前 范 規(guī)范性引用文 術(shù)語、定 方案選擇要 儀器設(shè) 試劑、溶液配 檢驗(yàn)程 結(jié)果分析和表 結(jié)果報(bào) 質(zhì)量保 廢棄物處 TCACM0101—2016《1部分:中藥材與中藥飲片》TCACM0102—2016《2》TCACM010郾3—2016《3》本標(biāo)準(zhǔn)的全部技術(shù)內(nèi)容為推薦性本標(biāo)準(zhǔn)在遵從《中華人民共和國藥典》的基礎(chǔ)上,提出了《中藥分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)通則》。本標(biāo)準(zhǔn)由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)歸口本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、中國食品藥品檢定研究院、國藥種業(yè)有限、袁媛、馬雙成、蔣超、魏鋒、張文娟、鄭健、趙玉洋、周駿輝、何雅莉、王繼永。TT/CACM010.3—TT/CACM010.3—中藥分子鑒定通則3部分:中藥材種子種苗本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用分子生物學(xué)手段鑒定中藥材種子種苗的通用方法和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于中藥材種子種苗鑒定。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。?！吨腥A人民共和國藥典GBT6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T23632—2009《進(jìn)境植物檢疫截獲有害生物鑒定復(fù)核規(guī)程》GB/T27403—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)》GBT35431—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則》GBT35435—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定術(shù)語、下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)

DNADNA從樣品中提取出DNA的方法DNA擴(kuò)增DNA通過一定技術(shù)使一段特定的DNA片段拷貝數(shù)增加的過程,可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)或其他DNA擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)polymerasechainPCR技術(shù)。模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數(shù)呈幾何倍數(shù)增長(zhǎng)。其擴(kuò)增產(chǎn)物可通過多種特異性和敏感性好的方法進(jìn)行檢測(cè)。positive一般使用對(duì)照樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程,用于證明鑒定過

使用常見混淆樣品代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程blank以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程,污染

standard包括對(duì)照藥材和種子種苗對(duì)照樣品。經(jīng)全國中藥材種子標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)認(rèn)定并保存,與品種名稱相符的種子種苗樣品送檢樣品與該品種文件標(biāo)注的對(duì)照樣品相符中藥材種子種苗分子鑒定應(yīng)采用抽取有代表性的送檢樣品與對(duì)照樣品比較的驗(yàn)證方式,檢測(cè)結(jié)果以規(guī)定數(shù)目引物的A位點(diǎn)差異數(shù)目表示。使用SSR或SP標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè),并根據(jù)檢測(cè)目的不同要求,選擇適宜的檢測(cè)方案。每次鑒定實(shí)驗(yàn)均應(yīng)包含陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。所有制備樣品使用的器具在使用前應(yīng)滅菌處理。根據(jù)方案,寫出標(biāo)準(zhǔn)中需要說明的儀器設(shè)備試劑、GB/T6682—2008規(guī)定的一級(jí)水要求。試劑應(yīng)為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑。試劑的保存應(yīng)有防污染措施。試劑配制操作應(yīng)在單獨(dú)的制備區(qū)進(jìn)行。所配制的溶液0.22滋m)除菌。應(yīng)記述鑒別引物的名稱和序列、合成引物質(zhì)量要求、純化方式等。20益保存,使用時(shí)應(yīng)DNA提取、擴(kuò)增和檢測(cè)程序。為防止交叉污染,收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進(jìn)行,進(jìn)入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行,即樣品制備區(qū)寅核酸制備區(qū)寅擴(kuò)增區(qū)寅檢測(cè)區(qū)。取樣應(yīng)在樣品制備區(qū)進(jìn)行。送檢樣品、試樣的抽取、分取應(yīng)有代表性。應(yīng)根據(jù)送檢樣品的不同要求,確定樣品的數(shù)量或重量。在生產(chǎn)基地取樣,送檢樣品可以為組織或器官;在加工或銷售地點(diǎn)取樣,送檢樣品為種子或種苗。粉碎應(yīng)在樣品制備區(qū)進(jìn)行。取送檢樣品置乳缽、組織勻漿機(jī)或球磨粉碎儀中充分研磨,必要時(shí)加適量液氮研磨。進(jìn)行樣品前處理時(shí)應(yīng)有預(yù)防交叉污染的措施,以避免送檢樣品交叉污染而導(dǎo)致假陽性DNADNA提取應(yīng)在核酸制備區(qū)進(jìn)行應(yīng)根據(jù)送檢樣品特性選擇合適的DNA提取方法或用等效DNADNA提取,所提取的DNA應(yīng)符合擴(kuò)增的要求,模板DNA必要時(shí)可進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂寯U(kuò)增應(yīng)在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積可依據(jù)中藥材種子種苗種類及其所使用方法確定。、酶、引物等選擇適宜的反應(yīng)程序。4益保存。應(yīng)記述鑒別引物的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度范圍、條帶數(shù)目等信息。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。電泳、、、8118111凝膠電泳法在陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果均符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品出現(xiàn)預(yù)期數(shù)目和大小的特征條帶,則判定測(cè)試結(jié)果為陽性;若送檢樣品未出現(xiàn)預(yù)期數(shù)目和大小的特征條帶,則判定為陰性。8112熒光檢測(cè)法在陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果均符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品與陽性對(duì)照一致,則判定測(cè)試結(jié)果為陽性,否則為陰性。812擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)純化、濃縮后使用DNA測(cè)序儀雙向測(cè)序,將拼接獲得序列與陽性對(duì)照序列進(jìn)行比對(duì),依據(jù)二者序列相似度和譜系關(guān)系原則判定。813應(yīng)根據(jù)選擇方法的技術(shù)原理要求和品種實(shí)際需求建立結(jié)果分析和表示方法種質(zhì)、檢驗(yàn)結(jié)果采用比較送檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品位點(diǎn)的差異數(shù)目表示。統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果,計(jì)算比較位點(diǎn)數(shù)、差異位點(diǎn)數(shù)及差異位點(diǎn)。位點(diǎn)差異記錄分為下列三種情形:位點(diǎn)存在差異的或完全相同的,記錄為有差異或無差異;位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失的,記錄為缺失;位點(diǎn)顯示無法判定的,記錄為無法判定“冶或陰性“冶;定量檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合具體品種分子鑒別標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)種質(zhì)、品系或品種的檢驗(yàn)結(jié)果可按送檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)判斷,當(dāng)樣品間2不同冶1,判定為近似冶;當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)0,判定為極近似或相同冶。樣品經(jīng)檢測(cè)后,根據(jù)具體操作程序和結(jié)果做好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄,出具檢測(cè)報(bào)告。檢測(cè)報(bào)告至少包送檢樣品的名稱、狀態(tài)和明確的標(biāo)識(shí);陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、特定方法取得的結(jié)果,結(jié)果使用的單位及計(jì)算方法;檢測(cè)結(jié)果應(yīng)來自兩份送檢樣品。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性,另一份為陰性時(shí),