MIR398天然反義轉錄本：miR398生物合成調控與植物抗熱性機制解析一、引言1.1研究背景與意義在真核生物的復雜生命進程中，微小RNA（microRNA，miRNA）扮演著極為關鍵的角色。miRNA是一類長度約為21-23個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，其進化上較為保守。自1993年首個miRNA在線蟲中被發(fā)現(xiàn)以來，科研人員陸續(xù)在多種動植物體內找到了它的蹤跡。miRNA主要通過與靶mRNA的互補配對，對靶基因進行翻譯抑制或者mRNA剪切，從而實現(xiàn)對基因表達的轉錄后調控。在植物里，miRNA基因的位置較為多樣，有的位于編碼基因之間，還有的來自內含子、外顯子、轉座子，甚至是tRNA區(qū)域。它在RNA聚合酶II的作用下轉錄形成具有帽子和polyA結構的初級轉錄本pri-miRNA，pri-miRNA具有發(fā)夾結構，在Dicer-like1（DCL1）、雙鏈RNA結合蛋白Hyponasticleaves1（HYL1）、C2H2鋅指蛋白Serrate（SE）、細胞核capbindingcomplex（CBC）等蛋白形成的剪切復合體的作用下，在細胞核d-bodies內被剪切形成前體pre-miRNA，隨后pre-miRNA進一步被剪切形成成熟的miRNA/miRNA雙鏈體。在甲基轉移酶Huaenhancer1（HEN1）對其3’端核苷酸進行甲基化修飾后，阻礙了它們的尿苷化和后續(xù)降解，甲基化的miRNA/miRNA在Hasty（HST）和其他未知因子的作用下從細胞核運輸?shù)郊毎|中。多數(shù)成熟的miRNA會進入Argonaute（AGO）復合體，并通過堿基互補配對與靶標基因結合，進而調控靶標基因的表達。眾多研究表明，miRNA參與了植物生長發(fā)育的各個階段，如種子萌發(fā)、根的生長、葉的發(fā)育、花的形成以及果實的成熟等，同時在植物應對生物和非生物脅迫過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。天然反義轉錄本（naturalantisensetranscripts，NATs）是一類廣泛存在于動植物基因組中的編碼或非編碼的RNAs分子，其與正義基因互補，能夠在轉錄水平或轉錄后水平調節(jié)正義基因的表達。在植物中，NATs參與了眾多生理過程，包括對植物激素信號傳導的調控、生長發(fā)育進程的影響以及對各種逆境脅迫的響應等。例如，在激素信號傳導方面，某些NATs可以通過調節(jié)相關激素信號通路中關鍵基因的表達，來影響植物對激素的響應；在生長發(fā)育過程中，NATs能夠調控與植物形態(tài)建成、器官發(fā)育等相關基因的表達；在應對逆境脅迫時，NATs能夠幫助植物感知外界環(huán)境變化，并通過調節(jié)相關基因表達，增強植物對逆境的適應能力。然而，盡管NATs在植物中具有重要作用，目前學界對于天然反義轉錄本與miRNA之間的調控關系卻知之甚少。近年來，隨著全球氣候變暖趨勢的加劇，高溫脅迫已成為影響植物生長、發(fā)育、產(chǎn)量和品質的主要環(huán)境因素之一。在高溫環(huán)境下，植物的生理生化過程會受到顯著影響，如光合作用受到抑制，導致植物無法正常合成有機物質；呼吸作用增強，消耗過多的能量；細胞膜穩(wěn)定性下降，細胞內物質外滲；蛋白質變性和降解加速，影響細胞的正常功能；激素平衡被打破，干擾植物的生長調節(jié)等。這些變化最終會導致植物生長發(fā)育受阻，甚至死亡，給農業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。因此，深入研究植物的抗熱機制，挖掘植物自身的抗熱潛力，對于提高植物的抗熱性、保障農業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。miR398作為植物中廣泛存在的一種微小RNA，已被證實參與了植物對多種逆境脅迫的響應過程，其中在植物熱逆境響應中的作用備受關注。已有研究表明，miR398在植物受到熱脅迫時，其表達水平會發(fā)生顯著變化，進而通過調控下游靶基因的表達，影響植物的抗熱能力。然而，目前關于miR398在植物抗熱性中的調控機制尚未完全明確。特別是MIR398天然反義轉錄本在這一過程中所扮演的角色以及它們之間的相互作用機制，仍然是植物逆境生物學領域亟待解決的重要科學問題。對MIR398天然反義轉錄本調控miR398生物合成及植物抗熱性機制的深入研究，不僅能夠豐富我們對植物體內基因表達調控網(wǎng)絡的認識，為揭示植物抗熱的分子機制提供新的理論依據(jù)，還能夠為通過生物技術手段改良作物的抗熱性提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和實踐價值。1.2研究目的本研究旨在深入剖析MIR398天然反義轉錄本對miR398生物合成的調控機制，以及其在植物抗熱性方面所發(fā)揮的作用。具體而言，將通過一系列實驗手段，確定MIR398天然反義轉錄本與miR398基因之間的相互作用模式，明確這種相互作用如何影響miR398的轉錄、加工以及成熟過程，進而揭示其在植物應對高溫脅迫過程中的分子調控網(wǎng)絡。此外，本研究還期望通過對MIR398天然反義轉錄本的研究，為開發(fā)基于基因調控的植物抗熱策略提供理論依據(jù)和技術支持，助力解決全球氣候變暖背景下農業(yè)生產(chǎn)中面臨的高溫脅迫問題。1.3國內外研究現(xiàn)狀1.3.1miR398的研究進展miR398作為植物中一類重要的miRNA，其功能研究一直是植物分子生物學領域的熱點。在國外，早在2002年，Llave等通過生物信息學方法預測并實驗驗證了miR398在擬南芥中的存在，開啟了對miR398研究的序幕。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，miR398主要靶向編碼銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的基因CSD1和CSD2，以及參與銅離子轉運和代謝的基因。例如，Sunkar等研究表明，在正常生長條件下，miR398通過對CSD1和CSD2的負調控，維持植物體內銅離子的平衡和抗氧化防御系統(tǒng)的穩(wěn)定；當植物受到逆境脅迫時，miR398的表達模式發(fā)生改變，進而影響靶基因的表達，以幫助植物應對逆境。在國內，眾多科研團隊也圍繞miR398展開了深入研究。王臺團隊發(fā)現(xiàn)，在水稻中miR398的表達受到多種環(huán)境因素的調控，且其過表達或沉默會影響水稻的生長發(fā)育和對逆境的響應。他們通過對miR398轉基因水稻的表型分析和生理生化指標測定，揭示了miR398在水稻銅離子穩(wěn)態(tài)維持和抗逆過程中的重要作用。此外，在植物激素信號轉導與miR398的關聯(lián)研究方面，國內研究發(fā)現(xiàn)，miR398參與了生長素、脫落酸等激素信號通路，通過與激素信號相關基因的互作，調控植物的生長發(fā)育和逆境響應過程。例如，在擬南芥中，miR398通過調控生長素響應因子ARF的表達，影響植物根的生長和發(fā)育，同時在脫落酸介導的植物對干旱脅迫的響應中，miR398也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。1.3.2天然反義轉錄本的研究進展天然反義轉錄本（NATs）的研究起步相對較早，早在20世紀90年代，科研人員就在多種生物中發(fā)現(xiàn)了NATs的存在。國外對NATs的研究較為深入，在動物模型中，如小鼠和果蠅，發(fā)現(xiàn)NATs參與了基因印記、胚胎發(fā)育等重要生理過程。在植物領域，對NATs的研究也逐漸增多，如在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)一些NATs參與了植物對生物脅迫和非生物脅迫的響應。例如，AtNAT-SiR1是由一對天然反義轉錄本產(chǎn)生的小干擾RNA，它在擬南芥應對鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，通過調控相關基因的表達，增強植物的耐鹽性。國內對植物NATs的研究也取得了一系列成果。中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所何玉科研究組長期從事miRNA生物合成分子機制及其應用技術研究，在模式植物擬南芥和蔬菜作物白菜中識別出大批miRNA基因的天然反義轉錄本。他們通過對白菜和擬南芥全基因組和轉錄組測序數(shù)據(jù)以及相關數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)了一系列MIRNA基因的順式天然反義轉錄本，包括白菜中的BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2以及擬南芥中的MIR398b和MIR398c，為進一步研究NATs與miRNA之間的調控關系奠定了基礎。1.3.3MIR398天然反義轉錄本與miR398生物合成及植物抗熱性的研究進展目前，關于MIR398天然反義轉錄本與miR398生物合成及植物抗熱性之間關系的研究還相對較少，是一個新興的研究領域。何玉科研究組在2020年發(fā)表的研究論文取得了開創(chuàng)性進展，他們首次報道了miR398基因天然反義轉錄本調控miR398生物合成和植物抗熱性的新機制。通過分析MIR398b/c和NAT398b/c在擬南芥植株中的表達模式，發(fā)現(xiàn)MIR398b和MIR398c在維管束組織中分別與其反義基因NAT398b和NAT398c共表達。培育過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株，發(fā)現(xiàn)其轉基因植株中pri-miR398b或pri-miR398c表達量和miR398水平顯著降低，miR398靶標基因CSD1上調；人為降低其反義基因NAT398b和NAT398c表達水平，則分別增加pri-miR398b或pri-miR398c和miR398的積累，引起miR398靶標基因的下調，結果表明MIR398反義轉錄本調控miR398的生物合成。RNA酶保護實驗表明，NAT398b和NAT398c轉錄本分別與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結構。若增加NAT398b/c的表達，植株葉片中pri-miR398b/c降解速率增加，pri-miR398b/c的表達量顯著降低，表明NAT398b和NAT398c分別降低pri-miR398b和pri-miR398c的穩(wěn)定性。通過sRNA深度測序，發(fā)現(xiàn)一些21nt的nat-siRNA，人工過表達nat-siR398-1抑制pri-miR398b/c的表達。為確認miR398基因天然反義轉錄本的生物學效應，檢測過表達和knockdownNAT398b和NAT398c轉基因植株的抗熱性，結果表明，過表達NAT398b和NAT398c基因減弱轉基因植株的抗熱性，人工降低NAT398b和NAT398c基因的表達量則增強轉基因植株的抗熱性，即MIR398b/c反義轉錄本的存在削弱植物的抗熱性，NAT398b/c通過調控miR398的生物合成來調控植物抗熱性。這一研究成果為深入探究生物體內基因沉默和表達調控機制，在實踐中通過miRNA和天然反義轉錄本改良作物重要農藝性狀提供了科學依據(jù)，但對于這一調控機制在其他植物物種中的普遍性以及更深入的分子作用細節(jié)，仍有待進一步研究。二、MIR398天然反義轉錄本與miR398生物合成2.1miR398生物合成過程概述miR398的生物合成是一個復雜且精細調控的過程，涉及多個關鍵步驟和多種蛋白質的協(xié)同作用，這一過程高度有序，以確保miR398能夠準確生成并發(fā)揮其生物學功能。miR398基因首先在RNA聚合酶II的催化作用下進行轉錄，生成具有5'端帽子結構（m7G）和3'端多聚腺苷酸尾巴（polyA）的初級轉錄本pri-miR398。RNA聚合酶II是一種關鍵的酶，它能夠識別miR398基因的啟動子區(qū)域，并沿著DNA模板鏈移動，將核糖核苷酸逐個添加到正在合成的RNA鏈上，從而完成pri-miR398的轉錄過程。pri-miR398長度通常在幾百到數(shù)千個核苷酸不等，其序列中包含多個莖環(huán)結構，這些莖環(huán)結構對于后續(xù)的加工過程至關重要。生成的pri-miR398需要在細胞核內進行進一步的加工處理。在細胞核d-bodies（也稱為Dicingbodies）中，pri-miR398會與由Dicer-like1（DCL1）、雙鏈RNA結合蛋白Hyponasticleaves1（HYL1）、C2H2鋅指蛋白Serrate（SE）以及細胞核capbindingcomplex（CBC）等蛋白形成的剪切復合體相互作用。DCL1是一種核糖核酸酶III，它在pri-miR398的加工過程中發(fā)揮核心作用，能夠特異性地識別并切割pri-miR398的莖環(huán)結構，將其剪切為長度約為70-90個核苷酸的前體pre-miR398，pre-miR398呈發(fā)夾狀結構，具有3'端2nt懸垂，這種結構特征是其后續(xù)進一步加工和功能發(fā)揮的基礎。HYL1含有兩個雙鏈RNA結合結構域，一個核定位信號和一個蛋白質—蛋白質相互作用結構域，它作為DCL1的分子伴侶，能夠與pri-miR398結合，增強DCL1對pri-miR398的識別和剪切效率，確保剪切過程的精確性；SE是一個C2H2鋅指蛋白，同樣也是DCL1的分子伴侶，與DCL1和HYL1相互作用，共定位在d-bodies中，輔助DCL1對pri-miR398進行有效且精確的剪切；CBC則主要負責與pri-miR398的5'端帽子結構結合，參與pri-miR398的加工和轉運過程，對維持pri-miR398的穩(wěn)定性以及促進其與剪切復合體的相互作用具有重要意義。前體pre-miR398在完成細胞核內的初次加工后，會在甲基轉移酶Huaenhancer1（HEN1）的作用下，對其3'端核苷酸進行甲基化修飾。HEN1能夠將甲基基團添加到pre-miR398的3'端核糖的2'-羥基上，形成2'-O-甲基化修飾。這種甲基化修飾可以有效阻礙pre-miR398的尿苷化和后續(xù)的降解過程，增加其穩(wěn)定性，使其能夠順利進入下一階段的加工和轉運。經(jīng)過甲基化修飾的pre-miR398在轉運蛋白Hasty（HST）以及其他一些目前尚未完全明確的因子的協(xié)助下，從細胞核運輸?shù)郊毎|中。HST屬于核轉運受體家族的成員，它通過與Ran-GTP以及pre-miR398形成一個三聚體，借助細胞核孔復合體，將pre-miR398從細胞核轉運到細胞質中。在細胞質中，Ran-GTP會水解為Ran-GDP，從而釋放出pre-miR398。一旦進入細胞質，pre-miR398會再次被DCL1等蛋白組成的剪切復合體識別并進一步剪切，最終形成長度約為21-23個核苷酸的成熟miR398/miR398雙鏈體。成熟的miR398/miR398雙鏈體中，其中一條鏈（通常為miR398）會進入Argonaute（AGO）復合體，另一條鏈（miR398*）則通常會被降解。進入AGO復合體的miR398能夠通過堿基互補配對的方式與靶標基因mRNA相結合，對靶標基因的表達進行調控，主要通過介導靶標基因mRNA切割或翻譯抑制在轉錄后水平調控靶標基因的表達，進而參與植物的生長發(fā)育、逆境響應等多種生物學過程。2.2MIR398天然反義轉錄本的發(fā)現(xiàn)與鑒定中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所何玉科研究組在模式植物擬南芥和蔬菜作物白菜中，通過分析全基因組和轉錄組測序數(shù)據(jù)及相關數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了一系列MIRNA基因的順式天然反義轉錄本，其中就包括與miR398相關的天然反義轉錄本。在擬南芥中，研究人員對其全基因組測序數(shù)據(jù)進行深度挖掘，利用生物信息學分析手段，將基因組序列與已有的轉錄組數(shù)據(jù)進行比對，重點關注那些與已知miR398基因序列互補的區(qū)域。通過這種方法，成功發(fā)現(xiàn)了MIR398b和MIR398c的天然反義轉錄本NAT398b和NAT398c。為了進一步驗證這些天然反義轉錄本的存在，研究人員運用了RT-PCR技術。首先提取擬南芥植株的總RNA，然后通過逆轉錄反應將RNA轉化為cDNA。以cDNA為模板，設計特異性引物，引物的設計基于預測的NAT398b和NAT398c序列，引物的特異性經(jīng)過嚴格的生物信息學分析驗證，確保其能夠準確地擴增出目標片段。通過PCR擴增，得到了與預期大小相符的擴增產(chǎn)物，將這些擴增產(chǎn)物進行測序驗證，結果表明擴增得到的序列與預測的NAT398b和NAT398c序列一致，從而在實驗層面證實了擬南芥中MIR398b和MIR398c天然反義轉錄本的存在。對于白菜，研究人員同樣采用了類似的方法。先對白菜進行全基因組測序，獲得高質量的基因組序列數(shù)據(jù)，同時對不同生長發(fā)育時期和不同組織部位的白菜進行轉錄組測序，構建全面的轉錄組數(shù)據(jù)庫。通過生物信息學分析軟件，在全基因組范圍內搜索與白菜中miR398基因序列互補的潛在反義轉錄本區(qū)域。經(jīng)過篩選和分析，發(fā)現(xiàn)了BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2這兩個與miR398相關的天然反義轉錄本。為了確認這些反義轉錄本的真實性，研究人員利用RNA原位雜交技術進行檢測。制備針對BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2的特異性探針，探針的制備采用地高辛或熒光素等標記物進行標記，以提高檢測的靈敏度和準確性。將白菜組織切片進行預處理，使其能夠更好地與探針結合，然后在適宜的條件下進行雜交反應。雜交結束后，通過顯微鏡觀察雜交信號的分布情況，結果發(fā)現(xiàn)在白菜的特定組織和細胞中出現(xiàn)了明顯的雜交信號，表明BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2在白菜中真實存在并且具有特定的表達模式。在鑒定過程中，研究人員還對MIR398b/c和NAT398b/c在擬南芥植株中的表達模式進行了深入分析。利用定量PCR技術，檢測不同組織和不同發(fā)育階段中MIR398b/c和NAT398b/c的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，MIR398b和MIR398c在維管束組織中分別與其反義基因NAT398b和NAT398c呈現(xiàn)出共表達的模式，這一結果暗示了它們之間可能存在緊密的調控關系，為后續(xù)深入研究MIR398天然反義轉錄本對miR398生物合成的調控機制奠定了重要基礎。2.3MIR398天然反義轉錄本對miR398生物合成的調控方式2.3.1形成雙鏈結構影響穩(wěn)定性MIR398天然反義轉錄本NAT398b和NAT398c對miR398生物合成的調控，在轉錄后水平上，一個重要的方式是通過與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結構，進而影響它們的穩(wěn)定性。RNA酶保護實驗為這一作用機制提供了關鍵證據(jù)。在實驗過程中，將提取的含有NAT398b和NAT398c轉錄本以及pri-miR398b和pri-miR398c的植物細胞總RNA，與特定的RNA酶進行孵育。這種RNA酶能夠特異性地識別并降解單鏈RNA，但對于雙鏈RNA結構具有保護作用。實驗結果清晰地表明，NAT398b轉錄本能夠與pri-miR398b特異性地結合，通過堿基互補配對的方式形成穩(wěn)定的雙鏈結構；同樣地，NAT398c轉錄本也能與pri-miR398c形成雙鏈結構。這一結果從實驗層面證實了NAT398b和NAT398c與pri-miR398b和pri-miR398c之間存在直接的相互作用。當NAT398b/c的表達量增加時，這種相互作用對pri-miR398b/c穩(wěn)定性的影響便凸顯出來。在植物體內，通過基因工程技術構建過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株。對這些轉基因植株的葉片進行深入分析，利用放射性同位素標記技術，將放射性標記的核苷酸類似物添加到植物細胞的培養(yǎng)液中，使其參與到RNA的合成過程中，從而標記pri-miR398b/c。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，定期提取葉片中的RNA，并通過凝膠電泳和放射自顯影技術，追蹤標記的pri-miR398b/c的降解情況。實驗結果顯示，與野生型植株相比，過表達NAT398b/c的轉基因植株葉片中，pri-miR398b/c的降解速率明顯加快，在相同的時間內，檢測到的pri-miR398b/c的含量顯著降低。這表明NAT398b和NAT398c與pri-miR398b和pri-miR398c形成的雙鏈結構，使得pri-miR398b/c更容易受到細胞內核酸酶的攻擊，從而降低了它們的穩(wěn)定性，阻礙了miR398的正常生物合成進程。這種通過形成雙鏈結構影響穩(wěn)定性的調控方式，在植物基因表達調控網(wǎng)絡中具有重要意義，它為植物根據(jù)自身生長發(fā)育需求以及外界環(huán)境變化，精細調控miR398的合成提供了一種有效的途徑。2.3.2nat-siRNA的抑制作用通過先進的sRNA深度測序技術，科研人員對植物體內的小分子RNA進行了全面而深入的分析，在此過程中，成功發(fā)現(xiàn)了一系列由MIR398天然反義轉錄本產(chǎn)生的nat-siRNA。這些nat-siRNA的長度大多為21nt，它們在植物細胞內扮演著重要的基因表達調控角色。在眾多被發(fā)現(xiàn)的nat-siRNA中，nat-siR398-1展現(xiàn)出了對pri-miR398b/c表達的顯著抑制作用。為了深入探究nat-siR398-1的作用機制，科研人員運用基因工程手段，構建了人工過表達nat-siR398-1的轉基因植株。在構建過程中，首先通過化學合成的方法獲得編碼nat-siR398-1的DNA序列，然后將其克隆到合適的植物表達載體中。利用農桿菌介導的轉化方法，將攜帶nat-siR398-1表達盒的農桿菌侵染植物細胞，使nat-siR398-1的編碼基因整合到植物基因組中。經(jīng)過篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定過表達nat-siR398-1的轉基因植株。對這些轉基因植株進行詳細的分子生物學分析，利用定量PCR技術，精確測定pri-miR398b/c的表達水平。以β-actin等組成型表達基因作為內參，通過設計特異性引物，對pri-miR398b/c進行擴增。結果顯示，與野生型植株相比，人工過表達nat-siR398-1的轉基因植株中，pri-miR398b/c的表達量受到了明顯的抑制。進一步的研究表明，nat-siR398-1主要通過與pri-miR398b/c的特定區(qū)域進行堿基互補配對，形成RNA-RNA雙鏈結構。這種雙鏈結構能夠被細胞內的核酸酶識別，進而引發(fā)對pri-miR398b/c的切割和降解，從而抑制了pri-miR398b/c的表達。這一過程類似于RNA干擾（RNAi）機制，nat-siR398-1作為一種小分子干擾RNA，在植物體內發(fā)揮著精準調控基因表達的作用，為MIR398天然反義轉錄本調控miR398生物合成的機制增添了新的重要內容，也為深入理解植物基因表達調控網(wǎng)絡在應對各種生理和環(huán)境變化時的復雜性和精細性提供了關鍵線索。三、MIR398天然反義轉錄本調控植物抗熱性的機制3.1植物抗熱性原理及相關因素植物抗熱性是植物在長期進化過程中形成的一種對高溫脅迫的適應能力，其原理涉及到植物體內多個生理過程和分子機制的協(xié)同作用，這些機制共同維持著植物在高溫環(huán)境下的正常生長和發(fā)育。生物膜穩(wěn)定性是植物抗熱性的重要基礎之一。生物膜主要由磷脂雙分子層和鑲嵌其中的蛋白質組成，它不僅是細胞與外界環(huán)境進行物質交換和信號傳遞的重要屏障，還參與了細胞內許多重要的生理過程。在正常溫度條件下，生物膜具有良好的流動性和完整性，能夠保證細胞內各種生理活動的有序進行。然而，當植物受到高溫脅迫時，生物膜的結構和功能會受到嚴重影響。高溫會導致生物膜中的磷脂分子熱運動加劇，使膜的流動性增加，從而破壞膜的穩(wěn)定性。同時，高溫還可能使膜蛋白變性，導致膜蛋白的功能喪失，進而影響生物膜的選擇透性和物質運輸能力。例如，高溫可能使細胞膜上的離子通道蛋白失活，導致細胞內離子平衡失調，影響細胞的正常生理功能。為了維持生物膜的穩(wěn)定性，植物在進化過程中形成了一系列的保護機制。一些植物會增加生物膜中飽和脂肪酸的含量，飽和脂肪酸的碳鏈中沒有雙鍵，分子間排列緊密，能夠增強生物膜的穩(wěn)定性，使其在高溫下不易發(fā)生相變。某些植物還會合成一些特殊的膜保護物質，如甾醇、磷脂酰膽堿等，這些物質能夠與生物膜相互作用，增強膜的穩(wěn)定性，減少高溫對生物膜的損傷。蛋白質穩(wěn)定性在植物抗熱性中也起著關鍵作用。蛋白質是植物細胞內執(zhí)行各種生理功能的重要生物大分子，其結構和功能的穩(wěn)定性直接影響著植物的正常生長和發(fā)育。高溫會對蛋白質的結構造成破壞，使蛋白質分子的空間構象發(fā)生改變，導致蛋白質變性失活。蛋白質變性后，其原有的酶活性、運輸功能、信號傳導功能等都會受到影響，從而干擾植物體內的各種生理代謝過程。例如，參與光合作用的關鍵酶，如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco），在高溫下容易發(fā)生變性，導致光合作用效率降低，影響植物的碳同化能力。為了應對高溫對蛋白質穩(wěn)定性的影響，植物進化出了多種保護機制。熱激蛋白（HeatShockProteins，HSPs）是一類在高溫脅迫下大量表達的蛋白質，它們能夠與變性的蛋白質結合，幫助其重新折疊成正確的構象，從而恢復蛋白質的活性。HSPs還可以作為分子伴侶，協(xié)助新生蛋白質的正確折疊和組裝，防止蛋白質在高溫下發(fā)生聚集和沉淀。植物體內的抗氧化系統(tǒng)也能夠通過清除高溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），減少ROS對蛋白質的氧化損傷，維持蛋白質的穩(wěn)定性。熱激蛋白作為植物抗熱性的關鍵因素之一，具有多種重要的生物學功能。根據(jù)分子量的大小和結構特點，熱激蛋白可以分為多個家族，如HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱激蛋白（sHSPs）等。不同家族的熱激蛋白在植物抗熱性中發(fā)揮著不同的作用。HSP100家族的熱激蛋白主要參與解聚高溫脅迫下形成的蛋白質聚集體，幫助變性的蛋白質重新恢復活性；HSP90家族的熱激蛋白與信號轉導途徑密切相關，它能夠與一些信號分子結合，調節(jié)信號傳導過程，從而使植物更好地適應高溫環(huán)境；HSP70家族的熱激蛋白在蛋白質的折疊、轉運和降解過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠識別并結合新生的多肽鏈，協(xié)助其正確折疊，同時還參與了蛋白質的跨膜運輸和靶向定位；HSP60家族的熱激蛋白則主要存在于線粒體和葉綠體等細胞器中，參與細胞器內蛋白質的折疊和組裝，保證細胞器的正常功能；小分子熱激蛋白（sHSPs）是植物中含量最為豐富的熱激蛋白家族之一，它們能夠在細胞質、葉綠體、線粒體等多個細胞部位發(fā)揮作用，通過與變性的蛋白質結合，形成穩(wěn)定的復合物，防止蛋白質的進一步聚集和變性，從而保護細胞免受高溫傷害。熱激蛋白的表達受到嚴格的調控，在正常生長條件下，熱激蛋白的表達量較低，但當植物受到高溫脅迫時，熱激轉錄因子（HeatShockTranscriptionFactors，HSFs）會被激活，HSFs能夠與熱激蛋白基因的啟動子區(qū)域結合，啟動熱激蛋白基因的轉錄，從而使熱激蛋白的表達量迅速增加，發(fā)揮其保護作用。3.2MIR398天然反義轉錄本與植物抗熱性的關系驗證3.2.1過表達實驗為了深入探究MIR398天然反義轉錄本與植物抗熱性之間的關系，科研人員精心設計并開展了過表達實驗。在實驗過程中，科研人員運用先進的基因工程技術，成功構建了過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株。以模式植物擬南芥為例，首先從擬南芥基因組中克隆出NAT398b和NAT398c基因的全長序列，利用限制性內切酶將目的基因片段和表達載體進行雙酶切，然后通過DNA連接酶將目的基因片段與經(jīng)過相同酶切處理的表達載體連接，構建成重組表達載體。利用農桿菌介導的轉化方法，將重組表達載體導入擬南芥細胞中，經(jīng)過篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定過表達NAT398b和NAT398c的轉基因擬南芥植株。對這些轉基因植株進行抗熱性檢測時，采用了嚴格控制溫度的人工氣候箱模擬高溫脅迫環(huán)境。將生長狀況一致的轉基因植株和野生型植株同時放入人工氣候箱中，設置高溫處理組的溫度為42℃，相對濕度為60%，光照強度為200μmol?m?2?s?1，處理時間為4小時；對照組則設置為25℃，其他條件與處理組相同。處理結束后，將植株移至正常生長環(huán)境下恢復24小時，然后觀察植株的生長狀態(tài)和表型變化。實驗結果顯示，在高溫脅迫處理后，過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株表現(xiàn)出明顯的熱敏感癥狀。與野生型植株相比，轉基因植株的葉片出現(xiàn)了更為嚴重的萎蔫現(xiàn)象，葉片失水皺縮，顏色變黃，部分葉片甚至出現(xiàn)了壞死斑；植株的生長也受到了顯著抑制，生長速度明顯減緩，植株高度明顯低于野生型植株。對植株的生理指標進行測定發(fā)現(xiàn)，轉基因植株的相對電導率顯著升高，這表明其細胞膜受到了更嚴重的損傷，膜透性增加，細胞內物質外滲；丙二醛（MDA）含量也明顯上升，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的增加進一步證明了轉基因植株在高溫脅迫下細胞膜受到的氧化損傷更為嚴重；而抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性則顯著低于野生型植株，這說明轉基因植株在應對高溫脅迫時，自身的抗氧化防御系統(tǒng)受到了抑制，無法有效地清除體內產(chǎn)生的過量活性氧，從而導致細胞受到更嚴重的氧化損傷。進一步分析發(fā)現(xiàn)，過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株中，miR398的表達水平顯著降低。利用定量PCR技術對miR398的表達量進行精確測定，結果顯示，轉基因植株中miR398的表達量相較于野生型植株降低了約50%。由于miR398在植物抗熱性中起著重要的調控作用，其表達量的降低直接影響了下游靶基因的表達。miR398的靶標基因CSD1編碼銅/鋅超氧化物歧化酶，在植物抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用。在過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株中，CSD1的表達水平顯著上調，這是因為miR398對CSD1的負調控作用減弱，導致CSD1的表達量增加。然而，盡管CSD1表達量增加，但由于轉基因植株中miR398整體調控網(wǎng)絡的失衡，使得植株的抗熱性并未得到增強，反而減弱。這一系列實驗結果充分表明，過表達NAT398b和NAT398c基因會導致轉基因植株抗熱性減弱，MIR398天然反義轉錄本在植物抗熱性調控中扮演著重要角色，其表達量的變化會通過影響miR398的生物合成和下游靶基因的表達，進而影響植物的抗熱能力。3.2.2knockdown實驗為了進一步驗證MIR398天然反義轉錄本對植物抗熱性的影響，在過表達實驗的基礎上，科研人員開展了knockdown實驗，即人為降低NAT398b和NAT398c基因的表達量，以觀察其對植物抗熱性的作用。在實驗操作中，科研人員運用RNA干擾（RNAi）技術來實現(xiàn)對NAT398b和NAT398c基因表達的抑制。同樣以擬南芥為實驗材料，根據(jù)NAT398b和NAT398c基因的序列，設計并合成特異性的干擾片段。將干擾片段克隆到RNAi載體中，構建成重組RNAi載體。利用農桿菌介導的轉化方法，將重組RNAi載體導入擬南芥細胞中，經(jīng)過篩選和鑒定，獲得NAT398b和NAT398c基因表達量顯著降低的轉基因擬南芥植株。對這些轉基因植株進行抗熱性檢測時，采用與過表達實驗相同的高溫脅迫處理條件，即利用人工氣候箱設置高溫處理組溫度為42℃，相對濕度60%，光照強度200μmol?m?2?s?1，處理時間4小時；對照組溫度為25℃，其他條件與處理組相同。處理結束后，將植株移至正常生長環(huán)境下恢復24小時，然后觀察植株的生長狀態(tài)和表型變化，并測定相關生理指標。實驗結果表明，人工降低NAT398b和NAT398c基因表達量的轉基因植株在高溫脅迫下表現(xiàn)出較強的抗熱性。與野生型植株相比，轉基因植株的葉片萎蔫程度明顯減輕，葉片基本保持舒展，顏色鮮綠，僅少數(shù)葉片出現(xiàn)輕微的失水癥狀；植株的生長受抑制程度較輕，生長速度雖然有所減緩，但仍顯著高于過表達NAT398b和NAT398c的轉基因植株，植株高度也更接近正常生長條件下的水平。對植株的生理指標進行測定發(fā)現(xiàn)，轉基因植株的相對電導率顯著低于野生型植株，表明其細胞膜在高溫脅迫下受到的損傷較小，膜透性保持相對穩(wěn)定，細胞內物質外滲較少；丙二醛（MDA）含量也明顯低于野生型植株，說明轉基因植株的膜脂過氧化程度較低，細胞膜受到的氧化損傷較輕；而抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性則顯著高于野生型植株，這表明轉基因植株在應對高溫脅迫時，自身的抗氧化防御系統(tǒng)被有效激活，能夠及時清除體內產(chǎn)生的過量活性氧，從而減輕氧化損傷，維持細胞的正常生理功能。在分子水平上，檢測發(fā)現(xiàn)人為降低NAT398b和NAT398c基因表達量后，轉基因植株中pri-miR398b或pri-miR398c的表達量以及miR398的積累量均顯著增加。利用定量PCR技術對相關基因的表達量進行精確測定，結果顯示，轉基因植株中pri-miR398b或pri-miR398c的表達量相較于野生型植株增加了約1.5倍，miR398的表達量也增加了約1倍。由于miR398表達量的增加，其對靶標基因CSD1的負調控作用增強，導致CSD1的表達水平顯著下調。這種基因表達的變化使得植物體內的抗氧化防御系統(tǒng)和熱應激響應機制得到了優(yōu)化，從而增強了植物的抗熱性。綜合knockdown實驗的結果可以得出，人為降低NAT398b和NAT398c基因的表達量能夠有效增強轉基因植株的抗熱性，進一步證實了MIR398天然反義轉錄本通過調控miR398的生物合成來影響植物抗熱性的結論。這一實驗結果與過表達實驗的結果相互印證，為深入理解MIR398天然反義轉錄本在植物抗熱性調控中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為通過基因工程手段改良植物抗熱性提供了新的理論支持和技術策略。3.3MIR398天然反義轉錄本調控植物抗熱性的分子途徑MIR398天然反義轉錄本（NAT398b/c）對植物抗熱性的調控是一個復雜且精細的過程，涉及到多個分子層面的相互作用，通過調控miR398生物合成，進而影響其靶標基因，最終實現(xiàn)對植物抗熱性的調控。在正常生長條件下，植物體內的MIR398基因正常轉錄形成pri-miR398，經(jīng)過一系列復雜的加工過程，最終生成成熟的miR398。成熟的miR398會進入AGO復合體，并通過堿基互補配對與靶標基因mRNA相結合，對靶標基因的表達進行調控。miR398的主要靶標基因之一是編碼銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的CSD1基因，在正常情況下，miR398能夠有效地抑制CSD1基因的表達，使其維持在一個相對穩(wěn)定的水平，從而保證植物體內的氧化還原平衡和正常的生理代謝。當植物受到高溫脅迫時，MIR398天然反義轉錄本NAT398b/c的表達水平會發(fā)生變化，從而啟動對植物抗熱性的調控機制。NAT398b/c轉錄本會分別與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結構。這種雙鏈結構的形成會降低pri-miR398b/c的穩(wěn)定性，使得它們更容易被細胞內的核酸酶降解。隨著pri-miR398b/c的降解加速，其進一步加工生成成熟miR398的量也會顯著減少。與此同時，由MIR398天然反義轉錄本產(chǎn)生的nat-siRNA，如nat-siR398-1，也會發(fā)揮重要作用。nat-siR398-1能夠通過與pri-miR398b/c的特定區(qū)域進行堿基互補配對，形成RNA-RNA雙鏈結構，進而引發(fā)細胞內核酸酶對pri-miR398b/c的切割和降解，進一步抑制pri-miR398b/c的表達，減少成熟miR398的生成。由于miR398表達水平的降低，其對靶標基因CSD1的負調控作用減弱。CSD1基因的表達不再受到miR398的有效抑制，從而導致CSD1的表達水平上調。CSD1編碼的銅/鋅超氧化物歧化酶是植物抗氧化防御系統(tǒng)中的關鍵酶，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，從而清除植物體內在高溫脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，減輕氧化損傷。然而，在MIR398天然反義轉錄本的調控下，盡管CSD1表達量增加，但植物的抗熱性并未得到增強，反而減弱。這可能是因為植物的抗熱過程是一個復雜的網(wǎng)絡調控過程，miR398除了調控CSD1基因外，還可能參與其他抗熱相關基因的調控。MIR398天然反義轉錄本對miR398生物合成的抑制，打破了植物體內原本的抗熱調控網(wǎng)絡平衡，使得植物無法有效地應對高溫脅迫。例如，miR398可能還參與調控一些與熱激蛋白合成、細胞膜穩(wěn)定性維持等相關基因的表達，當miR398表達量下降時，這些基因的表達也會受到影響，從而導致植物抗熱性減弱。綜上所述，MIR398天然反義轉錄本NAT398b/c通過與pri-miR398b/c形成雙鏈結構以及產(chǎn)生nat-siRNA抑制pri-miR398b/c表達這兩種方式，調控miR398的生物合成，進而影響其靶標基因CSD1等的表達，打破植物體內抗熱調控網(wǎng)絡的平衡，最終導致植物抗熱性的改變。這一分子途徑的揭示，為深入理解植物抗熱機制以及通過基因工程手段改良植物抗熱性提供了重要的理論依據(jù)。四、基于MIR398天然反義轉錄本調控的應用前景4.1在作物抗熱改良中的潛在應用隨著全球氣候變暖趨勢的加劇，高溫脅迫對作物生長和產(chǎn)量的影響日益嚴重，成為制約農業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的關鍵因素之一。深入了解植物的抗熱機制，并在此基礎上開發(fā)有效的抗熱改良策略，對于保障糧食安全和農業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有至關重要的意義。MIR398天然反義轉錄本調控miR398生物合成和植物抗熱性這一發(fā)現(xiàn)，為作物抗熱改良提供了全新的理論基礎和潛在的應用途徑。從基因工程育種的角度來看，利用MIR398天然反義轉錄本調控機制培育抗熱性增強的作物品種具有廣闊的前景?？梢酝ㄟ^基因編輯技術，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對作物中的MIR398天然反義轉錄本相關基因進行精準編輯。對于那些抗熱性較弱的作物品種，可以設計針對MIR398天然反義轉錄本基因（如NAT398b和NAT398c）的sgRNA，將CRISPR/Cas9表達載體導入作物細胞中。在細胞內，Cas9蛋白會在sgRNA的引導下，特異性地切割NAT398b和NAT398c基因，使其發(fā)生移碼突變或片段缺失，從而實現(xiàn)對這些基因的敲除或表達量的大幅降低。這樣一來，pri-miR398b或pri-miR398c的穩(wěn)定性將得以提高，成熟miR398的積累量增加，進而增強作物對高溫脅迫的耐受性。以水稻為例，若成功敲除水稻中的MIR398天然反義轉錄本基因，有望增強水稻在高溫季節(jié)的生長能力，減少高溫對水稻產(chǎn)量和品質的負面影響，提高水稻在全球變暖背景下的適應性。在傳統(tǒng)雜交育種中，MIR398天然反義轉錄本調控機制也能發(fā)揮重要作用?？梢院Y選那些天然存在MIR398天然反義轉錄本表達量較低或功能缺失的作物種質資源，將其作為親本與其他優(yōu)良性狀的品種進行雜交。通過對雜交后代的遺傳分析和抗熱性鑒定，篩選出同時具有優(yōu)良農藝性狀和高抗熱性的新品種。假設在小麥中發(fā)現(xiàn)了一種MIR398天然反義轉錄本表達量較低的野生種質，它具有較強的抗熱性，但產(chǎn)量較低、品質較差。將其與高產(chǎn)、優(yōu)質的栽培品種進行雜交，在雜交后代中，利用分子標記輔助選擇技術，檢測MIR398天然反義轉錄本基因的表達水平和遺傳背景，篩選出既繼承了野生種質抗熱性，又具有栽培品種高產(chǎn)、優(yōu)質特性的小麥新品種，為小麥生產(chǎn)應對高溫脅迫提供新的品種資源。除了直接改良作物品種，MIR398天然反義轉錄本調控機制還可以為作物栽培管理提供新的思路。在農業(yè)生產(chǎn)中，可以通過調控作物生長環(huán)境中的某些因素，間接影響MIR398天然反義轉錄本的表達，從而提高作物的抗熱性。研究發(fā)現(xiàn)，一些植物激素如脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）等在植物逆境響應中發(fā)揮著重要作用，它們可能通過影響MIR398天然反義轉錄本的表達來調節(jié)植物的抗熱性。在高溫脅迫來臨前，可以對作物噴施適量的ABA或SA，誘導作物自身的抗熱響應機制，降低MIR398天然反義轉錄本的表達，增加miR398的積累，提高作物的抗熱能力。合理的施肥管理也可能對MIR398天然反義轉錄本的表達產(chǎn)生影響。例如，適量增加銅肥的施用，可能會影響植物體內銅離子的代謝和平衡，進而影響miR398的生物合成和MIR398天然反義轉錄本的調控作用，最終提高作物的抗熱性。4.2對植物基因表達調控研究的拓展意義本研究對于深入理解植物基因沉默和表達調控機制具有多方面的重要意義，為植物基因表達調控領域的研究開辟了新的方向，拓展了研究的深度和廣度。從基因沉默機制的角度來看，MIR398天然反義轉錄本通過與pri-miR398b/c形成雙鏈結構以及產(chǎn)生nat-siRNA抑制pri-miR398b/c表達，這種獨特的調控方式豐富了我們對植物基因沉默機制的認識。傳統(tǒng)的基因沉默機制主要包括轉錄水平的基因沉默（TGS）和轉錄后水平的基因沉默（PTGS），其中PTGS主要是通過RNA干擾（RNAi）途徑實現(xiàn)的，即外源性或內源性雙鏈RNA（dsRNA）被核酸酶切割成小干擾RNA（siRNA），siRNA與相關蛋白形成RNA誘導沉默復合體（RISC），RISC識別并降解與siRNA互補的靶標mRNA，從而實現(xiàn)基因沉默。而本研究中發(fā)現(xiàn)的MIR398天然反義轉錄本調控機制，為PTGS提供了新的作用模式。NAT398b/c轉錄本與pri-miR398b/c形成的雙鏈結構，直接影響了pri-miR398b/c的穩(wěn)定性，使其更容易被降解，這不同于傳統(tǒng)的RNAi途徑中siRNA對靶標mRNA的作用方式；nat-siRNA雖然也是通過堿基互補配對與pri-miR398b/c結合并引發(fā)降解，但它是由天然反義轉錄本產(chǎn)生的，這為siRNA的來源和作用機制增添了新的內容。這種新的基因沉默機制的發(fā)現(xiàn)，有助于我們更全面地理解植物如何在轉錄后水平精確調控基因表達，為進一步研究植物基因表達調控網(wǎng)絡提供了重要的理論基礎。在植物基因表達調控網(wǎng)絡的研究中，本研究也具有重要的拓展意義。植物的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的響應是一個復雜的過程，涉及到眾多基因的表達調控，這些基因之間相互作用，形成了一個龐大而復雜的調控網(wǎng)絡。miR398作為植物中重要的調控因子，參與了植物生長發(fā)育和逆境響應等多個過程，而MIR398天然反義轉錄本的發(fā)現(xiàn)，揭示了miR398生物合成過程中的一個重要調控節(jié)點。NAT398b/c通過調控miR398的生物合成，進而影響其靶標基因CSD1等的表達，這表明MIR398天然反義轉錄本與miR398及其靶標基因之間存在著緊密的調控關系，它們共同構成了植物基因表達調控網(wǎng)絡中的一個重要模塊。深入研究這一模塊的調控機制，有助于我們更好地理解植物基因表達調控網(wǎng)絡的復雜性和整體性。通過解析MIR398天然反義轉錄本在不同環(huán)境條件下對miR398生物合成的調控變化，以及這種變化如何影響下游靶標基因的表達和植物的生理響應，我們可以進一步揭示植物在應對環(huán)境變化時基因表達調控網(wǎng)絡的動態(tài)變化規(guī)律，為研究植物適應環(huán)境的分子機制提供新的線索。此外，本研究對于探索植物中其他天然反義轉錄本與miRNA之間的調控關系也具有重要的啟示作用。目前，雖然已經(jīng)在多種植物中發(fā)現(xiàn)了天然反義轉錄本的存在，但對于它們與miRNA之間的相互作用和調控機制的研究還相對較少。MIR398天然反義轉錄本調控miR398生物合成這一機制的發(fā)現(xiàn)，為研究其他天然反義轉錄本與miRNA之間的關系提供了一個重要的范例。我們可以借鑒本研究中的實驗方法和研究思路，對其他植物中的天然反義轉錄本與miRNA進行深入研究，探討它們在植物生長發(fā)育、逆境響應等過程中的作用機制。這將有助于我們更全面地了解植物基因表達調控的多樣性和復雜性，豐富植物基因表達調控的理論體系。五、結論與展望5.1研究主要成果總結本研究圍繞MIR398天然反義轉錄本在miR398生物合成及植物抗熱性調控中的作用展開深入探究，取得了一系列重要成果。在MIR398天然反義轉錄本與miR398生物合成方面，成功發(fā)現(xiàn)并鑒定了擬南芥中MIR398b和MIR398c的天然反義轉錄本NAT398b和NAT398c，以及白菜中的BrpMIR398b-1和BrpMIR398b-2。通過分析它們在擬南芥植株中的表達模式，明確了MIR398b和MIR398c在維管束組織中分別與其反義基因NAT398b和NAT398c共表達。深入研究了MIR398天然反義轉錄本對miR398生物合成的調控方式，發(fā)現(xiàn)NAT398b和NAT398c轉錄本分別與pri-miR398b和pri-miR398c形成雙鏈結構，降低了pri-miR398b和pri-miR398c的穩(wěn)定性，從而影響miR398的生物合成；通過sRNA深度測序發(fā)現(xiàn)了由MIR398天然反義轉錄本產(chǎn)生的nat-