Ti-O薄膜表面固定原卟啉銅：一氧化氮原位催化釋放機制與生物相容性探究一、引言1.1研究背景與意義生物材料在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛，從人工關(guān)節(jié)、心臟支架到藥物輸送載體等，它們的出現(xiàn)極大地推動了醫(yī)學(xué)的進步，為無數(shù)患者帶來了福音。然而，生物材料在與生物體接觸時，常常面臨生物相容性不佳的問題，可能引發(fā)免疫反應(yīng)、炎癥、血栓形成等不良現(xiàn)象。例如，傳統(tǒng)的金屬植入物在體內(nèi)可能會釋放金屬離子，導(dǎo)致周圍組織的炎癥和過敏反應(yīng)；一些高分子材料在血液接觸過程中，容易引發(fā)血小板的黏附和聚集，增加血栓形成的風(fēng)險。這些問題不僅限制了生物材料的臨床應(yīng)用效果，還可能對患者的健康造成潛在威脅。為了解決這些問題，生物材料的表面改性技術(shù)應(yīng)運而生。通過對生物材料表面進行修飾，可以改善其與生物體的相互作用，提高生物相容性，增強生物活性，降低不良反應(yīng)的發(fā)生概率。表面改性技術(shù)能夠在不改變材料整體性能的前提下，賦予材料表面特定的功能，使其更好地適應(yīng)生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。一氧化氮（NO）作為一種重要的生物信號分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著舉足輕重的作用。它參與了血管舒張、神經(jīng)傳遞、免疫調(diào)節(jié)等多種生理過程。在心血管系統(tǒng)中，內(nèi)皮細胞釋放的NO能夠調(diào)節(jié)血管平滑肌的張力，維持血管的正常舒張狀態(tài)，防止血管痙攣和血栓形成；在免疫系統(tǒng)中，NO可以作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，參與巨噬細胞的殺菌作用，增強機體的免疫防御能力。鑒于NO在生物體內(nèi)的重要作用，將其引入生物材料表面改性領(lǐng)域具有重要的意義。NO釋放型生物材料能夠在局部持續(xù)釋放NO，發(fā)揮其生物學(xué)功能，從而改善生物材料的性能。在心血管植入物表面修飾NO釋放涂層，可以抑制血小板的黏附和激活，降低血栓形成的風(fēng)險；在組織工程支架表面引入NO釋放功能，能夠促進細胞的黏附、增殖和分化，加速組織修復(fù)和再生。Ti-O薄膜作為一種常見的生物材料，具有良好的生物相容性、耐腐蝕性和機械性能，在骨科植入物、牙科修復(fù)材料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而，其表面惰性較大，不利于細胞的黏附和生長，限制了其在一些生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。因此，對Ti-O薄膜進行表面改性，提高其生物活性，具有重要的研究價值和實際應(yīng)用意義。原卟啉銅是一種具有獨特結(jié)構(gòu)和性能的金屬卟啉化合物，它能夠在一定條件下催化釋放NO。將原卟啉銅固定在Ti-O薄膜表面，有望構(gòu)建一種新型的NO釋放型生物材料，實現(xiàn)NO的原位催化釋放，從而改善Ti-O薄膜的生物相容性和生物活性。這種新型生物材料在心血管疾病治療、組織工程等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，例如可用于制備具有抗血栓和促進血管內(nèi)皮化功能的心血管支架，以及促進組織修復(fù)和再生的組織工程支架等。本研究旨在探究Ti-O薄膜表面固定原卟啉銅原位催化釋放NO的性能及其生物相容性，通過對原卟啉銅的制備與表征、在Ti-O薄膜表面的固定方法及表征、NO的體外催化釋放性能以及生物相容性評價等方面的研究，為開發(fā)新型的NO釋放型生物材料提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，推動生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進一步發(fā)展和應(yīng)用。1.2研究現(xiàn)狀在NO釋放材料的研究領(lǐng)域，眾多學(xué)者致力于開發(fā)新型的NO釋放體系，以實現(xiàn)NO的有效釋放和精準調(diào)控。早期的研究主要集中在NO供體的開發(fā)上，如有機硝酸酯類、硝普鈉等。這些NO供體能夠在一定條件下釋放NO，但其釋放過程往往難以精確控制，且可能會產(chǎn)生一些副作用。隨著材料科學(xué)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，新型的NO釋放材料應(yīng)運而生。例如，基于聚合物的NO釋放材料，通過將NO供體與聚合物基質(zhì)相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)NO的持續(xù)、穩(wěn)定釋放。其中，聚乙二醇（PEG）、聚乳酸（PLA）等聚合物被廣泛應(yīng)用于NO釋放體系的構(gòu)建。研究表明，PEG修飾的NO釋放材料具有良好的生物相容性和水溶性，能夠在體內(nèi)緩慢釋放NO，發(fā)揮其生物學(xué)功能；而PLA基的NO釋放材料則具有可降解性，能夠在完成NO釋放任務(wù)后逐漸降解，減少對生物體的長期影響。此外，納米材料在NO釋放領(lǐng)域也展現(xiàn)出了巨大的潛力。納米粒子具有高比表面積、小尺寸效應(yīng)等特點，能夠有效地負載和釋放NO。如金納米粒子、二氧化硅納米粒子等被用作NO的載體，通過表面修飾和功能化設(shè)計，實現(xiàn)了NO的靶向輸送和可控釋放。有研究將NO供體修飾在金納米粒子表面，利用其獨特的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性，實現(xiàn)了在近紅外光照射下的NO可控釋放，為腫瘤治療等領(lǐng)域提供了新的策略。在Ti-O薄膜改性方面，目前的研究主要圍繞提高其生物活性和生物相容性展開。常見的改性方法包括物理改性、化學(xué)改性和生物改性。物理改性方法如等離子體處理、激光處理等，通過改變Ti-O薄膜的表面形貌和結(jié)構(gòu)，提高其表面能和粗糙度，從而改善細胞的黏附性能。研究發(fā)現(xiàn)，等離子體處理后的Ti-O薄膜表面形成了更多的羥基基團，增加了表面的親水性，有利于細胞的黏附與生長?；瘜W(xué)改性則主要通過在Ti-O薄膜表面引入活性官能團或涂層，賦予其特定的生物活性。例如，通過化學(xué)接枝的方法在Ti-O薄膜表面引入氨基、羧基等官能團，能夠增強薄膜與生物分子的相互作用，促進細胞的黏附和增殖；在Ti-O薄膜表面涂覆生物活性涂層，如羥基磷灰石涂層、膠原蛋白涂層等，可提高其生物相容性和骨整合能力。生物改性方法是利用生物分子或細胞對Ti-O薄膜進行修飾，使其具有更好的生物活性。比如，在Ti-O薄膜表面固定生長因子、細胞黏附肽等生物分子，能夠促進細胞的分化和組織的修復(fù)；將內(nèi)皮細胞種植在Ti-O薄膜表面，可構(gòu)建具有抗血栓功能的表面。盡管當前在NO釋放材料和Ti-O薄膜改性方面取得了一定的研究成果，但仍存在一些不足之處。在NO釋放材料方面，部分材料的NO釋放效率較低，難以滿足實際應(yīng)用的需求；一些NO釋放體系的穩(wěn)定性和可控性有待提高，可能導(dǎo)致NO的釋放量和釋放速率難以精確調(diào)控。在Ti-O薄膜改性方面，現(xiàn)有改性方法大多只能單一地改善其某一方面的性能，難以同時實現(xiàn)多種功能的優(yōu)化；而且一些改性過程較為復(fù)雜，成本較高，不利于大規(guī)模的臨床應(yīng)用。本研究創(chuàng)新性地將原卟啉銅固定在Ti-O薄膜表面，構(gòu)建一種新型的NO釋放型生物材料。原卟啉銅能夠原位催化釋放NO，為Ti-O薄膜提供了新的功能。通過這種方式，有望同時改善Ti-O薄膜的生物相容性和生物活性，實現(xiàn)多種功能的協(xié)同優(yōu)化。此外，本研究采用的固定方法和制備工藝相對簡單，成本較低，具有潛在的應(yīng)用前景。本研究對于解決現(xiàn)有研究中存在的問題，推動NO釋放材料和Ti-O薄膜在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的必要性和現(xiàn)實意義。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究Ti-O薄膜表面固定原卟啉銅原位催化釋放NO的性能，以及該復(fù)合材料的生物相容性，為開發(fā)新型高性能生物材料提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。在原卟啉銅的制備與表征方面，本研究將采用特定的合成方法，精心制備原卟啉銅。運用紅外光譜（FT-IR）、紫外-可見光譜（UV-Vis）、核磁共振（NMR）等多種先進的光譜分析技術(shù)，對原卟啉銅的結(jié)構(gòu)和性能進行全面、深入的表征。通過FT-IR分析，能夠準確確定原卟啉銅分子中各種化學(xué)鍵的振動吸收峰，從而推斷其分子結(jié)構(gòu)；UV-Vis光譜則可用于研究原卟啉銅的電子躍遷特性，了解其光學(xué)性能；NMR技術(shù)能夠提供分子中氫原子、碳原子等的化學(xué)環(huán)境信息，進一步驗證分子結(jié)構(gòu)的正確性。對于原卟啉銅在Ti-O薄膜表面的固定方法及表征，將探索有效的固定方法，如化學(xué)接枝、物理吸附等，實現(xiàn)原卟啉銅在Ti-O薄膜表面的牢固固定。采用X射線光電子能譜（XPS）、掃描電子顯微鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）等材料分析技術(shù)，對固定后的薄膜表面形貌、元素組成和化學(xué)狀態(tài)進行詳細表征。XPS可精確測定薄膜表面元素的化學(xué)價態(tài)和原子濃度，揭示原卟啉銅與Ti-O薄膜之間的相互作用；SEM和AFM能夠直觀地呈現(xiàn)薄膜表面的微觀形貌和粗糙度，為評估固定效果提供直觀依據(jù)。在NO的體外催化釋放性能研究中，將構(gòu)建體外模擬環(huán)境，運用NO檢測傳感器、化學(xué)發(fā)光法等檢測技術(shù)，系統(tǒng)地研究固定原卟啉銅的Ti-O薄膜在不同條件下（如不同pH值、溫度、時間等）的NO催化釋放性能。深入分析影響NO釋放速率和釋放量的因素，為優(yōu)化材料性能提供數(shù)據(jù)支持。通過改變pH值，觀察NO釋放性能的變化，探究環(huán)境酸堿度對催化反應(yīng)的影響；研究不同溫度下的NO釋放情況，了解溫度對催化活性的作用規(guī)律。本研究還將從多方面對固定原卟啉銅的Ti-O薄膜進行生物相容性評價。開展細胞實驗，選用內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等相關(guān)細胞系，通過細胞粘附實驗、細胞增殖實驗、細胞毒性實驗等，深入評估材料對細胞行為的影響。利用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測細胞增殖情況，通過熒光染色觀察細胞粘附形態(tài)，采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測細胞毒性。進行動物實驗，將固定原卟啉銅的Ti-O薄膜植入動物體內(nèi)，觀察組織反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等，全面評價材料的體內(nèi)生物相容性。定期對植入部位進行組織切片觀察，檢測炎癥因子的表達水平，評估免疫細胞的浸潤情況，以綜合判斷材料在體內(nèi)的生物相容性。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究采用多種先進的實驗與分析方法，從不同角度對Ti-O薄膜表面固定原卟啉銅原位催化釋放NO及其生物相容性進行深入探究。在材料制備方面，運用化學(xué)合成法制備原卟啉銅。按照特定的化學(xué)計量比，精確稱取相關(guān)化學(xué)試劑，在嚴格控制的反應(yīng)條件下，如特定的溫度、反應(yīng)時間和pH值環(huán)境中，進行一系列的化學(xué)反應(yīng)，以確保原卟啉銅的成功合成。利用磁控濺射技術(shù)制備Ti-O薄膜，將鈦靶材和氧氣作為濺射源，在高真空環(huán)境下，通過控制濺射功率、濺射時間、氣體流量等工藝參數(shù)，在基底材料表面沉積形成均勻、致密的Ti-O薄膜。采用化學(xué)接枝和物理吸附相結(jié)合的方法，將原卟啉銅固定在Ti-O薄膜表面。先對Ti-O薄膜表面進行預(yù)處理，引入活性官能團，然后通過化學(xué)鍵合或分子間作用力，使原卟啉銅牢固地結(jié)合在薄膜表面。在材料表征階段，利用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀對原卟啉銅的分子結(jié)構(gòu)進行分析。通過檢測原卟啉銅分子中化學(xué)鍵的振動吸收峰，確定其分子內(nèi)各種官能團的存在和相對位置，從而推斷分子的結(jié)構(gòu)信息。運用紫外-可見光譜（UV-Vis）儀研究原卟啉銅的電子躍遷特性。根據(jù)不同波長下的吸光度變化，了解原卟啉銅分子的電子云分布和能級結(jié)構(gòu)，為其光學(xué)性能和催化活性的研究提供依據(jù)。借助X射線光電子能譜（XPS）對固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜表面元素組成和化學(xué)狀態(tài)進行精確測定。通過分析XPS譜圖中各元素的特征峰位置和強度，確定薄膜表面元素的化學(xué)價態(tài)和原子濃度，揭示原卟啉銅與Ti-O薄膜之間的相互作用方式和化學(xué)鍵合情況。使用掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）觀察薄膜表面的微觀形貌。SEM能夠提供高分辨率的表面圖像，展示薄膜表面的整體形態(tài)、顆粒分布和粗糙度等信息；AFM則可精確測量薄膜表面的微觀粗糙度和三維形貌，為評估原卟啉銅在薄膜表面的固定效果和均勻性提供直觀依據(jù)。對于NO的體外催化釋放性能研究，搭建體外模擬釋放實驗裝置，將固定原卟啉銅的Ti-O薄膜置于模擬生理環(huán)境的溶液中，通過改變?nèi)芤旱膒H值、溫度等條件，模擬不同的生理狀態(tài)。采用NO檢測傳感器實時監(jiān)測溶液中NO的濃度變化。該傳感器具有高靈敏度和快速響應(yīng)的特點，能夠準確捕捉NO的釋放動態(tài)，記錄NO的釋放速率和釋放量隨時間的變化曲線。運用化學(xué)發(fā)光法對NO檢測傳感器的測量結(jié)果進行驗證和補充。化學(xué)發(fā)光法利用NO與特定試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光信號強度來定量檢測NO的濃度，通過與傳感器測量結(jié)果的對比分析，提高數(shù)據(jù)的可靠性和準確性。在生物相容性評價方面，選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和平滑肌細胞（SMCs）進行細胞實驗。采用細胞粘附實驗評估材料對細胞粘附能力的影響。將細胞接種在固定原卟啉銅的Ti-O薄膜表面，在適宜的細胞培養(yǎng)條件下孵育一定時間后，通過顯微鏡觀察細胞的粘附形態(tài)和數(shù)量，使用細胞計數(shù)法或熒光染色法對粘附細胞進行定量分析。利用細胞增殖實驗檢測材料對細胞增殖活性的影響。采用CCK-8法，在不同時間點檢測細胞的增殖情況，通過測量細胞代謝產(chǎn)物的吸光度值，繪制細胞增殖曲線，分析材料對細胞生長速度和增殖能力的影響。開展細胞毒性實驗評估材料的細胞毒性。通過檢測細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量，判斷細胞的損傷程度，確定材料是否對細胞產(chǎn)生毒性作用。選擇合適的實驗動物，如大鼠或小鼠，進行動物實驗。將固定原卟啉銅的Ti-O薄膜植入動物體內(nèi)特定部位，定期觀察動物的生理狀態(tài)和行為變化。在預(yù)定時間點處死動物，取出植入部位的組織，進行組織切片觀察，通過蘇木精-伊紅（HE）染色等方法，觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、炎癥細胞浸潤情況和組織修復(fù)情況。采用免疫組化法檢測相關(guān)炎癥因子和細胞因子的表達水平，從分子層面評估材料引發(fā)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)程度。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先進行原卟啉銅的制備與表征，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)材料；接著將原卟啉銅固定在Ti-O薄膜表面，并對固定后的薄膜進行全面的材料學(xué)表征；然后開展NO的體外催化釋放性能研究，分析影響NO釋放的因素；最后從細胞實驗和動物實驗兩個層面，綜合評價固定原卟啉銅的Ti-O薄膜的生物相容性。各步驟之間邏輯緊密，前一步驟為后一步驟提供條件和依據(jù)，逐步深入地探究Ti-O薄膜表面固定原卟啉銅原位催化釋放NO及其生物相容性的相關(guān)特性。[此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1生物材料表面改性原理生物材料表面改性是通過特定的物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，對生物材料表面的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行改變，以優(yōu)化其與生物體的相互作用，滿足生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的特殊需求。這種改性技術(shù)旨在不改變材料本體性能的前提下，賦予表面新的功能特性。表面修飾技術(shù)主要分為物理改性、化學(xué)改性和生物改性三大類。物理改性通過物理手段改變材料表面的物理性質(zhì)，如粗糙度、形貌和表面能等。離子束刻蝕利用高能離子束轟擊材料表面，去除表面原子，從而精確調(diào)控表面粗糙度和微觀形貌。在骨科植入物的表面處理中，采用離子束刻蝕技術(shù)，可在鈦合金表面形成納米級的粗糙結(jié)構(gòu)，增加細胞的粘附面積和接觸點，促進細胞在植入物表面的粘附和增殖，進而提高植入物與周圍組織的結(jié)合強度?；瘜W(xué)改性則借助化學(xué)反應(yīng)在材料表面引入新的化學(xué)基團或改變原有化學(xué)組成?；瘜W(xué)接枝是一種常見的化學(xué)改性方法，它通過化學(xué)反應(yīng)將具有特定功能的分子或聚合物鏈接枝到材料表面。在生物傳感器的制備中，將具有特異性識別功能的生物分子（如抗體、核酸適配體等）通過化學(xué)接枝固定在材料表面，使傳感器能夠?qū)δ繕松锓肿舆M行特異性識別和檢測。以免疫傳感器為例，將抗體通過化學(xué)接枝固定在金納米粒子修飾的電極表面，當目標抗原存在時，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，引起電極表面電學(xué)性質(zhì)的變化，從而實現(xiàn)對抗原的檢測。生物改性是利用生物分子（如蛋白質(zhì)、多肽、細胞等）對材料表面進行修飾，使其具有生物活性和生物相容性。在組織工程支架的構(gòu)建中，將細胞粘附肽修飾在支架材料表面，能夠促進細胞在支架上的粘附、鋪展和增殖，有利于組織的修復(fù)和再生。如將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽修飾在聚乳酸（PLA）支架表面，RGD肽能夠與細胞表面的整合素受體特異性結(jié)合，增強細胞與支架的相互作用，為細胞的生長和分化提供良好的微環(huán)境。這些表面修飾技術(shù)對材料性能的影響顯著。通過表面改性，材料的生物相容性得到極大改善，能夠減少免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在心血管支架的表面修飾中，引入抗凝血分子或內(nèi)皮化促進分子，可有效抑制血小板的粘附和聚集，降低血栓形成的風(fēng)險，提高支架在體內(nèi)的安全性和有效性。表面改性還可以增強材料的生物活性，促進細胞的粘附、增殖和分化。在骨修復(fù)材料的表面修飾中，引入鈣磷化合物或生長因子，能夠促進成骨細胞的粘附和增殖，加速新骨的形成，提高骨修復(fù)的效果。2.2NO生物信號分子特性NO是一種由一個氮原子和一個氧原子組成的無色、無味且具有高度反應(yīng)活性的氣體小分子。在生物體內(nèi)，NO主要通過一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成，同時產(chǎn)生瓜氨酸。NOS存在三種亞型，分別是內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細胞中，在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠持續(xù)釋放低水平的NO，調(diào)節(jié)血管平滑肌的張力，保持血管的舒張狀態(tài)，從而維持正常的血壓和血流。nNOS主要分布于神經(jīng)元，參與神經(jīng)信號的傳遞和調(diào)節(jié)，在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程中具有重要意義。iNOS通常在免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等受到細胞因子（如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等）、脂多糖（LPS）等刺激時被誘導(dǎo)表達，產(chǎn)生大量的NO，參與免疫防御反應(yīng)，發(fā)揮抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用。NO在生物體內(nèi)的存在形式較為特殊，它以自由基的形式存在，具有一個未配對的電子，這賦予了它較高的化學(xué)反應(yīng)活性。這種高反應(yīng)活性使得NO能夠迅速與生物體內(nèi)的多種分子發(fā)生相互作用。在生理條件下，NO的半衰期較短，一般僅為數(shù)秒至數(shù)分鐘。其短半衰期主要是由于NO容易與氧氣、超氧陰離子等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。NO與氧氣反應(yīng)會生成二氧化氮（NO?），NO?進一步與水反應(yīng)生成硝酸和亞硝酸；NO與超氧陰離子（O??）能夠快速反應(yīng)生成過氧亞硝基陰離子（ONOO?），ONOO?是一種強氧化劑，具有較高的細胞毒性，可能會對生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等造成損傷。NO在生物體內(nèi)具有廣泛而重要的生理作用，在心血管系統(tǒng)中，它扮演著至關(guān)重要的角色。當血管內(nèi)皮細胞受到血流剪切力、乙酰膽堿、緩激肽等刺激時，eNOS被激活，催化生成NO。NO擴散到血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC），使細胞內(nèi)的三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）。cGMP作為第二信使，通過激活蛋白激酶G（PKG），使血管平滑肌細胞內(nèi)的鈣離子濃度降低，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，血管擴張，從而降低血壓，增加血流量。這一過程對于維持心血管系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要。臨床研究表明，許多心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化等都與NO的生成或作用異常密切相關(guān)。在高血壓患者中，常常存在血管內(nèi)皮功能障礙，eNOS的表達或活性降低，導(dǎo)致NO生成減少，血管舒張功能受損，血壓升高。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NO作為一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)發(fā)揮作用。nNOS在神經(jīng)元中表達，當神經(jīng)元受到刺激時，nNOS催化生成NO。NO不像傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)那樣儲存于突觸小泡中并通過胞吐作用釋放，而是以自由擴散的方式從神經(jīng)元中釋放出來。它可以作用于周圍的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及血管平滑肌細胞等，參與神經(jīng)信號的傳遞和調(diào)節(jié)。NO在學(xué)習(xí)、記憶、突觸可塑性等過程中具有重要作用。在長時程增強（LTP）和長時程抑制（LTD）等突觸可塑性模型中，NO被證明是一種關(guān)鍵的信號分子。在LTP過程中，神經(jīng)元受到高頻刺激后，nNOS被激活，生成的NO作為逆行信使，從突觸后神經(jīng)元擴散到突觸前神經(jīng)元，促進神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增強突觸傳遞效率，從而參與學(xué)習(xí)和記憶的形成。在免疫系統(tǒng)中，NO同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。當免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等受到病原體（如細菌、病毒、寄生蟲等）感染或炎癥刺激時，iNOS被誘導(dǎo)表達，大量生成NO。NO具有強大的抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性。它可以通過多種機制發(fā)揮免疫防御作用，如抑制病原體的呼吸鏈酶活性，干擾病原體的能量代謝；與病原體的DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能受損；調(diào)節(jié)免疫細胞的活性和細胞因子的分泌，增強機體的免疫應(yīng)答。在巨噬細胞吞噬病原體后，iNOS產(chǎn)生的NO能夠直接殺傷病原體，同時還可以激活其他免疫細胞，協(xié)同發(fā)揮免疫防御作用。在腫瘤免疫中，NO可以通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和血管生成等機制，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，在某些情況下，過度產(chǎn)生的NO也可能對機體造成損傷，引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷。由于NO在生物體內(nèi)的重要生理作用，將其引入生物材料表面改性領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在心血管植入物方面，如心臟支架、血管移植物等，表面修飾NO釋放涂層可以有效抑制血小板的黏附和激活，降低血栓形成的風(fēng)險。血小板的黏附和聚集是血栓形成的關(guān)鍵步驟，NO能夠抑制血小板內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）磷酸二酯酶活性，使cAMP水平升高，從而抑制血小板的活化和聚集。研究表明，在心臟支架表面涂覆NO釋放聚合物涂層，能夠顯著減少支架植入后血栓的形成，提高支架的安全性和有效性。在組織工程支架領(lǐng)域，引入NO釋放功能可以促進細胞的黏附、增殖和分化，加速組織修復(fù)和再生。NO可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，促進細胞外基質(zhì)的合成和分泌，為細胞的生長和分化提供良好的微環(huán)境。在骨組織工程支架中，通過釋放NO，可以促進成骨細胞的增殖和分化，增強支架與周圍骨組織的整合，提高骨修復(fù)效果。2.3卟啉及金屬卟啉性質(zhì)卟啉是一類由四個吡咯類亞基的α-碳原子通過次甲基橋（=CH-）互聯(lián)而形成的大分子雜環(huán)化合物，其母體化合物為卟吩（C??H??N?）。卟啉環(huán)具有高度共軛的結(jié)構(gòu)，擁有26個π電子，這使得卟啉呈現(xiàn)出深色，其英文名稱“porphyrin”源于希臘語，意為紫色，因此卟啉也常被稱作紫質(zhì)。卟啉化合物種類繁多，根據(jù)其溶解性可大致分為兩類：脂溶性卟啉化合物，這類卟啉通常易溶于氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯等有機溶劑，但在石油醚、正己烷等非極性溶劑中的溶解度很??；水溶性卟啉化合物，一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等親水性有機溶劑。卟啉化合物的熔點普遍較高，大多在300℃以上，常為紫紅色的固體粉末或結(jié)晶固體。卟啉還具有一定的光敏性質(zhì)，在紫外或可見光的照射下，能夠有效釋放單線態(tài)氧。卟啉的合成方法豐富多樣。早期的卟啉主要從含有卟啉化合物的天然產(chǎn)物中獲取，如從血液中提取血紅素，從植物中提取葉綠素等，通過一系列提取、分離、純化等操作得到卟啉。隨著研究的深入，人們發(fā)展出多種合成卟啉的方法。單吡咯的四聚合成法，如Alder-Longo法，利用2,5-未取代的吡咯與提供橋聯(lián)亞甲基的醛反應(yīng)，可合成具有對稱性的meso-四取代卟啉。通過改變?nèi)〈鵕和R?的種類以及醛和吡咯的比例，還能合成多種對稱和不對稱的卟啉。以2-取代的吡咯為原料進行單吡咯的四聚反應(yīng)，能得到中心對稱（兩種不同取代基位于交替位置）的卟啉，也稱為“head-to-tail”環(huán)縮合。二吡咯中間體的縮合也是常用的合成方法，F(xiàn)ischer法中，1-bromo-9-methyldipyrromethenes在200°C的有機酸（通常為丙酸）中自聚可得到較高產(chǎn)率的卟啉；MacDonald法里，1-unsubstituted-9-formyldipyrromethanes在酸催化劑（如氫碘酸或?qū)谆交撬幔┳饔孟伦跃?，由于二吡咯甲烷較易制備，這種方法應(yīng)用較為廣泛。“3+1”合成法利用三吡咯化合物的β-H和二甲?；量┑娜┗s合得到目標分子。線性四吡咯環(huán)化則以1-bromo-19-methyl-a,c-biladienes為中間體進行環(huán)化，直接縮合得到目標卟啉化合物。金屬卟啉是卟啉與金屬離子形成的配合物，卟啉幾乎能與所有的金屬離子形成配合物。金屬卟啉具有獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，其中心金屬離子的存在賦予了配合物特殊的化學(xué)活性和物理性質(zhì)。在結(jié)構(gòu)上，金屬離子位于卟啉環(huán)的中心，與卟啉環(huán)上的氮原子通過配位鍵相結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得金屬卟啉具有良好的穩(wěn)定性和獨特的電子云分布。在性質(zhì)方面，金屬卟啉在可見光區(qū)通常有強吸收，這一特性使其在光催化、光電器件等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。例如，在光催化降解有機污染物的研究中，金屬卟啉能夠吸收可見光，激發(fā)產(chǎn)生光生載流子，從而促進有機污染物的降解反應(yīng)。金屬卟啉在生命科學(xué)領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用。血紅素是鐵卟啉的一種，它是血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素等生物大分子的重要組成部分。在血紅蛋白中，血紅素負責(zé)運輸氧氣，其與氧氣的結(jié)合和解離過程受到精細的調(diào)控。當血液流經(jīng)肺部時，氧氣分壓較高，血紅素中的鐵離子與氧氣結(jié)合，形成氧合血紅蛋白，將氧氣運輸?shù)浇M織器官；在組織中，氧氣分壓較低，氧合血紅蛋白釋放出氧氣，供細胞進行呼吸作用。細胞色素中的血紅素則參與生物體內(nèi)的電子傳遞過程，在細胞呼吸和能量代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。葉綠素是鎂卟啉的一種，它是植物進行光合作用的關(guān)鍵物質(zhì)。在光合作用中，葉綠素能夠吸收光能，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，驅(qū)動二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為有機物和氧氣。葉綠素分子中的卟啉環(huán)通過共軛π電子體系有效地吸收光子，激發(fā)電子躍遷，從而啟動光合作用的光反應(yīng)過程。在化學(xué)合成領(lǐng)域，金屬卟啉也展現(xiàn)出獨特的催化性能。金屬卟啉可以作為催化劑，模擬生物體內(nèi)的酶催化反應(yīng)，實現(xiàn)一些有機合成反應(yīng)的高效進行。在仿生催化氧化反應(yīng)中，金屬卟啉能夠模仿細胞色素P-450酶的作用，催化烴類的氧化反應(yīng)。以鐵卟啉為例，它可以在溫和的條件下催化環(huán)己烷氧化生成環(huán)己醇和環(huán)己酮，為工業(yè)生產(chǎn)提供了一種綠色、高效的合成方法。金屬卟啉還可用于催化二氧化碳與環(huán)氧化合物的共聚反應(yīng)，在助催化劑的共同作用下，將二氧化碳轉(zhuǎn)化為可降解的高分子材料，對于緩解溫室效應(yīng)和解決白色污染問題具有重要意義。2.4銅的生物學(xué)作用及催化原理銅是生物體內(nèi)不可或缺的微量元素之一，在生物體的多種生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它廣泛參與酶的組成和活化，以酶的輔助因子形式參與氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成、兒茶酚胺代謝、結(jié)締組織交聯(lián)、鐵和胺類氧化、尿酸代謝、血液凝固和毛發(fā)形成等一系列復(fù)雜的代謝過程。在造血過程中，銅發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它通過銅藍蛋白對鐵的吸收、釋放、轉(zhuǎn)運和利用產(chǎn)生影響，進而參與造血。銅能夠加速血紅蛋白及卟啉的合成，促使幼稚紅細胞成熟并釋放。食物中的鐵以Fe3?的形式貯存于鐵蛋白中，動物缺銅時，鐵在胃和腸道中被還原為Fe2?后被吸收，隨后與脫輔基鐵蛋白結(jié)合又轉(zhuǎn)為Fe3?并形成鐵蛋白貯存起來，也可再次還原為Fe2?釋放到血漿中。進入血流中的鐵必須再氧化成Fe3?形式與鐵傳遞蛋白相結(jié)合形成Fe3?-蛋白復(fù)合物，才能向骨髓等造血部位轉(zhuǎn)移，這一過程受銅藍蛋白的調(diào)控。當綿羊血液銅水平＜0.10mg?kg?1時，就會出現(xiàn)貧血癥狀；雞缺銅時會造成機體貧血，表現(xiàn)為低血色素型，紅細胞總數(shù)減少。銅對骨骼的生長發(fā)育和新陳代謝也具有重要意義。銅存在于多種含銅酶中，如銅藍蛋白、銅鋅超氧化物歧化酶、細胞色素C氧化酶、單胺氧化酶、賴氨酰氧化酶、抗壞血酸氧化酶等，這些酶與軟骨和骨架的形成及骨的韌性密切相關(guān)。動物缺銅易導(dǎo)致脊柱骨下垂、骨質(zhì)疏松、變脆、易發(fā)生骨折、肢端骨變形和軟骨病等問題，幼齡動物缺銅時成骨細胞形成減慢或停止。賴氨酰氧化酶作為一種含銅酶，能促進結(jié)締組織中彈性和膠原蛋白的交聯(lián)，利于結(jié)締組織的修復(fù)。銅缺乏時，賴氨酰氧化酶的活性降低，導(dǎo)致結(jié)締組織中彈性蛋白和膠原纖維交聯(lián)障礙，成熟遲緩，增加血管和骨骼脆性，降低血管彈性和骨骼強度。在軟骨細胞培養(yǎng)液中添加銅31.2μmol?L?1能促進軟骨細胞增殖，增加細胞培養(yǎng)液中的膠原含量；適量的銅還能通過提高軟骨細胞IGF-ⅠmRNA、TGF-βmRNA的表達，促進軟骨細胞增殖分化和膠原的合成，并促進軟骨細胞自分泌IGF-Ⅰ、IGFBP3。銅還具有抗氧化作用，它通過抗氧化酶系統(tǒng)來發(fā)揮這一功能。動物體內(nèi)主要的含銅酶有銅藍蛋白、銅鋅超氧化物歧化酶、細胞色素C氧化酶等。銅藍蛋白可作為超氧陰離子的清除劑，抑制通過黃嘌呤氧化酶調(diào)節(jié)的正鐵細胞色素C的還原作用，減少O??的生成，同時參與銅的傳遞以保持肝銅平衡，通過調(diào)控Fe2?的氧化，控制鐵傳遞蛋白結(jié)合鐵的速度參與鐵的代謝。日糧中添加硫酸銅240mg?kg?1時，血清中銅藍蛋白活性顯著上升；銅藍蛋白活性隨著納米氧化銅濃度的升高而升高，但當納米氧化銅濃度達到200mg?kg?1時，其活性顯著降低。銅鋅超氧化物歧化酶是一種能夠消除氧自由基的抗氧化酶，是機體防御體系的組成部分，銅作為其金屬輔酶，與酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和活性密切相關(guān)。動物缺銅將導(dǎo)致機體內(nèi)各器官銅鋅超氧化物歧化酶活性下降。細胞色素C氧化酶存在于真核生物的細胞線粒體上，主要作用是通過氧化磷酸化為細胞提供能量。缺銅后其活性降低，ATP生成減少，導(dǎo)致磷脂和髓磷脂合成受阻，從而引起腦細胞代謝障礙。在催化釋放NO的過程中，銅離子通常作為催化劑參與其中。其化學(xué)反應(yīng)機理較為復(fù)雜，涉及到多個步驟。以原卟啉銅催化釋放NO為例，原卟啉銅中的銅離子處于特定的氧化態(tài)，在一定的條件下（如適宜的pH值、溫度以及存在特定的反應(yīng)物等），銅離子能夠與底物發(fā)生相互作用。底物分子可能首先與銅離子進行配位，使底物分子的電子云分布發(fā)生改變，從而降低了反應(yīng)的活化能。在這個過程中，銅離子可能會發(fā)生氧化態(tài)的變化，通過接受或給出電子，促進反應(yīng)的進行。具體來說，可能是銅離子先將電子傳遞給底物分子，使底物分子發(fā)生還原反應(yīng)，生成中間產(chǎn)物。隨后，中間產(chǎn)物經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)，最終分解產(chǎn)生NO。而銅離子則在反應(yīng)結(jié)束后恢復(fù)到初始的氧化態(tài)，繼續(xù)參與下一輪的催化反應(yīng)。目前，關(guān)于銅催化釋放NO的研究主要集中在兩個方面。一方面是對催化反應(yīng)條件的優(yōu)化，眾多研究致力于尋找能夠提高NO釋放效率和穩(wěn)定性的最佳反應(yīng)條件。通過改變反應(yīng)體系的pH值、溫度、底物濃度以及催化劑的用量等因素，深入研究這些條件對催化反應(yīng)的影響規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，在特定的pH值范圍內(nèi)，催化反應(yīng)的活性較高，NO的釋放速率和釋放量也較為理想；適當升高溫度可以加快反應(yīng)速率，但過高的溫度可能會導(dǎo)致催化劑失活或反應(yīng)副產(chǎn)物的增加。另一方面，對催化劑結(jié)構(gòu)的優(yōu)化也是研究的重點之一。通過對原卟啉銅等催化劑的結(jié)構(gòu)進行修飾和改造，如改變卟啉環(huán)上的取代基、調(diào)整銅離子的配位環(huán)境等，以提高催化劑的催化活性和選擇性。有研究表明，在卟啉環(huán)上引入特定的電子給體或受體基團，可以改變銅離子的電子云密度，從而增強催化劑對NO釋放反應(yīng)的催化性能。三、實驗材料與方法3.1實驗材料本實驗所需的化學(xué)試劑及規(guī)格、來源見表3-1。試劑名稱規(guī)格來源鈦靶材純度99.99%，直徑50mm，厚度3mmXX有色金屬材料有限公司原卟啉純度≥98%XX生物科技有限公司乙酸銅分析純XX化學(xué)試劑公司無水乙醇分析純XX化學(xué)試劑公司鹽酸分析純XX化學(xué)試劑公司氫氧化鈉分析純XX化學(xué)試劑公司1,6-己二胺純度≥98%XX生物科技有限公司聚多巴胺鹽酸鹽純度≥98%XX生物科技有限公司S-亞硝基谷胱甘肽純度≥98%XX生物科技有限公司人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）XX細胞庫平滑肌細胞（SMCs）XX細胞庫胎牛血清特級XX生物工程有限公司DMEM培養(yǎng)基高糖型XX生物工程有限公司青霉素-鏈霉素雙抗溶液100×XX生物工程有限公司細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）XX生物工程有限公司乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒XX生物工程有限公司本實驗使用的儀器設(shè)備及規(guī)格、來源見表3-2。儀器名稱規(guī)格來源磁控濺射鍍膜機JGP560型XX真空技術(shù)有限公司傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）NicoletiS50型賽默飛世爾科技有限公司紫外-可見光譜儀（UV-Vis）Lambda365型珀金埃爾默股份有限公司X射線光電子能譜儀（XPS）ESCALAB250Xi型賽默飛世爾科技有限公司掃描電子顯微鏡（SEM）SU8010型日立高新技術(shù)公司原子力顯微鏡（AFM）Multimode8型布魯克公司NO檢測傳感器ISO-NO-A型XX傳感器技術(shù)有限公司化學(xué)發(fā)光分析儀LB9507型德國貝托公司二氧化碳培養(yǎng)箱3111型賽默飛世爾科技有限公司酶標儀MultiskanFC型賽默飛世爾科技有限公司倒置顯微鏡CKX53型奧林巴斯株式會社在本實驗中，鈦靶材用于磁控濺射制備Ti-O薄膜，是構(gòu)建實驗材料的基礎(chǔ)。原卟啉和乙酸銅作為合成原卟啉銅的關(guān)鍵原料，其質(zhì)量和純度直接影響原卟啉銅的合成效果和性能。無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等試劑用于溶液的配制、清洗以及反應(yīng)條件的調(diào)節(jié)等。1,6-己二胺和聚多巴胺鹽酸鹽在原卟啉銅固定在Ti-O薄膜表面的過程中發(fā)揮重要作用，用于構(gòu)建富氨基表面和作為連接層。S-亞硝基谷胱甘肽作為內(nèi)源性NO供體，用于研究固定原卟啉銅的Ti-O薄膜的NO體外催化釋放性能。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）和平滑肌細胞（SMCs）用于細胞實驗，以評價材料的生物相容性。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液等是細胞培養(yǎng)過程中必不可少的試劑，為細胞的生長和增殖提供適宜的環(huán)境。細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒分別用于檢測細胞增殖和細胞毒性。磁控濺射鍍膜機用于在基底材料表面沉積Ti-O薄膜，通過精確控制濺射功率、時間、氣體流量等參數(shù)，可制備出均勻、致密的Ti-O薄膜。傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）用于分析原卟啉銅的分子結(jié)構(gòu)，通過檢測化學(xué)鍵的振動吸收峰來確定分子內(nèi)各種官能團的存在和相對位置。紫外-可見光譜儀（UV-Vis）用于研究原卟啉銅的電子躍遷特性，為其光學(xué)性能和催化活性的研究提供依據(jù)。X射線光電子能譜儀（XPS）可精確測定固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜表面元素組成和化學(xué)狀態(tài)，揭示原卟啉銅與Ti-O薄膜之間的相互作用方式和化學(xué)鍵合情況。掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）用于觀察薄膜表面的微觀形貌，SEM能夠提供高分辨率的表面圖像，展示薄膜表面的整體形態(tài)、顆粒分布和粗糙度等信息；AFM則可精確測量薄膜表面的微觀粗糙度和三維形貌。NO檢測傳感器用于實時監(jiān)測溶液中NO的濃度變化，化學(xué)發(fā)光分析儀用于對NO檢測傳感器的測量結(jié)果進行驗證和補充，兩者結(jié)合可準確研究固定原卟啉銅的Ti-O薄膜的NO體外催化釋放性能。二氧化碳培養(yǎng)箱為細胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境。酶標儀用于檢測CCK-8法和LDH檢測試劑盒的反應(yīng)結(jié)果，通過測量吸光度值來定量分析細胞增殖和細胞毒性。倒置顯微鏡用于觀察細胞在材料表面的粘附和生長情況。3.2原卟啉銅與原卟啉二鈉銅的制備原卟啉銅（CuPp）和原卟啉二鈉銅（CuPpNa?）是本研究中的關(guān)鍵物質(zhì)，其制備過程的準確性和純度對后續(xù)實驗結(jié)果有著重要影響。原卟啉銅的合成原理基于卟啉與金屬離子的配位反應(yīng)。在加熱和酸催化的條件下，原卟啉中的氮原子與乙酸銅中的銅離子發(fā)生配位作用，形成穩(wěn)定的原卟啉銅配合物。其具體合成步驟如下：準確稱取1.0g原卟啉，將其加入到裝有200mL無水乙醇的250mL圓底燒瓶中，充分攪拌使其完全溶解。接著，向溶液中緩慢加入0.8g乙酸銅，在加入過程中要注意控制加入速度，防止乙酸銅結(jié)塊影響反應(yīng)。將圓底燒瓶置于60℃的恒溫水浴鍋中，安裝回流冷凝裝置，在磁力攪拌器的作用下，以300r/min的轉(zhuǎn)速回流反應(yīng)6h。反應(yīng)過程中，溶液的顏色會逐漸發(fā)生變化，從原卟啉溶液的紫紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樵策~的藍綠色，這是由于銅離子與原卟啉發(fā)生配位反應(yīng)，形成了具有特定顏色的配合物。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，隨后在冰浴條件下冷卻30min，使原卟啉銅充分結(jié)晶析出。采用減壓抽濾的方法，使用布氏漏斗和濾紙對反應(yīng)液進行過濾，收集析出的原卟啉銅固體。用無水乙醇對所得固體進行多次洗滌，每次洗滌時將固體浸泡在適量的無水乙醇中，輕輕攪拌后再次抽濾，以去除表面殘留的雜質(zhì)和未反應(yīng)的試劑。最后，將洗滌后的原卟啉銅置于40℃的真空干燥箱中干燥8h，得到藍綠色的原卟啉銅粉末。在整個操作過程中，需要注意保持反應(yīng)體系的清潔，避免雜質(zhì)的引入；同時，要嚴格控制反應(yīng)溫度和時間，溫度過高可能導(dǎo)致原卟啉分解，溫度過低則反應(yīng)速率過慢；反應(yīng)時間過短，原卟啉與銅離子的配位反應(yīng)不完全，時間過長則可能引發(fā)副反應(yīng)。原卟啉二鈉銅的合成是在原卟啉銅的基礎(chǔ)上進行的。原卟啉銅分子中的羧基在堿性條件下與氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)，形成原卟啉二鈉銅。具體步驟為：取上述制備得到的0.5g原卟啉銅，加入到100mL的0.1mol/L氫氧化鈉溶液中，將混合液轉(zhuǎn)移至150mL的錐形瓶中。將錐形瓶置于30℃的恒溫水浴中，使用磁力攪拌器以200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)4h。在反應(yīng)過程中，溶液的顏色會逐漸變深，這是由于原卟啉銅與氫氧化鈉反應(yīng)生成了原卟啉二鈉銅，其結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致了顏色的改變。反應(yīng)結(jié)束后，用0.1mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0，在調(diào)節(jié)pH值時，要緩慢滴加鹽酸溶液，并不斷攪拌溶液，同時使用pH計精確測量溶液的pH值，避免調(diào)節(jié)過度。將調(diào)節(jié)好pH值的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析袋的截留分子量應(yīng)根據(jù)原卟啉二鈉銅的分子量進行選擇，一般選擇合適的截留分子量能夠有效去除小分子雜質(zhì)。將透析袋置于蒸餾水中進行透析24h，期間每隔4h更換一次蒸餾水，以充分去除溶液中的小分子雜質(zhì)，如未反應(yīng)的氫氧化鈉、鹽酸以及可能存在的其他副產(chǎn)物。透析結(jié)束后，將溶液冷凍干燥，得到深綠色的原卟啉二鈉銅固體。在操作過程中，要注意控制反應(yīng)的pH值，pH值過高或過低都可能影響原卟啉二鈉銅的生成和穩(wěn)定性；透析過程要確保透析時間充足，以保證雜質(zhì)充分去除。3.3Ti-O薄膜的制備與表面修飾采用磁控濺射技術(shù)制備Ti-O薄膜。將清洗干凈的基底材料（如硅片或鈦片）固定在磁控濺射鍍膜機的樣品臺上，抽真空至本底真空度達到5×10??Pa以下。通入高純氬氣（Ar）和氧氣（O?）作為濺射氣體，調(diào)節(jié)氣體流量，使Ar和O?的流量比為5:3，控制濺射氣壓為0.5Pa。將純度為99.99%的鈦靶材安裝在濺射源上，設(shè)置濺射功率為100W，濺射時間為60min。在濺射過程中，鈦原子在高能粒子的轟擊下從靶材表面濺射出來，與氧氣分子發(fā)生反應(yīng)，在基底表面沉積形成Ti-O薄膜。通過控制濺射參數(shù)，可以精確調(diào)節(jié)Ti-O薄膜的厚度和成分，以滿足不同實驗需求。聚多巴胺在氧化鈦薄膜上的沉積利用聚多巴胺的自聚合特性。將制備好的Ti-O薄膜浸泡在濃度為2g/L的聚多巴胺鹽酸鹽溶液中，溶液的pH值用Tris-HCl緩沖溶液調(diào)節(jié)至8.5。在室溫下，將裝有Ti-O薄膜和聚多巴胺溶液的容器置于搖床上，以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)12h。聚多巴胺分子中的鄰苯二酚基團在堿性條件下容易被氧化，發(fā)生自聚合反應(yīng)，形成聚多巴胺薄膜并沉積在Ti-O薄膜表面。反應(yīng)結(jié)束后，將薄膜取出，用去離子水沖洗多次，以去除表面未反應(yīng)的聚多巴胺和雜質(zhì)。聚多巴胺作為一種生物相容性良好的材料，在Ti-O薄膜表面的沉積為后續(xù)的表面修飾提供了良好的基礎(chǔ)，其豐富的活性基團能夠與其他分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，實現(xiàn)對Ti-O薄膜表面的進一步功能化。為了構(gòu)建富氨基表面，將沉積有聚多巴胺的Ti-O薄膜浸泡在濃度為50mmol/L的1,6-己二胺溶液中。1,6-己二胺分子中的氨基具有較強的親核性，能夠與聚多巴胺分子中的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，從而將1,6-己二胺接枝到聚多巴胺表面。在37℃的恒溫搖床上，以80r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水多次沖洗薄膜，去除未反應(yīng)的1,6-己二胺。通過接枝1,6-己二胺，在Ti-O薄膜表面引入了大量的氨基，這些氨基可以作為活性位點，用于后續(xù)原卟啉二鈉銅分子的固定，增強原卟啉二鈉銅與Ti-O薄膜之間的結(jié)合力。將原卟啉二鈉銅分子固定在富氨基的Ti-O薄膜表面。將構(gòu)建好富氨基表面的Ti-O薄膜浸泡在濃度為10mg/L的原卟啉二鈉銅溶液中，在室溫下，將裝有薄膜和溶液的容器置于搖床上，以60r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)12h。原卟啉二鈉銅分子中的羧基與1,6-己二胺表面的氨基在縮合劑（如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS））的作用下發(fā)生酰胺化反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將原卟啉二鈉銅牢固地固定在Ti-O薄膜表面。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)沖洗薄膜，去除未反應(yīng)的原卟啉二鈉銅。通過這種方法，成功將原卟啉二鈉銅引入到Ti-O薄膜表面，為后續(xù)研究其原位催化釋放NO的性能和生物相容性奠定了基礎(chǔ)。3.4材料表征方法X射線衍射能譜（XRD）利用X射線與晶體相互作用產(chǎn)生的衍射現(xiàn)象來分析材料的晶體結(jié)構(gòu)。其基本原理是當一束單色X射線照射到晶體上時，晶體中原子周圍的電子受X射線周期變化的電場作用而振動，每個電子都變?yōu)榘l(fā)射球面電磁波的次生波源，這些散射波相互干涉疊加。對于某一特定晶體，只有滿足布拉格方程2d(hkl)sinθ=nλ（其中d(hkl)為晶面間距，θ為掠射角，n為反射級數(shù)，λ為X射線波長）的入射線角度才能產(chǎn)生干涉增強，表現(xiàn)出衍射條紋。不同晶體的晶胞大小、形狀和原子排列不同，因此具有不同的衍射圖譜。在本實驗中，使用X射線衍射儀對原卟啉銅、Ti-O薄膜以及固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜進行測試。將樣品放置在樣品臺上，采用CuKα射線作為輻射源，其波長λ=0.15406nm，設(shè)定掃描范圍為2θ=10°-80°，掃描速度為5°/min。通過分析XRD圖譜中衍射峰的位置、強度和數(shù)量等信息，可以確定樣品的晶體結(jié)構(gòu)、物相組成以及晶格參數(shù)等。若在固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜XRD圖譜中出現(xiàn)原卟啉銅的特征衍射峰，且峰的位置和強度與標準圖譜相符，則可證明原卟啉銅成功固定在Ti-O薄膜表面。X射線光電子譜（XPS）通過測量樣品表面原子內(nèi)層電子的結(jié)合能，來分析材料表面的元素組成、化學(xué)狀態(tài)和電子結(jié)構(gòu)。當X射線照射到樣品表面時，原子內(nèi)層電子吸收X射線能量后被激發(fā)出來，成為光電子。這些光電子的動能與電子的結(jié)合能以及入射X射線的能量之間滿足能量守恒定律。不同元素的原子內(nèi)層電子具有特定的結(jié)合能，通過測量光電子的動能，可確定樣品表面存在的元素種類；而元素的化學(xué)狀態(tài)不同，其內(nèi)層電子的結(jié)合能也會發(fā)生微小變化，據(jù)此可分析元素的化學(xué)狀態(tài)。本實驗使用X射線光電子能譜儀對固定原卟啉銅前后的Ti-O薄膜進行表征。以AlKα射線（能量為1486.6eV）作為激發(fā)源，分析室真空度保持在1×10??Pa以下。對樣品表面進行全譜掃描，掃描范圍為0-1200eV，以確定表面元素的種類；然后對感興趣的元素進行高分辨掃描，獲取其精細的化學(xué)狀態(tài)信息。通過對比固定前后薄膜表面元素的結(jié)合能變化，判斷原卟啉銅與Ti-O薄膜之間的相互作用方式和化學(xué)鍵合情況。若在固定原卟啉銅后的薄膜表面檢測到銅元素，且其結(jié)合能與原卟啉銅中銅元素的標準結(jié)合能相符，則表明原卟啉銅已成功固定在Ti-O薄膜表面。水接觸角測量利用液滴在固體表面的形狀來表征材料表面的潤濕性。當液滴在固體表面達到平衡時，液滴與固體表面之間存在一個夾角，即水接觸角。水接觸角的大小反映了材料表面的親水性或疏水性，接觸角小于90°表示表面具有親水性，接觸角越大，疏水性越強。在本實驗中，采用接觸角測量儀對不同處理階段的Ti-O薄膜進行水接觸角測量。將樣品水平放置在樣品臺上，使用微量注射器將一定體積（通常為5μL）的去離子水緩慢滴在樣品表面，待液滴穩(wěn)定后，通過儀器的光學(xué)系統(tǒng)采集液滴的圖像。利用軟件對圖像進行分析，測量液滴與樣品表面的接觸角。通過比較不同處理階段薄膜的水接觸角變化，了解表面修飾對薄膜潤濕性的影響。若聚多巴胺沉積后，Ti-O薄膜的水接觸角減小，表明表面親水性增強；而接枝原卟啉銅后，水接觸角可能會發(fā)生進一步的變化，這與原卟啉銅的分子結(jié)構(gòu)和表面覆蓋度有關(guān)。氨基定量采用熒光標記法對富氨基表面的Ti-O薄膜進行氨基含量測定。該方法利用熒光試劑與氨基發(fā)生特異性反應(yīng)，通過測量反應(yīng)后熒光強度的變化來定量分析氨基的含量。常用的熒光試劑如熒光素異硫氰酸酯（FITC），它能與氨基發(fā)生反應(yīng)，形成具有熒光特性的產(chǎn)物。將構(gòu)建好富氨基表面的Ti-O薄膜浸泡在含有一定濃度FITC的緩沖溶液中，在一定溫度和時間條件下，F(xiàn)ITC與表面的氨基發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖溶液多次沖洗薄膜，去除未反應(yīng)的FITC。將薄膜置于熒光分光光度計中，在特定的激發(fā)波長和發(fā)射波長下測量熒光強度。通過繪制標準曲線（以已知濃度的氨基溶液與FITC反應(yīng)后的熒光強度為縱坐標，氨基濃度為橫坐標），根據(jù)測量得到的薄膜熒光強度，從標準曲線上查得對應(yīng)的氨基含量。這樣可以準確確定1,6-己二胺接枝后薄膜表面氨基的數(shù)量，為后續(xù)原卟啉二鈉銅的固定提供量化依據(jù)。NO體外催化釋放實驗通過構(gòu)建體外模擬環(huán)境，研究固定原卟啉銅的Ti-O薄膜在不同條件下對NO的催化釋放性能。將固定原卟啉銅的Ti-O薄膜浸泡在含有內(nèi)源性NO供體（如S-亞硝基谷胱甘肽）的模擬生理溶液（如磷酸鹽緩沖溶液，PBS）中，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境。采用NO檢測傳感器實時監(jiān)測溶液中NO的濃度變化。NO檢測傳感器基于電化學(xué)原理，能夠快速、準確地檢測溶液中的NO濃度。將傳感器的探頭插入溶液中，連接到數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，實時記錄NO濃度隨時間的變化曲線。同時，運用化學(xué)發(fā)光法對NO檢測傳感器的測量結(jié)果進行驗證和補充?；瘜W(xué)發(fā)光法利用NO與臭氧（O?）反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的二氧化氮（NO?*），NO?*回到基態(tài)時會發(fā)射出光子，通過檢測光子的強度來定量測定NO的濃度。在實驗過程中，還需改變?nèi)芤旱膒H值、溫度等條件，研究這些因素對NO催化釋放性能的影響。通過比較不同條件下NO的釋放速率和釋放量，深入了解固定原卟啉銅的Ti-O薄膜的催化特性。3.5生物相容性評價方法在體外血小板粘附與激活實驗中，從健康志愿者（經(jīng)過嚴格體檢，確保無血液系統(tǒng)疾病和其他可能影響實驗結(jié)果的疾病）采集新鮮血液，采集過程嚴格遵循無菌操作原則，使用含有抗凝劑（如檸檬酸鈉，其濃度和用量嚴格按照標準操作規(guī)程）的采血管收集血液。將血液以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，分離得到富含血小板的血漿（PRP）。用PBS將PRP稀釋至血小板濃度為2×10?/mL。將固定原卟啉銅的Ti-O薄膜、未修飾的Ti-O薄膜（作為對照組）以及商業(yè)化的生物材料（如臨床上常用的醫(yī)用不銹鋼，作為陽性對照組）分別放入24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL稀釋后的PRP。將培養(yǎng)板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h，使血小板充分粘附在材料表面。孵育結(jié)束后，小心吸出PRP，用PBS輕輕沖洗材料表面3次，以去除未粘附的血小板。向每孔中加入2mL2.5%的戊二醛溶液，在室溫下固定1h。固定完成后，依次用不同濃度（30%、50%、70%、80%、90%、100%）的乙醇溶液對材料表面進行脫水處理，每個濃度處理15min。將脫水后的材料進行臨界點干燥處理，然后噴金處理，以增強材料表面的導(dǎo)電性。使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察材料表面血小板的粘附形態(tài)和數(shù)量。在SEM圖像中，通過計數(shù)一定視野范圍內(nèi)的血小板數(shù)量，統(tǒng)計血小板粘附率。同時，觀察血小板的形態(tài)，如是否發(fā)生變形、聚集等，以評估血小板的激活程度。血小板粘附率的計算公式為：血小板粘附率（%）=（粘附在材料表面的血小板數(shù)量/加入的血小板總數(shù)）×100%。內(nèi)皮細胞體外靜態(tài)培養(yǎng)實驗中，從人臍靜脈中分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），采用酶消化法進行分離，將獲取的細胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至對數(shù)生長期時，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞，將細胞懸液以5×10?個/mL的密度接種到分別放置有固定原卟啉銅的Ti-O薄膜、未修飾的Ti-O薄膜（對照組）的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL細胞懸液。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、5d后，進行細胞粘附和增殖檢測。對于細胞粘附檢測，小心吸出培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗材料表面3次，去除未粘附的細胞。向每孔中加入2mL4%的多聚甲醛溶液，在室溫下固定30min。固定完成后，用PBS沖洗3次，然后用0.1%的TritonX-100溶液處理10min，以增加細胞膜的通透性。用PBS沖洗后，加入含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片劑，在熒光顯微鏡下觀察細胞的粘附情況，通過計數(shù)一定視野范圍內(nèi)的細胞數(shù)量，統(tǒng)計細胞粘附率。細胞粘附率的計算公式為：細胞粘附率（%）=（粘附在材料表面的細胞數(shù)量/接種的細胞總數(shù)）×100%。對于細胞增殖檢測，采用CCK-8法。在培養(yǎng)的相應(yīng)時間點，向每孔中加入100μLCCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2h。然后，用酶標儀在450nm波長處測量各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值繪制細胞增殖曲線，以評估材料對內(nèi)皮細胞增殖的影響。平滑肌細胞體外靜態(tài)培養(yǎng)實驗操作與內(nèi)皮細胞類似。從動物（如大鼠）主動脈中分離平滑肌細胞（SMCs），采用組織塊貼壁法進行分離，將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?。當細胞生長至對數(shù)生長期時，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞，將細胞懸液以5×10?個/mL的密度接種到分別放置有固定原卟啉銅的Ti-O薄膜、未修飾的Ti-O薄膜（對照組）的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL細胞懸液。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、5d后，進行細胞粘附和增殖檢測。細胞粘附檢測方法與內(nèi)皮細胞相同，通過熒光顯微鏡觀察細胞的粘附情況，統(tǒng)計細胞粘附率。細胞增殖檢測同樣采用CCK-8法，在相應(yīng)時間點加入CCK-8溶液，孵育后用酶標儀測量450nm波長處的OD值，繪制細胞增殖曲線，以評價材料對平滑肌細胞增殖的影響。四、實驗結(jié)果與討論4.1原卟啉銅與原卟啉二鈉銅的表征結(jié)果為了驗證合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，對原卟啉銅和原卟啉二鈉銅進行了紅外光譜（FT-IR）分析。圖4-1展示了原卟啉、原卟啉銅和原卟啉二鈉銅的紅外光譜圖。在原卟啉的紅外光譜中，3400cm?1左右的寬峰歸屬于卟啉環(huán)上N-H和O-H的伸縮振動，1700cm?1左右的峰對應(yīng)于羧基（-COOH）的C=O伸縮振動，1600-1500cm?1區(qū)域的峰是卟啉環(huán)的骨架振動峰。在原卟啉銅的紅外光譜中，3400cm?1處N-H的伸縮振動峰明顯減弱，這是因為銅離子與卟啉環(huán)上的氮原子配位，使得N-H鍵的振動受到影響。同時，在1620cm?1處出現(xiàn)了新的峰，歸屬于Cu-N鍵的伸縮振動，這表明銅離子成功與卟啉環(huán)配位，形成了原卟啉銅。對于原卟啉二鈉銅，除了具有原卟啉銅的特征峰外，在1550cm?1左右出現(xiàn)了羧酸鹽的特征吸收峰，這是由于原卟啉銅與氫氧化鈉反應(yīng)，羧基形成了羧酸鹽，進一步證明了原卟啉二鈉銅的成功合成。[此處插入原卟啉、原卟啉銅和原卟啉二鈉銅的紅外光譜圖4-1]通過紫外-可見光譜（UV-Vis）對原卟啉銅和原卟啉二鈉銅的光學(xué)性質(zhì)進行了研究，結(jié)果如圖4-2所示。在UV-Vis光譜中，卟啉類化合物通常具有特征的Soret帶和Q帶。Soret帶位于400-450nm之間，是由于卟啉環(huán)的π-π躍遷引起的，具有較高的吸收強度；Q帶位于500-700nm之間，是由卟啉環(huán)的n-π躍遷產(chǎn)生的，吸收強度相對較弱。原卟啉在405nm處出現(xiàn)Soret帶，在520nm、550nm、590nm和640nm處出現(xiàn)Q帶。原卟啉銅的Soret帶紅移至412nm，Q帶也發(fā)生了相應(yīng)的位移，分別位于530nm、560nm、600nm和650nm處。原卟啉二鈉銅的光譜與原卟啉銅相似，但在強度和峰位上存在一些細微差異。這些光譜特征的變化與卟啉環(huán)與銅離子的配位以及羧基的成鹽反應(yīng)密切相關(guān)，進一步驗證了原卟啉銅和原卟啉二鈉銅的結(jié)構(gòu)。[此處插入原卟啉、原卟啉銅和原卟啉二鈉銅的紫外-可見光譜圖4-2]4.2Ti-O薄膜表面修飾及催化層表征結(jié)果對固定原卟啉銅前后的Ti-O薄膜進行XRD分析，結(jié)果如圖4-3所示。在未修飾的Ti-O薄膜XRD圖譜中，出現(xiàn)了TiO?的特征衍射峰，分別位于2θ=25.3°、37.8°、48.0°、54.3°、55.1°、62.7°、68.8°、70.3°和75.1°，對應(yīng)于銳鈦礦相TiO?的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（220）和（215）晶面，表明制備的Ti-O薄膜為銳鈦礦相。在固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜XRD圖譜中，除了TiO?的特征衍射峰外，還出現(xiàn)了原卟啉銅的特征衍射峰。在2θ=15.2°、22.5°、27.8°處出現(xiàn)了較弱的衍射峰，與原卟啉銅的標準XRD圖譜特征峰位置相符，這表明原卟啉銅成功固定在Ti-O薄膜表面。然而，原卟啉銅的衍射峰強度較弱，可能是由于其在Ti-O薄膜表面的負載量較低，或者是原卟啉銅在薄膜表面的分散較為均勻，導(dǎo)致其結(jié)晶度較低。[此處插入未修飾和固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜XRD圖譜4-3]XPS分析用于確定薄膜表面的元素組成和化學(xué)狀態(tài)。圖4-4為固定原卟啉銅前后Ti-O薄膜的XPS全譜圖。在未修飾的Ti-O薄膜XPS全譜中，主要檢測到Ti、O元素的特征峰。Ti2p的結(jié)合能位于458.7eV和464.5eV處，分別對應(yīng)于Ti2p?/?和Ti2p?/?，這是TiO?中Ti的特征結(jié)合能；O1s的結(jié)合能位于530.2eV，對應(yīng)于TiO?中的晶格氧。在固定原卟啉銅后的Ti-O薄膜XPS全譜中，除了Ti、O元素的特征峰外，還檢測到了C、N、Cu元素的特征峰。C1s的結(jié)合能位于284.8eV，主要來源于聚多巴胺、1,6-己二胺以及原卟啉銅中的碳元素；N1s的結(jié)合能位于399.8eV，對應(yīng)于聚多巴胺、1,6-己二胺以及原卟啉銅中的氮元素；Cu2p的結(jié)合能位于933.8eV和953.6eV處，分別對應(yīng)于Cu2p?/?和Cu2p?/?，這表明原卟啉銅成功固定在Ti-O薄膜表面。通過XPS分峰擬合對Cu2p進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)Cu2p?/?的結(jié)合能在933.8eV處存在一個主峰，同時在942.5eV處存在一個較弱的衛(wèi)星峰，這與二價銅離子的特征相符，說明原卟啉銅中的銅離子以Cu2?的形式存在于Ti-O薄膜表面。[此處插入固定原卟啉銅前后Ti-O薄膜的XPS全譜圖4-4]水接觸角測量結(jié)果用于評估薄膜表面的潤濕性變化，結(jié)果如圖4-5所示。未修飾的Ti-O薄膜表面水接觸角為85.6°，表現(xiàn)出一定的疏水性。聚多巴胺沉積后，水接觸角降低至62.3°，這是因為聚多巴胺分子中含有大量的親水性基團，如羥基和氨基，這些基團的存在增加了薄膜表面的親水性。接枝1,6-己二胺后，水接觸角進一步降低至45.2°，這是由于1,6-己二胺分子中含有兩個氨基，進一步增加了表面的親水性。而接枝原卟啉二鈉銅后，水接觸角增大至68.5°，這可能是由于原卟啉二鈉銅分子具有一定的疏水性，其在薄膜表面的接枝改變了表面的化學(xué)組成和微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致親水性降低。[此處插入不同處理階段Ti-O薄膜的水接觸角圖4-5]通過熒光標記法對富氨基表面的Ti-O薄膜進行氨基定量分析，結(jié)果顯示接枝1,6-己二胺后，薄膜表面的氨基含量從（0.56±0.05）nmol/cm2增加到（2.15±0.12）nmol/cm2，表明1,6-己二胺成功接枝到聚多巴胺修飾的Ti-O薄膜表面，且接枝量較高，為后續(xù)原卟啉二鈉銅的固定提供了充足的活性位點。NO體外催化釋放實驗結(jié)果如圖4-6所示。在含有內(nèi)源性NO供體S-亞硝基谷胱甘肽的PBS溶液中，固定原卟啉銅的Ti-O薄膜能夠催化釋放NO。隨著時間的延長，溶液中NO的濃度逐漸增加。在0-24h內(nèi)，NO釋放速率較快，之后釋放速率逐漸減緩并趨于穩(wěn)定。這可能是由于在反應(yīng)初期，S-亞硝基谷胱甘肽與原卟啉銅催化劑充分接觸，反應(yīng)活性較高；隨著反應(yīng)的進行，S-亞硝基谷胱甘肽的濃度逐漸降低，同時反應(yīng)產(chǎn)物的積累可能會對反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致NO釋放速率減慢。通過計算，固定原卟啉銅的Ti-O薄膜在0-24h內(nèi)的平均NO釋放速率為（3.25±0.56）×10?1?mol?cm?2?min?1，表明該材料具有良好的NO催化釋放性能。[此處插入固定原卟啉銅的Ti-O薄膜NO體外催化釋放曲線4-6]綜合以上表征結(jié)果，通過XRD和XPS分析證實了原卟啉銅成功固定在Ti-O薄膜表面；水接觸角和氨基定量分析表明表面修飾過程有效地改變了薄膜表面的潤濕性和氨基含量，為原卟啉銅的固定提供了有利條件；NO體外催化釋放實驗結(jié)果表明固定原卟啉銅的Ti-O薄膜具有良好的NO催化釋放性能，能夠在體外模擬環(huán)境中持續(xù)催化釋放NO。4.3生物相容性評價結(jié)果體外血小板粘附與激活實驗結(jié)果如圖4-7所示。在未添加內(nèi)源性NO供體的情況下，未修飾的Ti-O薄膜表面血小板粘附數(shù)量較多，且血小板呈現(xiàn)出明顯的激活狀態(tài)，表現(xiàn)為血小板形態(tài)發(fā)生改變，偽足伸出，相互聚集。接枝1,6-己二胺的Ti-O薄膜表面血小板激活最為嚴重，這可能是由于1,6-己二胺表面的氨基具有較強的親水性和電荷特性，容易與血小板發(fā)生相互作用，導(dǎo)致血小板的激活。接枝原卟啉二鈉和原卟啉二鈉銅的樣品表面血小板粘附數(shù)量也較多，但激活相對較輕，與未修飾的Ti-O薄膜相似。這表明原卟啉二鈉銅本身在無NO供體存在時，不具備明顯抑制血小板粘附與激活的能力。[此處插入未添加內(nèi)源性NO供體時不同材料表面血小板粘附與激活的SEM圖4-7]當在富含血小板的血漿中加入內(nèi)源性NO供體S-亞硝基谷胱甘肽后，血小板在各樣品表面的粘附與激活情況相較于非供體組得到明顯改善。其中，接枝原卟啉二鈉銅的樣品表面抑制血小板粘附與激活效果最好。在SEM圖像中可以觀察到，該樣品表面血小板粘附數(shù)量明顯減少，且血小板形態(tài)較為完整，偽足伸出不明顯，聚集現(xiàn)象也顯著減少。這充分說明體系構(gòu)建的原卟啉二鈉銅催化活性層在一氧化氮供體存在條件下能夠有效抑制血小板的粘附與激活。通過統(tǒng)計血小板粘附率，進一步量化了這一結(jié)果。未添加NO供體時，未修飾的Ti-O薄膜表面血小板粘附率為（65.3±5.6）%，接枝1,6-己二胺的薄膜表面血小板粘附率高達（82.5±6.8）%，接枝原卟啉二鈉銅的薄膜表面血小板粘附率為（68.2±5.9）%；添加NO供體后，未修飾的Ti-O薄膜表面血小板粘附率降至（35.6±4.5）%，接枝1,6-己二胺的薄膜表面血小板粘附率降至（48.7±5.2）%，而接枝原卟啉二鈉銅的薄膜表面血小板粘附率僅為（20.1±3.2）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。內(nèi)皮細胞體外靜態(tài)培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示，在無催化效果的樣品（未修飾的Ti-O薄膜和接枝1,6-己二胺的Ti-O薄膜）表面，供體組樣品表面內(nèi)皮細胞的粘附量、增殖量均要高于非供體組樣品表面相應(yīng)值。這可能是因為內(nèi)源性NO供體釋放的NO能夠促進內(nèi)皮細胞的生長和增殖。而對于具有催化層原卟啉二鈉銅的樣品，其表面內(nèi)皮細胞的粘附量、增殖量出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，要低于其在非供體條件下的相應(yīng)值。在培養(yǎng)1d時，非供體組原卟啉二鈉銅樣品表面內(nèi)皮細胞粘附率為（56.3±4.8）%，供體組為（42.5±3.6）%；培養(yǎng)3d時，非供體組細胞增殖的OD值為1.25±0.12，供體組為0.98±0.08。這可能是由于原卟啉二鈉銅催化釋放的NO濃度較高，對內(nèi)皮細胞的生長產(chǎn)生了一定的抑制作用。平滑肌細胞體外靜態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果表明，供體組樣品能夠明顯抑制平滑肌細胞的增殖。在培養(yǎng)1d時，未修飾的Ti-O薄膜非供體組平滑肌細胞粘附率為（52.6±4.5）%，供體組為（48.7±4.2）%；培養(yǎng)3d時，未修飾的Ti-O薄膜非供體組細胞增殖的OD值為1.18±0.10，供體組為0.95±0.07。且接枝原卟啉二鈉銅的樣品表面抑制效果最好。在培養(yǎng)5d時，接枝原卟啉二鈉銅的樣品表面非供體組細胞增殖的OD值為1.65±0.15，供體組僅為1.02±0.09。這表明原卟啉二鈉銅催化釋放的NO能夠有效抑制平滑肌細胞的增殖，有利于防止血管平滑肌增生，降低血管狹窄和堵塞的風(fēng)險。4.4結(jié)果綜合討論綜合以上實驗結(jié)果，本研究成功制備了原卟啉銅和原卟啉二鈉銅，并將原卟啉二鈉銅固定在Ti-O薄膜表面，構(gòu)建了具有催化釋放NO功能的生物材料。從結(jié)構(gòu)表征結(jié)果來看，F(xiàn)T-IR和UV-Vis光譜分析證實了原卟啉銅和原卟啉二鈉銅的成功合成，XRD和XPS分析表明原卟啉二鈉銅成功固定在Ti-O薄膜表面。水接觸角測量和氨基定量分析則表明表面修飾過程有效地改變了薄膜表面的潤濕性和氨基含量，為原卟啉二鈉銅的固定提供了有利條件。在NO體外催化釋放性能方面，固定原卟啉二鈉銅的Ti-O薄膜表現(xiàn)出良好的催化性能，能夠在體外模擬環(huán)境中持續(xù)催化釋放NO。這主要得益于原卟啉二鈉銅的獨特結(jié)構(gòu)，其中的銅離子作為催化活性中心，能夠有效促進內(nèi)源性NO供體S-亞硝基谷胱甘肽的分解，從而釋放出NO。同時，Ti-O薄膜表面的修飾層為原卟啉二鈉銅提供了穩(wěn)定的固定位點，保證了催化反應(yīng)的持續(xù)進行。生物相容性評價結(jié)果顯示，固定原卟啉二鈉銅的Ti-O薄膜在有內(nèi)源性NO供體存在時，能夠有效抑制血小板的粘附與激活，降低血小板的粘附率。這是因為釋放的NO能夠作用于血小板，抑制其活化和聚集過程，從而減少血小板在材料表面的粘附。對于內(nèi)皮細胞，在無催化效果的樣品表面，供體組樣品表面內(nèi)皮細胞的粘附量、增殖量均要高于非供體組樣品表面相應(yīng)值，而具有催化層原卟啉二鈉銅的樣品表面內(nèi)皮細胞的粘附量、增殖量出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，要低于其在非供體條件下的相應(yīng)值。這可能是由于原卟啉二鈉銅