質(zhì)疏松治療中的應(yīng)用提供了有力的支持。針對(duì)PKA表達(dá)降低的情況，開(kāi)發(fā)能夠提高PKA活性或表達(dá)水平的藥物也具有潛在的治療價(jià)值?？梢酝ㄟ^(guò)篩選和設(shè)計(jì)小分子化合物，或者利用基因治療等手段，來(lái)調(diào)節(jié)PKA的活性和表達(dá)，恢復(fù)其在肝臟中的正常功能，進(jìn)而改善糖代謝和骨代謝。在治療策略方面，綜合調(diào)節(jié)GLP-1R/PKA信號(hào)通路可能是一種更為有效的治療方式。由于GLP-1R與PKA處于同一信號(hào)通路中，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，同時(shí)調(diào)節(jié)這兩個(gè)靶點(diǎn)，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效的作用?？梢匝邪l(fā)同時(shí)作用于GLP-1R和PKA的雙靶點(diǎn)藥物，或者聯(lián)合使用GLP-1R激動(dòng)劑和能夠調(diào)節(jié)PKA活性的藥物。在聯(lián)合用藥時(shí)，需要注意藥物之間的相互作用和劑量調(diào)整，以確保治療的安全性和有效性。還可以結(jié)合其他治療方法，如飲食控制、運(yùn)動(dòng)療法、補(bǔ)充鈣劑和維生素D等，形成綜合治療方案。飲食控制可以幫助控制血糖和體重，減輕胰島素抵抗，從而改善糖代謝和骨代謝。運(yùn)動(dòng)療法能夠增加骨密度，提高骨骼的強(qiáng)度和韌性，同時(shí)也有助于控制血糖和體重。補(bǔ)充鈣劑和維生素D可以滿足骨骼對(duì)鈣的需求，促進(jìn)鈣的吸收和利用，維持骨骼的正常代謝。本研究結(jié)果還提示，早期干預(yù)對(duì)于2型糖尿病骨質(zhì)疏松的治療至關(guān)重要。在糖尿病和骨質(zhì)疏松的早期階段，肝臟中GLP-1R和PKA的表達(dá)可能已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生變化，但此時(shí)病情相對(duì)較輕，通過(guò)及時(shí)的干預(yù)措施，如控制血糖、調(diào)節(jié)飲食、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)等，可能能夠延緩或阻止GLP-1R和PKA表達(dá)的進(jìn)一步降低，從而減少2型糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于已經(jīng)確診為2型糖尿病骨質(zhì)疏松的患者，早期治療可以更好地控制病情的發(fā)展，改善患者的預(yù)后。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)建立2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型，深入探究了GLP-1R、PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中的表達(dá)變化情況。研究結(jié)果表明，在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中，GLP-1R和PKA的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這一結(jié)果提示，GLP-1R和PKA在2型糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示，GLP-1R與PKA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。從信號(hào)通路角度來(lái)看，GLP-1R與PKA處于同一信號(hào)傳導(dǎo)通路，GLP-1R被激活后，通過(guò)與Gαs蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，進(jìn)而激活PKA。在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中，GLP-1R表達(dá)降低，導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)受阻，PKA的激活和表達(dá)也受到抑制。在基因調(diào)控方面，兩者的