1鸚鵡熱衣原體超快速熒光PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3.1超快速熒光PCRultra-fastReal所構(gòu)建的高效核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，可在8~15min內(nèi)完成45個(gè)循4縮略語PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactCt值：閾值循環(huán)數(shù)（CyclethreshDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAciBHQ2：黑洞淬滅劑2（BlackHoleQuencherFAM：6-羧基熒光素（6-CarboxyfluorescMGB：MinorGrooveBinderQuencher淬滅基團(tuán)Cy5：近紅外熒光染料（Near-infraredfluorescentPBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebuffersoluti25試劑和耗材超快速熒光PCR擴(kuò)增（鸚鵡熱衣原體和內(nèi)參基因序列6.2移液器（量程：0.5μL～10μL、10μL～1剪刀、鑷子、棉拭子、Eppendorf管、研磨管等采樣工具需經(jīng)121℃(±2℃)高壓滅菌15min方3用量(μL）4在各設(shè)定的熒光PCR管中分別加入8.1提取的DNA溶液5μL，經(jīng)渦旋后瞬時(shí)離心，取50μL反應(yīng)液8.4.1上機(jī)9結(jié)果判定9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.3結(jié)果描述及判定9.3.3FAM通道37＜Ct值＜45且有典型“S”型擴(kuò)增曲線，Cy5通道Ct值≤30.0，判為可疑?？梢蓸悠窇?yīng)重新檢測(cè)，若重新檢測(cè)結(jié)果無特異性擴(kuò)增曲線或無Ct值或等于45則為鸚鵡熱衣原體核酸陰性，若Ct值小于45且有典型“S”型擴(kuò)增曲線則判為鸚鵡熱衣原體核酸陽性。5溶液配置A.10.01mol/LPBS(pH=7.2)溶液的配置水并定容至1L，完全溶解后用3mol/LNaOH調(diào)pH至7.2，經(jīng)121℃(±2℃)高壓滅菌15min，室溫保6B.1鸚鵡熱衣原體OmpA基因序列GGGGTTCAAATCAGATCAACCTCAATACCGGGGAGGTGAATCGACGAGCAACCTGGCTTCAACTGCCTTGAAGGATACGAATTCCGC。），L,將其稀釋為工作濃度約3.702×107copies/μL。TGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTACGACGAGTCCGGCCCCTCCATCGTCCACCGCAAATGCTTC和測(cè)序，鑒定為重組陽性質(zhì)粒（pUC57-β-actin質(zhì)粒濃度約為1.3×1010copies/μL,將其稀7工作濃度(μmol/L）FAM-ATGCAGCCTTCCTAGCCTTAAACAAGTCCGCCTAGAAGCATTTGCy5-AGTCCGGCCCCTCCATCGTCCA8